專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制造領(lǐng)域，更具體涉及一種利用一色齒毛菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)素、纖維素和半纖維素為自然界中最豐富的三大可再生資源，分別占植物干重的209Γ35%，45%和20%。木質(zhì)素是一種天然高分子化合物，廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁中，是儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的生物多聚體，而且每年以50億噸以上的速度再生。自然界中木質(zhì)素的完全降解主要是通過白腐真菌的分解作用來完成的。其機(jī)理是通過白腐菌分泌的胞外氧化酶——木質(zhì)素降解酶來實(shí)現(xiàn)的，其中漆酶(Lacca·^)、錳過氧化物酶(MnP)和木素過氧化物酶、LiP~)是白腐菌木質(zhì)素降解酶系的主要組成部分，其中漆酶在木質(zhì)素降解過程中扮演著重要角色，對(duì)木質(zhì)素的氧化、脫甲基和解聚等發(fā)揮著重要作用。漆酶不僅存在于高等植物中，而且一些多孔菌和腐生菌以及昆蟲和細(xì)菌等也能產(chǎn)漆酶，且大多數(shù)由真菌分泌。在大多數(shù)真菌中，白腐菌是目前公認(rèn)的最強(qiáng)、最主要的木質(zhì)素降解者，能使木質(zhì)素最終礦化為(X)2和H2O。漆酶能催化氧化多種有機(jī)物，包括苯酚、甲氧基酚、氨基酚等難以降解的芳香族化合物，同時(shí)分子氧被還原成水。最近研究表明，漆酶在造紙工業(yè)中有著重要作用，可以降解木漿中的木質(zhì)素，并能夠脫除造紙工業(yè)污水中的大量污染物。由于漆酶在催化木質(zhì)素、木質(zhì)素前體物質(zhì)分子及其結(jié)構(gòu)相似物等許多環(huán)境污染物的降解中具有特殊的作用，近年來，有關(guān)漆酶的研究受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，顯示出了較大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。盡管漆酶具有如此重要的用途，但其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用仍十分有限，主要原因是多數(shù)生產(chǎn)菌株合成漆酶的效率低，造成漆酶產(chǎn)量不足。因此，高產(chǎn)漆酶菌株的獲得對(duì)生態(tài)農(nóng)業(yè)、環(huán)境和生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化等方面有著非常重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，在提高農(nóng)副產(chǎn)品利用效率方面具有廣闊的應(yīng)用前景，特別是在農(nóng)作物廢棄物的利用、環(huán)境保護(hù)、我國生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展上具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，該方法可提高漆酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。本發(fā)明的一種發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，包括真菌分泌漆酶培養(yǎng)基的配制和產(chǎn)酶發(fā)酵，所述真菌分泌漆酶培養(yǎng)基為每IOOmL的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖l_4g，酒石酸銨 1-2. 5g，ABTS 0. 05-0. 25mmol/L, VB1 0. 6mg/L,大量元素，微量元素，余量為水，用 NaOH 或 HCl 調(diào)節(jié)初始 pH=5. 0-6. 0。所述真菌分泌漆酶培養(yǎng)基為每IOOmL的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖2g，酒石酸銨 1. 5g，ABTS 0. 05mmol/L, VB1O. 6mg/L，大量元素，微量元素，余量為水，調(diào)節(jié)初始pH=5. 0 ；其中大量元素包括KH2PO4 20. Og/L, MgSO4^H2O 13. 8g/L, CaCl2 1.0g/L 和 NaCl 0. 6g/L ；微量元素包括MnSO4- H2O 0. 35g/L, FeSO4- 7H20 60mg/L，CoCl2。6H20 llOmg/L, ZnSO4" 7H20 60mg/L, CuSO4- 5H20 95 mg/L, AlK (SO4) 2。12H20 6mg/L, H3BO3 6mg/L 禾口 NaMo04。2H20 6mg/L。所述真菌為一色齒毛菌、Cerrena unicolor)。發(fā)酵工藝條件為接種量8-12%，發(fā)酵溫度20-30°C，轉(zhuǎn)速150-250r/min，裝液量 50-70mL/250mLo發(fā)酵工藝條件為接種量8%，發(fā)酵溫度25°C，轉(zhuǎn)速200r/min，裝液量60mL/250mL。接種的種子液的制備方法為將在PDA平板上活化好的菌種用打孔器制成 10-12mm菌塊，將得到的菌塊接入PDA液體培養(yǎng)基中，所述PDA液體培養(yǎng)基的配制為馬鈴薯 200g,葡萄糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水IOOOmL(先將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，稱取200g， 加水IOOOmL煮沸約20min，紗布過濾去渣，再加入葡萄糖20g和瓊脂15_20g，加熱使之全部溶解，補(bǔ)充蒸餾水至lOOOmL，121°C滅菌30min) ；PDA液體培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL三角瓶，每瓶接種3個(gè)菌塊，然后在轉(zhuǎn)速200r/min，溫度30°C搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)4d，制成種子液。本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，最高漆酶活力可達(dá)58888. 59U/L，約為優(yōu)化前的 10. 8倍；經(jīng)過5L發(fā)酵罐試驗(yàn)，最高漆酶活力可達(dá)79733U/L，約為實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下的1. 35倍。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
隨著研究的不斷深入，漆酶的應(yīng)用已經(jīng)滲透到工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療等領(lǐng)域，然而在漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方面，以及探索適宜的發(fā)酵條件等方面報(bào)道較少，仍然是今后研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明建立了發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的工藝條件，為實(shí)現(xiàn)漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式1漆酶活力的測(cè)定方法
漆酶活力測(cè)定方法采用ABTS法。4. OmL反應(yīng)體系中含1. 95mL 0. lmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH3. 0)、2. OOmL 0. 5mmol/L 2，2，-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液和50 μ L稀釋好的酶液，30°C啟動(dòng)反應(yīng)并測(cè)定反應(yīng)前5min內(nèi)反應(yīng)液在420nm處吸光度的增加值Δ OD42tl，以滅活的酶液作為空白。定義該條件下，每min催化lymol ABTS氧化所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)，并按下式計(jì)算漆酶活力 酶活力 U(/L) =NX Δ OD420 X IO6/(36000 Xt)
其中，N為稀釋倍數(shù)；Δ OD420為5min內(nèi)反應(yīng)液在420nm處吸光度的增加值；36000為 ABTS氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)(Lmor1CnT1)，t為反應(yīng)時(shí)間5min。2產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化
2. 1碳源及其添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響
分別以麩皮、玉米淀粉、葡萄糖、酒糟、桔皮、可溶性淀粉、稻草、蔗渣為碳源，添加量均為l%(w/v)，考察它們對(duì)產(chǎn)漆酶的影響，結(jié)果見表1。以葡萄糖為碳源時(shí)，產(chǎn)酶效果最好，酶活力最高，且漆酶產(chǎn)率也最高。在發(fā)酵第6d，酶活力達(dá)到最高56355. 56U/L，產(chǎn)酶效率達(dá)到 9392. 59 U/L · cf1。表1碳源對(duì)一色齒毛菌產(chǎn)漆酶的影響
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，包括真菌分泌漆酶培養(yǎng)基的配制和產(chǎn)酶發(fā)酵，其特征在于所述真菌分泌漆酶培養(yǎng)基為每IOOmL的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖l-4g，酒石酸銨 1-2. 5g，ABTS 0. 05-0. 25mmol/L, VB1 0. 6mg/L,大量元素，微量元素，余量為水，用 NaOH 或 HCl 調(diào)節(jié)初始 pH=5. 0-6. 0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述真菌分泌漆酶培養(yǎng)基為每IOOmL的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖2g，酒石酸銨1. 5g，ABTS 0. 05mmol/L, VB1O. 6mg/L，大量元素，微量元素，余量為水，調(diào)節(jié)初始pH=5.0 ；其中大量元素包括=KH2PO4 20. Og/L, MgSO4- 7H20 13. 8g/L, CaCl2 1. Og/L 和 NaCl 0. 6g/L ；微量元素包括MnSO4" H2O 0. 35g/L, FeSO4- 7H20 60mg/L，CoCl2。6H20 llOmg/L, ZnSO4" 7H20 60mg/L，CuS04。5H20 95 mg/ L, AlK(SO4)2- 12H20 6mg/L, H3BO3 6mg/L 和 NaMo04。2H20 6mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述真菌為一色齒毛菌 (Cerrena unicolor)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于發(fā)酵工藝條件為接種量 8-12%，發(fā)酵溫度 20-30°C，轉(zhuǎn)速 150-250r/min，裝液量 50_70mL/250mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于發(fā)酵工藝條件為接種量 8%，發(fā)酵溫度 25 °C，轉(zhuǎn)速 200r/min，裝液量 60mL/250mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于接種的種子液的制備方法為將在PDA平板上活化好的菌種用打孔器制成10-12mm菌塊，將得到的菌塊接入PDA 液體培養(yǎng)基中，所述PDA液體培養(yǎng)基的配制為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，蒸餾水IOOOmL ；PDA液體培養(yǎng)基裝液量為IOOmLASOmL三角瓶，每瓶接種3個(gè)菌塊，然后在轉(zhuǎn)速 200r/min，溫度30°C搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)4d，制成種子液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，該方法包括真菌分泌漆酶培養(yǎng)基的配制和產(chǎn)酶發(fā)酵，所述真菌分泌漆酶培養(yǎng)基為每100mL的液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖1-4g，酒石酸銨1-2.5g，ABTS0.05-0.25mmol/L，VB10.6mg/L，大量元素，微量元素，余量為水，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)初始pH=5.0-6.0。隨著研究的不斷深入，漆酶的應(yīng)用已經(jīng)滲透到工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療等領(lǐng)域，然而在漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方面，以及探索適宜的發(fā)酵條件等方面報(bào)道較少，仍然是今后研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明建立了發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的工藝條件，為實(shí)現(xiàn)漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。該方法可提高漆酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102181410SQ20111012192
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者嚴(yán)芬, 葉秀云, 李仁寬, 楊捷, 林娟, 胡佑彪 申請(qǐng)人:福州大學(xué)