專(zhuān)利名稱(chēng)：棉鈴蟲(chóng)保幼激素結(jié)合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉鈴蟲(chóng)保幼激素結(jié)合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蟲(chóng)害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)的重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，各種作物因蟲(chóng)害而遭受的經(jīng)濟(jì)損失平均達(dá)20 % 30 %，每年損失約數(shù)千億美元。噴施化學(xué)農(nóng)藥、生物殺蟲(chóng)劑是目前主要的防治方法。由于人類(lèi)對(duì)環(huán)境保護(hù)和自身健康意識(shí)的增強(qiáng)、害蟲(chóng)抗性、農(nóng)藥殘留等因素使大量傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑已經(jīng)不適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要。利用基因工程手段培育抗蟲(chóng)新品種具有保護(hù)作用連續(xù)性、資源豐富、毒性專(zhuān)一、對(duì)環(huán)境污染小、周期短、成本低，目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物的出現(xiàn)使抗蟲(chóng)問(wèn)題可以在很大程度上解決。如來(lái)源于微生物蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)毒蛋白基因已成功地轉(zhuǎn)入各種作物及果樹(shù)林木，來(lái)源于高等植物的植物凝集素基因也被用來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物。雖然昆蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的抗性發(fā)展緩慢，但也是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因植物的大田抗性試驗(yàn)證明，經(jīng)12次繁殖后昆蟲(chóng)便對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性，轉(zhuǎn)單一晶體蛋白 (insecticidal crystal protein，ICP)基因的植物在生產(chǎn)上一般只能用8 10年。由此看來(lái)，昆蟲(chóng)的抗性是抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中較為嚴(yán)重的潛在問(wèn)題，迫切需要尋找新的方法或新的基因來(lái)有效或者特異的防治植物病蟲(chóng)害。RNA干擾(RNA interfefence，RNAi)現(xiàn)象是指利用內(nèi)源性或外源性雙鏈 RNA(double stranded RNA, dsRNA)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、植物、 錐蟲(chóng)、水螅、渦蟲(chóng)、斑馬魚(yú)、大小鼠等多種生物中。大多數(shù)昆蟲(chóng)也存在RNAi信號(hào)的系統(tǒng)性傳播現(xiàn)象。有研究表明將dsRNA直接注射進(jìn)昆蟲(chóng)的卵、血腔或局部組織，可引發(fā)遠(yuǎn)距離靶基因的特異性沉默。此外，除了直接注射dsRNA，還可以通過(guò)飼喂dsRNA的方法誘導(dǎo)昆蟲(chóng)產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。目前已有研究表明飼喂相應(yīng)靶基因的dsRNA已成功降低蘋(píng)淺褐卷蛾 (Epiphyas postvittana)幼蟲(chóng)羧酸酯酶表達(dá)水平、蜜蜂(Apismellifera)的雷帕霉素靶蛋白(targetof rapamycin, amTOR)(Helicoverpa armigera) P450SI3 的表達(dá)水平。因而，以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)新的害蟲(chóng)防治方法，為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治提供了高特異性和環(huán)境安全的新策略。昆蟲(chóng)激素在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育中起著極其重要的作用。調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)發(fā)育的昆蟲(chóng)激素， 其合成、運(yùn)輸和代謝途徑中所涉及的關(guān)鍵基因多數(shù)具有很強(qiáng)的物種特異性，即與其他物種的基因同源性低，尤其是與人類(lèi)基因相比幾乎沒(méi)有同源性，這在很大程度上降低了 RNAi技術(shù)的“脫靶效應(yīng)”，從而為應(yīng)用安全性方面提供了保障。因此，在植物中表達(dá)昆蟲(chóng)激素相關(guān)基因的dsRNA，其優(yōu)點(diǎn)在于只對(duì)植食性的昆蟲(chóng)有抑制作用，同時(shí)還可以根據(jù)昆蟲(chóng)激素相關(guān)基因的物種特異性，通過(guò)表達(dá)不同序列的dsRNA對(duì)某一種或某一屬昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響， 從而達(dá)到精確、安全的控制蟲(chóng)害的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種棉鈴蟲(chóng)保幼激素結(jié)合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱(chēng)為Ha-JHBP蛋白，獲自鱗翅目夜蛾科昆蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng) (Helicoverpa armigera),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第12至740位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的DNA 分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的DNA 分子。
3.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4.含有序列表的序列2自5’末端第207至689位核苷酸的DNA片段或序列表的序列 6所示的RNA。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段為DNA片段甲、DNA片段乙或DNA片段丙；所述DNA片段甲如序列表的序列2自5’末端第207至689位核苷酸所示；所述DNA片段乙如序列表的序列2自5’末端第204至691位核苷酸所示；所述DNA片段丙為含有正向序列和反向序列的DNA，所述正向序列如序列表的序列4 自5’末端第15至497位核苷酸所示，所述反向序列如序列表的序列4自5’末端第711至 1193位核苷酸所示；所述DNA片段丙優(yōu)選為序列表的序列4所示DNA。
6.含有權(quán)利要求4或5所述DNA片段的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為如下(I)或 (II)(I)將所述DNA片段丙插入重組質(zhì)粒PC2300PN的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒PC2300PN為以植物表達(dá)載體pCAMBIA2300為骨架載體，在I3St I和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列8自5，末端第12至295位核苷酸所示的DNA，在I^stI和HindIII 酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列9自5’末端第14至194位核苷酸所示的DNA，得到的重組質(zhì)粒；(II)將所述DNA片段甲或所述DNA片段乙插入細(xì)菌表達(dá)載體L4440的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述重組菌為將(II)所述的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌HTl 15 (DE!3)得到重組菌。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求5所述的DNA片段丙導(dǎo)入目的植物中，得到抗棉鈴蟲(chóng)能力高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述DNA片段丙通過(guò)權(quán)利要求7的(I)所述的重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述目的植物；所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物優(yōu)選為煙草。
10.一種用于殺死棉鈴蟲(chóng)的制劑，其活性成分為雙鏈RNA，所述雙鏈RNA的一條鏈如序列表的序列6自5’端第16至503位核苷酸所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種棉鈴蟲(chóng)保幼激素結(jié)合蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了所述蛋白的編碼基因及其功能片段。利用本發(fā)明Ha-JHBP基因作為目的基因構(gòu)建dsRNA植物表達(dá)載體，在植物中大量表達(dá)Ha-JHBP的dsRNA，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)能力。本發(fā)明對(duì)于植食性昆蟲(chóng)的生物防治，植物抗蟲(chóng)基因工程，分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102464710SQ201010539960
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者朱禎, 王曉芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所