專利名稱：一種培育附生蘭的方法及專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育附生蘭的方法及專用菌株。
背景技術(shù)：
蘭科植物是一個(gè)特殊的植物類群，是被子植物中最為進(jìn)化的大科之一。其中，白芨、天麻、石斛等可入藥；兜蘭、杓蘭等極具觀賞價(jià)值。因此，隨著市場(chǎng)的需求增大，野生資源日益遭到嚴(yán)重破壞。在野外，蘭花幼苗的生長需要依靠合適的真菌的存在。人們對(duì)蘭科菌根真菌的了解大部分都通過從成年蘭株的根中分離真菌進(jìn)行室內(nèi)研究獲得。蘭科種子極其微小，使得人們對(duì)蘭科植物從種子萌發(fā)到植株出土的地下生活階段無法進(jìn)行追蹤和調(diào)查，因此關(guān)于蘭科種子萌發(fā)的時(shí)間動(dòng)態(tài)過程的知識(shí)知之甚少。Rasmussen&Whigham首次提出了一種應(yīng)用于蘭科植物生境中的種子原地共生萌發(fā)技術(shù)。蘭科種子原地共生萌發(fā)技術(shù)即種子誘導(dǎo)技術(shù)， 是指將蘭科種子裝在一特制的袋子中，埋于蘭科植株的生境中，一段時(shí)間后，回收種子袋觀察種子是否萌發(fā)，并檢驗(yàn)是否有真菌侵染。目前該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于蘭科菌根真菌的研究中，并得到不斷得改進(jìn)。原生境種子萌發(fā)技術(shù)能夠提供貼近自然的真實(shí)數(shù)據(jù)，原地工作能夠調(diào)查一些異地所不能研究的問題，如土壤中種子庫的動(dòng)態(tài)，菌根真菌的分布與及原生境中真菌的專一性。蘭科植物與菌根真菌之間的關(guān)系不是高度專一的，這種共生平衡的關(guān)系是有條件的，環(huán)境條件的改變可能會(huì)導(dǎo)致這種平衡關(guān)系發(fā)生變化。在實(shí)施蘭科植物的易地保護(hù)之前， 應(yīng)用原地萌發(fā)技術(shù)進(jìn)行共生真菌的檢測(cè)非常必要，實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果并不一定適用于自然環(huán)境中。在實(shí)施重引入工程時(shí)，引入蘭花的同時(shí)也要引入其相應(yīng)的共生真菌。菌根是土壤真菌與植物的共生體，它能起到營養(yǎng)交換的作用。蘭科植物是典型的菌根植物，在自然條件下，蘭科種子依靠菌根真菌提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行萌發(fā)。蘭科種子與特定真菌的結(jié)合決定了種子是否能萌發(fā)。已有的研究結(jié)果還表明，共生真菌有助于提高幼苗移栽后的成活率和生長速度，增加植株對(duì)逆境的抵抗能力，維持較低的發(fā)病率，增加花的數(shù)量和提高花的品質(zhì)等。石斛屬植物，目前已成為世界蘭花產(chǎn)業(yè)的重要類群，其生產(chǎn)規(guī)模接近蝴蝶蘭。該屬植物集觀賞和藥用價(jià)值為一體，在我國和印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，石斛屬許多種植物的新鮮或干燥莖收作草藥。近年來人們對(duì)天然藥物的需求急劇增加。由于人工栽培技術(shù)沒有得到有效的解決，對(duì)野生資源的依賴性以及由此帶來的破壞性與日俱增。組培苗移栽成活率低是許多蘭科植物栽培存在的問題，石斛組培苗移栽后能否成活是人工栽培成功的關(guān)鍵。碎葉蒲桃(Syzygium buxifolium)屬于桃金娘科(Myrtaceae)(蒲桃屬 Syzygium)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株與蘭科植物共生的菌株。
本發(fā)明所提供的菌株為假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3，其保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 4148。假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3CGMCC No. 4148在培育蘭科植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述蘭科植物為石斛屬植物；所述石斛屬植物為華石斛 (Dendrobiumsinense)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育蘭科植物的方法。本發(fā)明所提供的培育蘭科植物的方法，包括如下步驟將蘭科植物種子與假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3 CGMCC No. 4148 共生，得到蘭科植物苗。上述培育方法中，所述將蘭科植物種子與假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148共培養(yǎng)的方法包括如下步驟將滅菌苔蘚固定在樹的樹皮上，再將滅菌紗布固定在苔蘚上，將蘭科植物種子的懸濁液噴灑在所述紗布上，再將假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌劑噴灑在所述噴灑有蘭科植物種子的紗布上，使所述假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148與所述蘭科植物種子共同生長。上述任一培育方法中，所述蘭科植物種子的懸濁液中蘭科植物種子的濃度為Img/ ml ；每塊紗布上噴灑的蘭科植物種子的懸濁液的量為5ml/12cm2 ；上述任一培育方法中，所述將假尾孢(Pseudocercosporasp. ) S3CGMCC No. 4148 的菌劑噴灑在所述紗布上的方法為每三天噴灑一次，共噴灑6-10次，每次噴灑的量為 5ml/12cm2 ；所述噴灑的次數(shù)具體為6次、8次或10次。上述任一培育方法中，所述假尾孢(Pseudocercosporasp. ) S3CGMCC No. 4148 的菌劑按照包括如下步驟的方法得到將假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148 用DE培養(yǎng)基培養(yǎng)，取帶有菌絲的培養(yǎng)基塊，將帶有菌絲的培養(yǎng)基塊搗碎后與水混合，即得到所述菌劑。上述任一培育方法中，所述搗碎的帶有菌絲的培養(yǎng)基塊與水的體積比為 1 0-4)，具體為 1 2、1 3 或 1 4。上述任一培育方法中，所述水為無菌水。上述任一培育方法中，所述樹為碎葉蒲桃(Syzygium buxifolium)或毛綿杜鵑 (Rhododendron moulmainense)；所述紗布的大小為長 4cmX 寬 3cm。上述任一培育方法中，所述蘭科植物為石斛屬植物；所述石斛屬植物為華石斛 (Dendrobium sinense)。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種分離內(nèi)生真菌的方法。本發(fā)明所提供的分離內(nèi)生真菌的方法，包括如下步驟將蘭科植物種子播種于培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)得到原球莖，從所述原球莖中分離得到內(nèi)生真菌；所述培養(yǎng)基質(zhì)為碎葉蒲桃的樹皮。本發(fā)明菌株對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長均有明顯的促進(jìn)作用，可作為石斛生長的優(yōu)良共生菌，還可用于指導(dǎo)瀕危物種的保育和蘭科植物的園藝栽培生產(chǎn)上，從而極大緩解野生資源的匱乏。在其他蘭科植物，尤其是附生蘭科植物的保育和規(guī)?；敝愁I(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為菌株的形態(tài)。圖2為華石斛原球莖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中使用的附生蘭種子為華石斛(Dendrobium sinense Tang&ffang)的種子，在文獻(xiàn)“吳智彪，宋希強(qiáng)，李紹鵬.華石斛內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)其組培苗生長的影響 (J)，熱帶作物學(xué)報(bào)，2006，27 (1)，77-79，，中公開過，公眾可從海南大學(xué)獲得。實(shí)施例1、真菌的分離與鑒定一、分離方法從采自海南省霸王嶺的野生華石斛分離出菌株，其方法如下1. 1、選取野生長勢(shì)健壯并生長旺盛的野生華石斛的新鮮營養(yǎng)根，流水沖洗掉根表面腐殖質(zhì)和雜物。1. 2、在超菌工作臺(tái)上將根段浸入次氯酸鈣溶液中10-iaiiin進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水沖洗3-4次。1. 3、將根段切成2-3mm長的小段，放置在PDA培養(yǎng)基上，25°C下暗培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后，待菌絲自根段中長成菌落后，挑取菌絲轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)純化。1.4、沒有污染，轉(zhuǎn)入指型管內(nèi)PDA斜面培養(yǎng)基，4°C短期保存待用。每升PDA培養(yǎng)基是由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g瓊脂粉和IL水制成，PH自然。 將分離得到的菌株與目標(biāo)苗分別進(jìn)行共生培養(yǎng)，一定時(shí)間后檢測(cè)該菌株對(duì)苗的生長的促進(jìn)作用的大小(檢測(cè)如下指標(biāo)單位時(shí)間內(nèi)苗增加的鮮重、株高、節(jié)數(shù)、葉片數(shù))，各指標(biāo)均高于對(duì)照組，則確定該菌為益菌。結(jié)果得到一株菌，命名為S3.二、鑒定菌株S3在PDA培養(yǎng)基上，菌落黑色，表面為灰白色，背面看有同心圓，菌落生長速度中等。菌絲淺褐色，有分支，未見分生孢子。如圖1(A為肉眼觀察，B為顯微鏡觀察)。檢測(cè)該菌株中的ITS rDNA基因，得到的序列如SEQ ID N0:1所示。將該基因序列在ncbi數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對(duì)。比對(duì)結(jié)果表明，該序列與假尾孢屬的序列的相似性為 99%。綜合以上鑒定結(jié)果，表明該菌株屬于假尾孢(Pseudocercospora sp.)。該菌株已于2010年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 4148，分類命名為假尾孢(Pseudocercospora sp.)。實(shí)施例2、華石斛的培養(yǎng)—、華石斛種子的采集及預(yù)處理取華石斛成熟且未開裂的果莢。
種子的消毒處理將生長發(fā)育良好的成熟且未開裂的果莢放入1. 5% (質(zhì)量百分含量)次氯酸鈣水溶液中13-15min進(jìn)行表面滅菌，無菌水沖洗3-4次。二、菌劑的制備1、活化將假尾孢(Pseudocercospora)S3 CGMCC No. 4148 接種于 PDA 培養(yǎng)基，25°C下暗培
養(yǎng)活化。PDA培養(yǎng)基制備與現(xiàn)有技術(shù)中相同，每升PDA培養(yǎng)基由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g瓊脂粉和IL水制成，PH自然。2、菌塊培養(yǎng)將帶有單一純菌絲的培養(yǎng)基塊接種于DE培養(yǎng)基中，在25°C下暗培養(yǎng)15天，得到含有菌株S3CGMCC No. 4148的DE培養(yǎng)基。DE培養(yǎng)基組成為現(xiàn)有技術(shù)中常用的培養(yǎng)基。每一升DE培養(yǎng)基具體是由終濃度為110. 98mg/L的CaCl2、終濃度為174. 25mg/L的 K2SO4、終濃度為 123. 24mg/L 的 MgSO4. 7H20、終濃度為 54. 44mg/L 的 KH2PO4、終濃度為 1. 55mg/ L的Η3Β04、終濃度為6. 53mg/L的MnCl. 4H20、終濃度為0. 80mg/L的ZnSO4. 7H20、終濃度為 0. 24mg/L 的 NaMO4. 2H20、終濃度為 52. llmg/L 的 CltlH14N2O8Na2. 2H20、終濃度為 27. 80mg/L 的 FeSO4. 7H20、終濃度為9g/L的可溶性淀粉、終濃度為lg/L的酵母膏、終濃度為8g/L的瓊脂和水組成，其最終PH值為6.0?？扇苄缘矸圪徸試幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為10021318。酵母膏購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為69024838。3、菌劑的制備取步驟2制備得到的帶有菌絲的培養(yǎng)基塊，將其搗碎，再將其與無菌水混合，搗碎的菌塊與水的體積比為1 2或1 3或1 4。三、培養(yǎng)華石斛方法I 實(shí)驗(yàn)組(野外進(jìn)行)1、將華石斛種子放入水中(其種子如粉塵)，配制成lmg/ml的懸濁液。2、分別以碎葉蒲1 (Syzygium buxifolium)和毛綿杜鵑 (Rhododendronmoulmainense)的樹皮為附生載體。3、用少量的消毒過的苔蘚附著到選好的樹種的樹皮上，再將一小塊(長km，寬 3cm)網(wǎng)格狀涂布(如醫(yī)用紗布等)附著于苔蘚上，用大頭釘固定。4、再將lmg/ml的種子懸濁液噴施于每塊固定好的紗布上(噴灑量為5ml/12cm2)， 再將菌劑噴施于附有目標(biāo)種子的紗布上，每三天一次(每次噴灑5ml/12cm2)，共噴施6次， 觀察其種子萌發(fā)狀況。5、每10天觀察一次。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組方法基本相同，且與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行，不同的是不噴施任何菌劑。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。方法II
實(shí)驗(yàn)組方法與方法I中實(shí)驗(yàn)組所述方法基本相同，不同的是所用的菌劑中菌塊與水的體積比為1 2 ；噴灑菌劑的次數(shù)為8次。方法III實(shí)驗(yàn)組方法與方法I中實(shí)驗(yàn)組所述方法基本相同，不同的是所用的菌劑中菌塊與水的體積比為1 4;噴灑菌劑的次數(shù)為10次。四、結(jié)果方法I的結(jié)果如下1、表型實(shí)驗(yàn)組苗比對(duì)照組苗生長旺盛，葉片寬而翠綠，植株高而健壯。從將種子噴灑于紗布上計(jì)起，60-90天后，觀察到綠色球形小體(圖2，A表示碎葉蒲桃的樹皮，B表示毛綿杜鵑的樹皮)。2、幼苗鮮重、干重鮮重檢測(cè)方法將苗清洗干凈用棉布吸干植株表面的水直接用電子天平稱量。結(jié)果經(jīng)20個(gè)月(從向紗布噴灑種子開始計(jì)起)的培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組植株平均鮮重0. 803g ；對(duì)照組結(jié)果0. 577g。干重檢測(cè)方法將植株清洗干凈后陰干植株表面的水分后放入105°殺青20 30 分鐘，然后60 80°烘干至恒重，稱重。結(jié)果經(jīng)15個(gè)月(從向紗布噴灑種子開始計(jì)起) 的培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組平均干重0. 243g ；對(duì)照組植株平均干重0. 185g。3、幼苗植株高度幼苗植株高度自根在莖上著生點(diǎn)到植株的莖尖的長度。經(jīng)20個(gè)月(從向紗布噴灑種子開始計(jì)起)的培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組植株平均高度為4. 23cm。對(duì)照組3. 12cm。4、根的數(shù)量及長度實(shí)驗(yàn)組結(jié)果植株根的平均數(shù)量為4. 13，平均長度為4. 07cm。對(duì)照組結(jié)果植株根的平均數(shù)量為3. 16，平均長度為2. 67cm。方法II中實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與方法I中實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果無顯著差異。方法III中實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與方法I中實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果無顯著差異。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)內(nèi)生真菌液體菌劑處理的幼苗鮮重、干重都增長顯著， 說明其有利于大幅度增加植株干物質(zhì)的積累。該真菌S3能產(chǎn)生較多的新生營養(yǎng)根，植株高而健壯，葉片寬而翠綠，增加了幼苗植株高度，且既增加了根的數(shù)量，也增加了根的長度。
權(quán)利要求
1.假尾孢(Pseudocercosporasp.) S3，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4148。
2.假尾孢(I^seudocercosporasp.) S3CGMCC No. 4148在培育蘭科植物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述蘭科植物為石斛屬植物；所述石斛屬植物為華石斛(Dendrobium sinense)。
4.一種培育蘭科植物的方法，包括如下步驟將蘭科植物種子與假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148 共生，得到蘭科植物苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述將蘭科植物種子與假尾孢 (Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148共培養(yǎng)的方法包括如下步驟將滅菌苔蘚固定在樹的樹皮上，再將滅菌紗布固定在苔蘚上，將蘭科植物種子的懸濁液噴灑在所述紗布上， 再將假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌劑噴灑在所述噴灑有蘭科植物種子的紗布上，使所述假尾孢(Pseudocercospora sp. ) S3CGMCC No. 4148與所述蘭科植物種子共同生長。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述蘭科植物種子的懸濁液中蘭科植物種子的濃度為lmg/ml ；每塊紗布上噴灑的蘭科植物種子的懸濁液的量為5ml/12cm2 ；和/或，所述將假尾孢(Pseudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌劑噴灑在所述紗布上的方法為每三天噴灑一次，共噴灑6-10次，每次噴灑的量為5ml/12cm2 ；所述噴灑的次數(shù)具體為6次、8次或10次。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述假尾孢O^seudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148的菌劑按照包括如下步驟的方法得到將假尾孢(I^seudocercospora sp.) S3CGMCC No. 4148用DE培養(yǎng)基培養(yǎng)，取帶有菌絲的培養(yǎng)基塊，將帶有菌絲的培養(yǎng)基塊搗碎后與水混合，即得到所述菌劑；所述搗碎的帶有菌絲的培養(yǎng)基塊與水的體積比為 1 0-4)，具體為 1 2、1 3 或 1 4。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述樹為碎葉蒲桃(Syzygium buxifolium)或毛綿杜鵑(Rhododendron moulmainense)；所述紗布的大小為長4cmX寬 3cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述蘭科植物為石斛屬植物；所述石斛屬植物為華石斛(Dendrobium sinense)。
10.一種分離內(nèi)生真菌的方法，包括如下步驟將蘭科植物種子播種于培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)得到原球莖，從所述原球莖中分離得到內(nèi)生真菌；所述培養(yǎng)基質(zhì)為碎葉蒲桃的樹皮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育附生蘭的方法及專用菌株。本發(fā)明所提供的菌株為假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3CGMCC No.4148。本發(fā)明菌株對(duì)幼苗生長有明顯的促進(jìn)作用，可作為石斛生長的優(yōu)良共生菌，可應(yīng)用于該植物的園藝栽培生產(chǎn)上。在其他蘭科植物，尤其是附生蘭科植物的保育和規(guī)?；敝持芯哂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102174413SQ20101059466
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者余文剛, 宋希強(qiáng), 朱國鵬, 李霖明, 鐘云芳 申請(qǐng)人:海南大學(xué)