專利名稱：一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌及其用途的制作方法
一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌及其用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種能夠干預(yù)幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌，還涉及所述植物乳桿菌的用途。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌OLpylori)作為慢性胃炎、消化性潰瘍，甚至胃癌的主要致病因素， 一直困擾著全世界。幽門螺桿菌作為胃中的原籍菌，能夠在強(qiáng)酸性的條件下生存并定殖下來(lái)，它主要有兩個(gè)特性，第一個(gè)特性是幽門螺桿菌在代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生大量的尿素酶，而尿素酶可以將尿素分解產(chǎn)生氨，因此，在幽門螺桿菌周圍形成“氨云”的微環(huán)境，從而能夠上調(diào)PH，使其免受強(qiáng)酸的侵蝕。第二個(gè)特性是幽門螺桿菌有鞭毛可以游動(dòng)，因而游到粘膜層， 并且粘附到胃上皮細(xì)胞中，從而定殖下來(lái)。定殖后的幽門螺桿菌就會(huì)分泌毒素，造成機(jī)體的損傷、病變，引起疾病。雖然隨著三聯(lián)療法，即PPI (質(zhì)子泵抑制劑)加兩種抗生素治療法的應(yīng)用，幽門螺桿菌治愈率得到很大的提高，但是仍然存在幽門螺桿菌感染復(fù)發(fā)率高，分布廣，危害性極大，藥物治療費(fèi)用高，并且幽門螺桿菌耐藥率的增加、長(zhǎng)期不合理應(yīng)用抗生素可引起胃腸功能紊亂及胃腸道菌群失調(diào)等不良反應(yīng)的問題。微生態(tài)療法恰是以一個(gè)嶄新的手段解決了傳統(tǒng)療法存在的多種問題。乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，廣泛存在于自然發(fā)酵乳制品、發(fā)酵植物食品如泡菜、酸菜、青貯飼料以及人腸道中。乳桿菌是食品工業(yè)上的常用菌種，與人類關(guān)系密切。乳桿菌具有耐酸性，定殖胃腸道的能力，并且乳桿菌能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價(jià)，降低血清膽固醇水平，控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、細(xì)胞感染、藥物效應(yīng)、毒性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、衰老過(guò)程和突然的應(yīng)激反應(yīng)等產(chǎn)生有益的影響。因此探索利用乳桿菌作為食療性食品預(yù)防幽門螺桿菌感染具有重大的意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳桿菌干預(yù)幽門螺桿菌感染進(jìn)行大量的臨床研究，研究結(jié)果表明益生菌具有抗感染，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能，平衡胃腸道正常菌群，降低抗生素副作用等多種功能。CN 1796M0A公開了一種具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌及其用途，用于制備食品組合物或藥物組合物，殺死或抑制幽門螺桿菌或大腸桿菌，治療由其引起的各種疾病。CN 1982437A公開了一種新穎的耐酸耐膽鹽、抗腸道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳桿菌株及其代謝產(chǎn)物與用途，用于制備抑制幽門螺桿菌、大腸桿菌或其它腸道致病菌的食品或藥品。但是，這些文獻(xiàn)沒有篩選抗幽門螺桿菌的乳桿菌的有效方法。因此，需要篩選一種抗幽門螺桿菌的乳桿菌，并且證明它們?cè)隗w內(nèi)外都具有良好的抗幽門螺桿菌的效果，同時(shí)研制這些乳桿菌實(shí)際的用途。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]
本發(fā)明的目的是提供一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌在制備藥物組合物、發(fā)酵劑、動(dòng)物飼料添加劑和保健品中的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CN2018。所述的植物乳桿菌在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為 CGMCC No.似86。所述的植物乳桿菌具有下述特性(1)在pH 2. 5環(huán)境下生長(zhǎng)良好；(2)體外抑制幽門螺桿菌生長(zhǎng)，降低其尿素酶活性；(3)體外抑制幽門螺桿菌粘附在胃上皮細(xì)胞上；(4)體內(nèi)預(yù)防或減輕幽門螺桿菌感染。本發(fā)明還涉及所述植物乳桿菌的用途，其特征在于它用于制備抑制幽門螺桿菌的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的組合物是由所述的植物乳桿菌CN2018 與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的組合物是膠囊、片劑、丸劑或口服液。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌CN2018用于生產(chǎn)乳制品、豆制品以及果蔬制品的發(fā)酵劑。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述植物乳桿菌CN2018用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料的添加劑。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌的用途，其特征在于所述的植物乳桿菌CN2018發(fā)酵液與益生元組合發(fā)酵制成液體、散劑、片劑或膠囊。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CN2018。所述的植物乳桿菌在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為 CGMCC No.似86。本發(fā)明的目的是解決上述問題。本發(fā)明人設(shè)立了下述標(biāo)準(zhǔn)篩選所需要的乳桿菌。 更具體地，本發(fā)明人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)食品和人腸道及糞便中篩選出一種具有下述性質(zhì)的乳桿菌，即本發(fā)明的植物乳桿菌CN2018 1、具有耐酸性，在低pH下可以生長(zhǎng)；2、混合物培養(yǎng)時(shí)對(duì)幽門螺桿菌(以H. pylori SSl為例)生長(zhǎng)和尿素酶活性有抑制作用；3、對(duì)幽門螺桿菌粘附人胃上皮細(xì)胞SGC7901有抑制作用；4、對(duì)未感染幽門螺桿菌的小鼠具有預(yù)防或減輕幽門螺桿菌感染的作用。下面將對(duì)這些性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)描述。1、具有耐酸性，在低pH下可以生長(zhǎng)將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CN2018分別接種于MRS培養(yǎng)基(例如青島海博
4的產(chǎn)品)中，在溫度37°C下培養(yǎng)Mh，再經(jīng)MRS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2 3次后，取ImL植物乳桿菌CN2018培養(yǎng)液，接種于19mL pH3. 0的MRS液體培養(yǎng)基，在溫度37°C下培養(yǎng)Mh，測(cè)定初始和培養(yǎng)結(jié)束后的0D600值。0D600值是在600nm波長(zhǎng)處的吸光值，利用這個(gè)值來(lái)測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，所以通常用來(lái)指菌體細(xì)胞密度。選擇在上述條件下生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用同樣培養(yǎng)方式，取1. OmL 用PBS (磷酸鹽緩沖液)清洗兩次后，并用PBS重懸的乳桿菌菌體，與9. OmL pH 2. 5的人工胃液混合后，在溫度37°C下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在開始(Oh)和池后，取樣用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率(存活率用對(duì)數(shù)比值換算，％)。篩選出存活率在80% 以上的菌株進(jìn)行下步研究。2、混合物培養(yǎng)時(shí)對(duì)H. pylori SSl生長(zhǎng)和尿素酶活性有抑制作用用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)乳桿菌的MRS 18h混合培養(yǎng)物抑制H. pylori SSl生長(zhǎng)情況，本發(fā)明植物乳桿菌CN2018能夠很強(qiáng)抑制H. pylori SSl生長(zhǎng)。所述植物乳桿菌CN2018的上清液可以明顯抑制H. pylori SSl的尿素酶活性。3、對(duì)H. pylori SSl幽門螺桿菌粘附人胃上皮細(xì)胞SGC7901有高抑制作用本發(fā)明植物乳桿菌CN2018的上清液和活菌體可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、替代和排阻三種方式降低H. pylori SSl粘附人胃上皮細(xì)胞SGC7901的粘附力。4、對(duì)未感染H. pylori SSl的小鼠具有預(yù)防或是減輕H. pylori SSl感染的作用通過(guò)先灌胃本發(fā)明植物乳桿菌CN2018十天，再灌胃H. pylori SSl感染小鼠，一周五次，最后再灌胃本發(fā)明植物乳桿菌CN2018三個(gè)月，對(duì)照組為灌生理鹽水十天，接著灌胃 H. pylori SS1，從感染小鼠的模型比較發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本發(fā)明植物乳桿菌CN2018預(yù)防的小鼠炎癥較輕，并且胃組織的尿素酶活力和血清中的抗H. pylori SSl的Ig-G抗體降低。本發(fā)明植物乳桿菌CN2018的其它生物學(xué)特性對(duì)植物乳桿菌CN2018的生長(zhǎng)特性的研究結(jié)果顯示該菌株的最低生長(zhǎng)溫度為 20°C，最高生長(zhǎng)溫度為40°C，該菌株以30-37°C的生長(zhǎng)溫度為佳，最高和最低初始生長(zhǎng)pH為 9. 0和3. 0，最適生長(zhǎng)初始pH為6. 0 ；本發(fā)明植物乳桿菌CN2018菌株的延遲期相對(duì)較短，4h 左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h就達(dá)到穩(wěn)定期。本發(fā)明植物乳桿菌的培養(yǎng)方法與培養(yǎng)條件所述植物乳桿菌CN2018原始菌種在溫度_75°C下以30重量％甘油懸液形式保存， 或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明植物乳桿菌CN2018可以在MRS培養(yǎng)基中在兼性厭氧條件、于溫度37°C下培養(yǎng)18-3 即可使用。本發(fā)明還涉及所述植物乳桿菌的用途，其特征在于它用于制備抑制幽門螺桿菌的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的組合物是由所述的植物乳桿菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組成的。所述的植物乳桿菌劑是將含有所述的植物乳桿菌CN2018的菌液通過(guò)凍干處理所得到的凍干粉劑，或采用其它方法處理得到的粉劑。得到的粉劑可以與在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合制成各種劑型，例如顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液，其中在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可以根據(jù)不同劑型進(jìn)行選擇，所使用的這些載體或賦形劑對(duì)于制藥技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都是容易確定的，也是顯而易見的。
根據(jù)本發(fā)明，在藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)該是指在藥學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)藥物載體，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解齊U、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體，例如填充劑如淀粉、蔗糖、 乳糖、微晶纖維素等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；潤(rùn)濕劑如甘油；崩解劑如羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉； 吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇、十二烷基硫酸鈉；吸附載體如高齡土和皂粘土 ；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、微粉硅膠和聚乙二醇；其它輔劑如香味劑、甜味劑等。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌用于生產(chǎn)乳制品、豆制品以及果蔬制品的發(fā)酵劑。根據(jù)本發(fā)明，所述的發(fā)酵劑應(yīng)該理解是含有用于生產(chǎn)乳制品、豆制品以及果蔬制品的本發(fā)明植物乳桿菌CN2018的活體培養(yǎng)物。在本發(fā)明中，所述的乳制品例如是牛奶、酸奶油和干酪等。所述的豆制品例如是豆腐乳、豆豉、豆醬和醬油等。所述的果蔬制品例如是黃瓜、紅蘿卜、甜菜、芹菜和圓白菜等。通常，把所述的發(fā)酵劑接種到待處理的原料中，通常使本發(fā)明植物乳桿菌CN2018濃度達(dá)到106CFU/mL以上，在一定條件下讓所述植物乳桿菌 CN2018繁殖，其代謝產(chǎn)物使發(fā)酵制品具有一定的酸度、香味等優(yōu)異特性，同時(shí)使產(chǎn)品增加了保藏時(shí)間，改善了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化性。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述植物乳桿菌用于制備生產(chǎn)動(dòng)物飼料的添加劑。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌的用途，其特征在于所述的植物乳桿菌CN2018發(fā)酵液與益生元組合發(fā)酵制成液體、散劑、片劑或膠囊劑。根據(jù)本發(fā)明， 所述的益生元應(yīng)該理解為通過(guò)選擇性的刺激一種或少數(shù)種菌落中的細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性而對(duì)寄主產(chǎn)生有益的影響從而改善寄主健康的不可被消化的食品成分，例如低聚果糖、大豆低聚糖等。添加益生元可以給腸道益生菌補(bǔ)充“食物”，激活與增殖人體內(nèi)的益生菌群，以達(dá)到促進(jìn)微生態(tài)平衡，改善健康的目的。人們知道，在人體結(jié)腸中有約100萬(wàn)億個(gè)、400至 500種細(xì)菌，這些細(xì)菌可分為三類有害菌、條件致病菌和益生菌。在益生菌中，以雙歧桿菌和乳桿菌為代表，它們作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高免疫力， 預(yù)防和治療便秘及腹瀉，降低血脂，抑制腸道病源和腐敗微生物的生長(zhǎng)，分解致癌物質(zhì)等作用，而益生元?jiǎng)t通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，強(qiáng)化腸道益生菌的功能。[有益效果]本發(fā)明的植物乳桿菌CN2018具有耐酸性，對(duì)幽門螺桿菌生長(zhǎng)和尿素酶活性有抑制作用，對(duì)幽門螺桿菌粘附人胃上皮細(xì)胞SGC7901有高抑制作用，對(duì)未感染幽門螺桿菌的小鼠具有預(yù)防或是減輕感染的作用。所述植物乳桿菌CN2018可以用于制備抑制幽門螺桿菌的藥物組合物；制備生產(chǎn)乳制品、豆制品以及果蔬制品的發(fā)酵劑；制備生產(chǎn)動(dòng)物飼料的添加劑；所述的植物乳桿菌CN2018發(fā)酵液與益生元組合發(fā)酵制成液體、散劑、片劑或膠囊劑。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)于2010年11月1日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 428
圖1是主成分分析載荷因子圖；圖2是主成分分析因子評(píng)分圖；圖3是抗幽門螺桿菌的乳桿菌成分分析圖；圖4是本發(fā)明植物乳桿菌CN2018抑制H. pylori SSl粘附在胃上皮細(xì)胞上的作用方式分析圖；圖5是小鼠胃組織切片HE染色圖，其中A :H. pylori SSl 感染組B :CN2018 干預(yù)組
具體實(shí)施方式實(shí)施例1 利用主成分分析篩選拮抗H. pylori SSl的乳桿菌從238株乳桿菌中篩選得到16株乳桿菌，它們?cè)诘蚿H條件下生長(zhǎng)良好，能夠耐受酸性人工胃液，對(duì)這16株乳桿菌進(jìn)行了耐酸性試驗(yàn)研究。通過(guò)耐酸性試驗(yàn)、抑制幽門螺桿菌(以H. pylori SSl為例)生長(zhǎng)試驗(yàn)、尿素酶活性檢測(cè)、乳桿菌的自凝集和疏水性作用以及乳桿菌和H. pylori SSl的共凝集作用試驗(yàn)，利用主成分分析和篩查了這些乳桿菌拮抗 H. pylori SSl 的能力。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，因子載荷圖(圖1)主要分成4個(gè)成分。第一個(gè)成分占 28. 87%，抑菌力起主要貢獻(xiàn)；第二個(gè)成分占14. 17%，共凝集和疏水性起主要作用；第三個(gè)成分占19. 40%，尿素酶活力和自凝集起主要作用；第四個(gè)成分占14. M%，耐酸性起主要作用。以第一個(gè)成分和第二個(gè)成分作因子評(píng)分圖(圖2)，從圖中可以看出第一個(gè)成分中， L. ρlantarum CN2018>L. ρlantarum DJ102-1>L. plantarum S3 禾口 L. ρlantarum ZS211-2 ^3 主要作用；第二個(gè)成分中主要是LGG、L. caise Siang和L. gesseri Chen起主要作用。通過(guò)綜合考慮，篩查得到L. plantarum CH2018可能潛在具有拮抗H. pyioriSSl的能力。實(shí)施例2 植物乳桿菌CN2018對(duì)其他幽門螺桿菌菌株的拮抗能力分析哥倫比亞培養(yǎng)基(Oxiod，UK)傾注平板(每平板15mL，平板為標(biāo)準(zhǔn)平板9mm)，把 H. pylori 43504,H. pylori 11637,H. pylori 26695 和 H. pylori C0707 涂布到平板上(濃度為1 X IO8CFU/平板)，立即放入4個(gè)牛津杯中，并向牛津杯中加入100 μ L乳桿菌發(fā)酵液， 在微需氧條件下固定Ih后，放入三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-7池，測(cè)量抑菌環(huán)大小。以MRS作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，其試驗(yàn)結(jié)果列于表1中。表1抑制其他幽門螺桿菌生長(zhǎng)分析
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌，其特征在于所述的植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum) CN2018于2010年11月1日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 4286。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌，其特征在于它具有下述特性(1)在pH2. 5環(huán)境下生長(zhǎng)良好；(2)抑制幽門螺桿菌生長(zhǎng)，降低其尿素酶活性；(3)抑制幽門螺桿菌粘附在胃上皮細(xì)胞上；(4)預(yù)防或減輕幽門螺桿菌感染。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物乳桿菌的用途，其特征在于它用于制備抑制幽門螺桿菌的藥物組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的組合物是由根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌與在醫(yī)用上可接受的載體組成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物乳桿菌的用途，其特征在于它用于生產(chǎn)乳制品、豆制品以及果蔬制品的發(fā)酵劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物乳桿菌的用途，其特征在于它用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料的添加劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物乳桿菌的用途，其特征在于所述的植物乳桿菌CN2018發(fā)酵液與益生元組合發(fā)酵制成液體、散劑、片劑或膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳桿菌CN2018，CGMCC No.4286及其用途。該乳桿菌CN2018具有耐酸性，對(duì)幽門螺桿菌(以H.pylori SS1為例)生長(zhǎng)和尿素酶活性有抑制作用，對(duì)幽門螺桿菌粘附人胃上皮細(xì)胞SGC7901有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)小鼠感染幽門螺桿菌具有預(yù)防或減輕感染程度的作用。
文檔編號(hào)A23C9/12GK102174450SQ20111005982
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者劉小鳴, 張灝, 張秋香, 田豐偉, 趙建新, 陳衛(wèi), 陳曉華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)