專利名稱:腺伴隨病毒(aav)進(jìn)化支、序列、含有這些序列的載體及它們的應(yīng)用的制作方法
腺伴隨病毒(AAV)進(jìn)化支、序列、含有這些序列的載體及它
們的應(yīng)用本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2004/(^8817,國際申請日為2004年9月 30日,進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮椤?00480027905. 2”,發(fā)明名稱為“腺伴隨病毒(AAV)進(jìn)化支、序列、含有這些序列的載體及它們的應(yīng)用”的發(fā)明專利申請的分案申請。關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明本申請包括由國家衛(wèi)生研究院(NIH)的NIDDK P30 DK47757和NHLBI P01HL59407 撥款資助的工作。美國政府享有本發(fā)明的一定權(quán)力。
背景技術(shù):
腺伴隨病毒(AAV)是細(xì)小病毒科家族的成員,它是小的無包膜、二十面體病毒,具有4. 7千堿基(1Λ)到61Λ的單鏈線形DNA基因組。由于該病毒是作為純化的腺病毒原種的污染物被發(fā)現(xiàn),AAV指定為依賴病毒屬(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潛伏期(AAV 基因組在感染后位點(diǎn)特異性地整合進(jìn)宿主染色體),感染期(腺病毒或單純皰疹病毒感染后,整合的基因組接著得到拯救、復(fù)制并包裝進(jìn)感染性病毒)。非致病性的特性、感染性的寬宿主范圍(包括非分裂細(xì)胞)與潛在的位點(diǎn)特異性染色體整合使得AAV成為用于基因轉(zhuǎn)移的有吸引力的工具。近來的研究表明AAV載體是用于基因遞送的優(yōu)選運(yùn)載體。迄今為止,已從人或非人靈長類(NHP)分離了幾種表征良好的不同AAV。已發(fā)現(xiàn)不同血清型的AAV表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率,也表現(xiàn)出對不同細(xì)胞或組織的向性。然而,以前還未對這些不同血清型之間的關(guān)系進(jìn)行研究?;贏AV的構(gòu)建物用于遞送異源分子是理想的。發(fā)明概述本發(fā)明提供AAV的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)序列的“超家族”或“進(jìn)化支”。這些AAV進(jìn)化支提供用于將分子靶向和/或遞送至所需靶細(xì)胞或組織的AAV序列源。本發(fā)明一方面提供具有至少三個(gè)AAV成員的AAV進(jìn)化支,這些成員是基于AAV VPl氨基酸序列對比,使用自引值為至少75% (基于至少1000次復(fù)制)的鄰接啟發(fā)式算法(Neighbor-Joining heuristic)與不大于0. 05的泊松校正距離測量值(Poisson correction distance measurement)確定為系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的。合適的AAV進(jìn)化支由用于產(chǎn)生載體的AAV序列組成。本發(fā)明還提供以前未知的人AAV血清型,這些血清型在本文中稱為克隆觀.4/ hu. 14或AAV血清型9。因此,本發(fā)明另一方面提供一種由AAV衣殼組成的血清型9的AAV, 該衣殼在血清學(xué)上與SEQ ID NO :123的氨基酸1-736的序列的衣殼相關(guān),在血清學(xué)上與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7 或 AAV8 中的任一衣殼蛋白不同。用該huAAV9的衣殼構(gòu)建的載體表現(xiàn)出的基因轉(zhuǎn)移效率類似于肝臟中的AAV8、優(yōu)于肌肉中的AAV并且比肺中的AAV5高200倍。此外,該新的人AAV血清型與以前所述的 AAVl到AAV8的序列同一性小于85%,并且不被任何這些AAV交叉中和。本發(fā)明也提供其它新的AAV序列、含有這些序列的組合物及它們的應(yīng)用。有利的是,這些組合物特別適用于出于治療或預(yù)防目的需要反復(fù)施用的AAV載體。本發(fā)明的這些和其它方面可通過以下發(fā)明詳述得到明白。附圖簡述
圖1是使用帶泊松校正距離測量值的鄰接啟發(fā)式算法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系樹?;诜蛛x的AAV vpl衣殼蛋白與分組于進(jìn)化支中分離的AAV確定關(guān)系。單個(gè)衣殼克隆的組基于它們共同的祖先分類在進(jìn)化支中。進(jìn)化支以A到F命名;亞型以進(jìn)化支字母加上一個(gè)數(shù)值表示。圖2A-2AE對比了本發(fā)明的AAV vpl衣殼蛋白的氨基酸序列(公布了各個(gè)序列的編號)與以前公布的 AAVl [SEQ ID NO :219]、AAV2 [SEQ ID NO :221]、AAV3-3 [SEQ ID NO: 217]、AAV4-4[SEQ ID NO :218]、AAV5 [SEQ ID NO :216]、AAV6 [SEQ ID NO :220]、AAV7 [SEQ ID NO :222]、AAV8[SEQ ID NO :223]與 rh. 25/42_15、29. 3/bb. 1、cy. 2、29. 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前稱為 41. 10)、 rh. 25(以前稱為 41. 15)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、 rh. 37、rh. 36、rh. 23、rh. 8 和 ch5 [公開的美國專利申請?zhí)?2003/0138772A1 (2003 年 7 月 24 日)]。本發(fā)明的序列包括 hu. 14/AAV9[SEQ ID NO 123]、hu. 17[SEQ ID NO :83]、 hu. 6[SEQ ID NO :84]、hu. 42 [SEQ ID NO :85]、hu. 38 [SEQ ID NO :86]、hu. 40 [SEQ ID NO:
87]、hu.37 [SEQ IDNO :88]、rh. 40 [SEQ ID NO :92]、rh. 52 [SEQ ID NO :96]、rh. 53 [SEQ ID NO :97]、rh. 49 [SEQ ID NO :103]、rh. 51 [SEQ ID NO :104]、rh. 57 [SEQ ID NO :105]、 rh. 58[SEQID NO :106]、rh. 61 [SEQ ID NO : 107]、rh. 50 [SEQ ID NO : 108]、rh. 43 [SEQ ID NO :163]、rh.62[SEQ ID NO :114]、rh.48[SEQ ID NO :115]、4_9/rh. 54[SEQ ID NO :116]和 4-19/rh. 55[SEQ ID NO :117]、hu. 31[SEQ ID NO : 121]、hu. 32[SEQ ID NO : 122]、hu. 34[SEQ ID NO :125]、hu. 45 [SEQ ID NO : 127]、hu. 47 [SEQ ID NO : 128]、hu. 13 [SEQID NO :129], hu. 28 [SEQ ID NO :130]、hu. 29 [SEQ ID NO : 132]、hu. 19 [SEQ IDNO : 133]、hu. 20 [SEQ ID NO :134]、hu. 21 [SEQ ID NO : 135]、hu. 23. 2 [SEQ ID NO : 137]、hu. 22 [SEQ ID NO :138]、 hu. 27 [SEQ ID NO : 140]、hu. 4 [SEQ ID NO :141]、hu. 2 [SEQ IDNO : 143]、hu. 1 [SEQ ID NO: 144], hu. 3 [SEQ ID NO : 145]、hu. 25 [SEQ ID NO : 146]、hu. 15 [SEQ ID N0:147]、hu. 16 [SEQ ID NO :148]、hu. 18 [SEQ ID NO : 149]、hu. 7 [SEQID NO : 150]、hu. 11 [SEQ ID NO: 153]、 hu. 9 [SEQ ID N0:155]、hu. 10 [SEQ ID NO :156]、hu. 48 [SEQ ID NO :157]、hu. 44 [SEQ ID NO: 158],hu. 46[SEQ ID NO : 159]、hu.43[SEQID NO :160]、hu.35[SEQ ID NO :164]、hu.24[SEQ ID NO :136]、rh. 64 [SEQ ID NO :99]、hu. 41 [SEQ ID NO :91]、hu. 39 [SEQ ID NO: 102]、 hu. 67[SEQ ID NO : 198]、hu.66[SEQID NO :197]、hu. 51[SEQ ID NO :190]、hu. 52[SEQ ID NO: 191],hu.49[SEQ IDNO :189]、hu.59[SEQ ID NO :192]、hu.57[SEQ ID NO : 193]、hu.58[SEQ ID NO :194]、hu. 63 [SEQ ID NO :195]、hu. 64 [SEQ ID NO :196]、hu. 60 [SEQ ID NO :184]、 hu.61[SEQID NO :185]、hu. 53[SEQ ID NO :186]、hu. 55[SEQ ID NO :187]、hu. 54[SEQ ID NO:
88],hu. 6 [SEQ ID NO :84]與rh. 56 [SEQ ID NO :152]。這些衣殼序列也見引為參考的序列表中。圖3A-3CN對比了本發(fā)明的AAV vpl衣殼蛋白的核酸序列(公布了各個(gè)序列的編號)與以前公布的 AAV5(SEQ ID NO 199)、AAV3-3 (SEQ ID NO :200)、AAV4-4 (SEQ ID NO: 201)、AAVl (SEQ ID NO :202)、AAV6 (SEQ ID NO :203)、AAV2 (SEQ ID NO :211)、AAV7 (SEQID NO 213)與 AAV8(SEQ ID NO :214)、rh. 25/42_15、29· 3/bb. 1、cy. 2、29· 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前稱為 41. 10)、 rh. 25(以前稱為 41. 15 ;GenBank 登錄號 AY530557)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、 cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、rh. 36、rh. 37、rh. 23、rh. 8 與 ch. 5[公開的美國專利申請?zhí)?2003/0138772 Al (2003 年 7 月 24 曰)]。本發(fā)明的核酸序列包括 hu. 14/AAV9 (SEQ ID NO: 3)、LG-4/rh. 38 (SEQ IDNO :7)、LG-10/rh. 40 (SEQID NO :14)、N721-8/rh. 43 (SEQ ID NO 43) U-8/rh. 49 (SEQ IDNO :25)、2_4/rh. 50 (SEQ ID NO :23)、2_5/rh. 51 (SEQ ID NO :22)、 3-9/rh.52(SEQ IDNO :18)、3_ll/rh.53(SEQ ID NO : 17)、5_3/rh.57(SEQ ID NO :26)、 5-22/rh. 58(SEQ IDNO :27)、2_3/rh.61(SEQ ID NO :21)、4_8/rh. 64(SEQ ID NO :15)、 3. 1/hu. 6(SEQ IDNO :5)、33. 12/hu. 17(SEQ ID NO :4)、106. 1/hu. 37 (SEQ ID NO :10)、 LG-9/hu. 39(SEQ IDNO 24),114. 3/hu. 40(SEQ ID NO :11),127. 2/hu. 41(SEQ ID NO :6)、 127. 5/hu. 42(SEQID NO :8)與 hu. 66(SEQ ID NO :173)、2_15/rh. 62(SEQ ID NO :33)、 1-7/rh. 48(SEQ IDNO :32)、4_9/rh. 54(SEQ ID NO :40)、4_19/rh. 55(SEQ ID N0:37)、52/ hu. 19 (SEQ IDNO 62) ,52. 1/hu. 20 (SEQ ID NO :63)、54. 5/hu. 23 (SEQ ID N0:60)、54.2/ hu. 22 (SEQ IDNO :67)、54. 7/hu. 24 (SEQ ID NO :66),54. 1/hu. 21 (SEQ ID NO :65)、54. 4R/ hu.27 (SEQ IDNO :64)、46.2/hu. 28(SEQ ID NO :68)、46.6/hu. 29(SEQ ID NO :69)、128.1/ hu. 43(SEQ IDNO :80)、128.3/hu. 44(SEQ ID NO :81)與130.4/hu. 48(SEQ ID NO :78)、3.1/ hu. 9 (SEQ IDNO :58)、16.8/hu. 10 (SEQ ID NO :56)、16.12/hu. 11(SEQ ID NO :57)、145. 1/ hu.53 (SEQID NO :176),145. 6/hu. 55(SEQ ID NO :178),145. 5/hu. 54 (SEQ ID NO :177)、 7. 3/hu. 7 (SEQ ID NO :55)、52/hu. 19 (SEQ ID NO :62)、33. 4/hu. 15 (SEQ ID N0:50)、33.8/ hu.16 (SEQ ID NO 51),58. 2/hu. 25(SEQ ID NO :49)、161. 10/hu. 60(SEQ IDNO : 170)、H_5/ hu. 3 (SEQ ID NO :44),H-1/hu. 1(SEQ ID NO :46)、161. 6/hu. 61(SEQ IDNO 174)、hu.31 (SEQ ID NO 1),hu. 32 (SEQ ID NO 2),hu.46(SEQ ID NO :82)、hu.34 (SEQ ID NO :72)、hu.47 (SEQ ID NO :77)、hu. 63 (SEQ ID NO :204)、hu. 56 (SEQ IDNO :205)、hu. 45 (SEQ ID NO :76)、 hu. 57 (SEQ ID NO :206)、hu. 35 (SEQ ID NO :73)、hu. 58 (SEQ ID NO :207)、hu. 51 (SEQ ID NO: 208),hu. 49(SEQ ID NO :209)、hu. 52(SEQID NO :210)、hu. 13(SEQ ID NO :71)、hu. 64 (SEQ ID NO :212)、rh. 56 (SEQ ID NO :54)、hu. 2 (SEQ ID NO :48)、hu. 18 (SEQ ID NO :52)、hu. 4 (SEQ ID NO 47)與hu. 67 (SEQ IDNO :215)。這些衣殼序列也見引為參考的序列表中。圖4A-4D提供了對基于AAV的新靈長類載體在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率的評價(jià)。 AAV 載體是如[Gao 等,Proc Natl Acad Sci 美國,“11邪4_11859 O002 年,9 月 3 日)]所述具有 AAV1、2、5、7、8 和 6 與 ch. 5、rh. 34,cy. 5、rh. 20,rh. 8 和 AAV9 衣殼的假型。如圖 4A 所示,為進(jìn)行體外研究,接種于95-孔板的84-32細(xì)胞(表達(dá)腺病毒血清型E4的293細(xì)胞) 以每細(xì)胞1 X IO4GC的感染復(fù)數(shù)(MoI)用假型AAVCMVEGFP載體感染。感染后48小時(shí)使用紫外顯微鏡將相對EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)效率估計(jì)為綠色細(xì)胞的百分比并顯示在Y軸上。為進(jìn)行體內(nèi)研究,分別經(jīng)門內(nèi)(intraportal)(圖4B)、氣管內(nèi)(圖4C)和肌肉內(nèi)(圖4D)以每只動物 1 X IO11GC的劑量給予NCR裸鼠周齡)的肝(圖4B)、肺(圖4C)和肌肉(圖4D)以表達(dá)分泌的報(bào)道基因AlAT的載體。在基因轉(zhuǎn)移后第觀天比較血清AlAT水平(ng/ml)并示于Y軸上。X軸表示所分析的AAV與它們所屬的進(jìn)化支。發(fā)明詳述
在任何用于治療或預(yù)防的載體庫中,為所需應(yīng)用選擇載體源,需要能將大分子攜帶至靶細(xì)胞的各種不同載體。迄今為止,關(guān)于將AAV用作載體的一個(gè)問題是缺乏各種不同的病毒來源。本發(fā)明通過提供AAV的進(jìn)化支來克服該問題,所述進(jìn)化支用于選擇系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的(或選擇治療方案所需的),或系統(tǒng)發(fā)生不同的AAV并用于預(yù)測功能。本發(fā)明還提供新的AAV病毒。當(dāng)術(shù)語“基本同源性”或“基本相似性”指核酸或其片段時(shí)意味著當(dāng)合適的核苷酸插入物或缺失物與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳對比時(shí),對比序列中至少約95%到99%的核苷酸序列同一性。優(yōu)選在全長序列、或其開放讀框、或另一至少長15個(gè)核苷酸的合適片段上具有同源性。合適片段的例子描述于本文。文中用于核酸序列的術(shù)語“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”指當(dāng)對比最大一致性時(shí),兩條序列中的殘基相同。序列同一性比較的長度可是基因組全長、基因編碼序列的的全長,或需要至少約500到5000個(gè)核苷酸的片段。然而,較小片段中的同一性也是需要的,例如至少約9個(gè)核苷酸、通常至少約20到M個(gè)核苷酸、至少約28到32 個(gè)核苷酸、至少約36或更多個(gè)核苷酸的片段。類似地,氨基酸序列、蛋白全長、或其片段的 “序列同一性百分比”可容易地確定。合適片段的長度至少約8個(gè)氨基酸,也可達(dá)約700個(gè)氨基酸。合適片段的例子描述于文中。當(dāng)術(shù)語“基本同源性”或“基本相似性”指氨基酸或其片段時(shí)意味著當(dāng)合適的氨基酸插入物或缺失物與另一氨基酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳對比時(shí),對比序列中至少約95%到 99%的氨基酸序列同一性。優(yōu)選在全長序列,或其蛋白質(zhì)(例如,cap蛋白、r印蛋白),或其至少8個(gè)氨基酸,或更希望至少15個(gè)氨基酸長度的片段上具有同源性。合適片段的例子描述于本文。術(shù)語“高度保守的”表示至少80%的同一性、優(yōu)選至少90%的同一性、更優(yōu)選超過 97%的同一性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可憑借本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的算法和計(jì)算機(jī)程序容易地
確定同一性。—般當(dāng)提及在兩種不同的腺伴隨病毒之間的“同一性”、“同源性”或“相似性”時(shí), “同一性”、“同源性”或“相似性”是參考“對比”的序列確定的?!皩Ρ取钡男蛄谢颉皩Ρ取敝付嗪怂嵝蛄谢虻鞍?氨基酸)序列,與參考序列相比,該序列通常含有缺失的或附加的堿基或氨基酸的校正。在實(shí)施例中,使用公開的AAV2或AAVl序列作為參考點(diǎn)進(jìn)行AAV對比。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地選擇另一 AAV序列作為參考??墒褂萌魏胃鞣N公用或市售可得的多序列對比程序進(jìn)行對比。這種程序的例子包括通過因特網(wǎng)的萬維服務(wù)器可得的“Clustal W”、“CAP序列組件”、“MAP”和“MEME”。這種程序的其它來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?;蛘咭部墒褂肰ectorNTI實(shí)用程序。許多本領(lǐng)域已知的算法,包括包含在上述程序中的算法也可用于測量核苷酸序列同一性。使用GCG6. 1 版中的程序hsta 來比較多核苷酸序列是另一個(gè)例子。hsta 提供在查詢和檢索序列之間最佳重疊區(qū)域的對比和序列同一性百分比。例如,核酸序列之間的序列同一性百分比可使用GCG6. 1版提供的具有默認(rèn)參數(shù)的i^staTM(字長為6和用于計(jì)分矩陣的NOPAM系數(shù)) 來確定,該程序納入本文引作參考。多序列對比程序也可應(yīng)用于氨基酸序列,例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME” 和"Match-Box” 程序。雖然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可視需要改變這些設(shè)置,但通常這些程序以默認(rèn)設(shè)置使用?;蛘?,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用另一種算法或計(jì)算機(jī)程序,該算法或程序提供的同一性或算法的水平至少同參考的算法和程序提供的一樣。參見,例如J. D. Thomson等,Nucl. Acids. Res.,“多序列對比的綜合比較,,(A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignments),27 (13) 2682-2690(1999)。術(shù)語“血清型”區(qū)分具有在血清學(xué)上不同于其它AAV血清型的一種衣殼的AAV。血清學(xué)特殊性是基于與其它AAV相比,針對AAV的抗體之間缺乏交叉反應(yīng)性來確定。交叉反應(yīng)性通常在中和抗體試驗(yàn)中測定。就該試驗(yàn)而言,使用腺伴隨病毒在家兔或其它合適的動物模型中產(chǎn)生抗特異性AAV的多克隆血清。然后在該試驗(yàn)中測試所產(chǎn)生的抗特異性AAV的血清中和相同(同源)或異源AAV的能力。達(dá)到50%中和作用的稀釋度看作中和抗體滴度。如果就兩種AAV而言,倒數(shù)形式的異源滴度除以同源滴度的商小于16,則此兩種AAV可視為是相同的血清型。相反,如果倒數(shù)形式的異源滴度與同源滴度之比是16 或更大,此兩種AAV視為是不同血清型。如本文所定義,為形成血清型9,所產(chǎn)生針對所選AAV衣殼的抗體必須與AAVl、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中任一種不交叉反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供一種在本文中鑒定為人AAV血清型9的新血清型的AAV衣殼。本說明書與權(quán)利要求書使用的術(shù)語“含有”和“包括”是包括其它成分、元素、整數(shù)、 步驟等在內(nèi)。相反,術(shù)語“由...組成”和其變體不包括其它成分、元素、整數(shù)、步驟等在內(nèi)。1.進(jìn)化支在一方面,本發(fā)明提供了 AAV的進(jìn)化支。進(jìn)化支是基于AAV vpl氨基酸序列對比, 使用自引值為至少75% (至少1000次復(fù)制)的鄰接啟發(fā)式算法與不大于0.05的泊松校正距離測量值確定為互相系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的一組AAV。鄰接算法詳細(xì)描述于參考文獻(xiàn)。參見,例如M. Nei與S. Kumar,《分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)生學(xué)》(Molecular Evolution and Phylogenetics)(牛津大學(xué)出版社,紐約 Q000)。計(jì)算機(jī)程序可用于執(zhí)行該算法。例如,MEGA v2.1程序執(zhí)行改進(jìn)的Nei-Gojobori方法。使用這些技術(shù)與計(jì)算機(jī)程序,AAV vpl衣殼蛋白的序列,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定所選擇的AAV是否包含在文中所鑒定的一種進(jìn)化支內(nèi)、另一種進(jìn)化支內(nèi)、或在這些進(jìn)化支之外。雖然本文所定義的進(jìn)化支主要基于天然的AAV vpl衣殼,這些進(jìn)化支不限于天然的AAV。這些進(jìn)化支可包括非天然AAV,包括(但不限于)重組、修飾、嵌合、雜交、合成、人工的等,基于AAV vpl氨基酸序列對比,使用自引值為至少75% (至少1000次復(fù)制)的鄰接啟發(fā)式算法與不大于0. 05的泊松校正距離測量值確定為系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的AAV。本文所述的進(jìn)化支包括進(jìn)化支A(以AAVl和AAV6表示)、進(jìn)化支B(以AAV2表示)、進(jìn)化支C (以AAV2-AAV3雜交體表示)、進(jìn)化支D (以AAV7表示)、進(jìn)化支E (以AAV8表示)與進(jìn)化支F(以人AAV9表示)。這些進(jìn)化支以前文所述AAV血清型的進(jìn)化支的成員代表。前文所述的AAVl和AAV6是單一進(jìn)化支(進(jìn)化支A)的成員,該進(jìn)化支中4種分離物回收自3種人。前文所述AAV3和AAV5血清型明顯相互不同,但在本文所述的篩選中未檢測到,并且未包括于任何這些進(jìn)化支中。進(jìn)化支B(AAV2)和進(jìn)化支C(AAV2-AAV3雜交體)是在人中發(fā)現(xiàn)的AAV最豐富的 (AAV2有22種分離物來自12種個(gè)體,進(jìn)化支C有17個(gè)分離物來自8種個(gè)體)。大量的序列分組于進(jìn)化支D (AAV7)或進(jìn)化支E (AAV8)。有趣的是,這些進(jìn)化支普遍存在于不同物種中。進(jìn)化支D對恒河猴與南美彌猴是獨(dú)特的,具有分離自10種不同動物的 15個(gè)成員。由于進(jìn)化支E在人和非人靈長類中發(fā)現(xiàn),它是令人感興趣的9種分離物回收自 7種人而21種分離物得自9種不同的非人靈長類,包括恒河猴、狒狒和豚尾彌猴(pigtail monkey)。在其它兩種動物中證實(shí)了某些序列的雜交特性,雖然在該情況中所有的序列似乎具有起源于兩種協(xié)同感染病毒(在兩種動物中是進(jìn)化支D與進(jìn)化支E病毒)的獨(dú)立而不同的重組。這些重組體無一在其它動物或受試對象中鑒定到。因?yàn)檫M(jìn)化支C(AAV2_AAV3雜交體)在6種不同的人對象中鑒定到,重組甚至導(dǎo)致了合適的后代。另一方面,就AAV7-AAV8雜交體而言,僅有少數(shù)重組情況涉及AAV進(jìn)化。這些重組情況說明AAV能重組,從而產(chǎn)生框內(nèi)基因以及在一些情況中產(chǎn)生可包裝和/或感染性衣殼結(jié)構(gòu)。另一方面,進(jìn)化支C(AAV2-AAV3雜交體進(jìn)化支)是一組通過重組獲得選擇性優(yōu)點(diǎn)的病毒,這種重組使它們?nèi)淌墉h(huán)境壓力。A.進(jìn)化支A (以AAVl禾Π AAV6表示)在另一方面,本發(fā)明提供進(jìn)化支Α,其特征在于含有前文公開的AAVl和AAV6。 參見,例如2000年5月18日的國際
發(fā)明者G·高, J·M·威爾森, L·H·范登伯格, M·R·阿爾維拉 申請人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會