專(zhuān)利名稱(chēng)：組合工程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之領(lǐng)域。其系關(guān)于核糖體RNA(rRNA)表達(dá)增加之生產(chǎn)宿主細(xì)胞系，該種增加系透過(guò)引入編碼UBF之核酸或減少NoCR蛋白質(zhì)(尤其系TIP-5)表達(dá)而達(dá)成。該等細(xì)胞系具有比對(duì)照細(xì)胞系改善之分泌及生長(zhǎng)特性。
背景技術(shù)：
篩選出哺乳動(dòng)物高效生產(chǎn)者細(xì)胞系仍然為生物醫(yī)藥制造工業(yè)中之主要挑戰(zhàn)。自 DNA至產(chǎn)物翻譯之過(guò)程為限制哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞系之比生產(chǎn)率之主要瓶頸。細(xì)胞能夠上調(diào)蛋白質(zhì)合成速率，其系藉由增加已存在之核糖體之翻譯效力，或透過(guò)生成新的核糖體 (核糖體生物合成)而使翻譯能力增加。由于約80%之核轉(zhuǎn)錄總量系用于合成核糖體 RNA(rRNA)，因此核糖體生物合成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞之其中一種主要新陳代謝活動(dòng)。核糖體組裝發(fā)生于核內(nèi)，且需要四種rRNA05S前rRNA，其隨后加工成18S、5. 8S、28S及5S rRNA)及約80種核糖體蛋白質(zhì)(r-蛋白質(zhì))之協(xié)同表達(dá)。45S前rRNA系于核內(nèi)由聚合酶I (Pol I) 轉(zhuǎn)錄，5S RNA系于核周邊由Pol III轉(zhuǎn)錄且隨后進(jìn)入核內(nèi)，且r-蛋白質(zhì)系由PolII轉(zhuǎn)錄。 因此，核糖體生物合成需要在不同隔室由不同聚合酶進(jìn)行一系列轉(zhuǎn)錄。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中之該等過(guò)禾呈大體上未知(Santoro,R.及Grummt,I. (2001). Molecular mechanisms mediating methyIation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Mol Cell 8, 719-725)。45S前rRNA之轉(zhuǎn)錄為核糖體生物合成之關(guān)鍵步驟。哺乳動(dòng)物單倍體基因組包含約 200個(gè)核糖體RNA基因，其中僅一部份于任一指定時(shí)間轉(zhuǎn)錄，而其余則保持沉默(Santoro， R.，Li，J.，及 Grummt, I. (2002). The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet. 32，393-396)?？筛鶕?jù)染色質(zhì)構(gòu)造區(qū)分活性及沉默基因活性基因具有常染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而沉默基因?yàn)楫惾旧|(zhì)的?；钚詒RNA基因之啟動(dòng)子無(wú)CpG甲基化，且系與乙?；M蛋白相連。沉默基因則相反。轉(zhuǎn)錄沉默rRNA基因之存在為合成rRNA及產(chǎn)生核糖體之限制因素。已經(jīng)建立假說(shuō)認(rèn)為細(xì)胞可藉由改變各基因之轉(zhuǎn)錄活性及/或藉由改變活性基因之?dāng)?shù)目而調(diào)節(jié)rDNA之轉(zhuǎn)錄水平。然而，在45S前rRNA合成水平與rRNA基因數(shù)目之間還未發(fā)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的相關(guān)性。 例如，于釀酒酵母(S. cerevisiae)中，使rRNA基因數(shù)目減少約三分之二不影響總rRNA生成。類(lèi)似地，含有不同rRNA拷貝數(shù)目之玉米自交系及非整倍體雞細(xì)胞顯示出相同的rRNA 轉(zhuǎn)錄水平。由于rDNA代表核糖體之主要組分，該等基因之沉默導(dǎo)致核糖體生物合成受到限制，且蛋白質(zhì)翻譯因此受到限制，故而最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少。于生物醫(yī)藥生產(chǎn)細(xì)胞中，其對(duì)細(xì)胞之完全生產(chǎn)能力構(gòu)成限制，其意指治療用蛋白質(zhì)產(chǎn)物之比生產(chǎn)率減少。因此會(huì)導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)工藝之總蛋白質(zhì)產(chǎn)量減少。除比生產(chǎn)率(PspJ以外之決定工藝產(chǎn)量(Y)之另一因素為IVC，即在產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)之時(shí)間內(nèi)的活細(xì)胞之積分值。該關(guān)系系由如下公式表示Y = P_。*IVC。因此，迫切需要增強(qiáng)宿主細(xì)胞之生產(chǎn)能力或藉由改善細(xì)胞生長(zhǎng)而增加生物反應(yīng)器中之活細(xì)胞密度，或最理想地，同時(shí)提高這兩個(gè)參數(shù)。發(fā)明概述本申請(qǐng)解決上述問(wèn)題，且顯示敲低TIP_5(NoRC(核仁重建復(fù)合物；McStay，B.及 Grummt, I. (2008). The epigenetics of rRNA genes from molecular to chromosome biology. Annu. Rev Cell Dev. Biol 24，131-157)之亞單位)可減少沉默rRNA基因之?dāng)?shù)目， 上調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)核糖體合成，并增加重組蛋白質(zhì)之生成。本申請(qǐng)解決上述問(wèn)題，且顯示引入轉(zhuǎn)錄因子UBF可上調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄，這可導(dǎo)致促進(jìn)核糖體合成、并增加重組蛋白質(zhì)之生成。本申請(qǐng)中之?dāng)?shù)據(jù)證實(shí)，能夠轉(zhuǎn)錄之rRNA基因之?dāng)?shù)目限制核糖體合成。后生遺傳工程處理核糖體RNA基因，為改善生物醫(yī)藥制造提供新的可能性，且提供了解主導(dǎo)翻譯機(jī)制之復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)之新觀點(diǎn)。本申請(qǐng)顯示，敲低TIP-5可誘發(fā)rDNA重復(fù)序列上之抑制性染色質(zhì)標(biāo)記喪失，促進(jìn) rDNA轉(zhuǎn)錄，改變核結(jié)構(gòu)，且促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖。TIP-5活性受乙酰轉(zhuǎn)移酶MOF (雄性最初缺失，males absent on the first)和脫乙?；窼IRTl (sirtuin-1)介導(dǎo)之可逆乙酰化控制。TIP-5于賴(lài)氨酸殘基(小鼠TIP-5 中之K633、人類(lèi)TIP-5中之K649)處之乙?；瘜?dǎo)致促進(jìn)結(jié)合rDNA基因、促進(jìn)異染色質(zhì)形成及rDNA沉默。相反，此賴(lài)氨酸殘基之突變(例如成精氨酸)導(dǎo)致減少rDNA甲基化及促進(jìn) rRNA轉(zhuǎn)錄(Zhou et al. (2009)Nat. Cell Biol.，(8)11 ；1010-1017)。突變此賴(lài)氨酸殘基或過(guò)表達(dá)攜帶該突變之TIP-5變體解決上文所述問(wèn)題，作為本發(fā)明之另一實(shí)施方案。特定言之，突變TIP-5此賴(lài)氨酸殘基與引入轉(zhuǎn)錄因子UBF的組合上調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄，其導(dǎo)致促進(jìn)核糖體合成和增加生成重組蛋白質(zhì)。為確定活性rRNA基因之?dāng)?shù)目增加是否會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖，我們藉由流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析數(shù)種shRNA-TIP5細(xì)胞。我們于本申請(qǐng)中首次令人驚奇地顯示，經(jīng)工程處理使沉默rRNA基因數(shù)目減少能與rRNA及核糖體之生產(chǎn)增加，且因此與哺乳動(dòng)物細(xì)胞之生產(chǎn)力提高相關(guān)。出人意料地，本申請(qǐng)還提供數(shù)據(jù)顯示，于不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中敲低TIP-5均導(dǎo)致細(xì)胞周期行進(jìn)加快且促進(jìn)細(xì)胞增殖。此發(fā)現(xiàn)系與先前技術(shù)(W02009/017670)中所述者相反。先前技術(shù)曾判定TIP-5 之功能為在全面miRNA篩選中作為Fas的由Ras介導(dǎo)之后生遺傳沉默效應(yīng)器(RESE) (W02009/017670)。已知Ras為參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤生成之致癌基因，其在人類(lèi)癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變或過(guò)表達(dá)。因此，先前技術(shù)認(rèn)為，減少諸如TIP-5之Ras效應(yīng)器的表達(dá)導(dǎo)致抑制細(xì)胞增殖。為了確認(rèn)此點(diǎn)，我們藉由流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析兩種shRNA_TIP5細(xì)胞。然而，如圖4A、B所示，shRNA-TIP-5細(xì)胞中處于S期之shRNA_TIP_5細(xì)胞的數(shù)目顯著高于對(duì)照細(xì)胞。 與該等結(jié)果一致，shRNA TIP5細(xì)胞中顯示，摻入至新生DNA的5-溴去氧尿苷(BrdU)增加， 且細(xì)胞周期蛋白A水平更高(圖4C)。此外，我們已比較shRNA-TIP5細(xì)胞、shRNA-對(duì)照細(xì)胞及親本NIH3T3及CH0-K1 細(xì)胞之間細(xì)胞增殖速率(圖4D、F)。令人驚奇地出現(xiàn)與先前技術(shù)報(bào)導(dǎo)相反之結(jié)果，即表達(dá)miRNA-TIP5序列的NIH/3T3及CHO-Kl細(xì)胞的增殖速率皆比對(duì)照細(xì)胞更快。因此，沉默rRNA 基因數(shù)目減少確實(shí)影響細(xì)胞之新陳代謝。令人驚奇地，本發(fā)明顯示，消減TIP5且因此導(dǎo)致 rDNA沉默降低，可加強(qiáng)細(xì)胞增殖。本申請(qǐng)證實(shí)，消減TIP-5之細(xì)胞中之蛋白質(zhì)生成顯著高于對(duì)照細(xì)胞系(參見(jiàn)實(shí)施例6及以下，圖6)。消減TIP-5之細(xì)胞中之蛋白質(zhì)生成比對(duì)照細(xì)胞系高2倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高6倍以上、高10倍以上、在2-10倍之間。該等數(shù)據(jù)顯示，消減TIP-5會(huì)增加異源性蛋白質(zhì)生成。本申請(qǐng)顯示，減少沉默rRNA基因數(shù)目會(huì)促進(jìn)核糖體合成，并提高細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)之潛力。于本發(fā)明中，我們提供一種藉由減少TIP-5及/或過(guò)表達(dá)UBF而促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄、 核糖體生物合成及翻譯的新穎方法，其效益為最終促進(jìn)重組蛋白質(zhì)分泌。此外，我們證實(shí)，TIP-5消減導(dǎo)致細(xì)胞周期行進(jìn)加快，且改善細(xì)胞生長(zhǎng)?；蛘撸高^(guò)抑制TIP-5乙?；?，例如藉由過(guò)表達(dá)不能被SIRTl乙酰化之TIP-5突變體或藉由刪除內(nèi)源性TIP-5基因內(nèi)之乙?；荏w位點(diǎn)可達(dá)成相同效果。本發(fā)明之一項(xiàng)特定實(shí)施方案為不能被SIRTl乙酰化之TIP-5突變體或刪除內(nèi)源性 TIP-5基因內(nèi)之乙?；荏w位點(diǎn)，二者較佳與引入轉(zhuǎn)錄因子UBF組合。這導(dǎo)致rRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)，然后導(dǎo)致促進(jìn)核糖體合成和增加重組蛋白質(zhì)生成。一種特別合適的TIP-5突變體為具有小鼠TIP-5中之K633或人類(lèi)TIP-5中之K649賴(lài)氨酸殘基處之突變的TIP-5。改善細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)生物醫(yī)藥生產(chǎn)工藝之許多方面具有深遠(yuǎn)影響-細(xì)胞生成時(shí)間縮短，導(dǎo)致細(xì)胞系開(kāi)發(fā)之時(shí)間線(xiàn)縮短。生成時(shí)間較佳少于M小時(shí)， 較佳20至M小時(shí)，更佳15至M小時(shí)或15至22小時(shí)，最佳10至M小時(shí)。-單細(xì)胞克隆之后之效力增加，且此后之生長(zhǎng)更快速。-擴(kuò)大規(guī)模期間之時(shí)間范圍縮短，尤其于大規(guī)模生物反應(yīng)器中接種體的情況。-由于IVC與產(chǎn)物產(chǎn)量之間具有成比例之相關(guān)性，隨每單位發(fā)酵時(shí)間之產(chǎn)物產(chǎn)量增加。相反，小的IVC導(dǎo)致產(chǎn)量較小及/或發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)。產(chǎn)量較佳增加10%，更佳增加 20%，最佳增加30%。此舉使得基于真核細(xì)胞之生產(chǎn)工藝的蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加。因此，降低該等工藝之生產(chǎn)成本，且同時(shí)使為了產(chǎn)生供研究、診斷、臨床研究或市場(chǎng)供應(yīng)治療用蛋白質(zhì)所需材料而需制造的生產(chǎn)批數(shù)減少。此外，本發(fā)明加快藥物開(kāi)發(fā)，因?yàn)楫a(chǎn)生供臨床前研究之足量材料通常成為與時(shí)間線(xiàn)相關(guān)之一套重要工作。本發(fā)明可用于改善所有用于產(chǎn)生一種或數(shù)種特定蛋白質(zhì)之真核細(xì)胞之性質(zhì)，該等蛋白質(zhì)系供診斷目的、研究目的(標(biāo)靶鑒定、先導(dǎo)鑒定、先導(dǎo)優(yōu)化)、或供制造用于出售或臨床開(kāi)發(fā)之治療用蛋白質(zhì)。由本發(fā)明提供之細(xì)胞系/宿主細(xì)胞有助于增加基于真核細(xì)胞之生產(chǎn)工藝的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。其降低該等工藝之生產(chǎn)成本，且同時(shí)減少為了產(chǎn)生供研究、診斷、臨床研究或市場(chǎng)供應(yīng)治療用蛋白質(zhì)所需要產(chǎn)生之材料而需制造之生產(chǎn)批數(shù)。此外，本發(fā)明加快藥物開(kāi)發(fā)，因?yàn)楫a(chǎn)生供臨床前研究之足量材料通常成為與時(shí)間
線(xiàn)相關(guān)之一套重要工作。TIP-5表達(dá)減少及/或UBF水平升高之優(yōu)化宿主細(xì)胞系可用于產(chǎn)生一種或多種特定蛋白質(zhì)，供用于診斷目的、研究目的(標(biāo)靶鑒定、先導(dǎo)鑒定、先導(dǎo)優(yōu)化)，或用于制造供出售或臨床開(kāi)發(fā)之治療用蛋白質(zhì)。其同樣可應(yīng)用于表達(dá)或產(chǎn)生共享相同分泌途徑且同樣于脂質(zhì)囊泡中運(yùn)送的分泌型或膜結(jié)合型蛋白質(zhì)，諸如表面受體、GPCR、金屬蛋白酶或受體激酶。該等蛋白質(zhì)隨后可用于研究目的，其致力于細(xì)胞表面受體之功能表征，例如用于產(chǎn)生及隨后純化、結(jié)晶及/或分析表面蛋白質(zhì)。其對(duì)開(kāi)發(fā)新穎之人類(lèi)藥物療法非常重要，因?yàn)榧?xì)胞表面受體為主要類(lèi)型之藥物標(biāo)靶。此外，其有利于研究與細(xì)胞表面受體相關(guān)之細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，或分析部分藉由可溶性生長(zhǎng)因子與其在相同細(xì)胞或另一細(xì)胞上之對(duì)應(yīng)受體的相互作用所介導(dǎo)之細(xì)胞-細(xì)胞-交流(communication)。


圖1 于嚙齒動(dòng)物及人類(lèi)細(xì)胞系中敲低TIP-5(A、B)針對(duì)(A)穩(wěn)定表達(dá) shRNA-TIP5-l 及 TIP5-2 序列之 NIH/3T3 細(xì)胞中及(B) 穩(wěn)定表達(dá)miRNA-TIP5-l及TIP5-2序列之HEI^93T細(xì)胞中之TIP5mRNA所進(jìn)行之qRT-PCR。 數(shù)據(jù)系針對(duì)GAPDH mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。(c)針對(duì)穩(wěn)定之 shRNA-TIP5-l/2NIH/3T3、miRNA-TIP5-l/2HEK293T 及 miRNA-TIP5-l/2CH0-Kl 細(xì)胞中之 TIP5mRNA 所進(jìn)行之半定量 RT-PCR。出示 GAPDH mRNA 之 qRT-PCR作為對(duì)照。圖2 敲低TIP-5導(dǎo)致rDNA甲基化減少 (A-C)消減TIP5使rDNA啟動(dòng)子之CpG甲基化減少。上圖包括所分析之HpaII (H) 位點(diǎn)的㈧小鼠、(B)人類(lèi)及(C)中國(guó)倉(cāng)鼠之rDNA啟動(dòng)子區(qū)域的圖。黑色圓點(diǎn)指示CpG 二核苷酸。箭頭表示用于擴(kuò)增被HpaII消化之DNA的引物。下圖于穩(wěn)定表達(dá)shRNA-及/或miRNA TIP5-1/2及對(duì)照序列的(A)NIH/3T3、(B) HEK293T及(C)CHO-Kl細(xì)胞中所測(cè)定rDNA CpG甲基化水平。數(shù)據(jù)表示HpaII抗性rDNA之量，其已利用涵蓋缺少HpaII位點(diǎn)之DNA序列之引物及未消化之DNA進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算總rDNA 量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。(D、E)消減TIP5減少rDNA CpG甲基化水平。分析(D)rDNA基因間及啟動(dòng)子區(qū)域，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)，及(E)編碼區(qū)內(nèi)之兩個(gè)區(qū)域。圖示代表單個(gè)小鼠rDNA重復(fù)序列及所分析之HpaII (H)位點(diǎn)。箭頭表示用于擴(kuò)增被HpaII消化之DNA的引物。數(shù)據(jù)表示 HpaII抗性rDNA之量，其已利用涵蓋缺少HpaII位點(diǎn)之DNA序列之引物及未消化之DNA進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算總rDNA來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。圖3 敲低TIP-5之細(xì)胞中之rRNA水平增加(A)消減TIP5促進(jìn)rRNA合成。穩(wěn)定之NIH/3T3及HEK293T細(xì)胞系中基于qRT-PCR 之45S前rRNA水平已針對(duì)GAPDH mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。(B)經(jīng)過(guò)相同暴露時(shí)間之后，于原位摻入BrUTP，檢測(cè)rDNA轉(zhuǎn)錄。于消減TIP-5之細(xì)胞中BrUTP信號(hào)(左圖)較強(qiáng)，且可于核中特異性檢測(cè)到(由相差影像(右圖)所示核內(nèi)之較暗區(qū)域)。圖4 消減TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)增殖及細(xì)胞生長(zhǎng)(A) shRNA TIP5 細(xì)胞之 FACS 分析(B)處于各細(xì)胞周期階段之細(xì)胞百分比。于消減TIP5之細(xì)胞中，處于S期之細(xì)胞的數(shù)目或百分比增加，而處于Gl期之細(xì)胞的數(shù)目或百分比減少。增殖加強(qiáng)。(C) BrdU摻入測(cè)定法。細(xì)胞與10 μ M BrdU 一起溫育30min，利用針對(duì)BrdU之抗體染色，并估測(cè)處于S期之細(xì)胞百分比。BrdU測(cè)定法顯示TIP5細(xì)胞中之DNA合成增加。(D-F)穩(wěn)定表達(dá) miRNA-TIP5 及對(duì)照序列之(D)NIH/3T3、(E)HEK293T 及(F) CHO-Kl細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)證實(shí)，消減TIP-5之細(xì)胞之生長(zhǎng)至少與對(duì)照細(xì)胞一樣快 (HEK293)，或甚至比對(duì)照細(xì)胞更快(NIH3T3及CH0-K1)。圖5 敲低TIP-5之細(xì)胞的核糖體分析(A-C) (A)穩(wěn)定之 NIH/3T3、(B)HEK293T 及(C)CHO-Kl 細(xì)胞中之細(xì)胞質(zhì) RNA/ 細(xì)胞的相對(duì)量。數(shù)據(jù)表示一式三份進(jìn)行之兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。(D)穩(wěn)定之HEK293T的核糖體曲線(xiàn)及(E)CHO-Kl 細(xì)胞系。敲低TIP5之細(xì)胞含有更多核糖體。圖6 敲低TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)產(chǎn)生受體蛋白質(zhì)(A-C)經(jīng)組成性SEAP表達(dá)載體pCAG_SEAP工程處理之(A)穩(wěn)定之NIH/3T3、(B) HEK293T及(C)CHO-Kl細(xì)胞系的SEAP表達(dá)。(D、E)經(jīng)組成性螢光素酶表達(dá)載體pCMV-螢光素酶工程處理之⑶穩(wěn)定之 NIH/3T3及(E)HEK293T細(xì)胞系的螢光素酶表達(dá)。圖7 過(guò)表達(dá)UBF促進(jìn)rRNA合成(A, B)表達(dá)漸增量之 UBF (pCMV-UBF)后(A)HEI^93T 和(B)HeLa 中 45SrRNA 水平之qRT-PCR。rRNA水平系針對(duì)GAPDH mRNA數(shù)量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。發(fā)明詳述TIP-5 之敲低為了工程處理細(xì)胞，使其增加合成重組蛋白質(zhì)，我們需決定減少沉默rRNA基因數(shù)目是否會(huì)增加45S前rRNA合成，且因此亦刺激核糖體生物合成，并增加能夠翻譯之核糖體之?dāng)?shù)目。因此，我們利用特異針對(duì)TIP5之兩個(gè)不同區(qū)域(TIP5-1及TIP5D之shRNA/miRNA 序列進(jìn)行RNA干擾，敲低TIP5表達(dá)，并構(gòu)建經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因之表達(dá)shRNA之NIH/3T3或表達(dá) miRNA之HEK293T及CHO-Kl。使用表達(dá)混合shRNA及miRNA序列之穩(wěn)定細(xì)胞系作為對(duì)照。 利用表達(dá)shRNA-TIP5或miRNA-TIP5序列之質(zhì)粒產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系而不是進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有兩個(gè)理由。第一，諸如CpG甲基化之抑制性后生遺傳學(xué)標(biāo)記之喪失為一種被動(dòng)機(jī)制，需要多次細(xì)胞分裂。第二，雖然可相對(duì)容易地轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，但是NIH/3T3及CHO-Kl細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效力差會(huì)妨礙隨后針對(duì)內(nèi)源性rRNA、核糖體水平及細(xì)胞生長(zhǎng)性質(zhì)之分析。為了確定所選擇克隆中敲低TIP5之效力，我們藉由逆轉(zhuǎn)錄酶所介導(dǎo)定量性及半定量性PCR測(cè)定TIP5mRNA 水平(圖1)。與對(duì)照細(xì)胞比較，NIH/3T3/shRNA-TIP5-l及-2細(xì)胞中之TIP5表達(dá)減少約 70-80% (圖1A)。在穩(wěn)定之HEK293T中，觀察到類(lèi)似的TIP5mRNA水平減少(圖1B)。僅可由半定量性PCR測(cè)得衍生自CHO-Kl之細(xì)胞中之TIP5mRNA水平(圖1C)，但其TIP5mRNA之減少類(lèi)似穩(wěn)定之NIH/3T3及HEK293T細(xì)胞的。該等結(jié)果證實(shí)，經(jīng)建立之細(xì)胞系含有低水平之 TIP5。敲低TIP-5導(dǎo)致rDNA甲基化減少小鼠rDNA啟動(dòng)子的CpG甲基化減少基本轉(zhuǎn)錄因子UBF之結(jié)合，且防止形成起始前復(fù)合物(Sani j, Ε. , Poortinga, G. , Sharkey, K. , Hung, S. , Holloway, Τ. P. , Quin, J. , Robb, Ε. , Wong, L. H. , Thomas, W. G. , Stefanovsky, V. , Moss, Τ. , Rothblum, L. , Hannan, K. Μ., McArthur,G. A. ,Pearson,R. B.,及Hannan, R. D. (2008). UBF levels determine the number of active ribosome RNA genes in mammals. J. Cell Biol 183,1259—1274)。于 NIH/3T3 細(xì)胞中，約40%至50%之rRNA基因含有CpG-甲基化序列，且呈轉(zhuǎn)錄沉默。人類(lèi)、小鼠及中國(guó)倉(cāng)鼠中之rDNA啟動(dòng)子之序列及CpG密度差異顯著。人類(lèi)之rDNA啟動(dòng)子含有23個(gè)CpG， 而小鼠及中國(guó)倉(cāng)鼠分別含有3個(gè)及8個(gè)CpG (圖2A-C)。為了證實(shí)敲低TIP5可影響rDNA沉默，我們測(cè)定CCGG序列中之meCpG量，以判定rDNA甲基化水平。以HpaII消化基因組DNA， 且利用涵蓋HpaII序列(CCGG)之引物進(jìn)行定量性實(shí)時(shí)PCR，測(cè)定對(duì)消化之抗性(亦即CpG 甲基化)。在所有敲低TIP5之細(xì)胞系中，大部份rRNA基因中之啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)之CpG甲基化減少，證實(shí)TIP5對(duì)促進(jìn)rDNA沉默具有關(guān)鍵作用(圖2)。注意，雖然TIP5結(jié)合及重新甲基化局限于rDNA啟動(dòng)子序列內(nèi)，但是TIP-5減少之 NIH3T3細(xì)胞的整個(gè)rDNA基因(基因間、啟動(dòng)子及編碼區(qū)域；圖2D、E)的CpG甲基化量均減少，說(shuō)明一旦TIP5與rDNA啟動(dòng)子結(jié)合，其即啟動(dòng)在整個(gè)rDNA基因座建立沉默后生遺傳標(biāo)記的傳播機(jī)制。敲低TIP-5之細(xì)胞中之rRNA水平增加為了判定沉默基因數(shù)目之減少是否會(huì)影響rRNA轉(zhuǎn)錄物之量，我們藉由使用涵蓋第一 rRNA加工位點(diǎn)之引物之qRT-PCR(圖3A)且藉由活體內(nèi)BrUTP摻入(圖，測(cè)定45S 前rRNA合成。在兩個(gè)分析中皆測(cè)得，消減TIP5之NIH/3T3及HEK293T細(xì)胞的rRNA產(chǎn)生皆比對(duì)照細(xì)胞系高。消減TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)增殖及細(xì)胞生長(zhǎng)已知Ras為涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤形成之致癌基因，其在人類(lèi)癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變或過(guò)表達(dá)。Green等人，在W02009/017670中記載已鑒定TIP-5之功能為在全面miRNA篩選中作為Fas之由Ras所介導(dǎo)后生遺傳沉默效應(yīng)器(RESE)。該出版物記載，減少諸如TIP-5 之Ras效應(yīng)器之表達(dá)導(dǎo)致抑制細(xì)胞增殖。我們已藉由流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析兩種shRNA_TIP5細(xì)胞。如圖4A、B所示，兩種 shRNA-TIP5細(xì)胞中處于S期之細(xì)胞數(shù)目顯著高于對(duì)照細(xì)胞。NIH3T3細(xì)胞在感染逆轉(zhuǎn)錄病毒 (其表達(dá)針對(duì)TIP5序列之miRNA) 10天后，獲得類(lèi)似曲線(xiàn)。與該等結(jié)果一致，shRNA TIP5細(xì)胞顯示，新生DNA的5-溴脫氧尿苷(BrdU)摻入增加，且細(xì)胞周期蛋白A水平較高(圖4C)。最后，我們比較shRNA-TIP5、shRNA-對(duì)照及親本 NIH3T3、HEK293 及 CH0-K1 細(xì)胞之細(xì)胞增殖速率(圖4D-F)。令人驚奇地，與先前技術(shù)報(bào)導(dǎo)相反，表達(dá)miRNA-TIP5序列之 NIH/3T3及CH0-K1細(xì)胞二者的增殖速率比對(duì)照細(xì)胞快，說(shuō)明沉默rRNA基因數(shù)目之減少確實(shí)影響細(xì)胞新陳代謝。HEK293T中之TIP5消減并未顯著影響細(xì)胞增殖，此系因?yàn)樵摰燃?xì)胞已到達(dá)彼等之最大增殖速率。令人驚奇地，該等數(shù)據(jù)顯示，TIP5消減及隨之rDNA沉默之減少會(huì)加快細(xì)胞增殖。敲低TIP-5之細(xì)胞之核糖體分析于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，蛋白質(zhì)合成速率為與產(chǎn)量直接相關(guān)的重要參數(shù)。為了確定TIP5消減及隨之rDNA沉默之減少是否會(huì)增加細(xì)胞中能夠翻譯之核糖體之?dāng)?shù)目，我們首先測(cè)定細(xì)胞質(zhì)rRNA水平。在細(xì)胞質(zhì)中，大多數(shù)RNA系由組裝成核糖體之經(jīng)加工rRNA組成。
9如圖5A-C所示，所有消減TIP5之細(xì)胞系中之每一個(gè)細(xì)胞均含有更多之細(xì)胞質(zhì)RNA，說(shuō)明該等細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多核糖體。多核糖體曲線(xiàn)之分析亦顯示，消減TIP5之HEK293及CHO-Kl細(xì)胞所含有之核糖體亞單位G0S、60S及80 比對(duì)照細(xì)胞更多(圖5D)。敲低TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)產(chǎn)生受體蛋白質(zhì)為了確定消減TIP5及減少rDNA沉默是否會(huì)促進(jìn)異源性蛋白質(zhì)產(chǎn)生，我們以促進(jìn)組成性表達(dá)人類(lèi)胎盤(pán)分泌之堿性磷酸酶SEAP(pCAG-SEAP;圖6A-C)或螢光素酶(pCMV-螢光素酶；圖6D、Ε)之表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定之消減ΤΙΡ5之ΝΙΗ/3Τ3、ΗΕΚ293Τ及CHO-Kl衍生物。4 之后，定量蛋白質(zhì)生成，發(fā)現(xiàn)消減TIP5之細(xì)胞中之SEAP及螢光素酶生成皆比對(duì)照細(xì)胞系多二至四倍，說(shuō)明消減TIP5使異源性蛋白質(zhì)生成增加。所有該等結(jié)果說(shuō)明，減少沉默rRNA基因數(shù)目會(huì)促進(jìn)核糖體合成，并增強(qiáng)細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)之潛力。敲除TIP5增加單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-I)之生物醫(yī)藥生成，并增加治療性抗體之生成a)以空載體(模擬對(duì)照)或設(shè)計(jì)用于敲低TIP-5表達(dá)之小型RNA (shRNA或RNAi) 轉(zhuǎn)染會(huì)分泌單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I)或治療性抗體之CHO細(xì)胞系(CHO DG44)。于TIP-5 消減效率最高之細(xì)胞群中觀察到最高之MCP-I滴度，而在模擬轉(zhuǎn)染之細(xì)胞或親本細(xì)胞系中，蛋白質(zhì)濃度顯著更低。b)首先以短RNA序列(shRNA或RNAi)轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞(CHO DG44)，以減少 TIP-5表達(dá)，且產(chǎn)生穩(wěn)定之消減TIP-5宿主細(xì)胞系。隨后以編碼作為感興趣基因之單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I)或治療性抗體之載體轉(zhuǎn)染該等細(xì)胞系及平行之CHO DG44野生型細(xì)胞。 于TIP-5消減效率最高之細(xì)胞群中觀察到最高M(jìn)CP-I滴度及生產(chǎn)率，而模擬轉(zhuǎn)染之細(xì)胞或親本細(xì)胞系中之蛋白質(zhì)濃度顯著較低。c)當(dāng)以a)或b)中所述相同細(xì)胞進(jìn)行分批或補(bǔ)料-分批發(fā)酵時(shí)，總MCP-I滴度或抗體滴度之差異甚至更顯著因?yàn)榻?jīng)減少表達(dá)之TIP-5轉(zhuǎn)染之細(xì)胞更快速生長(zhǎng)，且每單位細(xì)胞及每單位時(shí)間亦產(chǎn)生更多蛋白質(zhì)，因此其在相同時(shí)間內(nèi)具有更高IVC且顯示更高生產(chǎn)率。兩種性質(zhì)皆正面影響總工藝產(chǎn)量。因此，消減TIP-5之細(xì)胞具有顯著更高之MCP-I或抗體收獲滴度，且導(dǎo)致更高效率之生產(chǎn)工藝。刪除SNF2H之細(xì)胞同樣具有顯著更高之IgG收獲滴度，且導(dǎo)致更高效率之生產(chǎn)工藝。敲除TIP-5基因可最高效促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄且促進(jìn)增殖產(chǎn)生具有恒定降低水平之TIP-5表達(dá)之改良生產(chǎn)宿主細(xì)胞系的最有效方法為完全敲除TIP-5基因。為此，可利用同源性重組或利用鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)破壞TIP-5基因，防止其表達(dá)。由于CHO細(xì)胞之同源性重組效率不高，因此我們?cè)O(shè)計(jì)一種在TIP-5基因內(nèi)部引入雙鏈斷裂之ZFN，藉此破壞功能。為了控制有效敲除TIP-5，利用抗TIP-5抗體進(jìn)行 Western印跡。在膜上，敲除TIP-5之細(xì)胞不會(huì)檢測(cè)到TIP-5表達(dá)，而親本CHO細(xì)胞系則顯示對(duì)應(yīng)于TIP-5蛋白質(zhì)之清晰信號(hào)。隨后，分析敲除TIP-5之CHO細(xì)胞及親本CHO細(xì)胞系之rRNA轉(zhuǎn)錄。該測(cè)定法證實(shí)， 敲除TIP-5之細(xì)胞中之rRNA合成水平及核糖體數(shù)目皆高于親本細(xì)胞及僅減少TIP-5表達(dá)水平之細(xì)胞。此外，在補(bǔ)料-分批工藝中，TIP-5缺陷之細(xì)胞增殖比TIP5野生型細(xì)胞及其中僅藉由引入干擾RNA (諸如shRNA或RNAi)而減少TIP-5表達(dá)之細(xì)胞系更快速，且細(xì)胞數(shù)目更
尚ο過(guò)表達(dá)UBF促進(jìn)rRNA合成核糖體生成需要rRNA和r-蛋白質(zhì)之協(xié)同表達(dá)和裝配。UBF與活性rRNA基因結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始并調(diào)節(jié)延伸速率。如圖7中所示，于HEK293和HeLa細(xì)胞系二者中UBF均以劑量依賴(lài)性方式刺激45S前rRNA合成。因此，UBF過(guò)表達(dá)以及敲低TIP-5共享rRNA合成增加之作用。UBF過(guò)表達(dá)也促進(jìn)了核糖體生物合成和蛋白質(zhì)生成。UBF過(guò)表達(dá)增加了抗體的生物醫(yī)藥蛋白質(zhì)生成a)于UBF過(guò)表達(dá)細(xì)胞群中于分泌人源化抗⑶44v6IgG抗體BIWA 4之抗體產(chǎn)生CHO 細(xì)胞系(CHO DG44)中觀察到最高比生產(chǎn)率值，其中相較于模擬或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞而言顯著促進(jìn) IgG表達(dá)。若用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子進(jìn)行分批或補(bǔ)料-分批發(fā)酵可以得到非常相似的結(jié)果。在這些設(shè)定之每一個(gè)中，UBF過(guò)表達(dá)導(dǎo)致抗體分泌增加，顯示了 UBF能促進(jìn)在連續(xù)培養(yǎng)或生物反應(yīng)器分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)之細(xì)胞的比生產(chǎn)能力。b)首先以編碼UBF之載體轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞(CHO DG44)，施加選擇壓力并挑選證實(shí)UBF異源性表達(dá)之細(xì)胞系。隨后該等細(xì)胞系及平行之CH0DG44野生型細(xì)胞以編碼作為感興趣基因之人源化抗⑶44v6IgG抗體BIWA4的載體轉(zhuǎn)染。再一次，相較于對(duì)照而言于UBF 過(guò)表達(dá)培養(yǎng)物中IgG滴度顯著提高。此外于補(bǔ)料-分批培養(yǎng)中，UBF之異源性表達(dá)導(dǎo)致了 IgG生成增加。這些數(shù)據(jù)合起來(lái)顯示了 UBF之過(guò)表達(dá)能促進(jìn)連續(xù)培養(yǎng)或生物反應(yīng)器分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)之細(xì)胞的比生產(chǎn)能力。敲除TIP-5和過(guò)表達(dá)UBF協(xié)同作用促進(jìn)rRNA合成和治療用蛋白質(zhì)生成于本發(fā)明中，我們提供了消減TIP-5表達(dá)和過(guò)表達(dá)UBF導(dǎo)致rRNA合成提高之證據(jù)。我們還顯示了 TIP-5刪除導(dǎo)致rDNA基因甲基化減少。由于去甲基化是募集染色質(zhì)修飾因子諸如組蛋白乙?；负徒Y(jié)合轉(zhuǎn)錄因子諸如UBF的先決條件，我們假設(shè)是否兩種方法可能協(xié)同作用于rRNA合成，由此TIP-5消減介導(dǎo)之甲基化減少為隨后的UBF募集和結(jié)合提供了 rRNA基因之易接近性。(A)為了檢驗(yàn)此假設(shè)，我們生成組合了 TIP-5消減和UBF過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。當(dāng)于或者過(guò)表達(dá)UBF或者TIP-5刪除的彼等細(xì)胞系、細(xì)胞和未修飾親本細(xì)胞系之間比較rRNA合成時(shí)，于TIP-5消減細(xì)胞內(nèi)以及于UBF過(guò)表達(dá)細(xì)胞系內(nèi)之rRNA合成再次高于對(duì)照。重要的是，組合之TIP-5刪除和UBF過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了甚至更高的rDNA基因轉(zhuǎn)錄以及更高的核糖體合成。這顯示了 TIP-5消減和UBF過(guò)表達(dá)兩種方法的組合令人驚訝地對(duì)rRNA合成具有協(xié)同效應(yīng)。(B)當(dāng)用編碼感興趣蛋白質(zhì)之表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染(A)中生成之細(xì)胞并比較彼等細(xì)胞之培養(yǎng)液中該蛋白質(zhì)之濃度時(shí)，同時(shí)具有UBF過(guò)表達(dá)和TIP-5敲除的細(xì)胞之培養(yǎng)物中測(cè)定到最高滴度。排列在其次的是具有或者TIP-5消減或者UBF過(guò)表達(dá)的細(xì)胞，而未修飾親本細(xì)胞系中感興趣蛋白質(zhì)之滴度最低。藉由后生遺傳和分泌工程之組合協(xié)同促進(jìn)蛋白質(zhì)生成本發(fā)明中所述方法，即消減TIP-5或SNFH2以及過(guò)表達(dá)UBF，均藉由促進(jìn)rRNA合成、核糖體生物合成以及由此的蛋白質(zhì)翻譯來(lái)促進(jìn)重組蛋白質(zhì)生成。然而，蛋白質(zhì)生成不僅要求優(yōu)化翻譯機(jī)制還要求蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌之翻譯后步驟的效率。因此，我們開(kāi)始著手藉由于細(xì)胞內(nèi)刪除TIP-5和過(guò)表達(dá)促分泌基因CERT來(lái)同時(shí)改造翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)機(jī)制。為此目的，用編碼人CERT蛋白質(zhì)之突變體(CERT krl32 — Ala)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染 TIP-5表達(dá)遭到破壞之CH0-DG44細(xì)胞。于第二轉(zhuǎn)染步驟中，將編碼單克隆IgG亞型抗體的表達(dá)構(gòu)建物引入該等細(xì)胞中并產(chǎn)生穩(wěn)定之細(xì)胞群體。接著，將產(chǎn)生的穩(wěn)定細(xì)胞群體進(jìn)行接種和補(bǔ)料-分批培養(yǎng)以分析比IgG生產(chǎn)率以及獲得的總抗體滴度。有趣的是，于雙重改造細(xì)胞中獲得了最高抗體滴度和比生產(chǎn)率。具有TIP-5刪除和CERT過(guò)表達(dá)二者之細(xì)胞所產(chǎn)生之抗體濃度顯著高于單一改造細(xì)胞。這表明分泌途徑中兩個(gè)步驟之組合改造，即經(jīng)由TIP-5刪除的翻譯工程和經(jīng)由CERT的分泌工程，是更進(jìn)一步促進(jìn)分泌型蛋白質(zhì)生成和產(chǎn)生具有最佳生產(chǎn)能力之哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的方法。類(lèi)似地， 藉由組合UBF和CERT優(yōu)選CERT Serl32 — Ala之表達(dá)可獲得協(xié)同效應(yīng)。一般實(shí)施方案“包括”或“包含”涵蓋更特定之實(shí)施方案“由...組成”。此外，單數(shù)及復(fù)數(shù)形式之使用方式?jīng)]有限制。本發(fā)明過(guò)程中所用之術(shù)語(yǔ)具有如下含意。術(shù)語(yǔ)“后生遺傳工程”意指影響染色質(zhì)之后生遺傳修飾，而不影響核酸序列。后生遺傳修飾包括組蛋白或DNA核苷酸之甲基化或乙?；淖?、及烷基化。于本發(fā)明中，“后生遺傳工程”主要系指DNA甲基化之工程處理?！癗oRC” (核仁重建復(fù)合物)為rDNA沉默之關(guān)鍵決定物，且系由TIP-5 (TTF-1-相互作用蛋白質(zhì)5)及ATP酶SNF^1組成。NoRC系與沉默基因之rDNA啟動(dòng)子結(jié)合，且透過(guò)組蛋白修飾及DNA甲基化活性抑制rDNA轉(zhuǎn)錄。“TIP-5”或“TIP5”(轉(zhuǎn)錄終止因子I(TTFl)-相互作用蛋白質(zhì)5)為大于200kD之核仁蛋白質(zhì)，且系藉由與DNA-甲基-轉(zhuǎn)移酶(DNMT)及組蛋白去乙?；?HDAC)及其它染色質(zhì)修飾因子相互作用，為rDNA募集組蛋白去乙酰基化酶活性。其它同義詞為BAZ2A、 WALp3、FLJ13768、FLJ13780、FLJ45876、KIAA0314 及 DKFZp781B109?！?SNF^1 ”屬于SWI/SNF蛋白質(zhì)家族成員，且具有解螺旋酶及ATP酶活性。SNF^1為 NoRC之組分，且參與核小體轉(zhuǎn)移成封閉之異染色質(zhì)狀態(tài)。SNF^i之官方名稱(chēng)為SMARCA5 (表示與SWI/SNF相關(guān)，與基質(zhì)相連，染色質(zhì)之肌動(dòng)蛋白依賴(lài)性調(diào)節(jié)劑、a子家族、第五個(gè)成員)。 其它名稱(chēng)為 ISWI、hISWI、hSNF2H 及 WCRF135。上游結(jié)合因子(“UBF”)系一種具有DNA結(jié)合和反式激活域二者的核仁磷蛋白，作為18S、5. 8S、和28S核糖體RNA表達(dá)所需之轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。UBF也稱(chēng)作UBTF或N0R-90。表述“減少核糖體RNA基因(rDNA)沉默”意指影響編碼核糖體RNA的DNA或該特定區(qū)域中之染色質(zhì)的甲基化及/或乙?；瑢?dǎo)致rRNA基因轉(zhuǎn)錄解除抑制。更特定言之， 于本發(fā)明中，該術(shù)語(yǔ)系指減少rRNA基因甲基化之方法，導(dǎo)致基因更易于獲得轉(zhuǎn)錄因子，且使相應(yīng)基因合成更多rRNA。文中之“rDNA沉默”明確言之系指rRNA基因沉默。其不包括不受NoRC所介導(dǎo)之非特異性、全基因組沉默機(jī)制(genome-wide silencing mechanism)?？山逵扇缦聹y(cè)定法測(cè)定/監(jiān)測(cè)rDNA沉默rDNA沉默導(dǎo)致減少rRNA轉(zhuǎn)錄，其可由定量性或半定量性PCR分析(例如，如材料及方法部份所述，利用針對(duì)45S前RNA之寡核苷酸引物)。
rDNA基因啟動(dòng)子之甲基化之分析方法為以甲基化敏感性限制酶消化基因組DNA， 且隨后進(jìn)行Southern印跡，產(chǎn)生甲基化及未甲基化狀態(tài)的差異性條帶樣式?；蛘?，可由如下定量由甲基化誘導(dǎo)之rDNA沉默利用甲基化敏感性限制酶消化基因組DNA，且隨后利用橫跨裂解位點(diǎn)之引物進(jìn)行qPCR(如材料及方法部份中所述，且示于圖 2)。如文中所用，關(guān)于基因表達(dá)之術(shù)語(yǔ)“敲低”或“消減”系指導(dǎo)致指定基因之表達(dá)比對(duì)照細(xì)胞表達(dá)減少之實(shí)驗(yàn)方法?？山逵啥喾N實(shí)驗(yàn)方法達(dá)成基因敲低，諸如向細(xì)胞引入會(huì)與基因之部份mRNA雜交之核酸分子，導(dǎo)致其降解(例如shRNA、RNAi, miRNA)，或以一種導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄減少、mRNA穩(wěn)定性降低或mRNA翻譯減少之方式改變基因序列。完全抑制指定基因表達(dá)系稱(chēng)為“敲除”。敲除基因意指該基因不會(huì)合成功能性轉(zhuǎn)
錄物，導(dǎo)致該基因正常提供之功能喪失。敲除基因之方法為改變DNA序列，導(dǎo)致該基因或
其調(diào)節(jié)序列被破壞或刪除。敲除技術(shù)包括使用同源性重組技術(shù)，以置換、間斷或刪除關(guān)鍵部
份或整段基因序列，或使用諸如鋅指核酸酶之DNA修飾酶，于標(biāo)靶基因之DNA中引入雙鏈斷 m農(nóng)。有許多種監(jiān)測(cè)/證實(shí)基因之敲低或敲除之測(cè)定法例如，采用Northern印跡雜交、核糖核酸酶RNA保護(hù)、與細(xì)胞RNA原位雜交、或藉由PCR定量所選擇基因中轉(zhuǎn)錄之mRNA減少/流失。可藉由多種方法定量選擇之基因所編碼對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的減少/流失，例如ELISAJestern印跡、放射免疫測(cè)定法、免疫沉淀、測(cè)定蛋白質(zhì)之生物學(xué)活性、對(duì)蛋白質(zhì)免疫染色后進(jìn)行FACS分析、或均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)測(cè)定法。如本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“衍生物”意指與原始序列或其互補(bǔ)序列具有至少70%序列一致性之多肽分子或核酸分子。較佳地，多肽分子或核酸分子與原始序列或其互補(bǔ)序列具有至少80%之序列一致性。更佳地，多肽分子或核酸分子與原始序列或其互補(bǔ)序列具有至少 90%序列一致性。最佳地，多肽分子或核酸分子與原始序列或其互補(bǔ)序列具有至少95%序列一致性，且對(duì)分泌顯示與原始序列相同或類(lèi)似之影響。序列差異可源自不同生物體同源性序列之間的差異。序列差異亦可源于由于置換、插入或刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸(較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))，對(duì)序列進(jìn)行之靶定修飾?？衫梦稽c(diǎn)特異性誘變及/或基于PCR之誘變技術(shù)產(chǎn)生刪除、插入或置換突變體。相關(guān)方法說(shuō)明于(Lottspeich及hrbas，1998)之第36. 1章中及其它參考文獻(xiàn)。于本發(fā)明中，“宿主細(xì)胞”意指真核細(xì)胞，較佳為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最佳為嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，諸如倉(cāng)鼠細(xì)胞。較佳細(xì)胞為 BHK21、BHK ΤΓ、CHO、CHO-KU CHO-DUKX, CHO-DUKX Bi、 及CH0-DG44細(xì)胞或其中任一種細(xì)胞系之衍生物/后代。特別佳者為CH0-DG44、CH0-DUKX、 CHO-Kl及BHK21，且更佳者為CH0-DG44及CHO-DUKX細(xì)胞。最佳者為CH0-DG44細(xì)胞。于本發(fā)明之一項(xiàng)特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞意指鼠科動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，較佳為NSO及Sp2/0細(xì)胞或其中任一種細(xì)胞系之衍生物/后代?？捎糜诒景l(fā)明含意的鼠科動(dòng)物及倉(cāng)鼠細(xì)胞實(shí)例亦概括于表1中。然而，該等細(xì)胞之衍生物/后代、其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括但不限于人類(lèi)、小鼠、大鼠、猴、及嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系)、或真核細(xì)胞(包括但不限于酵母、昆蟲(chóng)及植物細(xì)胞)亦可用于本發(fā)明之含意，特定言之用于產(chǎn)生生物醫(yī)藥蛋白質(zhì)。表1:真核生產(chǎn)細(xì)胞系
權(quán)利要求
1.一種于細(xì)胞中增加重組蛋白質(zhì)表達(dá)之方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，c.藉由增加轉(zhuǎn)錄因子之表達(dá)來(lái)增加該細(xì)胞中之核糖體RNA轉(zhuǎn)錄，及d.該細(xì)胞于允許蛋白質(zhì)表達(dá)之條件下培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1之方法，其中該細(xì)胞中之重組蛋白質(zhì)表達(dá)比未減少rDNA沉默之細(xì)胞增加，該增加較佳為20 %至100 %，更佳為20 %至300 %，最佳大于20 %。
3.如權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟b)包含敲低或敲除核仁重建復(fù)合物(NoRC)之一種組分且步驟c)包含過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。
4.如權(quán)利要求1至3任一之方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子為上游結(jié)合因子(UBF)。
5.如權(quán)利要求3之方法，其中該NoRC組分為T(mén)IP-5或SNF2H，以TIP-5較佳。
6.如權(quán)利要求1至5任一之方法，其中敲除TIP-5。
7.如權(quán)利要求5或6之方法，其中TIP-5沉默載體包含a.如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 之 shRNA，或b.如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID N0:11 之 miRNA。
8.如權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟b包含藉由刪除或突變或藉由過(guò)表達(dá)不能乙?；甌IP-5變體，較佳藉由過(guò)表達(dá)TIP-5之賴(lài)氨酸突變體K633或K649來(lái)阻止TIP-5乙?；?。
9.如權(quán)利要求1至5任一之方法，其中敲除SNF2H。
10.如權(quán)利要求1至3任一之方法，其中于步驟b)中敲低TIP-5且于步驟c)中過(guò)表達(dá)UBF。
11.如權(quán)利要求1、2或8之方法，其中于步驟b)中藉由刪除或突變或藉由過(guò)表達(dá)不能乙?；甌IP-5變體，較佳藉由過(guò)表達(dá)TIP-5之賴(lài)氨酸突變體K633或K649來(lái)阻止TIP-5 乙?；坝诓襟Ec)中過(guò)表達(dá)raF。
12.如權(quán)利要求1至11任一之方法，其中另外于該細(xì)胞中增加神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)移蛋白 (CERT)之表達(dá)，其中CERT較佳為CERT野生型或CERT Serl32_ > Ala突變體。
13.—種于細(xì)胞中產(chǎn)生感興趣蛋白質(zhì)的方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，c.藉由增加轉(zhuǎn)錄因子之表達(dá)來(lái)增加該細(xì)胞中之核糖體RNA轉(zhuǎn)錄，及d.該細(xì)胞于允許該感興趣蛋白質(zhì)表達(dá)之條件下培養(yǎng)。
14.如權(quán)利要求13之方法，其中該方法另外包含e.純化該感興趣蛋白質(zhì)。
15.如權(quán)利要求13或14之方法，其中該細(xì)胞中之重組蛋白質(zhì)表達(dá)比未減少rDNA沉默之細(xì)胞增加，該增加較佳為20%至100%，更佳為20%至300%，最佳大于20%。
16.如權(quán)利要求13至15之方法，其中步驟b)包含敲低或敲除核仁重建復(fù)合物(NoRC) 之一種組分且步驟c)包含過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。
17.如權(quán)利要求13或16之方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子為上游結(jié)合因子(UBF)。
18.如權(quán)利要求16之方法，其中該NoRC組分為T(mén)IP-5或SNF2H，以TIP-5較佳。
19.如權(quán)利要求13至16任一之方法，其中敲低TIP-5并過(guò)表達(dá)UBF。
20.一種產(chǎn)生用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)之宿主細(xì)胞的方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，c.藉由增加轉(zhuǎn)錄因子之表達(dá)來(lái)增加該細(xì)胞中之核糖體RNA轉(zhuǎn)錄，d.視需要選擇單一細(xì)胞克隆，及e.獲得宿主細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20之方法，其中步驟b)包含敲低或敲除核仁重建復(fù)合物(NoRC)之一種組分且步驟c)包含過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。
22.如權(quán)利要求21之方法，其中該NoRC組分為T(mén)IP-5或SNF2H，以TIP-5較佳，且其中該轉(zhuǎn)錄因子為上游結(jié)合因子(UBF)。
23.一種如權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)之方法產(chǎn)生之細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)之方法或如權(quán)利要求23之細(xì)胞，其中該細(xì)胞為真核細(xì)胞，較佳哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物或倉(cāng)鼠細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24之方法，其中該倉(cāng)鼠細(xì)胞為CHO細(xì)胞，諸如CHO-K1、CHO-S、CH0-DG44 或 CH0-DUKXB11，較佳為 CH0-DG44 細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求1至22、24、或25任一之方法，其中步驟b)和c)之次序顛倒。
27.—種于細(xì)胞中增加重組蛋白質(zhì)表達(dá)之方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，較佳藉由敲低TIP-5或藉由阻止 TIP-5乙酰化來(lái)達(dá)成，c.增加該細(xì)胞中之神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)移蛋白(CERT)表達(dá)，d.視需要增加該細(xì)胞中之核糖體RNA轉(zhuǎn)錄，藉由增加轉(zhuǎn)錄因子，較佳UBF之表達(dá)來(lái)達(dá)成，及e.該細(xì)胞于允許蛋白質(zhì)表達(dá)之條件下培養(yǎng)。
28.—種于細(xì)胞中增加重組蛋白質(zhì)表達(dá)之方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.增加該細(xì)胞中之核糖體RNA轉(zhuǎn)錄，藉由增加轉(zhuǎn)錄因子，較佳UBF之表達(dá)來(lái)達(dá)成，c.增加該細(xì)胞中之神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)移蛋白(CERT)表達(dá)，d.視需要減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，較佳藉由敲低TIP-5或藉由阻止TIP-5乙?；瘉?lái)達(dá)成，及e.該細(xì)胞于允許蛋白質(zhì)表達(dá)之條件下培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之領(lǐng)域。其系關(guān)于經(jīng)由引入編碼UBF之核酸或減少NoRC蛋白質(zhì)(尤其TIP-5)表達(dá)而達(dá)成核糖體RNA(rRNA)表達(dá)增加之生產(chǎn)宿主細(xì)胞系。該等細(xì)胞系具有比對(duì)照細(xì)胞系改善之分泌及生長(zhǎng)特性。本發(fā)明另外關(guān)于一種利用所述方法產(chǎn)生之細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)之方法。
文檔編號(hào)C12N15/67GK102459608SQ201080031561
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者B.埃南克爾, H.考夫曼, L.弗洛林, M.弗瑟尼格, R.桑托羅 申請(qǐng)人:貝林格爾.英格海姆國(guó)際有限公司