專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物基因工程是大豆遺傳改良的的重要途徑。近幾年來(lái)轉(zhuǎn)基因植物與日俱增， 轉(zhuǎn)化方法也得到了快速的發(fā)展。大豆轉(zhuǎn)基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法、PEG ( polyethylene glycol,聚乙二醇)法、超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等。大豆是公認(rèn)難轉(zhuǎn)化的植物，轉(zhuǎn)基因的困難主要是轉(zhuǎn)化率低、重復(fù)性差、基因型局限等問(wèn)題，目前主要是靠大量的轉(zhuǎn)化受體來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植株。目前普遍采用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因體系包括子葉節(jié)法、下胚軸法、胚尖法等轉(zhuǎn)化方法存在周期長(zhǎng)，一般至收獲種子需 6-8個(gè)月，生根、移栽過(guò)程成功率低，并且轉(zhuǎn)化率低于10% 。因此，進(jìn)一步研究建立新的、 高效穩(wěn)定的大豆轉(zhuǎn)基因體系是十分必要的。本項(xiàng)發(fā)明一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因方法， 是在水培養(yǎng)條件下完成轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化周期短，獲得當(dāng)代種子僅需3-4個(gè)月，培養(yǎng)液用量少， 轉(zhuǎn)化效率可達(dá)15-25%，節(jié)省了大量時(shí)間、人員、財(cái)力、物力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供如下技術(shù)方案
將萌發(fā)的大豆種子移入水培養(yǎng)箱中保濕光照培養(yǎng)，用含有目的基因的農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染，侵染后包住子葉使其避光保濕培養(yǎng)，見(jiàn)光后每隔一天滴加芽誘導(dǎo)液于子葉節(jié)部位保濕培養(yǎng)約1-2周分化不定芽，篩選獲得陽(yáng)性再生苗，繼續(xù)培養(yǎng)成株后收獲種子。本發(fā)明具體步驟如下
(1)水培法轉(zhuǎn)化體系選取飽滿的大豆種子，于暗下25°c萌發(fā)，3天后移入水培箱中保濕光照培養(yǎng)，2天后去除頂芽及側(cè)芽，并沿脈絡(luò)劃3-5道傷口，將兩片子葉合攏用parafilm 膜包住子葉下1/2至下胚軸處，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染液滴入兩片子葉縫隙中進(jìn)行侵染；
(2)水培法共培養(yǎng)步驟侵染后用錫紙罩住子葉使其避光，在水培箱中20-25°C保濕培養(yǎng)，3天后去除錫紙；
(3)水培法芽誘導(dǎo)步驟每天或隔天滴加芽誘導(dǎo)液于子葉節(jié)部位，在水培箱中20-25°C 保濕培養(yǎng)約1-2周分化不定芽；
(4)陽(yáng)性芽篩選a)有選擇標(biāo)記載體的鑒定利用一定濃度篩選標(biāo)記物質(zhì)涂抹伸長(zhǎng)芽的葉片，2-3天去除陰性不定芽，直至篩選出陽(yáng)性伸長(zhǎng)芽；然后連根整體移入土中正常培養(yǎng)；b)無(wú)選擇標(biāo)記載體的鑒定去除每株首先伸長(zhǎng)的3個(gè)不定芽，留取第4個(gè)不定芽，連根整體移入土中正常培養(yǎng)；
(5)PCR鑒定提取陽(yáng)性伸長(zhǎng)枝的葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定。所述大豆品種為合豐35、合豐45、合豐55、黑河38、黑河48、黑農(nóng)44、黑農(nóng)48、黑農(nóng)51、綏農(nóng)觀、墾豐16、東農(nóng)44、東農(nóng)47、東農(nóng)48、東農(nóng)53、東農(nóng)50、東農(nóng)8004中任——種。所述避光保溫培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為3天。所述水培箱由水培容器、通氣裝置、植株固定裝置、保濕和避光裝置組成，是在液體環(huán)境培養(yǎng)下對(duì)大豆進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、芽誘導(dǎo)、篩選。所述水培溶液為適合大豆正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)液，包括大豆生長(zhǎng)所需的大量元素、微量元素及其它調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的物質(zhì)。所述種子萌發(fā)可在培養(yǎng)箱中水催芽萌發(fā)，也可以在土、蛭石或其他培養(yǎng)基質(zhì)中萌發(fā)，然后再移入水培環(huán)境中。所述侵染子葉用parafilm膜包住使兩片子葉保持合攏，適合侵染液直接滴入，避免侵染液的下流，同時(shí)起到避光的作用。侵染液可加入乙酰丁香酮類物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化率。所述共培養(yǎng)后不需要去除侵染菌液，直接進(jìn)行芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6BA(6-BenZylamin0pUrine，6芐基腺嘌呤)等促進(jìn)叢生芽分化的物質(zhì)，以促進(jìn)分化。芽誘導(dǎo)液的施用時(shí)間從共培養(yǎng)結(jié)束至篩選出陽(yáng)性伸長(zhǎng)枝為止，陰性植株的去除是從不定芽的基部切除。所述芽侵染液、芽誘導(dǎo)液、篩選物質(zhì)可添加表面活性劑SILWET -77等，其目的在于提高附著能力。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1.采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行大豆轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)15%_34%；
2.本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化周期短，從侵染到PCR檢測(cè)需要40-50天，整個(gè)周期獲得種子僅需要3-4個(gè)月；
3.TO代(轉(zhuǎn)基因當(dāng)代)結(jié)實(shí)率高、種子數(shù)量多；
4.本方法成本低，僅需要0.5-1L芽誘導(dǎo)培養(yǎng)液，需要植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)微量；
5.操作步驟簡(jiǎn)單，不需繼代、生根等操作；
6.培養(yǎng)環(huán)境要求低，不需要組培室，超凈臺(tái)等設(shè)備，并且植株受病蟲害、菌污染幾率小， 營(yíng)養(yǎng)成分方便控制；
7.本方法適用于不同大豆基因型，都能獲得較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率。


圖1 水培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)圖
A 氣泵通氣管；B 植株支架；C 固定漂浮板；D 保濕膜；E 水培箱；F 遮光布圖2:草丁膦抗性表現(xiàn)圖3 Bar引物(403bp)擴(kuò)增電泳部分結(jié)果
M: 2000plusII; 1:質(zhì)粒；2:陰性對(duì)照；3:水對(duì)照；4-16: PPT (phosphinothricin，草丁膦)陽(yáng)性植株圖4: Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因植株 1 質(zhì)粒，2 非轉(zhuǎn)基因，3-4 轉(zhuǎn)基因植株圖5 =Real-Time PCR檢測(cè)T2代(轉(zhuǎn)基因第二代)基因表達(dá)圖6 利用PPT (草丁膦)篩選陽(yáng)性植株圖7 Bar引物(403bp)擴(kuò)增電泳部分結(jié)果M: DL15000; 1-45: PPT (phosphinothricin，草丁膦)陽(yáng)性植株；46 水對(duì)照；47:質(zhì)粒；48:陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式材料和方法
補(bǔ)充培養(yǎng)基成分
MS (Murasbige和Skoog)基本培養(yǎng)基調(diào)至ρΗ5· 8 ； MSl :1/4MS ；
MS2 :1/2MS+1. 67mg/L 6BA+lg/L L-cys + 1. 58g/L Na2S203+l. 54g/L DTT+lOOuM AS+0. 5%o SILWET-77 ；
MS3 :l/2MS+2mg/L 6BA+0. 5%0 SILffET -77 ；
YEB =Beef extract (牛肉浸膏)5g/L ;Yeast extract (酵母膏)lg/L ;P印tone (蛋白胨)5g/L ；Sucrose (蔗糖)5g/L ；MgS04 · 7H20 (硫酸鎂)0. 04g/L ；pH 7. 4 實(shí)施例1
受體材料準(zhǔn)備挑取東農(nóng)50飽滿種子150粒，置于12cm培養(yǎng)皿中，上下各鋪雙層紗布， 加蒸餾水(約IOOml)剛好沒(méi)過(guò)種子，于25°C培養(yǎng)箱暗下催芽萌發(fā)，取3天已伸長(zhǎng)苗轉(zhuǎn)至加 MSl培養(yǎng)液的水培箱中(圖1)，25°C光照培養(yǎng)，2天后(子葉展開(kāi)前)用刀片小心去除頂芽及側(cè)芽，輕輕劃3-5道傷口后，輕輕將子葉合攏，將子葉下部1/2至下胚軸處用parafilm包好作為受體。農(nóng)桿菌制備將植物表達(dá)載體PCAMBIA3301-GmFB (用GmFB基因替換載體 PCAMBIA3301中的⑶S(β-glucuronidase，β -葡糖苷酸酶)產(chǎn)生)利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ΕΗΑ105、EHAlOl和LBA4404，獲得工程菌，所述農(nóng)桿菌的制備手段為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，另外宿主菌ΕΗΑ105、ΕΗΑ101和LBA4404為商業(yè)化菌株。侵染液準(zhǔn)備含有目的基因的工程農(nóng)桿菌在YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至0D_=0. 8時(shí)， 取30ml于4000rpm離心5min ；用50ml的MS2重懸，將制備好的菌液沿子葉縫隙滴入，用錫紙包好子葉，保濕培養(yǎng)3天。芽誘導(dǎo)階段去除錫紙，每天在傷口處滴加MS3芽誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)新芽的分化生長(zhǎng)， 分化的生長(zhǎng)點(diǎn)處膨大，并不斷分化出不定芽。隨著不定芽的繼續(xù)生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)旺盛的芽開(kāi)始伸長(zhǎng)生長(zhǎng)?？剐灾Y選利用70mg/L的PPT (phosphinothricin,草丁膦)對(duì)分化后伸長(zhǎng)芽的三出葉進(jìn)行涂抹，2-3天后觀察，葉片大面積失綠變黃的為不具有PTT抗性株表現(xiàn)(見(jiàn)圖2)， 用剪刀從基部去除陰性植株，直至篩選得到葉片無(wú)明顯變化的PPT抗性植株。PCR檢測(cè)PPT陽(yáng)性苗采用篩選標(biāo)記Bar ( 403bp)和目的基因GmFB雙重引物檢測(cè) PPT陽(yáng)性苗，電泳圖見(jiàn)圖3。引物序列如下
Bar sense: 5' GCGGTACCGGCAGGCTGAAG 3' Bar antisense: 5' CCGCAGGAACCGCAGGAGTG 3' 35S-GmFB- sense: 5' CCCGAGCAATAATCTCCAGG3' 35S-GmFB antisense 5' ATTCAACATACGCAGCAACT3，。移栽將PCR陽(yáng)性苗移至土壤中正常培養(yǎng)。TO代植株避免了傳統(tǒng)組培方式的繼代、再生根，獲得的植株更接近于實(shí)生苗，經(jīng)在土中正常培養(yǎng)結(jié)實(shí)率高。陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)經(jīng)過(guò)用上述兩種引物對(duì)陽(yáng)性枝進(jìn)行PCR檢測(cè)，最終從48株P(guān)PT抗性枝中鑒定出20株陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率為21. 1%，具體見(jiàn)表1、2。在進(jìn)行PPT篩選時(shí)，去除陰性植株，選取陽(yáng)性植株，獲得的PPT陽(yáng)性植株80%為第4、5個(gè)枝。若進(jìn)行無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因時(shí)，可去除首先長(zhǎng)出的不定芽，保留第4個(gè)以后的不定芽。Southern雜交鑒定T2代轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)X光片顯影結(jié)果顯示，基因以單拷貝和雙拷貝形式插入到基因組中，雜交結(jié)果見(jiàn)圖4
Real-Time PCR (實(shí)時(shí)熒光定量PCR)檢測(cè)T2代基因表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了 9 株T2代植株的基因表達(dá)情況，6株基因表達(dá)豐度顯著增加，結(jié)果表明基因已經(jīng)整合到基因組中并穩(wěn)定表達(dá)，實(shí)時(shí)定量結(jié)果見(jiàn)圖5。表1轉(zhuǎn)化過(guò)程中的不同時(shí)期數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因方法，其步驟如下(1)將萌發(fā)的大豆種子移入水培養(yǎng)箱中保濕光照培養(yǎng)，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染液對(duì)大豆傷口處理的生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行侵染；(2)侵染后包住子葉使其避光保濕共培養(yǎng)；(3)見(jiàn)光后每天或隔天滴加芽誘導(dǎo)液于子葉節(jié)部位保濕培養(yǎng)約1-2周分化不定芽；(4)篩選獲得陽(yáng)性芽，移栽土壤后繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，收獲種子；步驟(1)- (3)在水培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述大豆為合豐35、合豐45、合豐55、黑河 38、黑河48、黑農(nóng)44、黑農(nóng)48、黑農(nóng)51、綏農(nóng)沘、墾豐16、東農(nóng)44、東農(nóng)47、東農(nóng)48、東農(nóng)53、 東農(nóng)50、東農(nóng)8004中任——種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌侵染液采用MS2培養(yǎng)基，其組成如下(L) 50% MS, 1. 67mg 6 芐基腺嘌呤，Ig L-cys, 1. 58 g Na2S2O3,1. 54g 二硫蘇糖醇， IOOuM乙酰丁香酮，0. 5%。表面活性劑SILWET-77。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述芽誘導(dǎo)液采用MS3培養(yǎng)基，其組成如下 (L) :50%MS,2mg 6芐基腺嘌呤，0.5%。表面活性劑SILWET -77。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述水培養(yǎng)箱由水培容器、通氣裝置、植株固定裝置、保濕裝置和避光裝置組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，芽誘導(dǎo)液的施用時(shí)間是從共培養(yǎng)結(jié)束后至篩選出陽(yáng)性伸長(zhǎng)枝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，避光保溫培養(yǎng)時(shí)間為3天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，篩選物質(zhì)含有表面活性劑SILWET-77。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，具體步驟如下(1)水培法轉(zhuǎn)化體系選取飽滿的大豆種子，于暗下25°C萌發(fā)，3天后移入水培箱中保濕光照培養(yǎng)，2天后去除頂芽及側(cè)芽，并沿脈絡(luò)劃3-5道傷口，將兩片子葉合攏用paraf ilm 膜包住子葉下1/2至下胚軸處，用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染液滴入兩片子葉縫隙中進(jìn)行侵染；(2)水培法共培養(yǎng)步驟侵染后用錫紙罩住子葉使其避光培養(yǎng)3天，在水培箱中 20-25°C保濕培養(yǎng)，3天后去除錫紙；(3)水培法芽誘導(dǎo)步驟每天或隔天滴加芽誘導(dǎo)液于子葉節(jié)部位，在水培箱中20-25°C 保濕培養(yǎng)約1-2周分化不定芽；(4)陽(yáng)性芽篩選a)有選擇標(biāo)記載體的鑒定利用一定濃度篩選標(biāo)記物質(zhì)涂抹伸長(zhǎng)芽的葉片，2-3天去除陰性不定芽，直至篩選出陽(yáng)性伸長(zhǎng)芽；然后連根整體移入土中正常培養(yǎng)；b)無(wú)選擇標(biāo)記載體的鑒定去除每株首先伸長(zhǎng)的3個(gè)不定芽，留取第4個(gè)不定芽，連根整體移入土中正常培養(yǎng)；(5)PCR鑒定提取陽(yáng)性伸長(zhǎng)枝的葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定。
全文摘要
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在液體培養(yǎng)條件下，利用農(nóng)桿菌對(duì)萌發(fā)的大豆種子進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、芽誘導(dǎo)、篩選，利用篩選物質(zhì)去除陰性枝，獲得T0代陽(yáng)性枝，繼續(xù)培養(yǎng)后收獲種子。本發(fā)明縮短了轉(zhuǎn)化周期，獲得轉(zhuǎn)基因當(dāng)代種子僅需3-4個(gè)月，并且提高了轉(zhuǎn)化效率，T0代轉(zhuǎn)化效率高達(dá)15-34%。同時(shí)，本方法適用于不同大豆品種資源或基因型，都能產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102181479SQ20111005915
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月14日
發(fā)明者李文濱, 李永光, 趙琳 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)