專利名稱：Rt-lamp檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)與醫(yī)學領(lǐng)域，更具體的說，涉及RT-LAMP恒溫基因擴增的方法在快速檢測人體血衆(zhòng)/清或其他體液中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的有無以及半定量檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop—mediatedisothermal amplifieation, LAMP)是2000年Notomi等發(fā)明的體外等溫擴增特異核酸片段的技木。該技術(shù)利用針對基因序列中6個特異性片段的兩對特殊引物和有鏈置換活性的Bst (Bacillus stearotherrnophilus)DNA聚合酶，使模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，在60-65°C恒溫條件下使引物與模板結(jié)合并進行鏈置換擴增反應(yīng)。LAMP可以在60分鐘內(nèi)擴增出IO9 IOltl倍靶序列拷貝，結(jié)果可用直觀的熒光或電泳檢測，也可用焦磷酸鎂濁度法檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)起始于DNA的擴增，適用于DNA基因組的檢測。隨后，檢測RNA基因組的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)擴增技術(shù)也被提出，即是在LAMP擴增之前加上反轉(zhuǎn)錄步驟。目前，已有甲型流感病毒、豬瘟病毒等多種RNA病毒的RT-LAMP擴增方法被提出。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒HCV引起的嚴重危害健康的感染性疾病。目前，對于HCV的檢測主要依靠免疫學方法即抗體的檢測，這種方法實際檢測的是被感染者對于感染的免疫反應(yīng)情況。對于HCV載量的檢測，目前主要依賴Realtime-PCR技術(shù)，該技術(shù)需要定量PCR儀等昂貴設(shè)備，難以在基層及現(xiàn)場開展。將RT-LAMP技術(shù)用于HCV的測定已有相關(guān)報道，目前技術(shù)方法的結(jié)果判斷有實時法和終點法，實時法需要使用定量PCR儀；終點法主要面臨非特異擴增的問題?，F(xiàn)有的HCV載量檢測技術(shù)的主要不足是能夠?qū)崿F(xiàn)較精確定量的Realtime-PCR等方法儀器設(shè)備要求、人員操作要求高；而現(xiàn)有的RT-LAMP方法主要是以終點法進行檢測，無法實現(xiàn)對于HCV載量的定量，且對于體系污染等假陽性缺乏監(jiān)測，影響了這些方法的實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，可以實現(xiàn)人體血漿/清或其他體液中丙型肝炎病毒的快速半定量和定性檢測。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案=RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，包括以下步驟
(I)選取HCV的特異性基因片段用于LAMP擴增；(2)用于HCV基因擴增的結(jié)果判斷；步驟(I)中用于HCV基因擴增的特異性引物為
F3 GCAGAAAGCGTCTAGCCA ； B3 CTCGCAAGCACCCTATCA ；
FIP TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCC ；BIP TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA ；
用于HCV基因擴增的體系為ニ步法或者一歩法； 步驟(2)中在檢測時使用Sybgreen染液實時觀察，加入梯度濃度的標準品以及陰性血清對照，在紫外燈下每5分鐘對標準品、對照及待測樣本直接觀察，即可獲得待測樣本的HCV載量。所述ニ步法第一步反轉(zhuǎn)錄的體系為總體積20 U I ;其中10XAMV緩沖液2 ii I,HCVRNA 模板 2 ii 1，AMV 酶 Iii I, dNTP 2u 1，其中 dATP、dlTP、dCTP、dGTP 濃度各 10 mM，引物 B3
1u 1，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 y I ;
ニ步法第一步反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為50°C 30分鐘；
ニ步法第二步擴增的體系為總體積20iU ;其中IOXBst DNA pol大片段緩沖液
2iil，第一步反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物 2 iil，Bst DNA pol 大片段 I iil，dNTP 4 yl，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 濃度各 10 mM,引物 F3、B3 各 0. 1，引物 FIP、BIP 各 2 y 1，IOOXSybgreen2 U 1，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 y I ;
ニ步法第二步擴增的反應(yīng)條件為62°C 60-80分鐘，每5分鐘在紫外燈下觀察一次結(jié)果。所述ー步法的體系為總體積20 U I ;其中IOXBst DNA pol大片段緩沖液2 yl，HCV RNA 模板 2 ii 1，AMV 酶 I ii 1，Bst DNA pol 大片段 I ii 1，dNTP 4u 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 濃度各 10 mM，引物 F3、B3 各 0. 1，引物 FIP、BIP 各 2 y 1，IOOXSybgreen2 U 1，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 y I ;
ー步法的反應(yīng)條件為50°C 20分鐘；62°C 60-80分鐘，每5分鐘在紫外燈下觀察一次結(jié)果。LAMP擴增的溫度為60 V -650C，優(yōu)選為62°C。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明公開的技術(shù)方案實現(xiàn)了 RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的新的應(yīng)用，對于硬件設(shè)備的要求低，不需要PCR儀、定量PCR儀、電泳儀、成像儀等設(shè)備，僅需水浴箱和紫外燈即可，操作簡便快捷，適用于現(xiàn)場或基層檢測。本實驗方法既可以用于定性檢測(一歩法)HCV病毒的有無，也可以用于HCV病毒載量的初歩判斷(ニ步法半定量)。本實驗方法使用Sybgreen染液實時觀察，結(jié)果判斷方便快速，且可以有效監(jiān)測可能存在的LAMP反應(yīng)的污染或假陽性結(jié)果。


圖I為常規(guī)Real-time PCR的檢測結(jié)果。圖2為使用定量PCR儀檢測的RT-LAMP的檢測結(jié)果。圖3為RT-LAMP反應(yīng)40分鐘產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖4為RT-LAMP反應(yīng)60分鐘產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖5為60分鐘時的直接目測結(jié)果，其中上為白光照射，下為紫外光照射。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實施例一快速檢測丙型肝炎病毒載量的RT-LAMP檢測方法。
I、選取HCV的特異性基因片段用于LAMP擴增。目前，已經(jīng)完成基因組測序的HCV主要有6型，這6型也是目前最主要的HCV流行株。因此，為了實現(xiàn)對這些主要的不同型別的HCV載量進行檢測，就必須選取不同型別HCV的保守基因片段以供擴增。應(yīng)用DNAMAN等軟件對不同型別的HCV進行比較，選定5-UTR區(qū)域作為HCV的候選基因擴增區(qū)域。II、用于HCV基因擴增的特異性引物。在本方案中，用于HCV基因擴增的特異性引物為
F3 GCAGAAAGCGTCTAGCCA B3 CTCGCAAGCACCCTATCA
FIP TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCCBIP :TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA。III、用于HCV基因擴增的體系和反應(yīng)條件(ニ步法、ー步法)。本方案中，HCV基因擴增可由ニ步法或一步法進行。ニ步法第一步反轉(zhuǎn)錄的體系為總體積20 U I ;其中10XAMV緩沖液2 ii I,HCV RNA模板2 u 1(抽提自血清等體液，常規(guī)酚-氯仿法或者病毒RNA試劑盒抽提均可)，AMV酶I yl(20 單位)，dNTP 2 ill (dATP、dlTP、dCTP、dGTP 濃度各 10 mM)，引物 B3 I y 1，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 U I。ニ步法第一步反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為50°C 30分鐘。ニ步法第二步擴增的體系為總體積20 U I ;其中IOXBst DNA pol大片段緩沖液
2ii I，第一步反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物 2 iil，Bst DNA pol 大片段 I iil(8 單位)，dNTP 4 yl( dATP、dTTP、dCTP、dGTP 濃度各 10 mM),引物 F3、B3 各 0. 5 y 1，引物 FIP、BIP 各 2 y 1，IOOXSybgreen2u I，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20y I。ニ步法第二步擴增的反應(yīng)條件為62°C 60-80分鐘，每5分鐘在紫外燈下觀察ー
次結(jié)果。ー步法的體系為總體積20 U I ;其中IOXBst DNA pol大片段緩沖液2 yl，HCVRNA模板2 u I (抽提自血清等體液，常規(guī)酚-氯仿法或者病毒RNA試劑盒抽提均可)，AMV酶I u I (20 單位)，Bst DNA pol 大片段 I ii I (8 單位)，dNTP 4u I (dATP、dTTP, dCTP、dGTP濃度各10 mM)，引物F3、B3各0.5111，引物卩1 、81卩各2111，100\37ゎ8代611 2yl，補足DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 U I。ー步法的反應(yīng)條件為50°C 20分鐘；62°C 60-80分鐘，每5分鐘在紫外燈下觀察
一次結(jié)果。IV、用于HCV基因擴增的結(jié)果判斷。對于HCV基因擴增的結(jié)果判斷，目前常用的Realtime-PCR方法需要專用設(shè)備，而RT-LAMP方法又多為終點法。本方案將通常最終濃度為IX的Sybgreen染液濃度擴大到10X，以有效増加目測的靈敏度，每隔5分鐘觀察一次結(jié)果，可以根據(jù)目測熒光判斷待測樣本中HCV的有無，附以梯度稀釋的標準品后，可以初步判斷HCV載量(半定量)。同時由于一步法RT-LAMP檢測有一定的假陽性率，本方案在實驗工程中加入陰性樣本對照，可以有效控制終點法結(jié)果觀測的假陽性率。
附圖為HCV載量檢測方法的結(jié)果判斷，圖I為常規(guī)Real-time PCR的檢測結(jié)果；圖2為使用定量PCR儀檢測的RT-LAMP的檢測結(jié)果；圖3、圖4為RT-LAMP反應(yīng)40和60分鐘產(chǎn)物的電泳結(jié)果，可見對不同濃度的HCV樣本可以實現(xiàn)半定量；圖5為60分鐘時的直接目測結(jié)果(上為白光照射，下為紫外光照射)。從圖3、圖4可以看出，RT-LAMP對于不同濃度的HCV樣本可以實現(xiàn)半定量，但隨著反應(yīng)時間的延長，在圖4的低濃度樣本條帶中，可見到非特異性的擴增。由于LAMP反應(yīng)是在60-65°C (本方案優(yōu)選62°C )下進行等溫擴增，整個體系中的DNA鏈處于不穩(wěn)定狀態(tài)，因此隨著反應(yīng)時間延長，極易產(chǎn)生非特異性擴增導(dǎo)致假陽性。因此本方案的檢測中加入陰性對照并每隔5分鐘觀察一次熒光結(jié)果，可以有效降低非特異性擴增對結(jié)果判斷的影響。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾， 這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，包括以下步驟 (I)選取HCV的特異性基因片段用于LAMP擴增；(2)用于HCV基因擴增的結(jié)果判斷；其特征在干， 步驟(I)中用于HCV基因擴增的特異性引物為F3 GCAGAAAGCGTCTAGCCA ；B3 CTCGCAAGCACCCTATCA ；FIP TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCC ；BIP TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA ； 用于HCV基因擴增的體系為ニ步法或者一歩法； 步驟(2)中在檢測時使用Sybgreen染液實時觀察，加入梯度濃度的標準品以及陰性血清對照，在紫外燈下每5分鐘對標準品、對照及待測樣本直接觀察，即可獲得待測樣本的HCV載量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，其特征在于，所述ニ步法第一步反轉(zhuǎn)錄的體系為總體積20μ I ;其中IOXAMV緩沖液.2 μ 1，HCV RNA 模板 2 μ 1，AMV 酶 I μ 1，dNTP 2 μ 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 濃度各 10mM，引物 B3 I μ I，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 μ I ； ニ步法第一步反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為50°C，反應(yīng)30分鐘； ニ步法第二步擴增的體系為總體積20 μ I ;其中IOXBst DNA pol大片段緩沖液.2 μ 1，第一步反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物 2 μ 1，Bst DNA pol 大片段 I μ 1，dNTP 4μ 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 濃度各 10 mM,引物 F3、B3 各 O. 5μ 1，引物 FIP、BIP 各 2 μ 1，IOOXSybgreen.2 μ 1，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 μ I ; ニ步法第二步擴增的反應(yīng)條件為62°C，反應(yīng)60-80分鐘，每5分鐘在紫外燈下觀察ー次結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，其特征在于，所述ー步法的體系為總體積20μ I ;其中IOXBst DNA pol大片段緩沖液.2 μ 1，HCV RNA 模板 2 μ 1，AMV 酶 I μ 1，Bst DNA pol 大片段 I μ 1，dNTP 4 μ 1，其中 dATP、dTTP、dCTP、dGTP濃度各 10 mM，引物F3、B3 各 O. 5 μ 1，引物FIP、BIP各 2 μ I, IOOXSybgreen.2 μ 1，補足 DNAse、RNAse 酶 Free 水至 20 μ I ; ー步法的反應(yīng)條件為50°C，反應(yīng)20分鐘；62°C，反應(yīng)60-80分鐘，每5分鐘在紫外燈下觀察一次結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，其特征在于，LAMP擴增的溫度為60°C -65°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，其特征在于，LAMP擴增的溫度為62°C。
全文摘要
本發(fā)明公開RT-LAMP檢測方法在快速檢測丙型肝炎病毒載量中的應(yīng)用，包括以下步驟(1)選取HCV的特異性基因片段用于LAMP擴增；(2)用于HCV基因擴增的結(jié)果判斷；用于HCV基因擴增的體系為二步法或者一步法；步驟(2)中在檢測時使用Sybgreen染液實時觀察，加入梯度濃度的標準品以及陰性血清對照，在紫外燈下每5分鐘對標準品、對照及待測樣本直接觀察，即可獲得待測樣本的HCV載量。本發(fā)明對于硬件設(shè)備的要求低，操作簡便快捷，適用于現(xiàn)場或基層檢測，且本發(fā)明既可以用于定性檢測HCV病毒的有無，也可以用于HCV病毒載量的初步判斷。
文檔編號C12Q1/68GK102649981SQ201110045349
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者李擎天, 熊慧, 王穎, 郭曉奎, 金維榮 申請人:上海交通大學醫(yī)學院