專利名稱：單克隆抗體stro-4的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及熱休克蛋白-90 β (HSP-90i3)作為鑒定和/或分離多潛能細胞的標記物的用途。更具體地，本發(fā)明涉及特異性結合人和綿羊HSP-90 β的單克隆抗體(稱為 STR0-4)的鑒定。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法富集的細胞群和這些細胞的治療用途。
背景技術：
包含造血支持性骨髓基質和相關骨組織的細胞組分源自一群多潛能細胞，該多潛能細胞包括多潛能間充質干細胞(MSC)和它們的前體(間充質前體細胞(MPC) )。MPC存在于主要位于環(huán)繞血管的血管周圍生態(tài)位的骨髓空間中(Gronthos S et al.，2003和Sii S et al.，2003)。在過去二十年中，研究集中于不同人基質/間充質細胞群重建脂肪、骨、軟骨和肌肉的再生潛能(Gronthos S et al.，2003和Simmons PJ et al.，1991)。但是，這些技術的成功應用取決于以下能力分離純化的MPC群，以及隨后離體控制它們的生長和分化。此外，需要克服通常與基于干細胞的療法有關的各種技術和安全性顧慮，這通過在合適的大量人疾病臨床前動物模型代表中評價MPC制品(pr印aration)的安全性和功效實現(xiàn)。 人矯形和心臟疾病/創(chuàng)傷的綿羊模型已得到廣泛使用，因為綿羊與人解剖、生理、免疫學和胚胎發(fā)育具有相似性(Airey JA et al.，2004 ；Liechty Kff et al.，2000 和 Mackenzie TC et al.，2001)。同時，數(shù)種人多潛能細胞特異性標記物如STR0-1、⑶106、⑶146已經在文獻中進行了描述(Gronthos S et al.，2003和Shi S et al.，2003)，在人疾病綿羊模型中檢查多潛能細胞的治療潛力的顯著進展受到限制，這是因為缺乏允許分離和表征綿羊組織中等同的多潛能細胞群的特異性試劑。諸如單克隆抗體的與綿羊和人多潛能細胞均反應的生物學試劑的開發(fā)分別會極大促進在臨床前和臨床試驗中監(jiān)測和等同綿羊和人多潛能細胞群的功能性的能力。已包括在本說明書中的關于文獻、法規(guī)、材料、裝置、論文等的任何討論只是為了提供本發(fā)明的背景。其不應被視作承認任何或全部這些內容由于存在于本申請每項權利要求的優(yōu)先權日之前而構成現(xiàn)有技術基礎的一部分或是本發(fā)明相關領域的公知常識。發(fā)明概述本發(fā)明描述了一種稱為STR0-4的新單克隆抗體(mAb)的產生和表征，該單克隆抗體從未分級的綿羊和人骨髓鑒定和分離多潛能細胞。具體地，STR0-4抗體能夠在兩個物種中基本上分離全部產克隆多潛能細胞(CFU-F 成纖維細胞集落形成單位)。分離的多潛能細胞表現(xiàn)出高增殖潛能和多譜系分化。出人意料的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-90β (HSP_90i3)蛋白在體內多潛能細胞的細胞表面表達，并且據(jù)發(fā)現(xiàn)單克隆抗體STR0-4鑒定HSP-90 β上表達的獨特表位。因此，在一實施方案中，本發(fā)明提供了 HSP_90i3作為鑒定和/或富集多潛能細胞的標記物的用途。在一實施方案中，本發(fā)明提供了一種富集多潛能細胞的方法，所述方法包括從組織來源制備細胞樣品并且富集表達所述HSP-90 β標記物的細胞。
在本發(fā)明的一實施方案中，多潛能細胞是成體多潛能細胞。在一實施方案中，本發(fā)明的富集的細胞群沒有被體外培養(yǎng)。在另一實施方案中，本發(fā)明的富集的細胞群能夠產生產克隆CFU-F。在另一實施方案中，富集的細胞群對于HSP-90 β +/STR0-4+細胞是同質 (homogenous)的。在一個實例中，富集多潛能細胞的方法包括使細胞樣品與HSP-90 β結合劑接觸；和將結合所述HSP_90i3結合劑的細胞與不結合所述HSP-90 β結合劑的細胞分離。在另一實施方案中，本發(fā)明還提供了一種鑒定細胞樣品中多潛能細胞的存在的方法，所述方法包括鑒定樣品中表達所述HSP-90 β標記物的細胞。在一實例中，鑒定細胞樣品中多潛能細胞存在的方法包括從組織來源獲得細胞樣品；在適合于HSP_90i3與所述HSP-90 β結合劑結合的條件下，使所述細胞樣品與 HSP-90 β結合劑接觸；和檢測結合所述樣品中細胞的HSP_90i3結合劑的存在，其中結合所述HSP-90 β結合劑的細胞指示多潛能細胞的存在。細胞樣品可以源自疑似含有多潛能細胞的任何組織來源。例如，組織來源可以是胎盤、脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、 卵巢、胰、骨、韌帶、骨髓、腱或骨骼肌。在優(yōu)選實施方案中，組織來源是骨髓。富集多潛能細胞的細胞來源可以是人或綿羊來源。但是，本發(fā)明還適用于源自其他動物物種的細胞，包括牛、馬、鼠、豬、犬或貓
本發(fā)明還涉及從本發(fā)明多潛能細胞的體外培養(yǎng)產生的子代細胞。本發(fā)明的擴增的細胞可以具有多種表型，這取決于培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)量和/或類型)、 傳代次數(shù)等。在另一實施方案中，培養(yǎng)本發(fā)明的富集群產生還表達選自以下標記物的一種或多種標記物的多潛能細胞STR0-1、STR0-3 (TNSAP)、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、 P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD 18、 CD61、整合蛋白 β、6-19、血栓調節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、 FGF-R、瘦蛋白-R、(STR0-2 =瘦蛋白-R)、RANKL、STRO-Itoight和CD146或這些標記物的任意組合。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的多潛能細胞在培養(yǎng)時不能產生造血細胞。本發(fā)明的方法還可以包括在第一富集步驟之前收獲多潛能細胞來源的步驟。這可以包括，例如從受試者手術取出組織，并且從該組織分離細胞以形成單細胞懸液。這種分離可以通過物理或酶促方式實現(xiàn)。這類方式是本發(fā)明領域的技術人員熟知的。在本發(fā)明的一實例中，這個步驟涉及使用已知技術收集骨髓細胞。用于本發(fā)明方法的HSP_90i3結合劑可以是鑒定為具有對HSP-90 β的結合親和力的任何多肽或化合物。優(yōu)選地，HSP-90 β結合劑特異性結合HSP-90 β。優(yōu)選地，HSP-90 β結合劑特異性結合HSP-90 β上的表位，其中HSP-90 β包含與
5SEQ ID N0:1(圖5)的序列至少約75%相同的序列，優(yōu)選與SEQ IDNO :1至少約78%相同， 更優(yōu)選至少約80%相同，仍然更優(yōu)選至少約85%相同，仍然更優(yōu)選至少約90%相同，甚至更優(yōu)選與 SEQ ID NO :1 至少約 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同。在一實施方案中，HSP-90 β結合劑選自肽、擬肽類(ρ印tidomimetic)、核酸適配體、肽適配體、樹狀聚體和小有機分子。在一實例中，HSP_90i3結合劑是寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸是標記的寡核苷酸。在另一實施方案中，HSP_90i3結合劑是純化的抗HSP-90 β抗體或其抗原結合片段或衍生物?？笻SP-90i3抗體可以是單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在本發(fā)明的一實施方案中，抗HSP_90i3單克隆抗體是由雜交瘤細胞系產生的 STR0-4抗體，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約(Budapest Treaty)的條款于2008年7 月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。用于本發(fā)明方法的其他合適的抗HSP_90i3單克隆抗體包括可商購的抗體，如小鼠抗人Hsp9O0 mAb克隆H9010 Qnvitrogen)、小鼠抗Hsp90b mAb克隆 EMD-5E12 (Calbiochem)、小鼠抗人 HSP90 β mAb 克隆 Κ3725Β (Cosmo Bio Co.，Ltd)和小鼠抗人 Hsp90 3mAb 克隆 K3705(Assay Designs/Stressgen Bioreagents)。上文未提及的其他可商購的抗體考慮為在本發(fā)明范圍內。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種HSP-90 β結合劑或其抗原結合片段或衍生物，其選自⑴STR0-4單克隆抗體；(ii)嵌合抗體，其包含來自STR0-4的重鏈和輕鏈的可變區(qū)以及人重鏈和輕鏈的恒定區(qū)；和(iii)人源化抗體，其包含至少一個來自STR0-4的互補決定區(qū)(OTR)以及人框架 (framework)區(qū)和f亙定區(qū)序列。在另一實施方案中，人源化抗體包含所有6個來自STR0-4的⑶R。在另一實施方案中，HSP_90i3結合劑是重組抗體，其包含與雜交瘤細胞系產生的STR0-4抗體的序列基本上相同的序列，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約的條款于 2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。在本發(fā)明的一實施方案中，HSP_90i3結合劑是標記的。在一實例中，標記是熒光標記。在另一實例中，標記是酶標記。在另一實施方案中，結合HSP_90i3結合劑的細胞的分離通過機械式細胞分選儀進行。在本發(fā)明的另一實施方案中，HSP_90i3結合劑與熒光標記化合物偶聯(lián)。在這種情況下，結合HSP-90i3結合劑的細胞的分離優(yōu)選使用熒光激活細胞分選儀(FACS)進行。在本發(fā)明的另一實施方案中，HSP_90i3結合劑與固體顆粒連接。優(yōu)選地，固體顆粒是磁性顆粒。在本發(fā)明的這一實施方案中，結合HSP-90i3結合劑的細胞的分離優(yōu)選通過從液相分離顆粒相進行。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，在分離步驟前，使細胞樣品與針對連接到固體顆粒的HSP-90i3結合劑的抗體接觸，其中結合HSP-90 β結合劑的細胞的分離通過從液相分離顆粒相進行。
在本發(fā)明的另一實施方案中，細胞樣品的細胞是在固體支持物上培養(yǎng)的粘附細胞，未結合的HSP_90i3結合劑的去除通過漂洗進行。在本發(fā)明的另一實施方案中，細胞樣品的細胞是懸浮培養(yǎng)的，未結合的HSP-90 β 結合劑的去除通過離心細胞樣品并分離所得上清進行。在另一實施方案中，將細胞樣品進行進一步的細胞分選步驟以富集或減少細胞中表達至少一種其他多潛能細胞標記物的細胞群。多潛能細胞標記物可以是選自以下標記物的一種或多種標記物STR0-1、STR0-3 (TNSAP)、CD106、CD146、LFA-3、THY-U VCAM-U ICAM-U PECAM-U P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/ CD29、CD29、CD18、CD61、整合蛋白β、6-19、血栓調節(jié)蛋白丄010、〇013、5〇卩、卩06卩_1 』6卩-1 、 IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦蛋白-R、(STR0-2 =瘦蛋白-R)、RANKL或這些標記物的任意組合。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法獲得的富集的多潛能細胞群。本發(fā)明還提供了富集的HSP-90 β +多潛能細胞群。優(yōu)選地，總富集的細胞群的至少1%,2%,3%,4%,5% ,10% ,15%,20%,30%, 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%是具有表型HSP-90 β +的多潛能細胞。優(yōu)選地，富集的多潛能細胞群通過本發(fā)明的方法獲得。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)本發(fā)明的富集的多潛能細胞群而獲得的擴增的細胞群。在一實施方案中，本發(fā)明的富集的細胞群或本發(fā)明的擴增的細胞群包含至少一些經遺傳修飾的細胞。本發(fā)明還提供了一種產生組織特異性定向的細胞群的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的多潛能細胞群，和將所述培養(yǎng)的細胞群置于使所述多潛能細胞偏向分化為特定組織類型的條件下。在本發(fā)明這種方法的一實施方案中，組織類型選自胎盤組織、心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經組織、平滑肌和內皮組織。本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的富集的多潛能細胞和/或本發(fā)明的擴增的細胞群。在優(yōu)選實施方案中，所述組合物還包含刺激因子。這樣的組合物可以是治療上有益的，因此會制備成藥學可接受的形式。在另一實施方案中，所述組合物還包含使本發(fā)明的多潛能細胞偏向分化為一種特定組織類型的因子。優(yōu)選地，所述組織類型選自但不限于心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經組織、胎盤、平滑肌和內皮組織。在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物還包含纖維蛋白膠。本發(fā)明還提供了一種產生或修復受試者的組織的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的富集和/或擴增的多潛能細胞群。本發(fā)明還提供了一種產生或修復受試者的組織的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的富集和/或擴增的多潛能細胞群在制備用于產生或修復受試者的組織的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物在制備用于產生或修復受試者的組織的藥物中的用途。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明產生或修復的組織選自但不限于心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經組織、胎盤、平滑肌和內皮組織。優(yōu)選地，本發(fā)明的多潛能細胞是人來源的。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法獲得的分離的細胞或其子代細胞，其中所述細胞是遺傳修飾的。本發(fā)明還提供了一種STR0-4雜交瘤細胞系，其依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008 年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。本發(fā)明還提供了由雜交瘤細胞系產生的STR0-4抗體，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。本發(fā)明還提供了一種分離的抗體，其與雜交瘤細胞系產生的STR0-4抗體結合多潛能細胞上相同的表位，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含HSP_90i3結合劑或其抗原結合片段或衍生物。優(yōu)選地，所述組合物還包含一種或多種藥學可接受的載體(carrier)和/或合適的佐劑或賦形劑。在本說明書中，單詞“包含(comprise)”或者諸如“包含(comprises) ”或“包含 (comprising)，，的變形應理解為表示包括一個指定的元素、整數(shù)或步驟或者元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟或者元素、整數(shù)或步驟的組。


圖1. STR0-4抗原由包括基本上所有產克隆MPC在內的綿羊和人BM MNC的小細胞群表達對Ficoll分離的綿羊和人BM MNC的樣本進行單色免疫熒光和流式細胞術以檢查 STR0-4抗原的表達。對每個群，綿羊(A)和人(B)BMMNC樣品中STR0-4+細胞的平均發(fā)生率分別是4.0% 士 1.2和3.0% 士 1.0 (η = 3)。數(shù)據(jù)顯示為1 X IO4個光散射門控事件的單參數(shù)熒光(藻紅蛋白(PE))直方圖，收集為列表式數(shù)據(jù)。IgG對照(虛線)；mAb STR0-3(實線)。將未分級BM和MACS選擇的STR0-4+和STRO-f綿羊(C)和人(D)BMMNC的單細胞懸液接種入普通生長培養(yǎng)基以評價每種細胞組分中粘附性集落形成細胞的發(fā)生率。按照方法部分的描述，培養(yǎng)12天后，將集落(50個細胞或更多的聚集體)染色并評分。柱圖表示對于每種細胞組分，接種的每IO5個細胞的產克隆集落的數(shù)目，該結果來自3個獨立實驗的平均值。這些數(shù)據(jù)證明大多數(shù)產克隆MPC僅限于BM的STR0-4+組分。圖2.離體擴增的MPC表達高水平的STR0-4抗原。傳代兩次的綿羊MPC(A)和人MPC(B)以及MG63細胞(C)的單細胞懸液通過胰蛋白酶/EDTA消化獲得，然后進行處理以用于單色流式細胞術。隨后將細胞用STR0-4上清孵育，然后用偶聯(lián)PE的山羊抗鼠IgG間接標記。直方圖代表2X IO4個事件，收集為列表式數(shù)據(jù)。STR0-4的陽性(通過水平統(tǒng)計學標記物高亮顯示)定義為大于99%的同種型匹配的未結合對照抗體(1B5 ；黑線)所觀察到的熒光水平的熒光水平。結果證明大多數(shù)離體擴增的綿羊和人MPC表達STR0-4 (粗線)。圖3. STR0-4抗原選擇的綿羊和人MPC的發(fā)展?jié)摿Α?br> 在成脂(adipocytic)、成骨或成軟骨條件下誘導源自STR0-4抗原選擇的綿羊和人MPC的細胞的傳代培養(yǎng)物。于脂肪形成誘導兩周內，通過油紅-0染色(箭頭)檢測人 MPC(A)和綿羊MPC(B)培養(yǎng)物Q00X)中含脂脂肪細胞簇的存在。于骨誘導條件下培養(yǎng)4 周內，在人MPC(C)和綿羊MPC(D)培養(yǎng)物QOOX)中形成用茜素紅試劑(箭頭)陽性染色的礦化沉積物。于成軟骨誘導3周后，在人MPC(E)和綿羊MPC(F)培養(yǎng)物(箭頭M200X) 中，聚集培養(yǎng)中蛋白聚糖的甲苯胺藍陽性染色存在于圍繞軟骨細胞樣細胞(箭頭)的整個細胞團。圖4. STR0-4抗體鑒定90kDa分子量的蛋白。按照方法部分的描述，從培養(yǎng)擴增的STR0-4+人MPC的單細胞懸液制備質膜裂解物。將細胞裂解物用STR0-4上清或同種型匹配的對照抗體1B5孵育，然后通過磁珠分離進行免疫沉淀。通過10% (w/v) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀物，然后利用考馬斯藍染色顯示。圖5. STR0-4抗體鑒定熱休克蛋白-90 β。按照方法部分的描述，從培養(yǎng)擴增的STR0-4+人MG63的單細胞懸液制備質膜裂解物。將細胞裂解物用STR0-4上清孵育，然后通過磁珠分離進行免疫沉淀。通過10% (w/ ν) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀物，然后利用考馬斯藍染色顯示。從凝膠切下 90kDa條帶，將其進行胰蛋白酶消化，然后利用具有MS模式的T0F/T0F光學裝置的Applied Biosystems 4700蛋白質組分析儀(Proteomics Analyser)進行質譜分析。微量測序肽分析證明了與人熱休克蛋白-90 β (NCBI，登錄號Ρ08238)匹配的STR0-4測序的肽(粗體)。圖6. STR0-4抗體對熱休克蛋白_90 β的特異性反應性的確認。按照方法部分的描述，制備培養(yǎng)擴增的STR0-4+人MPC作為單獨的全細胞裂解物或用于產生STR0-4或1Β5免疫沉淀物。在10% (w/v) SDS-聚丙烯酰胺凝膠上通過電泳分析全細胞裂解物和STR0-4或1B5免疫沉淀物。將蛋白轉移至PVDF膜，然后用5%脫脂奶粉-0.05%吐溫-20封閉，然后將濾膜(filter)用可商購的針對HSP-90 β的多克隆抗體孵育。通過 ImageQuant 軟件(Molecular Dynamics),禾丨J用 FluorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)顯示免疫反應性蛋白?？笻SP-90 β抗體在對照全細胞裂解物制品和STR0-4免疫沉淀樣品中均檢測到特征性90kDa條帶。發(fā)明詳述術語“和/或”，例如“X和/或Y”應當理解為表示“X和Y”或“X或Y”，并且應當對這兩種含義或任一種含義提供明確的支持。微生物保藏詳細資料產生命名為STR0-4的單克隆抗體的雜交瘤于2008年7月10日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登錄號為PTA-9362。該保藏依據(jù)國際公認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的條款和其下細則進行。這保證了從保藏日起30年可以維持成活力的培養(yǎng)物。該有機體可以根據(jù)布達佩斯條約的條款從ATCC得到，布達佩斯條約保證在相關專利公布后，公眾可永久并且不受限制的獲得培養(yǎng)物的子代。本申請的受讓人同意，如果在合適條件下培養(yǎng)時保藏的培養(yǎng)物死亡或丟失或破壞，將根據(jù)通知迅速用相同培養(yǎng)物的活樣本進行替換。保藏株的可獲得性不應理解為對違反任何政府根據(jù)其專利法所授權的權利來實施發(fā)明的許可。常規(guī)技術除非另外專門定義，本文使用的所有技術和科學術語都應與本領域(例如細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學和生物化學)普通技術人員通常的理解具有相同的含義。除非另外指出，本發(fā)明使用的重組蛋白、細胞培養(yǎng)和免疫技術是本領域技術人員公知的標準方法。這類技術在貫穿以下的文獻中進行了描述和解釋，例如J.Pertal， A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J. Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)，Τ. A. Brown (editor)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach,Volumes 1 and 2，IRL Press(1991),D. M. Glover and B. D. Hames(editors),DNA Cloning :A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996)禾口F. M. Ausubel et al. (editors)， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括到現(xiàn)在為止的所有更新)，Ed Harlow and David Lane (editors)Antibodies :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)禾口J. E. Coligan et al. (editors)Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons (包括到現(xiàn)在為止的所有更新)。多潛能細胞多潛能細胞是能夠產生幾種成熟細胞類型中的任意種的細胞。在一實施方案中， 多潛能細胞源自成體組織。該術語包括例如間充質前體細胞(MPC)、間充質干細胞(MSC)和多潛能擴增的MPC子代(MEMP)。間充質前體細胞(MPC)是在骨髓、血液、真皮和骨膜中發(fā)現(xiàn)的細胞；其能夠分化為間充質或結締組織的特定類型，包括脂肪、骨、軟骨、彈性、肌肉和纖維結締組織。這些細胞進入的特定譜系定向和分化途徑取決于各種機械影響和/或諸如生長因子、細胞因子的內源生物活性因子的影響和/或宿主組織所建立的局部微環(huán)境條件的影響。間充質前體細胞定義為不會終端分化的細胞；其可以無限地分裂；其分裂產生的子細胞是干細胞或在一定時期會不可逆分化以產生表型和/或功能不同的細胞類型的祖細胞。MPC是能夠形成大量多潛能細胞的非造血祖細胞。多潛能細胞的富集本文使用的術語“富集的”、“富集”或其變形用于描述與未處理的細胞群相比，一種特定細胞類型的比例或許多種特定細胞類型的比例增加的細胞群。本發(fā)明的富集多潛能細胞的方法可以基于檢測單獨的HSP_90i3標記物的存在或 HSP-90i3標記物結合一種或多種其他標記物的存在。例如，富集多潛能細胞的方法還可以基于富集對選自以下標記物的一種或多種標記物陽性的細胞STR0-1、STR0-3 (TNSAP)、 CD106、CD146、LFA-3, THY-U VCAM-U ICAM-1、PECAM-1、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、CD49a/ CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD 18、CD61、整合蛋白 β、6_19、血栓調節(jié)蛋白、 CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦蛋白-R、(STR0-2 =瘦蛋白 _R)、 RANKL或這些標記物的任意組合。因此，本發(fā)明的富集的多潛能細胞群也可以對這些標記物的一種或多種或它們的組合是陽性的。
細胞對指定標記物是“陽性”表示它可以是該標記物的低(Io或dim)或高(高 (bright), bri)表達者(expresser)，這取決于標記物在細胞表面存在的程度，其中該術語涉及用于細胞的顏色分選方法的熒光或其他顏色的強度。Io (或dim或dull)和bri的區(qū)別在用于分選的特定細胞群的標記物的背景下進行理解。當用于本文時，術語“高”指當可檢測地標記時在細胞表面產生較高信號的標記物。同時不希望受理論約束，認為“高”細胞比樣品中的其他細胞表達更多的靶標記物抗原 (例如由STR0-1識別的抗原)。例如，通過FACS分析，當用熒光偶聯(lián)的STR0-1抗體標記時， STRO-Itoi細胞比非-高細胞(STR0-ldullMm)產生更多的熒光信號。在另一實例中，STRO-Itoight細胞具有STR0-1表面表達的2個log級的更高表達。 這是相對于同種型匹配的陰性對照計算的。通過比較，STRO-Idim和/或STR0-廣細胞相對于同種型匹配陰性對照具有STR0-1表面表達的少于2個log級的更高表達，通常是約1個log或更低的表達。例如，所述方法可以包括制備第一部分富集的細胞池(pool)的步驟，這通過富集第一多潛能細胞特異性標記物的表達進行，然后進行從部分富集的細胞池富集HSP-90 β 的表達的步驟。在另一實例中，所述方法可以包括基于選擇表達HSP-90i3的細胞的初始富集步驟，然后進行涉及富集不同多潛能細胞標記物的步驟。仍在另一實例中，所述方法涉及同時選擇表達HSP-90 β和一種或多種其他多潛能細胞標記物的細胞。優(yōu)選地，大部分多潛能細胞能夠分化為至少兩種定向細胞類型。多潛能細胞可以分化成的細胞系的非限制性實例包括骨前體細胞；肝細胞祖細胞(progenitor)，其對于膽管上皮細胞和肝細胞是多能性的；神經限制性細胞，其可以產生發(fā)展為少突膠質細胞和星形膠質細胞的膠質細胞前體；神經元前體，其發(fā)展為神經元；心肌和心肌細胞的前體，葡萄糖應答性胰島素分泌胰β細胞系。其他細胞系包括但不限于成牙本質細胞、牙質產生細胞和軟骨細胞以及下列前體細胞視網膜色素上皮細胞、成纖維細胞、諸如角質形成細胞的皮膚細胞、樹突細胞、毛囊細胞、輸尿管(renal duct)上皮細胞、平滑肌和骨骼肌細胞、睪丸祖細胞、血管內皮細胞、腱細胞、韌帶細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞、 心肌細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、周細胞、血管細胞、上皮細胞、神經膠質細胞、神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。在優(yōu)選實施方案中，多潛能細胞至少能在體內或體外培養(yǎng)以產生脂肪細胞、成骨細胞和/或軟骨細胞。應理解表達細胞表面HSP-90i3的細胞的分離可以受到多種不同方法的影響，但是所有這些方法在一定程度上依賴于細胞與HSP-90 β結合劑的結合，然后是表現(xiàn)出高水平結合或低水平結合或不結合的那些細胞的分離。HSP-90 β /STR0-4 抗原HSP-90 β通常存在于細胞的細胞質中，它作為分子伴侶蛋白以促進后天細胞生長和分化的許多關鍵調節(jié)子的正常折疊、胞內沉積和蛋白水解轉換。其是高度保守的應激應答蛋白家族的部分。在正常生理條件下HSP通常以低水平表達，但在響應細胞應激時則表現(xiàn)出顯著增加的表達。應理解術語“HSP-90 β ”不限于人或綿羊來源的序列，還包括獲得自任何來源的同源序列，例如同系物，尤其是直系同源物(即獲得自除了人之外的物種的同系物)、等位基因變體及其片段和合成肽或衍生物。
多肽的序列同一性(％同一性)通過 FASTA(Pearson and Lipman, (198 )分析 (GCG程序)確定，這使用缺省設置和長度為至少50個氨基酸的查詢序列，因此FASTA分析在至少50個氨基酸的區(qū)域比對兩條序列。更優(yōu)選地，F(xiàn)ASTA分析在至少100個氨基酸的區(qū)域比對兩條序列。更優(yōu)選地，F(xiàn)ASTA分析在至少250個氨基酸的區(qū)域比對兩條序列。甚至更優(yōu)選地，F(xiàn)ASTA分析在至少350個氨基酸的區(qū)域比對兩條序列。術語“HSP_90i3 ”還包括上述全長多肽的片段及其變體，包括HSP_90i3序列的片段。優(yōu)選的片段包括包含表位的那些片段。合適片段的長度為至少約6或7個氨基酸，例如長度為至少10、12、15或20個氨基酸。它們的長度還可以小于200、100或50個氨基酸。HSP-90 β 結合劑當用于本文時，短語“HSP-90 β結合劑”指識別和/或特異性結合HSP-90 β的部分?！疤禺愋越Y合”表示HSP_90i3結合劑能夠以合適的親和力和/或親合性結合 HSP-90i3以提供用于選擇性富集表達HSP-90 β的細胞的有效工具。即，與替代性靶標(例如非HSP-90 β )相比，HSP-90 β結合劑與HSP-90 β的結合更頻繁、更快速、持續(xù)時間更長和/或親和力更高。例如，與結合其他非HSP90i3靶標相比，特異性結合HSP90i3或者其表位或免疫原性片段的HSP90i3結合劑的結合具有更高的親和力、親合性、更容易和/或持續(xù)時間更長。優(yōu)選的HSP_90i3結合劑是經鑒定具有對HSP-90 β的結合親和力的多肽或化合物?；诜强贵w的結合劑本發(fā)明的HSP_90i3結合劑包括肽、擬肽類、核酸適配體、肽適配體、樹狀聚體和小有機分子。核酸適配體(可適應的低聚物)是能夠形成提供結合分子靶標的能力的二級和/ 或三級結構的核酸分子。例如，通過將隨機寡核苷酸克隆入載體(或者就RNA適配體而言是表達載體)來產生適配體文庫，其中隨機序列的兩側是提供PCR引物的結合位點的已知序列。例如，使用SELEX (指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進化(Sytematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment))選擇活性增加的適配體。用于產生和/或篩選適配體文庫的合適方法描述于例如 Elloington and Szostak, Nature 346 :818-22,1990。用于合成小有機化合物的技術依據(jù)化合物而顯著改變，但是這類方法是本領域技術人員公知的。在一實施方案中，使用信息學方法從已知化合物中選擇合適的化學結構單元來產生組合文庫。例如，QSAR(定量構效關系(Quantitative Structure Activity Relationship))建模方法使用線性回歸或化合物結構的回歸樹來確定適應性。Chemical Computing Group, Inc. (Montreal, Canada)的軟件使用關于活性以及非活性化合物的高通量篩選實驗數(shù)據(jù)來產生隨機QSAR模型，該模型隨后用于選擇前導化合物。二元QSAR方法基于化合物的3種特性，其構成特定化合物能或不能完成所需功能的可能性的“描述符 (descriptor)，，部分電荷、摩爾折射率(鍵合相互作用)和logP(分子的親脂性)。分子中的每個原子都有表面積，并且具有與此相關的這3種特性。具有某種范圍的部分電荷的化合物所有原子都被確定，并將表面積(Van der Walls Surface Area描述符)相加。然后將二元QSAR模型用于建立活性模型或ADMET模型，其用于構建組合文庫。因此，在初始篩選中鑒定的前導化合物可用于擴大篩選的化合物列表從而鑒定高活性化合物?；诳贵w的結合劑尤其優(yōu)選的HSP-90 β結合劑是抗HSP-90 β抗體或其抗原結合片段或其衍生物/ 變體(天然存在或重組的，來自任何來源)。如本文使用的，術語“抗體”指這樣的免疫球蛋白分子，其能夠通過至少一個位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的表位識別位點來結合靶標，例如HSP-90 β和/或其表位和/或其免疫原性片段和/或其修飾形式(例如糖基化、糖基化等)。該術語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且包括變體、包含具有所需特異性的表位識別位點的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體以及包含所需特異性的表位識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。本文使用的術語“抗體結合片段”旨在表示抗體的任何片段，其保留結合HSP-90 β 的能力，優(yōu)選特異性結合HSP-90 β的能力。這包括(l)Fab，含有抗體分子的單價抗原結合片段的片段，可以通過以下方式制備用木瓜蛋白酶消化整個抗體以產生完整的輕鏈和一條重鏈的一部分；(2) Fab'，抗體分子的片段，可以通過以下方式獲得用胃蛋白酶處理整個抗體， 然后還原，以產生完整的輕鏈和重鏈的一部分；每個抗體分子獲得兩個Fab'片段；(3) (Fab' )2，抗體的片段，可以通過以下方式獲得用胃蛋白酶處理整個抗體，沒有后續(xù)的還原；F(ab)2是通過兩條二硫鍵結合在一起的兩個Fab'片段的二聚體；G)Fv，定義為基因工程片段，其含有表達為兩條鏈的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)；和(5)單鏈抗體(“SCA”)，定義為基因工程分子，其含有輕鏈的可變區(qū)、重鏈的可變區(qū)，通過合適的多肽連接物(linker)連結為遺傳融合的單鏈分子。(6)單結構域抗體，優(yōu)選不含輕鏈的可變重鏈結構域。制備這些片段的方法是本領域已知的。(參見，例如，Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,New York(1988), 其通過引用并入本文)。術語“單克隆抗體”指能夠結合相同抗原并優(yōu)選地結合抗原內相同表位決定簇的同質性抗體群。該術語不意圖限制限制抗體的來源或其制備方式。術語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種 (例如鼠，如小鼠)或者屬于特定抗體種類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與源自另一物種(例如靈長類，如人)或者屬于另一抗體種類或亞類的抗體的相應序列相同或者同源；以及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學活性(美國專利 4，816，567 號；和 Morrison et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci USA 81:6851-6855)。術語“人源化抗體”應當理解為表示嵌合分子，其通常使用重組技術制備，具有源自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點，并且分子的剩余免疫球蛋白結構基于人免疫球蛋白的結構和/或序列?？乖Y合位點優(yōu)選包含來自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)，其移植到人抗體的可變結構域中合適的框架區(qū)上；并且剩余區(qū)域來自人抗體。表位結合位點可以是野生型或由一個或多個氨基酸取代修飾。已知重鏈和輕鏈的可變區(qū)均含有3個互補決定區(qū)(CDR)，其根據(jù)所關注表位而變化，并決定結合能力；側翼是4個框架區(qū)(FR)，其在指定物種中是相對保守的，據(jù)推測為CDR提供支架。當根據(jù)特定表位制備非人抗體時，可以將可變區(qū)“重塑(reshape) ”或“人源化”，這通過將源自非人抗體的⑶R移植到存在于待修飾人抗體的FR上進行。這種方法的應用是本領域已知的，和/或在本文中更詳細地描述。本文使用的術語恒定區(qū)(CR)指提供效應物功能的抗體分子的部分。受試者人源化抗體的恒定區(qū)源自人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可以選自5種同種型中的任意種α、δ、 ε、Y或μ。此外，各種亞類(諸如重鏈的IgG亞類)的重鏈負責不同的效應物功能，因此通過選擇期望的重鏈恒定區(qū)可以產生具有期望的效應物功能的抗體。優(yōu)選的重鏈恒定區(qū)是 Yl (IgGl)、y2(IgG2), y3(IgG3)和y4(IgG4)0輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ型，優(yōu)選κ 型?！翱蚣軈^(qū)”是除了 CDR殘基以外的那些可變結構域殘基。天然存在抗體的每個可變結構域通常具有4個FR，經鑒定為FRl、FR2、FR3和FR4。如果根據(jù)Kabat確定CDR，則輕鏈 FR 殘基位于約殘基 1-23 (LCFRl)、35-49 或 40-54 (LCFR2)、57-88 或 62-93 (LCFR3)以及98-107或103-112 (LCFR4)；重鏈FR殘基位于重鏈殘基中約殘基1_30或1_30 (HCFRl)、 36-49 (HCFR2)、66-94 或 67-96 (HCFR3)以及 103-113 或 109-119 (HCFR4)。如果 CDR 包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，則輕鏈FR殘基位于輕鏈中約殘基1-25 (LCFRl) ,33-49 (LCFR2)、 53-90 (LCFR3)以及97-107 (LCFR4)；重鏈FR殘基位于重鏈殘基中約殘基1_25 (HCFRl)、 33-52 (HCFR2) ,56-95 (HCFR3)以及 102-113 (HCFR4)。在一些情況下，當 CDR 包含來自 Kabat 所確定的CDR的氨基酸和高變環(huán)的氨基酸時，F(xiàn)R殘基將相應調整。技術人員會清楚在FR定位的一些變化，例如作為突變(例如缺失和/或插入)的結果，例如多達5個殘基變化、或 4個殘基變化、或2個殘基變化、或1個殘基變化(例如，本文所示例的抗體)。本文使用的術語“互補決定區(qū)”(同義詞⑶R ；BP⑶R1、⑶R2和⑶R3)指抗體可變結構域的氨基酸殘基，其存在是抗原結合必需的。每個可變結構域通常具有3個CDR區(qū)，稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3。每個互補決定區(qū)可以包含來自Kabat確定的“互補決定區(qū)”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結構域中的約殘基M-M或M-39(L1) ,50-56或55-61 (L2)和89-97 或93-102 (L3)以及重鏈可變結構域中的31-35或沈_35 (Hl)、50-65或50-66 (H2)和95-102 或97-108(H3) ；Kabat et al. ,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))禾口 /或來自“高變環(huán)”的那些殘基，即輕鏈可變結構域中的約殘基^_32(L1)、50-52(L2)和 91-96 (L3)以及重鏈可變結構域中的洸_32(H1)、53-55(H2)和 96-101 (H3) ；Chothia and Lesk (1987) J. Mol Biol. 196 :901-917)。在一些情況下，互補決定區(qū)可以包含Kabat確定的 CDR區(qū)和高變環(huán)的氨基酸。技術人員會清楚在FR定位的一些變化，例如作為突變(例如缺失和/或插入)的結果，例如，多達5個殘基變化、或4個殘基變化、或2個殘基變化、或1 個殘基變異(例如，本文所示例的抗體)。本文使用的術語“衍生物”旨在表示包含一個或多個保守氨基酸取代的抗 HSP_90i3抗體或其抗原結合片段。術語“保守取代”應當表示表1所述的氨基酸取代。表1.示例性取代
權利要求
1.HSP-90 β作為鑒定和/或富集多潛能細胞的標記物的用途。
2.一種富集多潛能細胞的方法，所述方法包括從組織來源制備細胞樣品并且富集表達所述HSP-90i3標記物的細胞。
3.權利要求2的方法，其中富集表達所述HSP-90i3標記物的細胞包括使細胞樣品與HSP-90i3結合劑接觸；和將結合所述HSP-90i3結合劑的細胞與不結合所述HSP-90 β結合劑的細胞分離。
4.一種鑒定細胞樣品中多潛能細胞的存在的方法，所述方法包括鑒定樣品中表達所述 HSP-90 β標記物的細胞。
5.權利要求4的方法，其中樣品中表達所述HSP-90i3標記物的細胞的鑒定包括從組織來源獲得細胞樣品；在適合于HSP-90i3與所述HSP-90i3結合劑結合的條件下，使所述細胞樣品與 HSP-90 β結合劑接觸；和檢測結合所述樣品中細胞的HSP-90i3結合劑的存在，其中結合所述HSP-90 β結合劑的細胞指示多潛能細胞的存在。
6.權利要求2至5中任一項的方法，其中所述細胞樣品源自胎盤、脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、卵巢、胰、骨、韌帶、骨髓、 腱或骨骼肌。
7.權利要求2的方法，其中所述方法還包括在制備細胞樣品的步驟之前收獲多潛能細胞來源的步驟。
8.權利要求2至5中任一項的方法，其中所述結合劑是抗體或其抗原結合片段或衍生物。
9.權利要求8的方法，其中所述抗體是由雜交瘤細胞系產生的STR0-4抗體，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為 ΡΤΑ-9362。
10.權利要求8或9的方法，其中所述結合劑是所述STR0-4抗體的抗原結合片段。
11.通過權利要求2至10中任一項的方法獲得的富集的多潛能細胞群。
12.通過培養(yǎng)權利要求11的富集的多潛能細胞群獲得的擴增的細胞群。
13.—種產生組織特異性定向的細胞群的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的多潛能細胞群，和將所述培養(yǎng)的細胞群置于使所述多潛能細胞偏向分化為特定組織類型的條件下。
14.權利要求13的方法，其中所述組織類型選自胎盤組織、心肌、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神經組織、平滑肌和內皮組織。
15.一種產生或修復受試者的組織的方法，所述方法包括給予所述受試者權利要求11 的富集的細胞群或權利要求12的擴增的細胞群。
16.權利要求11的富集的細胞群或權利要求12的擴增的細胞群在制備用于產生或修復受試者的組織的藥物中的用途。
17.—種STR0-4雜交瘤細胞系，其依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為ΡΤΑ-9362。
18.—種HSP-90i3結合劑或其抗原結合片段或衍生物，其選自2(i)STR0-4單克隆抗體；( )嵌合抗體，其包含來自STR0-4的重鏈和輕鏈的可變區(qū)以及人重鏈和輕鏈的恒定區(qū)；和(iii)人源化抗體，其包含至少一個來自STR0-4的互補決定區(qū)(CDR)以及人框架區(qū)和恒定區(qū)序列。
19.一種由雜交瘤細胞系產生的STR0-4抗體，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008年7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。
20.一種分離的抗體或其抗原結合片段，其與雜交瘤細胞系產生的STR0-4抗體結合間充質前體細胞(MPC)上相同的表位，所述雜交瘤細胞系依據(jù)布達佩斯條約的條款于2008年 7月10日保藏于ATCC，保藏登錄號為PTA-9362。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稱為STRO-4的單克隆抗體及其用于富集諸如間充質前體細胞(MPC)的多潛能細胞的用途，所述單克隆抗體特異性結合人和綿羊HSP-90β。
文檔編號C12N5/07GK102257388SQ200980141163
公開日2011年11月23日 申請日期2009年8月18日 優(yōu)先權日2008年8月18日
發(fā)明者A·C·W·贊內蒂諾, S·格龍索斯 申請人:成血管細胞系統(tǒng)公司