專利名稱：具有木聚糖酶活性的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具木聚糖酶活性的多肽及其使用。本發(fā)明還涉及修飾具木聚糖酶活性的多肽以影響(優(yōu)選提高)木聚糖酶活性和/或麩皮溶解性的方法。
背景技術(shù)：
多年來，內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶(EC 3.2. 1.8)(在此稱為木聚糖酶)已被用于來自植物細(xì)胞壁物質(zhì)的復(fù)合碳水化合物的修飾。在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知不同木聚糖酶(來源于不同微生物或植物)的功能性有巨大差異。基于結(jié)構(gòu)和遺傳信息，木聚糖酶已被劃歸不同的糖苷水解酶家族(GH) (Henrissat，1991 ；Coutinho and Henrissat，1999)。直至最近，所有已知并定性的木聚糖酶均屬于家族GHlO或GH11。最近的工作已鑒定了許多其它類型的屬于家族 GH5, GH7, GH8 和 GH43 的木聚糖酶(Coutinho and Henrissat, 1999 ；Collins et al.，2005)。至今GHll家族仍不同于所有其它的GH，它是唯一的只由木聚糖特異性木聚糖酶組成的家族。GHll木聚糖酶的結(jié)構(gòu)可描述為β-果凍卷(β-Jelly roll)結(jié)構(gòu)(見本文所述

圖1)。US 6，682，923涉及木聚糖酶活性蛋白及核酸。已用定性清楚的純底物進(jìn)行了表征木聚糖酶功能性的全面研究(Kormelink et al.，1992)。這些研究顯示不同的木聚糖酶對(duì)于阿拉伯糖基木聚糖(AX)之木糖主干的取代具有不同的特殊要求。某些木聚糖酶需要三個(gè)非取代的木糖殘基以水解木糖主干；其它的僅需要一個(gè)或兩個(gè)。據(jù)認(rèn)為造成特異性方面的這些差異的原因是由于催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，其繼而又取決于木聚糖酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即氨基酸序列。不過，這些氨基酸序列上的差異向木聚糖酶功能性上差異的轉(zhuǎn)化至今尚未在木聚糖酶作用于復(fù)雜環(huán)境諸如植物材料中的情況下得到證明。在小麥(小麥面粉)中發(fā)現(xiàn)的木聚糖酶底物傳統(tǒng)上被分成兩部分水不可提取的AX (WU-AX)和水可提取的AX (WE-AX)。WU-AX WE-AX的比例在小麥面粉中是大約 70 30。關(guān)于為何有兩種不同的AX組分存在眾多的解釋。較早的文獻(xiàn)(D'Appolonia and MacArthur (1976)以及 Montgomeryand Smith (1955))描述了 WE-AX 和 WU-AX 之間在取代程度上相當(dāng)大的差異。在WE-AX中發(fā)現(xiàn)最高程度的取代。這被用于解釋為何某些AX是可提取的。相較于較低取代程度(它會(huì)引起聚合物之間的氫鍵形成及隨之而來的沉淀)而言， 高度取代使得聚合物可溶。不同木聚糖酶功能性之間的差異被認(rèn)為歸因于木聚糖酶特異性上的差異以及它們由此對(duì)WU-AX或TO-AX底物的偏愛。不過，更新近的文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)在TO-AX和WU-AX之間取代程度有同樣巨大的差異。因此，除了木聚糖酶底物特異性之外的其它參數(shù)可能是具有重要意義的。這些參數(shù)可能是相對(duì)于WU-AX而言木聚糖酶更偏愛WE-AX，這是由經(jīng)典的底物特異性之外的其它方式確定的。 此參數(shù)在文獻(xiàn)中被描述為底物選擇性。在某些應(yīng)用中(例如面包房)希望從WU-AX組分產(chǎn)生高分子量(HMW)可溶性聚合物。這樣的聚合物與面包制備中的體積增大相關(guān)(Rouau，1993 ;Rouau et al.，1994 andCourtin et al. ,1999).在其它應(yīng)用中期望修飾WU-AX和TO-AX 二者，使WU-AX溶解，降低分子量，減少它們的水狀膠質(zhì)效果，產(chǎn)生阿拉伯糖基木聚糖寡糖，從而可以進(jìn)一步降解其它細(xì)胞壁組分 (諸如在餅干生產(chǎn)、面粉分離、飼料施用、生物乙醇產(chǎn)生、益生元等等方面)。各種應(yīng)用中所用木聚糖酶的所有上述特性針對(duì)的是木聚糖酶的性能并且對(duì)于獲得所需的功能性而言是非常重要的。不過，選擇具有正確特性的木聚糖酶用于某些應(yīng)用中或改造已知的木聚糖酶以達(dá)到此目的，經(jīng)常導(dǎo)致了較低效率的木聚糖酶分子，例如具有低催化活性的分子(即由分子單位/mg木聚糖酶蛋白表征的比活性)。由于這些分子是待用于商業(yè)用途的，因此具有盡可能高的催化活性是非常重要的。由于農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物諸如谷類麩皮使用的增加或者在纖維素生物乙醇生產(chǎn)中的使用，此特性的改善對(duì)于未來實(shí)現(xiàn)這些酶的商業(yè)應(yīng)用而言將是越來越重要的。發(fā)明簡述本發(fā)明基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即通過相較于SEQ ID No. 1中所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶多肽序列而言在第110位修飾具木聚糖酶活性的多肽有可能增加該酶的麩皮溶解性和/或木聚糖酶活性。由此，本發(fā)明的發(fā)明者已證明可能產(chǎn)生具有增加的木聚糖酶活性和/或麩皮溶解性的木聚糖酶多肽。這將例如使得涉及纖維素生物乙醇生產(chǎn)的谷類加工過程中半纖維素組分的水解成為可能，或者使得諸如動(dòng)物飼料、淀粉液化，食物烘焙、面粉分離(濕磨法)、益生元產(chǎn)生以及紙和紙漿生產(chǎn)等許多應(yīng)用中所需要的木聚糖酶的量減少。第一方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含與SEQ ID No. 1具至少88%同一性或與選自SEQ ID No. 2-22之氨基酸序列具至少75%同一性的氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。第二方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含與SEQ ID No. 1具至少88%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。第三方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含與SEQ ID No. 2具至少75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含與SEQ IDNo. 3具至少 75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第 110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及鑒定本發(fā)明多肽的方法，所說方法包括(i)制備與SEQ ID No. 1具至少88%同一性或與選自SEQ ID No. 2-22之氨基酸序列具至少75%同一性的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110 位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ IDNo. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置；(ii)將所說多肽的麩皮溶解和/或木聚糖酶活性與選自SEQ ID NOs 1~22之中的與其具有最高同一性百分比的氨基酸序列的麩皮溶解和/或木聚糖酶活性進(jìn)行比較；然后(iii)如果相較于SEQ ID NOs :1_22之中的、與其具有最高同一性百分比的氨基酸序列而言具有改善的麩皮溶解和/或改善的木聚糖酶活性則選擇該多肽。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明多肽的方法，所說方法包括表達(dá)編碼所說多肽的核苷酸序列；并在表達(dá)后任選地分離和/或純化該多肽。在某些實(shí)施方案中，通過修飾多肽氨基酸序列第110位或在編碼多肽氨基酸序列之核苷酸序列中編碼第110位氨基酸殘基之密碼子來制備所述多肽，其中第110位參照SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列確定。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的載體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及已被編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列轉(zhuǎn)化或已被包含編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及已被編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列轉(zhuǎn)化或已被包含編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主生物體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明方法鑒定之多肽的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明制備之多肽的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含含有編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的載體的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含已被編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含含有編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的載體的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含已被編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列轉(zhuǎn)化或已被含有編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化之生物體并混合非毒性組分的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明所述多肽或依照本發(fā)明鑒定之多肽或依照本發(fā)明制備之多肽或符合本發(fā)明之核苷酸序列或符合本發(fā)明之載體或符合本發(fā)明之細(xì)胞或符合本發(fā)明之生物體混合非毒性組分或符合本發(fā)明之組合物的面團(tuán)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明所述多肽或依照本發(fā)明鑒定之多肽或依照本發(fā)明制備之多肽或符合本發(fā)明之核苷酸序列或符合本發(fā)明之載體或符合本發(fā)明之細(xì)胞或符合本發(fā)明之生物體混合非毒性組分或符合本發(fā)明之組合物或符合本發(fā)明之混合物的食物烘焙產(chǎn)品。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明所述多肽或依照本發(fā)明鑒定之多肽或依照本發(fā)明制備之多肽或符合本發(fā)明之核苷酸序列或符合本發(fā)明之載體或符合本發(fā)明之細(xì)胞或符合本發(fā)明之生物體混合非毒性組分或符合本發(fā)明之組合物的動(dòng)物飼料。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含木聚糖酶的洗滌組合物。在某些實(shí)施方案中， 所述的洗滌組合物是衣物洗滌組合物，而在其它的實(shí)施方案中所述洗滌組合物是盤碟洗滌劑。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述的盤碟洗滌劑是自動(dòng)盤碟洗滌劑。在某些另外的實(shí)施方案中，含木聚糖酶的洗滌組合物進(jìn)一步包含一種或更多種另外的酶。在某些實(shí)施方案中，所述的另外的酶選自半纖維素酶、纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木質(zhì)酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanases, β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、硫酸軟骨素酶、漆酶和淀粉酶或它們的混合物。在某些實(shí)施方案中，使用酶的組合(即“雞尾酒”)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及降解或修飾植物細(xì)胞壁的方法，該方法包括令所說的植物細(xì)胞壁接觸本發(fā)明所述多肽或依照本發(fā)明鑒定的多肽或依照本發(fā)明制備的多肽或本發(fā)明所述核苷酸序列或本發(fā)明所述載體或本發(fā)明所述細(xì)胞或本發(fā)明所述生物體混合非毒性組分或本發(fā)明所述組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及加工植物材料的方法，該方法包括使所述的植物材料接觸本發(fā)明之任一項(xiàng)所述多肽或依照本發(fā)明鑒定的多肽或依照本發(fā)明制備的多肽或本發(fā)明所述核苷酸序列或本發(fā)明所述載體或本發(fā)明所述細(xì)胞或本發(fā)明所述生物體混合非毒性組分或本發(fā)明所述組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及在修飾植物材料的方法中使用本發(fā)明所述多肽或依照本發(fā)明鑒定的多肽或依照本發(fā)明制備的多肽或本發(fā)明所述核苷酸序列或本發(fā)明所述載體或本發(fā)明所述細(xì)胞或本發(fā)明所述生物體混合非毒性組分或本發(fā)明所述組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述多肽或依照本發(fā)明鑒定的多肽或依照本發(fā)明制備的多肽或本發(fā)明所述核苷酸序列或本發(fā)明所述載體或本發(fā)明所述細(xì)胞或本發(fā)明所述生物體混合非毒性組分或本發(fā)明所述組合物在以下任一方面或多方面的用途食物烘焙、谷類加工、淀粉液化、從纖維素材料生產(chǎn)生物乙醇、動(dòng)物飼料、木材加工、提高木漿漂白。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及實(shí)質(zhì)上如上文所述與實(shí)施例和附圖有關(guān)的多肽或其片段。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及實(shí)質(zhì)上如上文所述與實(shí)施例和附圖有關(guān)的方法。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及實(shí)質(zhì)上如上文所述與實(shí)施例和附圖有關(guān)的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及實(shí)質(zhì)上如上文所述與實(shí)施例和附圖有關(guān)的用途。圖例說明在此參看以下附圖。圖1顯示了疊加的枯草芽孢桿菌XynA變體木聚糖酶(TllOA)(黑色)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)Xyn2 變體木聚糖酶(T120A)(深灰)和嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus) XynA變體木聚糖酶(T120A)(淺灰)。突變的殘基TllO和T120分別被突出顯不。圖2顯示了利用AlignX程序(vectorNTI組的一部分)以適合多重比對(duì)的默認(rèn)值 (缺口開放罰分10og缺口延伸罰分0. 05)進(jìn)行的SEQID NO 1~22的多重序列比對(duì)。序列左邊的數(shù)字代表SEQ ID NOs0發(fā)明詳述
已報(bào)道木聚糖酶來自近100種不同的生物體，包括植物、真菌和細(xì)菌。這些木聚糖酶被劃歸到超過40個(gè)糖基水解酶家族中的數(shù)個(gè)內(nèi)。糖基水解酶包括木聚糖酶，甘露聚糖酶，淀粉酶，β -葡聚糖酶，纖維素酶及其它糖酶，基于諸如氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)的幾何學(xué)等特性進(jìn)行分類(Gilkes, et al.，1991，Microbiol. Reviews 55 :303-315)。一方面，本發(fā)明涉及具木聚糖酶活性并且相對(duì)于SEQ ID NO 1_22的任一氨基酸序列而言包含至少三個(gè)(諸如5、6、7、8、9或10個(gè))氨基酸取代的多肽，該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。一方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含氨基酸序列的多肽，所說氨基酸序列與SEQ ID No. 1具至少88%同一性或與選自SEQ IDNo. 2_22之氨基酸序列具至少75% 同一性，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。本發(fā)明所述多肽內(nèi)的特定氨基酸位置是利用標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)工具通過將所說多肽的氨基酸序列與SEQ ID No. 1進(jìn)行比對(duì)而確定的，譬如用Smith-Waterman運(yùn)算法則或用CLUSTALW2運(yùn)算法則比對(duì)兩個(gè)序列，其中當(dāng)比對(duì)得分最高時(shí)認(rèn)為所述序列是對(duì)準(zhǔn)的。 比對(duì)得分可依照 Wilbur，W. J. and Lipman，D. J. (1983)Rapid similarity searches of nucleicacid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :726-730 中所述的方法進(jìn)行計(jì)算。在ClUStalW2(1.82)運(yùn)算法則中優(yōu)選使用默認(rèn)參數(shù)蛋白質(zhì)缺口開放罰分 =10.0 ；蛋白質(zhì)缺口延伸罰分=0.2 ；蛋白質(zhì)矩陣=Gonnet ；蛋白質(zhì)/DNA端隙=-1 ；蛋白質(zhì) /DNAGAPDIST = 4.優(yōu)選用AlignX程序(vectorNTI組中的一部分)以適于多重比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)(缺口開放罰分10og缺口延伸罰分0.05)通過將多肽的氨基酸序列與SEQ ID No. 1進(jìn)行比對(duì)來確定本發(fā)明所述多肽內(nèi)特定氨基酸的位置。對(duì)于本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案而言，可如本文圖2所述進(jìn)行序列比對(duì)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含與SEQ IDNo. 1具至少 88%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第 110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且與SEQ ID No. 2具至少75% 同一性的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且與SEQ ID No. 3具至少75% 同一性的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且與SEQ ID No. 4具至少75% 同一性的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性并且包含與SEQ IDNo. 1具至少 75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有替換為選自下述的任一種不同氨基酸殘基的氨基酸取代谷氨酸、色氨酸、丙氨酸和半胱氨酸，其中所說的第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。除非另外聲明，否則術(shù)語關(guān)于氨基酸的“序列同一性”用于此處時(shí)指按照 (nref-ndif) · 100/riMf計(jì)算的序列同一性，其中ndif是比對(duì)時(shí)兩個(gè)序列中不相同的殘基總數(shù)目，而其中的nMf是其中一個(gè)序列的殘基數(shù)目。因此，氨基酸序列ASTDYWQNWT與序列 ASTGYffQAffT 具有 80% 的序列同一性(ndif = 2 和 nref = 10)。在某些實(shí)施方案中用常規(guī)方法確定序列同一性，例如Smith andffaterman,1981, Adv. App 1. Math. 2 :482, fflil Pearson & Lipman，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444 的搜索相似性方法，用 Thompson et al.，1994，Nucleic Acids Res 22 :467380 的 CLUSTAL W運(yùn)算法則，通過計(jì)算機(jī)化運(yùn)行這些運(yùn)算法則(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP， BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和 TFASTA，Genetics Computer Group)。此外還可使用其軟件可獲自美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information www. ncbi. nlm. nih. gov/)的 BLAST 運(yùn)算法則(Altschul et al.，1990，Mol. Biol. 215 :403-10)。在利用任何上述運(yùn)算法則時(shí)，對(duì)于“窗口”長度、缺口罰分等使用默認(rèn)參數(shù)。術(shù)語“修飾”用于此處意指對(duì)選自SEQ ID NO 1~22的多肽之任一氨基酸或氨基酸序列的任何化學(xué)修飾，以及編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、刪除和/或插入以及一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈的置換。在某些實(shí)施方案中，具木聚糖酶活性的所述多肽相對(duì)于SEQ ID No. 1-22只具有氨基酸取代。應(yīng)當(dāng)理解，在給定多肽中的“修飾”是相對(duì)于選自SEQ ID NO 1~22之中的、與此給定多肽具最高百分比序列同一性的多肽而言的。此說明書中所用有關(guān)氨基酸取代的術(shù)語如下。第一個(gè)字母代表特定序列某一位置上天然存在的氨基酸。后面的數(shù)字代表相對(duì)于SEQ ID No. 1的位置。第二個(gè)字母代表取代該天然氨基酸的不同氨基酸。譬如D11F/R122D/T110A，其中SEQ ID NO :1的第11位天冬氨酸被苯丙氨酸取代，SEQ ID NO 1的第122位精氨酸被天冬氨酸取代，第110位蘇氨酸被丙氨酸取代，全部三個(gè)突變均在具木聚糖酶活性的同一多肽內(nèi)。除了本發(fā)明所述具木聚糖酶活性之多肽內(nèi)的氨基酸修飾之外，所述多肽可能還進(jìn)一步具有性質(zhì)輕微的氨基酸取代，即不顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小的刪除，通常1至約30個(gè)氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基；長達(dá)約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而方便純化的小的延伸，諸如多聚組氨酸束、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。保守取代的例子是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸和甲硫氨酸)組內(nèi)的取代。通常不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域所已知的并可參閱例如 H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, AcademicPress, New York。 最普遍發(fā)生的交換是丙氨酸對(duì)絲氨酸、纈氨酸對(duì)異亮氨酸、天冬氨酸對(duì)谷氨酸、蘇氨酸對(duì)絲氨酸、丙氨酸對(duì)甘氨酸、丙氨酸對(duì)蘇氨酸、絲氨酸對(duì)天冬酰胺、丙氨酸對(duì)纈氨酸、絲氨酸對(duì)甘氨酸、酪氨酸對(duì)苯丙氨酸、丙氨酸對(duì)脯氨酸、賴氨酸對(duì)精氨酸、天冬氨酸對(duì)天冬酰胺、亮氨酸對(duì)異亮氨酸、亮氨酸對(duì)纈氨酸、丙氨酸對(duì)谷氨酸以及天冬氨酸對(duì)甘氨酸。除了 20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(諸如4-羥脯氨酸、6-/V-甲基賴氨酸、 2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可能取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)目的非保守氨基酸、不是由遺傳密碼編碼的氨基酸以及非天然氨基酸可能取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被?在蛋白質(zhì)合成后被修飾以及/或者在它們的側(cè)鏈具有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可化學(xué)合成，并優(yōu)選的可商品化獲得，且包括哌啶酸、 噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3_ 二甲基脯氨酸。術(shù)語“宿主生物體”用于此處時(shí)包括可以接受包含編碼本發(fā)明所述多肽之多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。就本發(fā)明目的而言，木聚糖酶意指具木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)或多肽。短語“具木聚糖酶活性的多肽”用于此處指在諸如本文所述之木聚糖酶測定中具活性的任何蛋白質(zhì)或多肽。木聚糖酶活性可以任何測定法來檢測，其中使用的底物包括木聚糖內(nèi)的1， 4-i3_D-木糖苷內(nèi)鍵。測定中所用的pH和溫度是適合所述木聚糖酶的。譬如合適的pH值是 4，5，6，7，8，9，10 或 11。譬如合適的溫度是 30，35，37，40，45，50，55，60，65，70 或 80°C。 有不同類型的底物可用于測定木聚糖酶活性，例如Xylazyme片劑(交聯(lián)的染色木聚糖底物，Megazyme, Bray, Ireland)。優(yōu)選的，用以下測定法檢測木聚糖酶活性。泖丨雜(力-β -1，4-舌十牛)在此測定法中將樣品稀釋于檸檬酸(0. 1M)-磷酸氫二鈉(0. 2M)緩沖液pH 5. 0中以達(dá)到大約OD59tl = 0. 7。將三個(gè)不同稀釋度的樣品在40°C預(yù)保溫5分鐘。在時(shí)間達(dá)到5分鐘時(shí)，將1片Xylazyme片劑(交聯(lián)的染色的木聚糖底物，Megazyme，Bray，Ireland)加入反應(yīng)體積為Iml的酶溶液中。在時(shí)間達(dá)到15分鐘時(shí)通過加入IOml的2% TRIS/NaOH, pH 12 終止反應(yīng)。用1000 μ 1緩沖液替代酶溶液制備空白。將反應(yīng)混合物離心(1500Xg，10分鐘， 20°C)并在590nm檢測上清液的0D。一個(gè)木聚糖酶單位(XU)定義為將OD59tl每分鐘升高 0. 025的木聚糖酶活性。以上測定法中所用的底物(提取自小麥的交聯(lián)并染色的阿拉伯糖基木聚糖)非常近似商業(yè)應(yīng)用中的相應(yīng)底物?？苫趤碜訬C-IUBMB的酶命名法手冊(cè)(1992)將酶進(jìn)一步的分類，也可參閱 ENZYME的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址http://www. expasy. ch/enzyme八ENZYME是與酶命名法有關(guān)的信息庫。它主要基于國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)協(xié)會(huì)(IUB-MB)命名委員會(huì)的推薦，并且描述了對(duì)其已提供EC (Enzyme Commission)編號(hào)的每一類型的已定性酶(Bairoch A. TheENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 沘304-305)。此 IUB-MB 酶命名法是是以它們的底物特異性為基礎(chǔ)的，有時(shí)候也以它們的分子機(jī)制為基礎(chǔ)；這樣的分類不反應(yīng)這些酶的結(jié)構(gòu)特性。在本發(fā)明的一方面，木聚糖酶是歸類為EC 3.2.1.8的酶。正式名稱是內(nèi)_1， 4-β -木聚糖酶.系統(tǒng)名稱是1，4-β -D-木聚糖酶(xylanxylanohydrolase)?？赡苁褂闷渌拿Q，諸如內(nèi)-(1-4)-β-木聚糖酶；(1-4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶(xylanohydrolase)；內(nèi)_1，4_木聚糖酶；木聚糖酶；β-1，4_木聚糖酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-β_1，4-木聚糖酶；內(nèi)-l，4-i3-D-木聚糖酶；1，4-β-木聚糖酶 (xy lanxy lanohydrolase) ；β-木聚糖酶；β_1，4_ 木聚糖酶(xy lanxy lanohydrolase)； 內(nèi)-1，4- β -木聚糖酶；β -D-木聚糖酶。催化的反應(yīng)是木聚糖內(nèi)1，4- β -D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。在幾年前已提出在基于氨基酸序列相似性的家族內(nèi)對(duì)某些糖苷水解酶進(jìn)行另外的分類，諸如內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。它們目前屬于90個(gè)不同的家族參閱CAZy (ModO)互聯(lián)網(wǎng)址(Coutinho，P. Μ. & Henrissat, B. (1999)碳水化合物活性醇月艮務(wù)器(Carbohydrate-Active Enzymes server) 在:http://afmb. cnrs-mrs. fr/_cazy/CAZY/index, html (相應(yīng)文獻(xiàn)Coutinho, P. Μ. & Henrissat,B. (1999)Carbohydrate-active enzymes :an integrated database approach。 在"Recent Advances inCarbohydrate Bioengineering " , HJ. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson 編輯，The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12 ;Coutinho, P. M. & Henrissat, B. (1999)Themodular structure of cellulases and other carbohydrate-activeenzymes :an integrated database approach cIll0 在"Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation" . , K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S.Karita and T. Kimura eds. , Uni Publishers Co., Tokyo,pp.15-23 中)。本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的木聚糖酶是糖苷水解酶(GH)家族11的木聚糖酶。術(shù)語“糖苷水解酶(GH)家族11的”意指所述木聚糖酶是或者可歸類于GH家族11。應(yīng)當(dāng)理解蛋白質(zhì)相似性搜索(類似例如http://toolkit. tuebinRen. mpg. de/ prot_blast上的ProteinBlast)可能不必確定未知序列實(shí)際上是否落在GHll木聚糖酶家族成員的范疇內(nèi)。用blast搜索找到的蛋白質(zhì)序列可能具有相對(duì)高的同一性/同源性但仍然不是真實(shí)的木聚糖酶，而且更進(jìn)一步的，不是屬于GHll的木聚糖酶?；蛘撸鞍踪|(zhì)序列可能具有相對(duì)低的一級(jí)氨基酸序列同一性但仍是GHll木聚糖酶家族的成員。為了確定未知蛋白質(zhì)序列實(shí)際上是否是GHll家族內(nèi)的木聚糖酶蛋白質(zhì)，要進(jìn)行評(píng)估，不只對(duì)序列的相似性，而且還對(duì)3D-結(jié)構(gòu)的相似性評(píng)估，因?yàn)镚H-家族內(nèi)的分類取決于3D折疊。可預(yù)測未知蛋白質(zhì)序列之 3D 折疊的軟件是 HHpred (http://toolkit. tuebinRen. mpR. de/hhpred)。此軟件用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的能力依賴于用已知結(jié)構(gòu)作為模板鑒定同源序列。此軟件運(yùn)行良好，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)趨異比一級(jí)序列要慢得多。同一家族的蛋白質(zhì)可能具有非常相似的結(jié)構(gòu)，即便是當(dāng)它們的序列趨異到無法認(rèn)出的時(shí)候。在實(shí)踐中，可將未知序列以FASTA格式粘貼到軟件(http //toolkit, tuebingen. mpg. de/hhpred)中。做完此步后，提交搜索。搜索輸出信息將顯示具有已知3D結(jié)構(gòu)的序列清單。為了證實(shí)未知序列真的是GHll木聚糖酶，應(yīng)在具有大于90的可能性的同源物清單內(nèi)找到GHll木聚糖酶。并非所有被鑒定為同源物的蛋白質(zhì)都會(huì)被定性為GHll木聚糖酶， 而是某些會(huì)。后者的蛋白質(zhì)是具有已知結(jié)構(gòu)以及鑒定其為木聚糖酶之生化特性的蛋白質(zhì)。 前者則沒有在生化上被定性為GHll木聚糖酶。有多篇文獻(xiàn)描述了此流程，諸如Siiding J. (2005)Protein homologydetection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics 21， 951-960(doi :10. 1093/bioinformatics/btil25)禾口 SSding J，BiegertA， and Lupas AN. (2005)The HHpred interactive server for proteinhomology detection andstructure prediction. Nucleic AcidsResearch 33, W244—W248 (Web Server issue) (doi :10.1093/nar/gki40)。依照Cazy (ModO)位點(diǎn)，家族11糖苷水解酶可定性如下已知活性木聚糖酶(EC 3. 2. 1. 8)機(jī)制保留催化親核物質(zhì)/堿基谷氨酸(實(shí)驗(yàn)性的)催化質(zhì)子供體谷氨酸(實(shí)驗(yàn)性的)3D結(jié)構(gòu)狀態(tài)折疊β-果凍卷(β-jelly roll)家族GH_C用于此處時(shí)，“家族C"指享有共同的三維折疊和相同的催化機(jī)制的家族類型 (參閱，例如 Henrissat，B. and Bairoch, Α.，(1996) Biochem. J.，316，695—696)。用于此處時(shí)，“家族11〃 指 Henrissat and Bairoch (1993) BiochemJ. ,293, 781-788 所確立的一個(gè)酶家族(還可參閱 Henrissat andDavies (1997) Current Opinion in Structufal Biol. 1997，& :637-644)。家族11成員的共同特征包括高度遺傳同源性，大約20kDa的大小以及雙重取代催化機(jī)制(參閱Tenkanen et al.，1992 ；Wakarchuket al.， 1994)。家族11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)包括由β-鏈組成的兩個(gè)大的β-片層和α-螺旋。家族11木聚糖酶包括但不局限于以下黑曲霉(Aspergi llusnigeiOXynA、 白曲霉(Aspergillus kawachiir)XynC> Aspergillustubigensis XynA,環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)XynA> Baci 1 luspunziIus XynA,枯草芽抱桿菌 XynA, Neocalliniastixpatriciarum XynA,變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)XynB,變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)XynC, Streptomycestherinoviolaceus XynII, 赫色嗜熱單抱菌(Thermomonosporafusca) XynA,哈茨木霉(Trichoderma harzianum) Xyn, Tyichodermareesei XynI,里氏木霉(Trichoderma reesei)XynII,綠色木霉 (Trichodermaviride)Xyn0用于此處時(shí)，“野生型”指天然的或自然存在的序列或蛋白質(zhì)。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的木聚糖酶來源于細(xì)菌木聚糖酶，例如來自 ⑴厚壁菌門；(ii)芽孢桿菌綱；(iii)芽孢桿菌目；(iv)類芽孢桿菌科；或(ν)類芽孢桿菌屬的細(xì)菌；例如來自(Vi)類芽孢桿菌(Paenibacillus pabuli)，多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)或類芽孢桿菌種(Paenibacillus sp.)的細(xì)菌；例如來自 (vii)類芽孢桿菌或多粘類芽孢桿菌(I^enibacillus polymyxa)的菌株。表述"衍生自細(xì)菌木聚糖酶的木聚糖酶"用于此處時(shí)包括分離自所述細(xì)菌的任何野生型木聚糖酶，及其保持木聚糖酶活性的變體或片段。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的木聚糖酶衍生自真菌木聚糖酶。上述"衍生自"的定義(在細(xì)菌木聚糖酶的上下文中)也可類推適用于真菌木聚糖酶.舉例而言，家族11糖苷水解酶的真菌木聚糖酶是可衍生自以下真菌屬的那些類型曲霉屬(Aspergillus)，短梗霉屬(Aureobasidium)，裸胞殼屬(Emericella)，鐮孢菌 (Fusarium)，頂囊殼屬(Gaeumannomyces)，腐殖霉屬(Humicola)，香燕屬(Lentinula)，禾S 癌菌屬(Magnaporthe), Neocallimastix,擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis), Orpinomyces,擬青霉屬(Paecilomyces)，青霉屬(Penicillium)，畢赤酵母屬(Pichia)，裂褶菌屬 (Schizophyllum),踝節(jié)菌屬(Talaromyces),嗜熱真菌屬(Thermomyces),木霉菌屬 (Trichoderma)。真菌木聚糖酶包括酵母和絲狀真菌木聚糖酶。在某些實(shí)施方案中，木聚糖酶是衍生自⑴子囊菌門；(ii)盤菌綱；(iii)散囊菌目；(iv)散囊菌亞目；(ν)發(fā)菌科的真菌，例如絲孢發(fā)菌(mitosporic Trichocomaceae)；或來自(vi)曲霉屬(Aspergillus)的真菌； 例如來自(vii)黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株。應(yīng)當(dāng)理解前述物種的定義包括完美的和不完美的狀態(tài)，以及其它的分類學(xué)對(duì)等物例如變形物，不管它們已知的物種名稱為何。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易認(rèn)知合適的對(duì)等物的身份。上述細(xì)菌和真菌菌株是公眾在許多培養(yǎng)物收藏中心可方便獲得的，諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，德國微生物菌種保藏中心 (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ),荷蘭微生物菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures, CBS)和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏中心北方區(qū)石if究中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection, Northern Regional ResearchCenter, NRRL)。涉及分類學(xué)的問題可查閱分類學(xué)數(shù)據(jù)庫諸如可從以下網(wǎng)址獲得的NCBI分類學(xué)瀏覽器:http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 分類學(xué) / 分類學(xué) home, html/。不過， 優(yōu)選參考以下手冊(cè)Dictionary of the Fungi,9thedition, edited by Kirk, P. Μ., P. F. Cannon,J. C. David & J. A. Stalpers,CAB Publishing,2001 ；禾口Bergey' s Manual of SystematicBacteriology, Second edition(2005)。本發(fā)明涉及在某些氨基酸位置的修飾。這些位置是參考SEQ ID No. 1所示的枯草芽孢桿菌氨基酸序列而列出的。在本發(fā)明中，具木聚糖酶活性的多肽至少在相較于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌序列的第110位具有修飾?？赡芡ㄟ^將其它家族11木聚糖酶與 SEQ ID No. 1進(jìn)行比對(duì)并確定哪一個(gè)氨基酸對(duì)準(zhǔn)SEQ ID No. 1的特定氨基酸來找到在其它家族11木聚糖酶中的同等位置(例如，參閱實(shí)施例5)。以某一序列作為第一參照的所述比對(duì)和用法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言僅僅是例行公事而已。一方面，本發(fā)明所述的木聚糖酶變體具有提高的麩皮溶解活性，該活性在“麩皮溶解測定法”中高于使用相應(yīng)野生型木聚糖酶或包含選自SEQ ID No. 2-22中之氨基酸序列的任一木聚糖酶所獲得的活性。一方面，本發(fā)明所述木聚糖酶具有由于第110位的修飾而造成的提高的麩皮溶解活性。適當(dāng)?shù)模捎帽疚乃峁┑柠熎と芙鉁y定法檢測木聚糖酶麩皮溶解活性。由此，可提供具增加的木聚糖酶活性和/或增加的麩皮溶解活性的多肽。對(duì)WU-AX特異性的需求越來越重要，因?yàn)樵S多應(yīng)用是使用濃度提高的谷類麩皮。由于健康和營養(yǎng)的問題，面包制造業(yè)在許多產(chǎn)品中提高了麩皮濃度，由于在例如生物乙醇生產(chǎn)中使用谷類，飼料工業(yè)摻入了數(shù)量越來越多的麩皮物質(zhì)(纖維，具有可溶物的干酒糟(DistilersDried Grains with Solubles, DDGS)) 0因此提供特異性增加且由此溶解此麩皮物質(zhì)的效率增高的新木聚糖酶是有利的。麩皮溶解測定法
優(yōu)選的，用以下測定法檢測麩皮溶解度。在(0. IM)-磷酸氫二鈉(0.2M)緩沖液，PH 5. 0中制備小麥麩皮懸浮液至濃度 1. 33%麩皮(w/w)。從此懸浮液中，邊攪拌邊將750 μ 1的等分試樣轉(zhuǎn)移入Eppendorph管中。將每個(gè)底物管在40°C預(yù)熱5分鐘。至此，加入250 μ 1酶溶液，使底物終濃度達(dá)到1%。 從每一種木聚糖酶制備三個(gè)稀釋度的稀釋液(一式兩份)，對(duì)于每個(gè)測定時(shí)間點(diǎn)(0，30，60 和240分鐘)具有逐步增加的酶濃度(0. 33、1.0和3. Oyg木聚糖酶/克麩皮)。使用木聚糖酶熱變性溶液作為空白。在給定的時(shí)間通過將管子轉(zhuǎn)移至設(shè)置為95°C的孵育器上終止反應(yīng)。熱變性樣品保存于4°C直至所有的酶反應(yīng)終止。當(dāng)所有的酶反應(yīng)終止時(shí)，將Eppendorph 管離心以獲取清澈的上清液。酶溶解麩皮的能力表現(xiàn)為用PAHBAH測定的還原端基的增加 (Lever,1972)。由于附帶的活性例如淀粉酶活性可能干擾以上測定法，所以麩皮溶解測定法應(yīng)只用純化后的木聚糖酶樣品進(jìn)行(見實(shí)施例2)。一方面，本發(fā)明所述木聚糖酶與任一野生型木聚糖酶或含有選自SEQ ID No. 2-22 之氨基酸序列的任一木聚糖酶相比對(duì)木聚糖酶抑制劑的敏感性降低。在進(jìn)一步的方面，由于在第110位的修飾聯(lián)合以下任一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的一個(gè)或多個(gè)修飾，所述本發(fā)明木聚糖酶活性的多肽對(duì)木聚糖酶抑制劑的敏感性下降11， 12，13,34,54,77,81,99,104，113，114，118，122，141，154，159，162，164，166 和 175。所述抑制劑可以是在植物組織中自然發(fā)現(xiàn)的抑制劑。用于此處時(shí)，術(shù)語“木聚糖酶抑制劑”指其作用為控制植物細(xì)胞壁中所存在的復(fù)雜碳水化合物例如阿拉伯糖基木聚糖解聚的化合物，通常是蛋白質(zhì)。這些木聚糖酶抑制劑能降低自然存在的木聚糖酶以及真菌或細(xì)菌來源木聚糖酶的活性。已報(bào)道在谷類種子中有木聚糖酶抑制劑的存在(參閱例如 McLauchlan et al 1999a ；Rouau and Suget 1998)。McLauchlan等(1999a)公開了來自小麥且結(jié)合并抑制兩種家族_11木聚糖酶的蛋白質(zhì)的分離和定性。同樣地，WO 98/49278證實(shí)了小麥面粉提取物對(duì)均歸類于家族 11木聚糖酶的一組微生物木聚糖酶活性的影響。Debyser等(1999)也公開了來自黑曲霉(Aspergillus niger)和枯草芽孢桿菌的內(nèi)木聚糖酶，它們都是被小麥木聚糖酶抑制劑 TAXI所抑制的家族11木聚糖酶成員。McLauchlan等(1999b)講述了來自商品化面粉諸如小麥、大麥、黑麥和玉米的提取物能抑制家族10和11木聚糖酶。所述木聚糖酶抑制劑可以是任何合適的木聚糖酶抑制劑。舉例而言，所述木聚糖酶抑制劑可能是W0-A-98/49278中所述的抑制劑和/或Rouau，X. and Surget, Α. (1998)，McLauchlan, R.，et al. (1999)所述的木聚糖酶抑制劑和/或英國專利申請(qǐng)?zhí)?9擬8599. 2(于1998年12月23日遞交)、英國專利申請(qǐng)?zhí)?907805. 7 (于1999年4月6日遞交)和英國專利申請(qǐng)?zhí)?908645.6(于1999年4月15日遞交)中所述的木聚糖酶抑制劑。在現(xiàn)有技術(shù)中所描述的抑制劑也可用于測定法中以確定本發(fā)明變體多肽對(duì)木聚糖酶抑制劑的敏感性。它們也可如下文所述用于調(diào)節(jié)木聚糖酶的功能性。木聚糖酶抑制劑測定法優(yōu)選的，用以下測定法檢測木聚糖酶抑制活性。將100 μ 1抑制劑制品(包含多個(gè)濃度的木聚糖酶抑制劑(對(duì)于定量，參閱下文的木聚糖酶抑制劑定量))、250μ1木聚糖酶溶液(含12XU木聚糖酶/ml)和650 μ 1緩沖液 (0. IM 檸檬酸-0. 2Μ 磷酸氫二鈉緩沖液，BSA(Sigma-Aldrich, USA)，pH 5. 0)混合?；旌衔镌?0. 0°C恒溫5分鐘。在時(shí)間為5分鐘時(shí)加入一片Xylazyme片劑。在時(shí)間為15分鐘時(shí)通過加入IOml 2% TRIS/NaOH, pH 12終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物離心(1500xg，10分鐘， 20°C)并在590nm檢測上清液。木聚糖酶抑制計(jì)算為與空白相比較而言的殘留活性百分?jǐn)?shù)。所用的內(nèi)源內(nèi)-β -1，4-木聚糖酶抑制劑可獲自小麥面粉。該抑制劑是二肽，分子量約為40kDa(根據(jù)SDS-PAGE或質(zhì)譜檢測)且等電點(diǎn)約為8至9. 5。迄今為止的序列分析顯示所述抑制劑具有SEQ ID No. M所示序列或與其高度同源。對(duì)給定抑制劑制品中的抑制劑濃度進(jìn)行定量的方法可參閱實(shí)施例3。以同樣方式制備空白，但以水替代抑制劑溶液。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述多肽的核苷酸序列，其包含與一個(gè)或多個(gè)控制序列可操作性連接的核苷酸序列，所述控制序列在與該控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)?？梢远喾N方式處理編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸以提供所述多肽的表達(dá)。在其插入載體之前處理多核苷酸的序列可能是值得做的或必需的，這取決于表達(dá)載體。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？刂菩蛄锌赡苁沁m當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，被宿主細(xì)胞識(shí)別用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽之多核苷酸的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在選定宿主細(xì)胞內(nèi)顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可能獲自與宿主細(xì)胞同源或異源之編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子是獲自以下來源的啟動(dòng)子大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)， 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶基因(amyL)，脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)麥芽淀粉酶基因{amyM)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) α -淀粉酶基因{amyQ)，地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核 β -內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al. , 1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 :3727-3731)，以及 tac 啟動(dòng)子(DeBoer et al. , 1983, Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 80:21-25)。更多的啟動(dòng)子參閱"Useful proteins from recombinant bacteria" in ScientificAmerican, 1980,242 :74-94 ；以及 Sambrook et al.，1989，見上文。指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的例子是獲自以下來源基因的啟動(dòng)子米曲霉(Aspergi llusoryzae) TAKA淀粉酶，米黑根毛霉 (Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶，黑曲霉(Aspergillusniger)酸穩(wěn)定α-淀粉酶，黑曲霉(Aspergillus niger)或泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶{glaA)，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶，米曲霉(Aspergillus oryzae)堿性蛋白酶，米曲霉(Aspergillus oryzae)磷酸丙糖異構(gòu)酶， 構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶，鐮孢霉(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(W000/56900)，鐮孢霉(Fusarium venenatum) Daria (WO 00/56900)，鐮孢霉(Fusariumvenenatum) Quinn (W0 00/56900)，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶 (W0 96/00787)，瑞氏木霉(Thchodermareesei) β -葡萄糖苷酶，里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維二糖水解酶I，里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維二糖水解酶II，里氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切葡聚糖酶I，里氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切葡聚糖酶II，里氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切葡聚糖酶III，里氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切葡聚糖酶IV，里氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切葡聚糖酶V，里氏木霉 (Trichoderma reesei)木聚糖酶I，里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II，里氏木霉(Trichoderma reesei) β -木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子(來自黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶和米曲霉(Aspergillus oryzae)磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；以及它們的突變的、截短的和混合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子獲自以下酶的基因釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(EN0-1)，釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)，釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)，釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase, TPI)，釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)，和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶 (Phosphoglycerate kinase)。其它適于酵母宿主細(xì)胞的有用啟動(dòng)子參閱Romanos et al.， 1992，Yeast 8 :423-488。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，被宿主細(xì)胞識(shí)別來終止轉(zhuǎn)錄的序列。 終止子序列與編碼所述多肽之核苷酸序列的3'末端可操作性的連接。在選定宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的任何終止子均可用于本發(fā)明中。適于絲狀真菌宿主細(xì)胞的終止子可獲自以下酶的有關(guān)基因米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)令PM1 基苯甲酸合Bl (anthranilate synthase),黑曲霄(Aspergillus niger) α-葡萄糖苷酶，和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶。適合酵母宿主細(xì)胞的終止子可獲自釀酒酵母烯醇化酶，釀酒酵母細(xì)胞色素C (CYCl)，和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。其它適于酵母宿主細(xì)胞的有用終止子參閱Romanos et al., 1992，見上文。調(diào)控序列也可能是合適的前導(dǎo)序列，即對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯而言非常重要的mRNA 非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼所述多肽之核苷酸序列的5'末端可操作性連接。在選定宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明中。適于絲狀真菌宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列可獲自米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。適于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列可獲自釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)，釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)，釀酒酵母α -因子和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因。調(diào)控序列還可以是聚腺苷酸化序列，即是與核苷酸序列的3'末端可操作性連接并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)被宿主細(xì)胞識(shí)別為添加聚腺苷酸殘基至被轉(zhuǎn)錄mRNA的信號(hào)的序列。在選定宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的任何聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明中。適于絲狀真菌宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列可獲自米曲霉(Aspergillus oryzae) TAKA淀粉酶，黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)，尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶，和黑曲霉屬(Aspergillus niger) α -葡萄糖苷酶的有關(guān)基因。用于酵母宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列參閱Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15 :5983_5990。調(diào)控序列也可以是編碼與多肽的氨基末端連接之氨基酸序列并指導(dǎo)所編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)。核苷酸序列的編碼序列的5'末端可能固有的包含在翻譯讀碼框架內(nèi)與編碼所述分泌多肽之編碼區(qū)部分天然連接的信號(hào)肽編碼區(qū)。或者，編碼序列的5'末端可能包含對(duì)于編碼序列而言是外來的信號(hào)肽編碼區(qū)。在編碼序列天然不包含信號(hào)肽編碼區(qū)的情況下可能需要外源的信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘撸庠吹男盘?hào)肽編碼區(qū)可能簡單地替代天然信號(hào)肽編碼區(qū)以便促進(jìn)所述多肽的分泌。無論如何，指導(dǎo)被表達(dá)多肽進(jìn)入選定宿主細(xì)胞之分泌途徑即分泌入培養(yǎng)基中的任何信號(hào)肽編碼區(qū)均可能用于本發(fā)明中。適于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是獲自以下有關(guān)基因的信號(hào)肽編碼區(qū)芽孢桿菌(Bacillus)NCIB 11837麥芽糖源淀粉酶，脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophi lus) α-淀粉酶，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) β -內(nèi)酰胺酶，脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophi lus)中性蛋白酶(nprT, nprS, nprM)，禾口枯草芽孢桿菌 prsA。更多的信號(hào)月太參閱 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137。適于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是獲自以下有關(guān)基因的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉(Aspergillus oryzae) TAKA淀粉酶，黑曲霉(Aspergillus niger)中性淀粉酶， 黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶，米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)纖維素酶，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)內(nèi)切葡聚糖酶V，和腐柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶.適于酵母宿主細(xì)胞的有用信號(hào)肽獲自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其它有效的信號(hào)肽編碼區(qū)參閱Romanos et a/.，1992，見上文。調(diào)控序列還可以是編碼定位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。所產(chǎn)生的多肽被認(rèn)為是前酶或多肽原(或在某些情況下是酶原)。多肽原通常是無活性的，但可通過從多肽原催化性或自身催化性切割前肽而轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚远嚯?。前肽編碼區(qū)可能獲自以下編碼下述的基因枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶 (nprf)，釀酒酵母α-因子，米黑根毛霉(I hizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(W095/33836)。當(dāng)信號(hào)肽和前肽區(qū)均存在于多肽的氨基末端時(shí)，前肽區(qū)定位在緊鄰多肽的氨基末端，而信號(hào)肽區(qū)則定位于緊鄰前肽區(qū)的氨基末端。還可適當(dāng)?shù)奶砑釉试S所述多肽表達(dá)相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)序列。 調(diào)節(jié)系統(tǒng)有例如使得基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而開啟或關(guān)閉的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在原核體系內(nèi)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac，teC，和tip操縱子系統(tǒng)。在酵母內(nèi)， 可用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌內(nèi)，TAKA α -淀粉酶啟動(dòng)子，黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉(Aspergillus oryzae)葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)控序列。其它的調(diào)控序列的例子有允許進(jìn)行基因擴(kuò)增的那些調(diào)控序列。在真核體系內(nèi)，這些包括在氨甲喋呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，由于重金屬而被擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些案例中，編碼多肽的核苷酸序列將可操作性的與所述調(diào)控序列連接。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明多肽之多核苷酸、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。本文所述的各種核酸和調(diào)控序列可結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，它可能包含一個(gè)或更多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)以便在所述位點(diǎn)對(duì)編碼所述多肽的核苷酸序列進(jìn)行插入或取代?；蛘撸幋a本發(fā)明所述多肽的核苷酸序列可通過將核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適于表達(dá)的合適載體進(jìn)行表達(dá)。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于所述載體內(nèi)以便編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列可操作性的連接。重組表達(dá)載體可能是可方便進(jìn)行重組DNA操作并可使核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常取決于載體與該載體待引入之宿主細(xì)胞的相容性。所述載體可能是線性的或閉環(huán)的質(zhì)粒。載體可能是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。該載體可能包含保證自我復(fù)制的任何工具?；蛘?，所述載體可能是當(dāng)引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合入基因組中并與其所整合入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用單個(gè)載體或質(zhì)?；蛘咭黄鸢璉入宿主細(xì)胞基因組之總DNA的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，或者轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或更多個(gè)可選擇標(biāo)記，它們可允許方便地選擇被轉(zhuǎn)化、被轉(zhuǎn)染、被轉(zhuǎn)導(dǎo)等等的細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記是其產(chǎn)物提供了殺菌劑或病毒抗性、抵抗重金屬、給營養(yǎng)缺陷型提供原養(yǎng)型等等的基因。細(xì)菌可選擇標(biāo)記的例子有來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或賦予抗生素抗性諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記物有ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1和URA3。 適用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記包括但不局限于amdS (乙酰胺酶)，argB (鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶)，bar (草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)，hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD (硝酸還原酶)， PyrG (乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)，sC (硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(sulfate adenyltransferase)) 和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))及其它們的對(duì)等物。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的 amdS 和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因被用于曲霉 (Aspergillus)細(xì)胞中。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或在細(xì)胞內(nèi)不依賴于基因組而自主復(fù)制的元件。對(duì)于整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的方面，所述載體可依靠編碼多肽的多核苷酸序列或適于通過同源或非同源重組整合入基因組的載體的任何其它元件?；蛘撸d體可包含用于指導(dǎo)在染色體的準(zhǔn)確位置通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組的附加的核苷酸序列。為了提高在準(zhǔn)確位置處整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的核酸，譬如100至10，000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400至10，000個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選800至10，000個(gè)堿基對(duì)，它們與相應(yīng)的靶序列具有高度的同一性以提高同源重組的概率。整合元件可能是與宿主細(xì)胞基因組內(nèi)靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非編碼的或編碼的核苷酸序列。另一方面，載體可能通過非同源重組整合入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。對(duì)于自主復(fù)制而言，載體可能進(jìn)一步包含能使載體在所述宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可能是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語"復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在此定義為能使質(zhì)?；蜉d體在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的例子有允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322，pUC19，pACYC177， 和PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌(Bacillus)中進(jìn)行復(fù)制的pUBl 10，pE194， PTA1060，和ρΑΜβ i的復(fù)制起點(diǎn)。適于用在酵母宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制起點(diǎn)有例如2 μ復(fù)制起點(diǎn)、ARSU ARS4、ARSl和 CEN3的組合以及ARS4和CEN6的組合?？捎糜诮z狀真菌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制起點(diǎn)有例如AMAl和ANSI (Gems eta/.，1991，Gene 98 :61-67 ；Cullen et al.，1987，Nucleic AcidsResearch 15 :9163-9175 ；WO 00/24883) AMAl基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可依照WO 00/24883中所公開的方法完成?？蓪⒁豢截愐陨系谋景l(fā)明之多核苷酸插入宿主細(xì)胞中以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。可通過將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組中或者通過將可擴(kuò)增的可選擇標(biāo)記基因與所述多核苷酸包含在一起來達(dá)到多核苷酸拷貝數(shù)目的增加，在后一情形下，包含擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因以及由此而來的附加拷貝的多核苷酸的細(xì)胞可通過在適當(dāng)?shù)目蛇x擇制劑存在的條件下人工培養(yǎng)所述細(xì)胞進(jìn)行選擇。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明之重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參閱，例如Sambrook et al.，1989，見上文)。本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其中包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，它被方便的用于所述多肽的重組生產(chǎn)中。將包含編碼本發(fā)明多肽之多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞中使得載體作為染色體整合體的一部分存在或如早先所述作為自我復(fù)制的染色體外載體存在。 術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不完全相同的任何親本細(xì)胞后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼所述多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或者非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，諸如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不局限于芽孢桿菌細(xì)胞，例如嗜堿性芽孢桿菌(Baci 1 lusalkalophilus)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),短芽孢桿菌(Bacillus brevis),環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans),克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii),凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)，遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)， 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium), 脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢桿菌，和蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)；或鏈霉菌細(xì)胞，例如變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰鏈霉菌(Sti^ptomycesmurinus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌諸如大腸桿菌和假單胞菌O^eudomonassp)。在一個(gè)方面中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophi lus)或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一方面中，芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿性的芽孢桿菌。將載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可能通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參閱，例如Chang and Cohen, 1979, MolecularGeneral Genetics 168 :111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參閱，例如 Youngand Spizizen,1961, Journal of Bacteriology 81 :823-829,或 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology56 :209-221)電穿孔(參閱，例如 Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6 :742-751)，或接合(參閱，例如 Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278)來實(shí)現(xiàn)。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，諸如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一方面中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。"真菌"用于此處時(shí)包括子囊菌門 (Ascomycota)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota),壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門 (Zygomycota)(如文獻(xiàn)所述Hawksworthet al. , In, Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi,8thedition,1995,CAB International,Univetsity Press, Cambridge, UK) 以及卵菌門(Oomycota)(如文獻(xiàn)中所印證的=Hawksworth et al.，1995，見上文，第171頁) 和所有的有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi) (Hawksworth et al.，1995，見上文)。在另一方面中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。“酵母”用于此處時(shí)包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))，產(chǎn)擔(dān)抱子酵母(basidiosporogenous yeast)禾口屬于半知菌(Fungi Imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能有變化，所以針對(duì)本發(fā)明的目的而言，酵母應(yīng)如以下文獻(xiàn)中所述定義Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. Μ. , and Davenport, R. R. , eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9,1980)。在更進(jìn)一步的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母(Candida)，漢遜酵母屬 (Hansenula)，克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)，畢赤酵母屬(Pichia)，酵母屬 (Saccharomyces),裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或耳口氏酵母屬(Yarrowia)細(xì)胞。在某一特定方面，酵母宿主細(xì)胞是卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)， 酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)， Saccharomyces douglasii, rS-BJ (Saccharomyces kluyveri), 1 iiil BJ (Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)細(xì)胞。在另——方面， 酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另一方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)細(xì)胞。在另一方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！ńz狀真菌〃包括分支真菌門 (Eumycota)禾口卵菌門(Oomycota)的所有絲狀形式(參閱 Hawksworth et al.，1995， 見上文)。絲狀真菌通常特征為由幾丁質(zhì)，纖維素(cellulose)，葡聚糖(glucan)，殼聚糖(chitosan)，甘露聚糖(marman)和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。無性繁殖的生長是通過菌絲延長，而碳分解代謝專性好氧的。相反，酵母諸如釀酒酵母(Mccharomyces cerevisiae)的無性繁殖生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽，而碳分解代謝可能是發(fā)酵性的。另一方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是支頂孢屬(Acremonium)，曲霉屬(Aspergillus)， 短梗霉屬(Aureobasidium)，煙管菌屬(Bjerkandera)，擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)，鬼傘屬(Coprinus)，云芝屬(Coriolus)，隱球菌屬(Cryptococcus)，F(xiàn)ilibasidium，鍵抱菌屬 (Fusarium)，腐殖霉屬(Humicola)，稻瘟菌屬(Magnaporthe)，毛霉屬(Mucor)，毀絲霉屬 (Myceliophthora), Neocallimastix，脈抱菌屬(Neurospora)，擬青霉屬(Paecilomyces), 青霉屬(Penicillium),平革菌屬(Phanerochaete),身寸脈菌屬(Phlebia), Piromyces, 側(cè)茸(Pleurotus)，裂褶菌屬(Schizophyllum)，踝節(jié)菌屬(Talaromyces)，嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)，梭抱殼霉屬(Thielavia)，彎頸霉屬(Tolypocladium)，栓菌屬(Trametes) 或木霉菌屬(Trichoderma)細(xì)胞。另一方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉(Aspergi 1 Ius awamori)，煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，曰本曲霉(Aspergillus japonicus)，構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)，漂曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉 (Aspergillusoryzae)細(xì)胞。另一方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是 Fusarium bactridioides， 禾谷鐮刀菌(Fusarium cerealis)，克地鐮刀菌(Fusariumcrookwellense)，大刀鐮刀菌 (Fusarium culmorum)，禾谷德刀菌(Fusarium graminearum)，F(xiàn)usarium graminum，異抱 ,廉抱(Fusariumheterosporum)，F(xiàn)usarium negundi，尖抱德刀菌(Fusarium oxysporum), 多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)，粉紅鐮刀菌(Fusarium roseum)，接骨木鐮刀菌 (Fusarium sambucinum)，膚色德抱(Fusariumsarcochroum)，擬枝抱,廉刀菌(Fusarium sporotrichioides)，硫色德刀菌(Fusarium sulphureum)， Fusarium torulosum，類 (擬)絲抱德刀菌(Fusarium trichothecioides)或 Fusarium venenatum 細(xì)胞。另一方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑管菌(Bjerkmdera adusta)，干擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina),干 M 胃(Ceriporiopsis aneirina), Ceriporiopsis caregiea,淺胃 錯(cuò)孑L 菌(Ceriporiopsis gilvescens)，Ceriporiopsis pannocinta，Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsissubrufa,蟲擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis subvermispora)，灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)，毛云芝菌(Coriolus hirsutus)，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)，腐柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lmuginosa)，米黑毛霉(Mucor miehei)，嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)，粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)，產(chǎn)紫青導(dǎo)(Penicillium purpurogenum)，黃 包原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium), 射脈側(cè)菌(Wilebiaradiata)，杏鮑菇(Pleurotus eryngii)，太瑞斯梭孢殼霉 (Thielaviaterrestris)，長絨毛栓菌(Trametes villosa)，云芝(Trametesversicolor)， 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，康氏木霉(Trichoderma koningii)，長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉 (Trichoderma viride)細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以通過本身已知的方式通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的過程被轉(zhuǎn)化。適合曲霉屬(Aspergillus)和木霉菌屬 (Trichoderma)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化步驟參閱 EP 238 0 和 Yelton etal.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA81 :1470—1474。(Fusarium) 的方法參閱 Malardier etal.，1989，Gene 78 :147-156 和 WO 96/00787。酵母的轉(zhuǎn)化可用以下文獻(xiàn)所述步驟進(jìn)行Becker and Guarente, In Abelson，J. N. and Simon，M. I.， editors， Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194，pp 182—187，Academic Press，Inc.，New York ；Ito et al.，1983，Journal of Bacteriology 153 163 ；and Hinnen et a/.，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75 ； 1920。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞在其野生型形式下能產(chǎn)生所述多肽；然后(b)回收所述多肽。優(yōu)選的， 所述細(xì)胞屬于曲霉屬(Aspergillus)，更優(yōu)選是煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，用本領(lǐng)域眾所周知的方法將所述細(xì)胞培養(yǎng)于適于所述多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基上。例如，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中以合適的培養(yǎng)基并且在允許所述多肽表達(dá)和/或分離的條件下通過搖瓶培養(yǎng)和小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、 分批投料或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞。用本領(lǐng)域已知的步驟在包含碳和氮源以及無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可購自供應(yīng)商或依照已發(fā)表的組成配制(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏(American Type CultureCollection)的目錄上)。若所述多肽被分泌入營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可直接從培養(yǎng)基中回收該多肽。若所述多肽不分泌到培養(yǎng)基中，則可從細(xì)胞裂解物中回收它?？捎帽绢I(lǐng)域已知特異于所述多肽的方法檢測該多肽。這些檢測方法可包括使用特異抗體、形成酶產(chǎn)物或酶底物的消失。例如，可如本文所述用酶檢測法測定所述多肽的活性。產(chǎn)生的多肽可用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，可通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收所述多肽，這些方法包括但不局限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、揮發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行純化，包括但不局限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和分子排阻)、電泳流程(例如制備型等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE 或提取(參閱，例如 Protein Purification^. -C. Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers, New York, 1989)來獲得充分純的多肽。一方面，在第110位的氨基酸修飾是氨基酸取代。一方面，在第110位的氨基酸修飾是氨基酸刪除。—方面，在第110位的氨基酸修飾是氨基酸插入。在某些實(shí)施方案中，測定相對(duì)于SEQ ID No. 1的序列同一性，其中SEQ ID No. 1所述氨基酸序列進(jìn)一步包含信號(hào)肽序列，諸如其天然信號(hào)肽序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽與SEQ ID No. 1具有至少90、92或95%的同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽與選自SEQ ID No. 2_22之中的具有最高同一性百分比的序列具有至少76，78，80，85，90，95，98或95%的同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽與SEQ ID No. 2具有至少76，78，80，85，90， 95，98或95%的同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽與SEQ ID No. 3具有至少76，78，80，85，90， 95，98或95%的同一性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有果凍卷折疊。在本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案中，第110位的氨基酸修飾是氨基酸取代。在本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案中，第110位的氨基酸修飾是取代為選自以下的任一不同氨基酸殘基丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。在本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案中，第110位的氨基酸修飾是取代為選自以下的任一不同氨基酸殘基丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。在本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案中，第110位的氨基酸修飾是取代為選自以下的任一不同氨基酸殘基谷氨酸，色氨酸，丙氨酸和半胱氨酸。在本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案中，第110位的氨基酸修飾是取代為丙氨酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有總數(shù)少于250個(gè)氨基酸，諸如少于M0， 諸如少于230，諸如少于220，諸如少于210，諸如少于200個(gè)氨基酸，諸如在160至240個(gè)范圍內(nèi)，諸如在160至220個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下任何一個(gè)或多個(gè)位置處的一個(gè)或多個(gè)修飾11,12，13,34,54,77,81,99,104，113，114，118，122，141，154，159，162，164，166 和175，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含選自以下的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代:11F,12F,54Q,54ff,122D,113A,13Y,113D,175L,122F,34K,99Y,104W,141Q,154R,159D, 175K，81I，166F,162Ε,162D,164F,114D,114Υ,114F,118V,175K,77L,77M,77S,77V,和 77Y, 所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含選自以下的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代 D11F, G12F, N54Q, R122D, Y113A, G13Y, Y113D, N141Q, Q175L, R122F, G34K, K99Y, T104W, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L, I77M，I77S，I77V和I77Y，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的一個(gè)或多個(gè)修飾13，99，104，113，122，154，159和175，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下氨基酸位置處的取代13，99， 104，113，122，154，159和175，所述位置被確定為SEQID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽進(jìn)一步包含在以下任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的一個(gè)或多個(gè)修飾114和166，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽進(jìn)一步包含在以下任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的一個(gè)或多個(gè)取代114和166，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下氨基酸位置中至少4個(gè)位置處的取代:13，99，104，113，114，122，154，159，166 和 175，所述位置被確定為 SEQ ID No. 1 所示
之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下氨基酸位置處的取代13，99， 104，113，114，122，154，159和175，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下氨基酸位置處的取代13，99，104，113，122，154，159，166和175，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨
基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含在以下氨基酸位置處的取代13，99， 104，113，122，154，159和175，所述位置被確定為SEQID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含選自以下的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代 13Y，99Y，104W, 110Α, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175Κ 和 175L,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽相比于選自SEQ ID No. 1_22之中的與其具有最高同一性的序列而言具有至少5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有至少9或10個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含選自以下的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代a. D11F, R122D 和 TllOA ；b. D11F, R122D, TllOA 和 Y113A ；c. G13Y, T110A, Y113D, R122D 和 Q175L ；d. G13Y, T110A, Y113D, R122F 和 Q175L ；e. G13Y, G34K, T110A, Y113D, R122D 和 Q175L ；f. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ；g. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Q175 和 V81I ；h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F 和 Q175L ；i. G13Y, T110A, Y113D, R122D, K154R, N159D 和 Q175L ；j. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；k. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162E 和 Q175L ；1. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162D 和 Q175L ；m. G13Y, T110A, Y113D, R122D, W164F 和 Q175L ；n. G13Y, Κ99Υ, T104W, Τ110Α, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；ο. G13Y, Κ99Υ, T104W, Τ110Α, Y113D, Ν114Υ, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；p. G13Y, Κ99Υ, T104W, Τ110Α, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；q. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, I118V, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；r. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114Y, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ；s. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ；t. G13Y, I77L, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；u. G13Y, I77M, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；v. G13Y, I77S, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；w. G13Y, I77V, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；χ. G13Y, I77Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175Ly. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175L ；z. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175 ；aa. G13Y, N54W, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, 141Q, K154R, N159D, 175L ；
bb. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D, Q175L ；cc. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L ；和dd.G13Y，54Q， K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F,141Q, K154R, N159D, Q175L ；所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽包含選自以下的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代a. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ；b. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F 和 Q175L ；c. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；d. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；e. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ；所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有麩皮溶解活性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽是分離的形式。術(shù)語“分離的”用于此處意指所述多肽至少大體上沒有至少ー種在自然界與所述 序列天然相伴的其它組分。在本發(fā)明所述的某些實(shí)施方案中，第110位的氨基酸修飾不是T110D。在某些實(shí)施方案中，具有木聚糖酶活性的多肽在第110位沒有天冬氨酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽在木聚糖酶活性檢測中相較于SEQ ID No. 1 所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列而言具有改善的木聚糖酶活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽由于第110位的修飾而具有改善的木聚糖酶 活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽在麩皮溶解活性檢測中相較于SEQ ID No. 1 所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列而言具有改善的麩皮溶解活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽由于第110位的修飾而具有改善的麩皮溶解 活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽對(duì)木聚糖酶抑制劑的敏感性降低。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有包含在選自以下列表位置處之修飾的氨 基酸序列a) 13/110/113/122/154/159/175 ；b)13/99/104/110/113/122/154/159/166/175 ；c)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；d)13/110/113/122/175 ；e)13/99/104/110/113/122/154/159/175 ；f)13/99/104/110/113/122/154/159/175 ；g) 13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；h)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；i)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；j)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
k)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；1)13/81/99/104/110/113/122/154/159/175 ；m) 13/110/113/122/164/175 ；n)13/110/113/122/162/175 ；o)13/110/113/122/175 ；p)11/122/110/113 ；q)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；r)11/122/110 ；s) 13/34/110/113/122/175 ；t)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；u)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；v)13/99/104/110/113/118/122/154/159/175 ；w)13/110/113/122/162/175 ；x)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；y)13/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；z)13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；aa)13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；bb)13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；cc)13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ；和dd)13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ；所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有包含選自以下列表之氨基酸取代的氨基 酸序列a)13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L ；b)13Y/99Y/104W/11OA/113D/122F/154R/159D/166F/175L ；c)13Y/99Y/104W/11OA/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；d)13Y/110A/113D/122F/175L ；e)13Y/99Y/104W/11OA/113D/122F/154R/159D/175L ；f)13Y/99Y/104W/11OA/113D/122F/154R/159D/175K ；g)13Y/99Y/104W/11OA/113D/114D/122F/154R/159D/175K ；h)13Y/99Y/104W/11OA/113D/114Y/122F/154R/159D/175L ；i)13Y/99Y/104W/11OA/113D/114D/122F/154R/159D/175L ；j)13Y/99Y/104W/11OA/113D/114Y/122F/154R/159D/175K ；k)13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；1)13Y/811/99Y/104W/11OA/113D/122F/154R/159D/175L ；m)13Y/110A/113D/122D/164F/175L ；n)13Y/110A/113D/122D/162D/175L ；O)13Y/110A/113D/122D/175L ；p)11F/122D/110A/113A ；
q)13Y/77Y/99Y/104W/1IOA/113D/122F/154R/159D/175L ；r)11F/122D/110A ；s)13Y/34K/110A/113D/122D/175L ；t)13Y/77V/99Y/104W/1IOA/113D/122F/154R/159D/175L ；u)13Y/77M/99Y/104W/11OA/113D/122F/154R/159D/175L ；v)13Υ/99Υ/104W/11OA/113D/118V/122F/154R/159D/175L ；w)13Y/110A/113D/122D/162E/175L ；χ)13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；y)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；z)13Y/54Q/99Y/104W/11OA/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；aa)13Y/54W/99Y/104W/11OA/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；bb)13Y/54Q/99Y/104W/11OA/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；cc)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ；禾口dd)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ；所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有包含選自以下列表之氨基酸取代的SEQ ID No. 1之氨基酸序列a)G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L ；b)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L ；c)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；d)G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L ；e)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；f)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；g)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；h)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L ；i)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；j)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K ；k)G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；l)G13Y/V81I/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；m)G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L ；n)G13Y/T110Α/Υ113D/R122D/S162D/Q175L ；ο)G13Y/T110Α/Υ113D/R122D/Q175L ；ρ)Dl1F/R122D/T110Α/Υ113Α ；q)G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；r)Dl1F/R122D/T1IOA ；s)G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L ；t)G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；U)G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；v)G13Υ/Κ99Υ/Τ104W/T110Α/Υ113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L ；w)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L ；and χ)G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L y)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ； z)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ； aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110Α/Υ113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L ； bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ； cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L ；禾口 dd)G13Y/54Q/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有包含選自以下列表之氨基酸取代的氨基a13Y/xIlOA/113D/122D/154R/159D/175L ；
b13Y/,99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L9
C13Y/,99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L9
d13Y/xIlOA/113D/122F/175L ；
e13Y/,99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
f13Y/,99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K ；
g13Y/,99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K
h13Y/,99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L
i13Y/,99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L
j13Y/,99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K
k13Y/,77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
113Y/々11/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
m13Y/xIlOA/113D/122D/164F/175L ；
η13Y/xIlOA/113D/122D/162D/175L ；
013Y/xIlOA/113D/122D/175L ；
PIlF/,122D/110A/113A ；
q13Y/,77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
rIlF/,122D/IlOA ；
S13Y/,34K/110A/113D/122D/175L9
t13Y/,77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
U13Y/,77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
V13Y/,99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L9
W13Y/xIlOA/113D/122D/162E/175L ；
X13Y/,77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
y13Y/,99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L9
ζ13Y/S4Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/L75L ；
aa)13Y/54W/99Y/104W/11OA/113D/122F/141Q/154R/159D//175L
bb)13Y/54Q/99Y/104W/11OA/113D/114F/122F/154R/159D//175L
cc)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ；禾口dd)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L,所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列，其中具有選自以下列表的氨基酸取代a)G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L ；b)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L ；c)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
d)G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L ；e)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；f)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；g)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；h)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L ；i)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；j)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K ；k)G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；l)G13Y/V81I/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；m)G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L ；
n)G13Y/T110Α/Υ113D/R122D/S162D/Q175L ；ο)G13Y/T110Α/Υ113D/R122D/Q175L ；ρ)Dl1F/R122D/T110Α/Υ113Α ；q)G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；r)Dl1F/R122D/T1IOA ；s)G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L ；t)G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；u)G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；v)G13Υ/Κ99Υ/Τ104W/T110Α/Υ113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L ；w)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L ；禾口χ)G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175Ly)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；z)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T110Α/Υ113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L ；bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L ；禾口dd)G13Y/54Q/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/ Q175L。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽不是SEQ ID No. 25。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述多肽不具有選自以下列表的序列國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 57 ；
國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 62 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 59 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 53 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 65 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 56 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 64 國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 52 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 63 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 61 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 60 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 58 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 55 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 12 ；國際專利申請(qǐng) W00238746 的 SEQ ID No. 11 ；國際專利申請(qǐng) W00068396 的 SEQ ID No. 21 ；和國際專利申請(qǐng) W00068396SEQ ID No. 22。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述氨基酸序列被用于大規(guī)模的應(yīng)用中。優(yōu)選所述氨基酸序列在宿主生物體培養(yǎng)后以每升總細(xì)胞培養(yǎng)物體積中含Ig至約 IOOg的量產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及包含如本文所述之氨基酸序列和/或編碼木聚糖酶之核苷酸序列的組合物。本發(fā)明的組合物可改善供消費(fèi)含所述組合物的產(chǎn)品的氣味，滋味、溫和性，一致性，質(zhì)地、形狀、口感，硬度，粘度，膠裂，結(jié)構(gòu)和/或感官特性以及營養(yǎng)。此外，本發(fā)明的組合物還可與供消費(fèi)之產(chǎn)品的其它組分聯(lián)合使用以達(dá)到所說的改善。盡管優(yōu)選本發(fā)明組合物用于改進(jìn)含所述組合物供消費(fèi)的產(chǎn)品的氣味，滋味、溫和性，一致性，質(zhì)地、形狀、口感，硬度，粘度，膠裂，結(jié)構(gòu)，表面光滑性和/或感官特性以及營養(yǎng)，本發(fā)明還覆蓋了將本發(fā)明組合物用作含其它組分之藥用組合物的組分以向消費(fèi)者提供醫(yī)學(xué)或生理學(xué)益處。因此，本發(fā)明的組合物可與其它組分聯(lián)合使用。其它組分的例子包括以下一種或多種增稠劑，膠凝劑，乳化劑，粘合劑，結(jié)晶改良劑，甜味劑(包括人造增甜劑)，流變改性劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑，染料，酶，載體，媒介物，賦形劑，稀釋劑，潤滑劑，增香劑，著色劑，懸浮劑，崩解劑，造粒粘合劑等。這些其它組分可以是天然的。這些其它組分可以通過使用化學(xué)的和/或酶促的技術(shù)制備。術(shù)語“增稠劑或膠凝劑”用于此處時(shí)指通過減慢或阻礙顆粒移動(dòng)來防止分開的產(chǎn)品，所述顆粒是不混溶液體小滴、氣體或不溶固體。增稠發(fā)生在當(dāng)單獨(dú)的水合分子引起粘性增加，減慢分離的情況下。膠凝發(fā)生在當(dāng)水合分子連接形成三維網(wǎng)絡(luò)而捕獲顆粒，從而使它們固定。術(shù)語“穩(wěn)定劑”用于此處時(shí)定義為保持產(chǎn)品(例如食品)不隨時(shí)間改變的一種成分或幾種成分的聯(lián)合。
術(shù)語“乳化劑”用于此處時(shí)指防止乳劑分離的成分(例如一種食品成分)。乳劑是兩種不混溶的物質(zhì)，一種以小滴形式存在，包含于另一種內(nèi)。乳劑可以是水包油組成，其中小滴或被分散相是油而連續(xù)相是水；或者是油包水組成，其中水變成了被分散相而連續(xù)相是油。泡沫(液體包氣體)以及懸浮液(液體包固體)也可通過使用乳化劑來穩(wěn)定。氣化可發(fā)生在三相系統(tǒng)中，其中空氣被液態(tài)油包圍然后經(jīng)由用乳化劑穩(wěn)定的凝聚油脂結(jié)晶來加以穩(wěn)定。乳化劑具有對(duì)水有親和力的極性基團(tuán)(親水的)和被油類所吸引的非極性基團(tuán) (親脂的)。它們被吸收在兩種物質(zhì)的接觸面，形成了兩表面間的薄膜，起到穩(wěn)定乳劑的作用。乳化劑的親水/親脂特性受分子結(jié)構(gòu)的影響。這些特性通過親水的/親脂的平衡(HLB) 值進(jìn)行鑒定。低HLB值指示較大的親脂傾向，可用于穩(wěn)定油包水的乳劑。高HLB值指向親水的乳化劑，通常用于水包油的乳劑。這些數(shù)值來自簡單的體系。因?yàn)槭澄锍３０绊懭榛匦缘钠渌煞郑訦LB值可能不總是乳化劑選擇的可靠指南。用于此處時(shí)“粘合劑”指通過物理或化學(xué)反應(yīng)將產(chǎn)物粘合在一起的成分(例如食物成分)。例如在"elation”過程中，水被吸收，達(dá)到了粘合的效果。不過，粘合劑可吸收其它液體，諸如油，將它們保持在產(chǎn)品內(nèi)。在本發(fā)明的上下文中粘合劑通常用于固體或低濕度產(chǎn)品中，例如烘焙產(chǎn)品糕餅、甜圈、面包及其它。術(shù)語“結(jié)晶改良劑”用于此處指影響油脂或水結(jié)晶的成分(例如食物成分)。由于兩個(gè)原因，冰晶的穩(wěn)定是很重要的。第一個(gè)原因從分離的立場看直接涉及產(chǎn)物的穩(wěn)定性。 產(chǎn)品經(jīng)受越多的凍/融循環(huán)，產(chǎn)生的冰晶就越大。這些巨大的晶體可以破壞產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)，它或者是天然存在的，如同在細(xì)胞壁的情形中，或者是由于"elation”而造成的。因?yàn)樗辉俦３衷谠?，所以產(chǎn)品在融化后可能展現(xiàn)出脫水收縮或滴水。其次，在產(chǎn)品以冷凍狀態(tài)消費(fèi)的情況下，這些巨大的晶體導(dǎo)致了令人不快的有砂礫的口感。“載體"或"媒介物"意指適于化合物施用的材料，包括本領(lǐng)域已知的任何所述材料，例如任何液體、凝膠、溶劑、液體稀釋劑、增溶劑等等，它是非毒性的并且不以有害形式與組合物的任何組分相互作用。在營養(yǎng)上可接受的載體的例子包括例如水、鹽溶液、醇、硅氧烷，蠟，凡士林油，植物油、聚乙二醇，丙二醇，脂質(zhì)體，糖，明膠，乳糖，直鏈淀粉，硬脂酸鎂，滑石，表面活性劑，硅酸，粘性石蠟，芳香油，脂肪酸單甘油酯和二甘油酯，petroethral脂肪酸酯，羥甲基-纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等等。賦形劑的例子包括以下一種或多種微晶纖維素和其它纖維素、乳糖，檸檬酸鈉， 碳酸鈣，磷酸氫鈣，甘氨酸，淀粉，乳糖和高分子量聚乙二醇。崩解劑的例子包括以下一種或多種淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)，淀粉羥乙酸鈉，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復(fù)合硅酸鹽。造粒粘合劑的例子包括以下一種或多種聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素 (HPMC)，羥丙基纖維素(HPC)，蔗糖，麥芽糖，明膠和阿拉伯樹膠。潤滑劑的例子包括以下一種或多種硬脂酸鎂，硬脂酸，甘油二十二烷酸酯和滑石·稀釋劑的例子包括以下一種或多種水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它們的組合。其它組分可同時(shí)(例如，當(dāng)它們混合在一起或甚至當(dāng)它們經(jīng)由不同途徑遞送時(shí))或順序(例如，它們可通過不同途徑遞送)使用。用于此處時(shí)術(shù)語“適于動(dòng)物或人消耗的組分”意指作為補(bǔ)充物被加入或者可以加入本發(fā)明組合物中的化合物，它可能是營養(yǎng)上有益的、纖維替代品或者通常對(duì)消費(fèi)者具有有益的影響。所述成分可用于需要凝膠化，質(zhì)地化(texturising)，穩(wěn)定，懸浮，形成薄膜和結(jié)構(gòu)化，保持濕潤，而不添加不必要的粘性的各種產(chǎn)品中。優(yōu)選的，所述成分能改善活培養(yǎng)物的保質(zhì)期和穩(wěn)定性。舉例說來，所述組分可以是益生元諸如藻酸鹽，黃原膠，果膠，槐樹豆膠(LBG)，菊粉，瓜爾膠，低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide，G0S)，左旋寡糖類(fructo-oligosaccharide, F0S),低聚乳果糖(Iactosucrose),大豆寡糖，帕拉金糖(palatinose),低聚異麥芽糖(isomalto-oligosaccharides),低聚葡糖 (gluco-oligosaccharide)禾口/[氏聚τΚ (xylo-oligosaccharides)。本發(fā)明的組合物還可用作食物，或用于食物制備中。在此，術(shù)語“食物”是在廣義上使用的，涵蓋了人的食物以及動(dòng)物的食物(即飼料)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述食物是供人消費(fèi)的。所述食物可以是溶液形式或作為固體-取決于用途和/或應(yīng)用方式和/或施用方式。當(dāng)用作或用于食物諸如功能性食物制備中時(shí)-本發(fā)明的組合物可與以下一種或多種成分聯(lián)合使用營養(yǎng)上可接受的載體、營養(yǎng)上可接受的稀釋劑、營養(yǎng)上可接受的賦形劑、營養(yǎng)上可接受的佐劑、營養(yǎng)活性成分。本發(fā)明的組合物可用作食物成分。用于此處時(shí)術(shù)語“食物成分”包括作為或能夠作為營養(yǎng)補(bǔ)充物和/或纖維補(bǔ)充物加入功能性食物或食品中的配方。術(shù)語食物成分用于此處時(shí)還指可低水平用于需要凝膠化，纖維卷曲化，穩(wěn)定，懸浮，形成薄膜和結(jié)構(gòu)化，保持濕潤和改善口感而不增加粘性的多種產(chǎn)品中的配方。所述食物可以是溶液形式或作為固體-取決于用途和/或應(yīng)用方式和/或施用方式。本發(fā)明的組合物可以是-或者可以被加入-食物補(bǔ)充物。本發(fā)明的組合物可以是-或者可以被加入-功能性食物。用于此處時(shí)“功能性食物”意指不僅能提供營養(yǎng)效果和/或味覺的滿足，還能給消費(fèi)者傳遞更多有益效果的食物。因此，功能性食物是具有摻入其中賦予食物以特殊功能性的組分或成分(諸如本文所述的那些)的普通食物-所述功能性是除了純粹的營養(yǎng)作用之外的例如醫(yī)學(xué)或生理學(xué)益處。盡管功能性食物沒有法律定義，對(duì)此領(lǐng)域有興趣的大部分人員都同意它們是由于具有特殊健康作用而上市的食物。 某些功能性食物是保健食品。在此，術(shù)語“保健食品”意指不僅能提供營養(yǎng)效果和 /或味覺的滿足，還能給消費(fèi)者傳遞治療(或其它有益)效果的食物。保健食品跨越了食物和藥品之間的傳統(tǒng)分界線。 調(diào)查顯示消費(fèi)者最著重于涉及心臟疾病的功能性食物要求。預(yù)防癌癥是營養(yǎng)品令大量消費(fèi)者感興趣的另一方面，但有趣的是在此領(lǐng)域消費(fèi)者感到他們可發(fā)揮的控制作用最小。事實(shí)上，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization)的報(bào)告，至少35%的癌癥病例是飲食相關(guān)的。此外涉及骨質(zhì)疏松癥，腸道健康和肥胖現(xiàn)象的需求也是關(guān)鍵的因素，它們可能刺激功能性食物的購買并驅(qū)使市場發(fā)展。本發(fā)明的組合物可用于制備食品，諸如以下一種或多種果醬、橘子醬、果凍、乳制品(諸如牛奶或奶酪)、肉制品、家禽制品、魚產(chǎn)品和烘焙產(chǎn)品。舉例而言，本發(fā)明的組合物可用作以下制品的成分軟飲料、水果汁或包含乳清蛋白的飲料、健康茶飲、可可飲料、牛奶飲料和乳酸菌飲料、酸奶和酸奶飲品、奶酪、冰激凌、水冰和甜品、糖果、餅干蛋糕和蛋糕混合料、小吃、早餐谷物、速食面和杯面、速食湯和杯湯、平衡食物和飲料、增甜劑、質(zhì)地改善的快餐棒、纖維棒、烘焙穩(wěn)定的水果餡、喜歡的糖汁(care glaze)、巧克力烘焙餡料、奶酪蛋糕味餡料、水果味蛋糕餡料、蛋糕和甜甜圈糖衣、熱穩(wěn)定烘焙餡料、方便烘焙餡料奶油、餅干餡料、現(xiàn)成的烘焙餡料、減少熱量型餡料、成人營養(yǎng)飲料、 酸化豆?jié){/果汁飲料、無菌的/蒸餾的巧克力飲料、酒吧混合飲料、飲料粉、鈣加強(qiáng)型豆?jié){/ 純凈水和巧克力奶、鈣加強(qiáng)型咖啡飲料。本發(fā)明所述組合物可進(jìn)一步用作食品中的成分，例如美國干酪沙司、適于搓碎和切碎奶酪的抗結(jié)劑、碎屑澆汁、奶油干酪、干混和攪拌澆頭脫脂酸奶油，冷凍的/融化的牛奶鮮奶油、冷凍的/融化的穩(wěn)定鮮鑲邊、低脂和清淡的天然切達(dá)干酪、低脂的瑞士風(fēng)味酸奶、充氣冷凍甜品和新奇棒、硬填料冰激凌、標(biāo)簽友好的、改良的經(jīng)濟(jì)和特許的硬填料冰激凌、低脂冰激凌冷凍奶油狀、烤肉調(diào)味醬、干酪澆頭調(diào)味料、村舍奶酪汁、干混和Alfredo 沙司、混和奶酪沙司、干混和番茄沙司及其它。對(duì)于某些方面，優(yōu)選所述食品是飲料。對(duì)于某些方面，優(yōu)選所述食品是烘焙產(chǎn)品-諸如面包、丹麥酥皮餅、餅干或曲奇餅。本發(fā)明還提供了制備食物或食物成分的方法，所述方法包含根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的木聚糖酶或攜帶另外的食物成分的本發(fā)明所述組合物。用于制備食物或食物成分的方法也是本發(fā)明的又一方面。在廣義上，本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽可用于溶解和/或降解包含阿拉伯糖基木聚糖的不溶植物細(xì)胞壁物質(zhì)，改變例如降低含植物細(xì)胞壁物質(zhì)之溶液或體系中由于半纖維素或阿拉伯糖基木聚糖存在造成的粘性。通常所說的植物細(xì)胞壁物質(zhì)會(huì)包含一種或多種木聚糖酶抑制劑。明確的說，本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽可用于加工植物材料來用作食品，諸如動(dòng)物飼料、用于淀粉生產(chǎn)、用于食物烘焙、用于以纖維素材料生產(chǎn)生物乙醇以及用于加工木漿以造紙。本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽可用于加工植物材料諸如用于包括動(dòng)物飼料在內(nèi)的食品中的谷類。用于此處時(shí)，術(shù)語“谷類”意指用于食品的任何種類谷物和/或產(chǎn)生此谷物的任何草，諸如但不局限于以下任一種小麥、去殼小麥、大麥、玉米、高粱、黑麥、燕麥、 黑小麥和稻或它們的組合。在某一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述谷類是小麥。通過使木聚糖接觸本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽來改良食物和/或飼料補(bǔ)充物中的木聚糖。
用于此處時(shí)，術(shù)語“接觸”包括但不局限于用本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽噴灑、涂覆、灌注或分層覆蓋所述食物和/或飼料補(bǔ)充物。在某一實(shí)施方案中，可通過將具木聚糖酶活性的多肽直接與食物和/或飼料補(bǔ)充物混合來制備本發(fā)明之食物和/或飼料補(bǔ)充物。舉例而言，可用具木聚糖酶活性的多肽接觸(例如通過噴灑)到以谷類為基礎(chǔ)的食物和/或飼料補(bǔ)充物諸如去殼小麥、玉米或豆粉上。還可能將具木聚糖酶活性的多肽摻入第二種(以及不同的)食物和/或飼料或飲用水中，然后將其加入本發(fā)明的食物和/或飼料補(bǔ)充物中。因此，不是必須將本發(fā)明所述之具木聚糖酶活性的多肽摻入以谷類為基礎(chǔ)的食物和/或飼料補(bǔ)充物本身中，盡管這樣的摻入形成了本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的方面。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，可將食物和/或飼料補(bǔ)充物與其它的食物和/或飼料組分聯(lián)合生產(chǎn)以谷類為基礎(chǔ)的食物和/或飼料。所述的其它食物和/或飼料組分可包括一種或多種其它(優(yōu)選熱穩(wěn)定的)酶補(bǔ)充物、維生素食物和/或飼料補(bǔ)充物、礦物食物和/ 或飼料補(bǔ)充物和氨基酸食物和/或飼料補(bǔ)充物。然后可將由此產(chǎn)生的可能包含數(shù)種不同類型化合物的(組合)食物和/或飼料補(bǔ)充物以適當(dāng)?shù)牧颗c其它食物和/或飼料組分諸如谷類和蛋白質(zhì)補(bǔ)充物混和從而構(gòu)成人的食物和/或動(dòng)物的飼料。在某一優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過將具適當(dāng)活性的不同酶混和產(chǎn)生酶混合物來制備本發(fā)明的食物和/或飼料補(bǔ)充物。舉例而言，可使由例如去殼小麥或玉米形成的以谷類為基礎(chǔ)的食物和/或飼料補(bǔ)充物同時(shí)或順序接觸(例如通過噴灑)木聚糖酶和具適當(dāng)活性的其它酶。這些酶可包括但不局限于以下任何一種或多種淀粉酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、植酸酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、 ferulyol酯酶、果膠酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和木聚糖酶。例如具所需活性的酶可與本發(fā)明之木聚糖酶混和，混和或者在這些酶接觸以谷類為基礎(chǔ)的食物和/或飼料補(bǔ)充物之前進(jìn)行，或者所述的酶可同時(shí)或順序接觸這種以谷類為基礎(chǔ)的補(bǔ)充物。然后將食物和/或飼料補(bǔ)充物與以谷類為基礎(chǔ)的食物和/或飼料混和來制備最終的食物和/或飼料。 還可能將食物和/或飼料補(bǔ)充物配制成各個(gè)酶活性的溶液，然后在將食物和/或飼料補(bǔ)充物加工成丸?；蚝隣钗镏皩⒋巳芤号c食物和/或飼料物質(zhì)混和。本發(fā)明提供了本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽在食品制備工藝中的用途。本發(fā)明所述之典型的烘焙產(chǎn)品包括面包-諸如烤過的食物、卷狀食物、小圓面包、比薩餅底等-椒鹽卷餅、玉米粉圓餅、蛋糕、餅干、曲奇餅、薄脆餅干等。食品諸如烘焙產(chǎn)品的制備是本領(lǐng)域眾所周知的。例如生面團(tuán)制造參閱實(shí)施例4。利用本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽來改變烘焙食物的性能參閱實(shí)施例4。本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽還可用于從來自谷類和塊莖諸如馬鈴薯的植物材料生產(chǎn)淀粉中。本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽還可例如在造紙中用于加工木質(zhì)紙漿。加工纖維素材料用于生物乙醇生產(chǎn)本發(fā)明之具木聚糖酶活性的多肽還可用于水解纖維素植物材料用于生產(chǎn)可發(fā)酵成生物乙醇的糖。在某些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述具木聚糖酶活性的多肽在生面團(tuán)加工溫度諸如大約20至大約40°C的范圍內(nèi)具有最佳木聚糖酶活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述具木聚糖酶活性的多肽在食物烘焙過程中被滅活。在某些替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述具木聚糖酶活性的多肽與相應(yīng)的野生型酶相比具有提高的熱穩(wěn)定性和/或溫度最適值，以便在熱處理之后保持活性。這兩種特性均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。
實(shí)施例實(shí)施例1-木聚糖酶的定位誘變和表達(dá)利用構(gòu)建體獲得枯草芽孢桿菌木聚糖酶的特異突變體，所述構(gòu)建體包含來自 pET24a ^^WW^i^itL^ (ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat)，^f1 ^^· ]
信號(hào)序列(atggctagcacagactactggcaa--------tggtaa)之野生型木聚糖酶基因融合，將
其轉(zhuǎn)移至載體pCRBlunt(InVitrogen，Carlsbad, CA, USA)。這導(dǎo)致了在用構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化后木聚糖酶在T0P10細(xì)胞(InVitrogen)中組成型表達(dá)，條件是所述基因的方向是"順時(shí)針〃方向。然后依照制造商的流程使用"QuickChange"誘變?cè)噭┖?Stratagene, La Jolla,CA,USA)獲得該基因內(nèi)的定位突變。突變體通過測序來驗(yàn)證。通過將已轉(zhuǎn)化的TOPlO 細(xì)胞以1升的規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)來獲得足夠產(chǎn)量的已驗(yàn)證的突變體。實(shí)施例2-木聚糖酶突變體的麩皮溶解研究由于小麥麩皮用于商業(yè)應(yīng)用中，所以我們利用小麥麩皮作為底物來評(píng)估木聚糖酶變體的比活性。麩皮底物舉例而言，麩皮可以是通過實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的Chopin⑶AutoMill (Chopin Technologies, France)利用供應(yīng)商所提供的的設(shè)置和條件將小麥碾磨成小麥面粉和麩皮而獲自干磨小麥的小麥麩皮。所獲得的麩皮組分可在麩皮溶解試驗(yàn)中用作底物。在此實(shí)施例中將小麥用作谷物來源。麩皮溶解試驗(yàn)將(0. IM)-磷酸氫二鈉(0. 2M)緩沖液，pH 5. O中的小麥麩皮懸浮液配制成濃度 1，33%麩皮(w/w)。從此懸浮液中，將750 μ 1等分試樣邊攪拌邊轉(zhuǎn)移入^pendorph管中。 將每個(gè)底物管在40°C預(yù)熱5分鐘。向其中加入250 μ 1酶溶液，使底物終濃度為1%。從每一種木聚糖酶制備三個(gè)稀釋液(一式兩份)，對(duì)每個(gè)測定時(shí)間(0，30，60和240分鐘)采用逐步升高的酶濃度(0，33;1，0和3，(^8木聚糖酶/克麩皮)。使用木聚糖酶熱變性溶液作為空白。在給定的時(shí)間通過將管子轉(zhuǎn)移至設(shè)置為95°C的孵育器上終止反應(yīng)。熱變性樣品保存于4°C直至所有的酶反應(yīng)終止。當(dāng)所有的酶反應(yīng)終止時(shí)，將Eppendorph管離心以獲取清澈的上清液。酶溶解麩皮的能力以O(shè)D41tl的增加表示，這是通過用PAHBAH試劑測定還原性端基的增加而確定的(Lever，1972)。簡而言之，還原性端基與PAHBAH反應(yīng)，形成有色反應(yīng)產(chǎn)物，它可在OD41tl進(jìn)行定量。以上麩皮溶解試驗(yàn)對(duì)于對(duì)麩皮底物中殘余淀粉有活性的酶的附帶活性敏感?？莶菅挎邨U菌木聚糖酶純化流程通過離心(20分鐘，3500xg, 20°C )收獲已表達(dá)木聚糖酶的大腸桿菌T0P10細(xì)胞并重懸于 50mM Tris, 2mM EDTA, pH 7. 4 中。加入 lmg/ml 溶菌酶(ICN Biomedicals, CostaMesa, CA, US, cat. No. 100831)打開細(xì)胞，在環(huán)境溫度將漿狀液體攪拌2小時(shí)，凍融后超聲處理。用IMHCl將pH調(diào)到4. 0，隨后進(jìn)行離心(20分鐘，3500xg, 20°C )。用以50mM乙酸鈉 pH 4. 5平衡和洗脫的一次性PD-10脫鹽柱(AmershamBioscience，Sweden)將包含木聚糖酶的上清液進(jìn)行脫鹽。將脫鹽后的樣品加到用50mM乙酸鈉(pH 4. 5)預(yù)平衡的IOml SOURCE 15S柱(Amersham Bioscience, Sweden)上。然后用平衡緩沖液清洗柱子并用線性NaCl梯度(50mM乙酸鈉，0-0.35M NaCl,pH 4.5)進(jìn)行洗脫。合并含木聚糖酶活性的組分并用于進(jìn)一步的分析?？烧{(diào)整相似的流程使其適于具有顯著不同于枯草芽孢桿菌XynA之pi的非枯草芽孢桿菌XynA來源木聚糖酶變體。表1.木聚糖酶麩皮溶解活性，表示為最大光密度、木聚糖酶突變體的斜率、與木聚糖酶BSl (如SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌酶)和木聚糖酶BS3 (如SEQ ID No. 23
所示之枯草芽孢桿菌變體)相比的相對(duì)光密度和斜率
權(quán)利要求
1.具有木聚糖酶活性并包含以下特性之氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQID No. 1具有至少88%的同一性或者與選自SEQ ID No. 2_22的氨基酸序列具有至少75%的同一性，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所述第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
2.具有木聚糖酶活性并且包含與SEQID No. 1具至少88%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所述第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于 SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
3.具有木聚糖酶活性并且包含與SEQID No. 2具至少75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所述第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于 SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
4.具有木聚糖酶活性并且包含與SEQID No. 3具至少75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且該多肽在第110位具有氨基酸修飾，其中所述第110位通過序列比對(duì)確定為相應(yīng)于 SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌木聚糖酶序列第110位的位置。
5.權(quán)利要求2所述多肽，其中所述多肽與SEQID No. 1具有至少90，92或95%的同一性。
6.權(quán)利要求1和3-4之任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽與選自SEQID No.2-22之中的與其具有最高同一性百分比的序列具有至少76，78，80，85，90，95，98或95%的同一性。
7.權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述多肽與SEQID No. 2具有至少76，78，80，85，90， 95，98或95%的同一性。
8.權(quán)利要求4所述的多肽，其中所述多肽與SEQID No. 3具有至少76，78，80，85，90， 95，98或95%的同一性。
9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽，其具有β-果凍卷折疊。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽，其中第110位的氨基酸修飾是氨基酸取代。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的多肽，其中第110位的氨基酸修飾是替代成選自以下的任一不同的氨基酸殘基丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的多肽，其中第110位的氨基酸修飾是替代成選自以下的任一個(gè)不同的氨基酸殘基谷氨酸，色氨酸，丙氨酸和半胱氨酸。
13.權(quán)利要求12所述的多肽，其中第110位的氨基酸修飾是替代成丙氨酸。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的多肽，包含以下任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處的一個(gè)或多個(gè)修飾11,12，13,34,54,77,81,99,104，113，114，118，122，141，154，159，162，164， 166和175，所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多肽，包含選自以下的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代:11F,12F,122D,113A,13Y,54Q,54ff,113D,141Q,175L,122F,34K,99Y,104W,154R,159D, 175K，81I，166F,162Ε,162D,164F,114D,114Υ,114F,118V,175K,77L,77M,77S,77V 和 77Y, 所述位置被確定為SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢桿菌氨基酸序列的相應(yīng)位置。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)具有木聚糖酶活性的多肽進(jìn)行修飾以提高麩皮溶解性和/或木聚糖酶活性。所述修飾包括在第10位的至少一個(gè)氨基酸修飾，并且可能還包含在第11、12、13、34、54、77、81、99、104、113、114、118、122、141、154、159、162、164、166或175位的至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾，其中所述位置是根據(jù)枯草芽孢桿菌木聚糖酶(SEQ ID NO1)的位置而確定的。所述多肽與SEQ ID NO1具有至少88％的同一性或者與選自SEQ ID NO2-22的序列有至少75％的同一性。
文檔編號(hào)C12N9/24GK102292436SQ200980155229
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者J·F·索任森, O·斯本森 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司