專利名稱：：一種復合酶制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種黑曲霉液態(tài)發(fā)酵生產酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的方法。
背景技術：
：甘露聚糖酶對甘露聚糖原料的分解原理e-甘露聚糖酶(e-1，4-D-mannanmannohy-drolase，EC3*2*1'78)是一類能水解含{3-1，4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纖維素酶，廣泛存在于動植物和微生物中。甘露聚糖是以l，4-e-D-吡喃甘露糖苷鍵連結而成的線狀多糖，如果主鏈某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過l，6-a-糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分枝。則稱之為異甘露聚糖。主要有半乳甘露聚糖(galactornannan)、葡萄甘露聚糖(glucomannan)、半乳葡萄甘露聚糖(galactoglucomannan)。上述物質構成了植物半纖維素的第二大組份，這些物質的降解主要依靠的酶就是e-甘露聚糖酶。完全降解還需要e-甘露糖苷酶(e-mannosidase)、外切{3-D-甘露聚糖酶(Exo-{3-D秋annanase)、葡萄糖苷酶(glucosidase)，半乳糖苷酶(galactosidase)等支鏈酶的協同作用?，F行的甘露聚糖酶檢測底物主要是甘露糖與葡萄糖聚合的甘露聚糖，能夠體現出除半乳糖苷酶外的其他全部酶組分的協同效果，但是對于自然界中的半乳糖含量比較多的甘露聚糖原料，此酶還不足以對底物進行徹底的分解，由于半乳糖支鏈的存在，還會影響到其他酶分子對底物直鏈部分的分解作用。甘露聚糖酶在飼料上的應用e-甘露聚糖酶能將廣泛存在于豆類籽實中，可將甘露聚糖等多糖降解為甘露寡糖等低聚糖，不僅消除了甘露聚糖對單胃動物各種營養(yǎng)索的抗營養(yǎng)作用，同時生成的甘露低聚糖在動物腸道中起著重要的調節(jié)作用。近年來隨著對自然界半纖維素資源的開發(fā)應用，微生物e-甘露聚糖酶的開發(fā)和利用研究進入了一個新階段。研究表明在富含e-甘露聚糖的動物飼糧中添加外源e-甘露聚糖酶可以有效消除e-甘露聚糖的抗營養(yǎng)作用，從而提高動物的生長性能。e-甘露聚糖酶的作用機理主要表現在以下幾個方面。①降低消化道內容物粘度。甘露聚糖在e-甘露聚糖酶的作用下降解為低聚糖，大大減少了e-甘露聚糖與水分子的相互作用，從而降低腸道內容物的粘度，有利于營養(yǎng)物質的進一步消化吸收。②破壞植物性飼料細胞壁結構，使營養(yǎng)物質與消化酶充分接觸。植物細胞中淀粉和蛋白質等營養(yǎng)物質被細胞壁包裹，細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠等組成的一種復雜化合物，單胃動物不能很好地消化這一類物質。飼料中適當地添加能夠分解這類物質的酶，可以破壞飼料中存在的植物細胞壁，使營養(yǎng)物質釋放出來，提高飼料的營養(yǎng)價值。e-甘露聚糖是半纖維素的主要組成成分之一，添加e-甘露聚糖酶可起到降解細胞壁的作用。③改善腸道微生物菌群和提高腸黏膜的完整性。甘露聚糖的降解產物為甘露低聚糖(MOS)，它能顯著地促進動物腸道內以雙歧桿菌為代表的有益菌的增殖，減少病原菌在腸道的定植，調節(jié)動物的免疫反應，提高腸黏膜的完整性，最終提高動物的生產性能。甘露寡糖可選擇性地抑制有害微生物在腸道中的增殖。微生物病原菌的第一步是結合在消化道腸黏膜表面，這種結合是特異性的，其機理為細菌細胞壁表面蛋白如植物凝血素與動物腸道黏膜上皮細胞表面糖脂或糖蛋白的糖殘基結合。當腸道內存在一定量的MOS等寡糖時，可結合細菌的植物凝血素，而減少了與腸黏膜上皮細胞結合的機會，這樣外源病菌就會被排出體外，根據競爭性排阻作用，促進有益菌在腸道中增殖。④e-甘露聚糖酶能夠提高動物的生長性能。e-甘露聚糖酶可有效地改進豬與家禽等單胃動物的生長性能。特別是在應激條件下，e-甘露聚糖酶可使其生長性能顯著改善。一般認為類胰島素生長因子((IGF-I)是畜禽真正的生長調控因子。生長激素(GH)的促生長作用是IGF-I介導的。IGF-I作用于生長組織，刺激細胞對氨基酸的利用從而促進蛋白質的合成，抑制蛋白質的分解，最終導致蛋白質的凈增長。在石油上的應用在石油進行二次開采時，為打通地下油的通道，采取用瓜爾膠攜帶沙子支撐細縫，在瓜爾膠在把沙子帶入細縫后，要降解成水樣，利于油液的滲透。甘露聚糖酶即可起到這樣的作用，并且甘露聚糖酶還具有作用時間長，可以調控和減輕環(huán)境污染等優(yōu)點國內現在多利用固體發(fā)酵生產甘露聚糖酶，發(fā)酵產品中除含有需要的酶成分外，還會含有發(fā)酵的原料廢渣、發(fā)酵菌體和雜菌，會影響到產品在飼料上的應用效果；在石油上應用，由于固態(tài)殘渣過多會堵塞石油的滲透縫隙，達不到疏通地下油道的效果。本發(fā)明目的在于提供一種采用菌體液體發(fā)酵，同時生產出含有液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶兩種復合酶制劑，這樣就可以更徹底的分解甘露聚糖大分子成為低聚糖直至分解成為甘露糖，在飼料和石油上的應用效果更好。本發(fā)明復合酶制劑，其包含以下酶種及活性液體酸性e—甘露聚糖酶，1300u/ml，液體a-半乳糖苷酶，300u/ml。本發(fā)明復合酶制劑的制備方法該方法包括以下工藝步驟將斜面培養(yǎng)的黑曲霉，經液態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵菌種；1)在無菌操作下，把斜面種子接入，在12rC下滅菌30分鐘并冷卻至29。C的700立升種子罐中，在罐壓O.05MPa，29°C±1°C的條件下培養(yǎng)48-60小時，經滅菌后的移種管路轉入在12rC滅菌30分鐘并冷卻到29。C士rC含10T培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在通風量l:O.6，罐壓O.05MPa，溫度29。C±1°C的條件下培養(yǎng)100-125小時，達到放罐標準后，經滅菌后的放料管路放入滅菌后的絮凝罐加入絮凝劑，在經清洗處理過后的板框壓濾機進行壓濾，清液打入循環(huán)罐進入超濾膜濃縮器進行超濾濃縮至要求的活力后，即制得液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的復合酶制劑。所述種子罐的培養(yǎng)基是1%魔芋粉，8%麩子，2%硫酸銨，滅菌后pH值為4.6-5.3。所述發(fā)酵罐的培養(yǎng)基是1%魔芋粉，8%麩子，2%硫酸銨，0.2%磷酸二氫鉀、0.5%氯化鈣，滅菌后pH值為4.6-5.3。所述液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶，應用在飼料和石油上。本發(fā)明的優(yōu)點及技術指標i、一次一菌株液態(tài)深層發(fā)酵，產品同時含有液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶。2、發(fā)酵酶活酸性e—甘露聚糖酶1300u/ml，a-半乳糖苷酶300u/ml。3、此兩種酶在pH2.0-7.5，溫度20-70范圍內均可較高的發(fā)揮酶活力，能夠滿足動物不同消化道環(huán)境的酸堿要求和不同石油開采深度對溫度的要求。具體實施例方式在無菌操作下，把黑曲霉斜面種子接入，在12rC下滅菌30分鐘并冷卻至29。C的700立升種子罐中，在不斷通入無菌空氣(通風量為1:0.6)罐壓0.05MPa，29°C±1°C的條件下培養(yǎng)48-60小時，經化驗檢測成熟這到標準后，經滅菌后的移種管路轉入在12rC滅菌30分鐘并冷卻到29。C士rC含10T培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在通風量l:O.6，罐壓O.05MPa，溫度29。C士1。C的條件下培養(yǎng)100-125小時，達到放罐標準后，經滅菌后的放料管路放入滅菌后的絮凝罐加入絮凝劑硅藻土助濾劑，在經清洗處理過后的板框壓濾機進行壓濾(渾液回流絮凝罐)，清液打入循環(huán)罐進入超濾膜濃縮器進行超濾濃縮至要求的活力后，化驗合格后，即制得液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的復合酶制劑。將食用淀粉或稻殼粉投入混合機內，按淀粉或稻殼粉體積的75%比例加入成品酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶濃縮液，在混合機內攪拌5-10分鐘以上，待混均后，放入干燥盤中，送入烘房45。C以下進行干燥，在干燥過程中要間歇翻盤，大約36小時可達到干燥要求，按上述操作再進行第二次吸附干燥，然后粉碎混粉，檢驗合格后即為成品粉劑酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的復合酶產品。各種發(fā)酵原料的選定原料+2%硫酸銨添加量％酶活U/mL魔芋粉0.6219豆粕0.6128菜籽粕0.697麩皮6103稻糠687玉米皮623原料不同比例的確定魔芋粉添加量％+6%麩皮+2%硫酸銨酶活U/mL0.54220.88511.09501.259251.57202.0324麩皮添加量％+1%魔芋粉+2%硫酸銨酶活U/mL273148536926898710920由于在發(fā)酵過程中我們添加了0.2%的磷酸二氫鉀和0.5。/。的氯化鈣來緩解發(fā)酵過程中pH的變化，使產品的發(fā)酵酶活達到1300u/ml。本發(fā)明在飼料上的應用及效果試驗測定了添加此復合酶量控制在O.04%—0.05%之間對飼喂玉米-大豆日糧的產蛋母雞性能的影響。結果表明如表l，在日糧中添加此復合酶可以顯著提高母雞日產蛋率，降低蛋料比和破蛋率。試驗還表明在日糧中添加e-甘露聚糖酶也可以增加產蛋母雞早期的平均蛋重，提高產蛋量，明顯延遲產蛋高峰的急劇下降。表l產品飼喂蛋雞的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明復合酶制劑在石油上的使用及效果試驗在每kg石油壓裂液中添加O.6g本產品的應用效果如表2原料黏度下降速度采油量(噸)攜沙壓裂液不下降--攜沙壓裂液+過硫酸銨黏度迅速下降39.8攜沙壓裂液+此產品黏度下降可控，持續(xù)下降63.7此表表明在攜沙壓裂液中添加此產品可以達到降低壓裂液黏度的要求，又因其具有黏度下降慢，攜沙效果好等優(yōu)點使采油的時間和量得到了提高，可多采油60%。權利要求1.一種復合酶制劑，其特征在于包含以下酶種及活性液體酸性β-甘露聚糖酶，1300u/ml，液體α-半乳糖苷酶，300u/ml。2.如權利要求l所述復合酶制劑的制備方法其特征在于該方法包括以下工藝步驟將斜面培養(yǎng)的黑曲霉，經液態(tài)發(fā)酵，得到發(fā)酵菌種；1)在無菌操作下，把斜面種子接入，在12rC下滅菌30分鐘并冷卻至29。C的700立升種子罐中，在罐壓O.05MPa，29。C士1。C的條件下培養(yǎng)48-60小時，經滅菌后的移種管路轉入在12rC滅菌30分鐘并冷卻到29i:士rC含10T培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在通風量1:0.6，罐壓0.05MPa，溫度29。C±1°C的條件下培養(yǎng)100-125小時，達到放罐標準后，經滅菌后的放料管路放入滅菌后的絮凝罐加入絮凝劑，在經清洗處理過后的板框壓濾機進行壓濾，清液打入循環(huán)罐進入超濾膜濃縮器進行超濾濃縮至要求的活力后，即制得液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的復合酶制劑。3.根據權利要求2所述的復合酶制劑的制備方法，其特征在于所述種子罐的培養(yǎng)基是1%魔芋粉，8%麩子，2%硫酸銨，滅菌后pH值為4.6-5.3。4.根據權利要求2所述的復合酶制劑的制備方法，其特征在于所述發(fā)酵罐的培養(yǎng)基是1%魔芋粉，8%麩子，2%硫酸銨，0.2%磷酸二氫鉀、0.5%氯化鈣，滅菌后pH值為4.6-5.3。5.如權利要求i所述的液體酸性e—甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶，在飼料和石油上的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種復合酶制劑及其制備方法和應用，本發(fā)明復合酶制劑，其包含以下酶種及活性液體酸性β-甘露聚糖酶，1300u/ml，液體α-半乳糖苷酶，300u/ml。本發(fā)明復合酶制劑的制備方法，將斜面培養(yǎng)的黑曲霉，經液態(tài)發(fā)酵，得到液體酸性β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的復合酶制劑。此兩種酶在pH2.0-7.5，溫度20-70范圍內均可較高的發(fā)揮酶活力，能夠滿足動物不同消化道環(huán)境的酸堿要求和不同石油開采深度對溫度的要求。文檔編號C12N9/42GK101608175SQ20091030486公開日2009年12月23日申請日期2009年7月27日優(yōu)先權日2009年7月27日發(fā)明者任樹文,勇何,孟令文,張豐杰,李樹俊,梁東升,王福興,蔡松巖,薛立新申請人:肇東市日成酶制劑有限公司