專利名稱：草魚白細胞化學吸引素2基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學中的基因克隆領(lǐng)域，尤其涉及草魚白細胞化學吸引素2基 因的核苷酸及氨基酸序列。
背景技術(shù)：
LECT2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2)最早分離自人 T 細胞 SKW-3 株 培養(yǎng)液，它具有嗜中性粒細胞趨化活性，其在人肝臟中特異表達并分泌到血液中。而新近 的研究揭示，LECT2可能是一個多功能的蛋白，其與細胞生長、分化、損傷修復及免疫等過 程相關(guān)。有多種動物的白細胞化學吸引素基因已被克隆，例如牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)、角里魚(Cyprinus carpi ο)、虹魚尊(Oncorhynchus mykiss)、斑馬魚(Danio rerio) 禾口大黃魚(Pseudosciaena crocea)等物禾中。目前白細胞化學吸引素2基因在草魚基因研究上還屬空白。本基因的獲得可以進 一步研究該基因在草魚細胞中的組成及基因結(jié)構(gòu)，并為研究該基因在草魚生長中的作用提 供更高層次的科學服務(wù)，為研究草魚功能飼料提供理論依據(jù)和新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以本實驗室保存草魚腸道cDNA文庫中白細胞化學吸引素2基因 EST序列為模版設(shè)計引物，結(jié)合RACE技術(shù)，用PCR法擴增克隆得到草魚白細胞化學吸引素2 基因的全表達序列。上述目地是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的取出新鮮草魚腸道組織，采用TRIzol (Invitrogen Corporation) 一步法提取總 RNA,甲醛變性凝膠電泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)檢測總RNA質(zhì)量。本實驗室保存草魚腸道cDNA文庫中篩選到白細胞化學吸引素2基因(lect2)EST 序列，經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)該EST序列欠缺cDNA序列的5’端和3 ‘端。利用cDNA末端快速 擴增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)對目的基因的5端進行擴增。根據(jù)Takara 5' -Full RACE Kit試劑盒，通過本實驗室草魚腸道cDNA文庫中白 細胞化學吸引素2基因EST序列設(shè)計5端(GSP5)和3端(GSP3)兩個特異引物GSP5 :5， -CAACTTCACATCAAATGGAGCAA-3，GSP3 :5， -GAGACCTGTTACAAATTAAATTCCAAG-3，分別對應(yīng)試劑盒中5，-CDS primer A :5，_(T)25VN_3，(N = A, C, G, or T ;V = A, G, C)3，-CDS primer A :5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)3。VN_3，(N = A, C, G, or T ;V = A, G，C)以TRIzol —步法提取總的RNA為模板，進行5 ‘-RACE反應(yīng)和3’-RACE PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 101 PCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產(chǎn)物。分 別得到大小為400bp和300bp左右的清晰條帶。
PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳膠回收后連接到pMD19-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E. Coli DH5 α菌株， 經(jīng)質(zhì)粒酶切驗證后用Ml3通用引物測序。將測序結(jié)果和已知EST序列拼接所得序列進行比對，對全序列進行調(diào)整后獲得了 完整的草魚白細胞化學吸引素2基因序列，既目的基因。通過該基因的原核表達和蛋白免疫印跡(Western blotting)，證實該基因的表達 蛋白為lect2蛋白。進一步證實該基因確為lect2基因。草魚腸道細胞白細胞化學吸引素2基因序列的獲得可以進一步研究該基因在草 魚細胞中的組成及基因結(jié)構(gòu)，并為研究該基因在草魚生長中的作用提供更高層次的科學服 務(wù)，為研究草魚功能飼料提供理論依據(jù)和新思路。


我們得到結(jié)果如圖1所示，免疫印記條帶出現(xiàn)在20kD位置左右。
具體實施例方式下面通過以下具體實施方式
對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限 于此?？俁NA的提取挑選實驗材料——健康雌性草魚，體長340mm，約1. 1冬齡(13個月)， 1.3kg。取出新鮮草魚腸道組織，液氮迅速冷凍后保存于-80°C冰箱備用。采用 TRIzol (InvitrogenCorporation) 一步法提取總RNA，甲醛變性凝膠電泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)檢測總 RNA 質(zhì)量。1.引物設(shè)計依據(jù)和合成方法在本實驗室保存草魚腸道cDNA文庫中篩選到含有白細胞化學吸引素2基因EST 序列的轉(zhuǎn)化子，送交測序，并將測序結(jié)果在GenBank中進行比對，比對結(jié)果顯示該EST序列 欠缺cDNA序列的5’端和3 ‘端。以該EST序列為模版設(shè)計5端(GSP5)和3端(GSP3)兩 個特異引物。引物序列設(shè)計后送交Invitrogen Corporation進行合成。GSP5 :5， -CAACTTCACATCAAATGGAGCAA-3，GSP3 :5， -GAGACCTGTTACAAATTAAATTCCAAG-3，3.利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)對草魚白細胞化學吸引素2基因的5端和 3端進行擴增獲得cDNA全序列3，RACE按照 Smart RACE cDNA amplification kit (BD Biosciences Clontech)使用說 明書進行3，RACE。在RNAase-Free的200 μ IEP管中加入以下成分總 RNA2μ 13' -CDS primer1 μ 1RNase的去離子水2 μ L混合均勻后，在離心機中短暫離心，于帶熱蓋的PCR儀中70°C溫浴2min，立即置于 冰上冷卻2min。短暫離心后將液體收集在EP管底。加入以下成分DTT (20mM)1 μ L
5×First—Strand Buffer2 Ix L
dNTP Mix(10mm01／L)l u L
PowerScript’“Reverse TranSCriDtaSe l u L
共lo u L反轉(zhuǎn)錄體系于42℃空氣浴1．5小時。轉(zhuǎn)錄完成后，加入100 u LTricine—EDTA緩沖液。于72℃溫育7分鐘。此時，3’RACE用cDNA第一鏈合成結(jié)束。
lo×Advantage 2 PCR Buffer5 Ix l
dNTP Mix(IOmM)l u l
50×Advantage 2 P。lymerase Mixl u l
3’RACE用CDNA2．5 u l
UPM(10×Universal Primer A Mix)5 lX l
GSP3l u l
PCR—Grade Water34．5 IX l
Tota50 IX l
3’RACE反應(yīng)流程
3’RACE產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖(1×／AE)凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收目的片段，回收的目的片段一20℃保存。
5’RACE
在RNAase—Free的200 u IEP管中加入以下成分
總RNA2 IX l
5’一CDS primerl u l
SMART II A 01igol u L
RNase的去離子水l u L
混合均勻后，在離心機中短暫離心，于帶熱蓋的PCR儀中70℃溫浴2min，立即置于冰上冷卻2min。短暫離心后將液體收集在EP管底。加入以下成分
D／／(20lnM)l u L
5×First—Strand Buffer2 IX L
dN／P Mix(10mmoi／L)l u L
PowerScript’“Reverse TranSCriDtaSel u L
共lo u L反轉(zhuǎn)錄體系于42℃空氣浴1．5小時。轉(zhuǎn)錄完成后，加入100 u LTricine—EDTA緩沖液。于72℃溫育7分鐘。此時，5’RACE用cDNA第一鏈合成結(jié)束。
5’RACE反應(yīng)體系
10×Advantage 2 PCR Buffer5 IX l
dNTP Mix(IOmM)50XAdvantage 2 Polymerase Mix5，RACE用cDNAUPM(10X Universal Primer A Mix)GSP5PCR-Grade WaterTota5，RACE 反應(yīng)流程 5’ RACE產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖(IXTAE)凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收目的片 段，回收的目的片段-20°C保存。3. 7反應(yīng)結(jié)束后，取5 101 PCR反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產(chǎn)物。 分別得到大小為4000bp和300bp左右的清晰條帶。3. 8將RACE擴增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后，然后將純化的PCR 產(chǎn)物克隆到PMD-19T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取 質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切驗證后，將具有插入片段質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子送交 InvitrogenCorporation，利用M13通用引物進行雙向測序。3. 9將測序結(jié)果和已知EST序列拼接所得序列進行比對，對全序列進行調(diào)整后獲 得了完整的草魚白細胞化學吸引素2基因序列，既目的基因4.草魚白細胞化學吸引素2基因序列的確定將PCR反應(yīng)所得5端和3端擴增片段克隆到PMD-19T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 菌株感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切驗證后，將具 有插入片段質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子送交Invitrogen Corporation，利用M13通用引物進行雙向 測序。所得結(jié)果用vector NT進行拼接，比對分析，獲得一完整的cDNA序列。將該序列用 BLAST軟件(http://www. ncbi. nim. nih. gov/blast)進行同源性測定，來確定為白細胞化 學吸引素2基因同源序列。比對結(jié)果為Sequences producing significant alignments Max Total Query E MaxAccessionDescriptionscore score coverage value identPREDICTED :Daniο rerio similar toXM 690441. 3 leukocyte cell-derived chemotaxin 387 387 54%le一104 80％
2(LOC567 149)，mRNA
Danioretieleukocyte
cel l—derived chemotaxin 2 l ike
(10ct21)，mRNA>gb DQ372604．1
NM 001048055．137937957％2e—102 79％
Danioretieleukocyte
cell一derived chemotaxin 2(1ect2)
mRNA，complete cds
根據(jù)Ironl995年的報道，只要兩個序列間用BLAST軟件比對后E-Value值小于0．005，兩個序列之間具有絕對的同源性，即證明序列為同一種基因序列。從比對結(jié)果看草魚的基因序列BLAS／比對后，與斑馬魚的leukocyte cell一derived chemotaxin 2基因的E值絕對小于0．005，所以證明該序列是lect2基因的同源序列。
5．通過該基因的原核表達和蛋白免疫印跡(Western blotting)，證實該基因的表達蛋白為lect2蛋白。
5．1目的蛋白的原核表達
(一)獲得目的基因
通過R／一PCR方法用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。[Ol oo] Sense5’CGGGATCCATGAGACTTTACATCCTTCTCAGT 3’[Ol 01] Ant i5’CTGCTCGAGTCAAAAATACTTGGTGGGATCTGAT 3’
(二)構(gòu)建重組表達載體將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點BamIII和Xh01)進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit回收載體大片段。PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在／4DNA連接酶作用下連接入載體pE／28a。
(三)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 o，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL2 1(D3)的感受態(tài)細胞。
(四)誘導表達挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50 u g／m1)中37~C過夜培養(yǎng)。按l50比例稀釋過夜菌，一般將lml菌加入到含50mlLg培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600竺0．4一1．0(最好0．6，大約需3hr)。取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0．4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。分別取菌體lml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100 u l 1％SDS重懸，混勻，70℃10min。離心12000g×lmin，取上清作為樣品。上清為含有表達的lect2蛋白的溶液。
5．2蛋白免疫印跡
一抗為人的lect2蛋白的兔源多克隆抗體lect2 Protein。二抗為goatanti—Rabbit工gA+工gG+工gM Antibody。均貝勾自Santa Cruz
(一)分離膠的配制配制15％分離膠。灌膠至玻璃板2／3處，預(yù)留濃縮膠的位置。加蒸餾水封閉，凝膠30分鐘。水和凝膠界面可見一條折線。
(二)洗滌棄去上層蒸餾水，洗滌分離膠上層界面。濾紙吸干殘留水分。
(三)濃縮膠的配制配制5%膠濃縮膠。灌膠，插入合適的梳子，凝膠30分鐘。(四)樣品制備取合適的蛋白量與2倍體積上樣緩沖液等比混勻，100°C煮沸5分鐘。(五)加樣每個泳道加入10-20U1的上述樣品(膠一般在Imm到1.5mm)。(六)電泳等壓電泳(濃縮膠70V;分離膠150V)。至溴酚蘭剛跑出即可終止。(七)平衡將電泳后的凝膠取出，在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡平衡15分鐘以上。PVDF 膜先在甲醇中浸泡10-15秒，再在純水中浸泡2min，然后同樣在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡平衡15 分鐘。(八)按順序依次放置(-)海綿墊-濾紙(雙層)_凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿 墊(+)；并且用玻璃棒仔細去除氣泡。PVDF膜的一側(cè)靠近正極，要保持膜是濕潤的。(九)濕轉(zhuǎn)恒流電泳100mA。時間大約60 lOOmin，根據(jù)預(yù)染Marker的條帶進 行調(diào)整。(十)洗滌將PVDF膜取下，用蒸餾水洗滌2遍，每次2min。(十一)封閉含5%脫脂牛奶的TBST液，過夜。(十二)洗滌TBST洗滌三遍。每次10分鐘。(十三)加入一抗加入含5%脫脂奶粉TBST稀釋過的抗體。(十四)洗滌TBST洗滌三遍。每次10分鐘。(十五)加入HRP-二抗用含5%脫脂奶粉TBST稀釋到合適的比例(十六)洗滌TBST洗滌三遍。每次10分鐘。(十七)加入HRP-DAB底物。室溫2 5分鐘。(十八)掃面結(jié)果圖片從圖中可以看出原核表達的蛋白能夠和lect2蛋白抗體結(jié)合，說明上述得到的基 因確為Lect2基因。
權(quán)利要求
一種草魚白細胞化學吸引素2基因，其特征在于具有以下RNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列1 TTATCAATTACTAAAGCCAGCTGAACTTTGCATTTGAGTCCTCACTACATCCTTACCCAC61 AAACTGACACAAACAGACTGAGGACAACAGCAGAGAAGAAAGCATCGGAAAACAAATGCT121TATAGGATC130ATG AGA CTT TAC ATC CTT CTC AGT TTT CTG CTT TTG GCA GTG TTT TGC AGC Met Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Ala Val Phe Cys Ser 17181TCT CTT GTT GAT GCT AGT CGA GTG AAA TTT GGC ACC CTC TGC AGT CGT AAC Ser Leu Val Asp Ala Ser Arg Val Lys Phe Gly Thr Leu Cys Ser Arg Asn 34232CCA AGT AAC CGT CAA AGA GGA TGT GAT AAA AAG TAT GGC TGT GGA CAC TAT Pro Ser Asn Arg Gln Arg Gly Cys Asp Lys Lys Tyr Gly Cys Gly His Tyr 51283GGA GCC AAG CGT GGG AAT CGG AAA CAT ATG GGT CTT GAC ATT ATG TGT GCT Gly Ala Lys Arg Gly Asn Arg Lys His Met Gly Leu Asp Ile Met Cys Ala 68334GAT GGA GAC ACA GTT GTT GCT CCA TTT GAT GTG AAG TTG AAC GGC AGA TTT Asp Gly Asp Thr Val Val Ala Pro Phe Asp Val Lys Leu Asn Gly Arg Phe 85385ATG CCA TAC TCA CAG AAC AAC GCT ATC AAT GAT GGC ATT AAC TTG AGC GGA Met Pro Tyr Ser Gln Asn Asn Ala Ile Asn Asp Gly Ile Asn Leu Ser Glv 102436CAA GGT TTT TGC TTC AAG CTG TTT TAC GTT AAG CCA GAC CGT TAC TTT GGG Gln Gly Phe Cys Phe Lys Leu Phe Tyr Val Lys Pro Asp Arg Tyr Phe Gly 119487ACC CTA AAG AAA GGG CAG AGG ATC GGA CGT ATG CTC CCA ATG CAG AGG GTT Thr Leu Lys Lys Gly Gln Arg Ile Gly Arg Met Leu Pro Met Gln Arg Val 136538TAT CCT GGC ATC ACT TCC CAT GTT CAC GTT CAA ATG TGT GAC AGA TCA GAT Tyr Pro Gly Ile Thr Ser His Val His Val Gln Met Cys Asp Arg Ser Asp 153589CCC ACC AAG TAT TTT TGA Pro Thr Lys Tyr Phe 158607TGCCGATTTTGATGACCAACTGCAACTATCAAACCACTTCAAAATTTTTTGCCATACTTT667AAAAAATAATTCAAGAGACCTGTTACAAATTAAATTCCAAGTTAAAAATGATCATTTATT727GATTTAATTAAAACTTTTAAGCTGCAAACATTATTTTTTTAGTTCTTTAGTTCATAATAA787TGTTGATCATTACATTAACTTAATAGTGTGTGTAATTTAAACTCAAATTTCTGTTAATTG847ATTGATTGTTATTTTTTTGTTGAGCCAGCATATTTTTTTGTGTATATATCAGCTTTTTTT907TTACATGCTGGTGCCCAGCACTTTGCGATTTAACAATAAAGTTTTTAAGACTAAAAAAAA967AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
全文摘要
本發(fā)明公開了草魚白細胞化學吸引素基因2，以本實驗室保存草魚腸道cDNA文庫中白細胞化學吸引素2基因的EST序列為模版設(shè)計引物，結(jié)合RACE技術(shù)，用PCR法擴增克隆得到草魚腸道細胞白細胞化學吸引素2基因的全表達序列。對于研究草魚白細胞化學吸引素2基因結(jié)構(gòu)組成，探討其在草魚抗病中的作用和功能區(qū)域位置，以及與其他物種的區(qū)別都提供了重要的理論依據(jù)。本發(fā)明對探索建立草魚基因組計劃與功能飼料產(chǎn)業(yè)化之間紐帶的方法具有開創(chuàng)性作用。
文檔編號C12N15/12GK101906421SQ20101021723
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者吳江, 府躍軍, 徐恒, 袁恬, 顧繼銳 申請人:通威股份有限公司