專利名稱：一種控制植物生長(zhǎng)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種植物發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
植物的發(fā)育及形態(tài)由細(xì)胞的伸長(zhǎng)，延展及分裂決定。其中植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)受外部環(huán)境因素及包括油菜素甾醇類激素在內(nèi)的多種植物內(nèi)源激素共同影響。而油菜素甾醇類激素對(duì)于植物最為明顯的生理效應(yīng)就是促進(jìn)植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)，如BRs促進(jìn)幼苗的莖、豌豆和綠豆的上胚軸、黃瓜下胚軸、單子葉植物的胚芽鞘、中胚軸等的伸長(zhǎng)，而且幼嫩的營(yíng)養(yǎng)器官對(duì)BRs的反應(yīng)尤為明顯。近年來(lái)隨著一系列BR相關(guān)突變體的鑒定及分子遺傳學(xué)及生物化學(xué)手段的研究，在擬南芥中BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)比較清楚了。BRs可結(jié)合在BRI1的胞外域，激活BRI1的激酶域，使得BRI1與BAK1結(jié)合并相互磷酸化，同時(shí)與抑制因子BKI1解聚，活化的BRI1磷酸化BSKs，BSKs將BRs信號(hào)由受體復(fù)合物BRI1/BAK1傳出，激活BSU1，BSU1通過(guò)去磷酸化使BIN2失活，去磷酸化的BZR1和BZR2積累，激活BR信號(hào)途徑下游基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。然而B(niǎo)R如何通過(guò)BZR1調(diào)控下游基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)，還有待進(jìn)一步研究。因此克隆BR信號(hào)途徑下游調(diào)控植物細(xì)胞伸長(zhǎng)的基因，將成為調(diào)控植物細(xì)胞伸長(zhǎng)從而控制植物發(fā)育及株型的重要分子工具。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物發(fā)育相關(guān)蛋白。
本發(fā)明提供的蛋白(AtIBH1)，來(lái)自擬南芥col生態(tài)型，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列3的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物發(fā)育相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)；所述植物發(fā)育體現(xiàn)在成株株高和/或葉柄長(zhǎng)度和/或下胚軸長(zhǎng)度和/或特定器官的大小等性狀上。
為了使(a)中的AtIBH1便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
表1標(biāo)簽的序列 上述(b)中的AtIBH1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的AtIBH1的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述蛋白的編碼基因(AtIBH1)可為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子 1)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子； 2)序列表中序列5的自’端第54-600位所示的DNA分子； 3)序列表中序列5所示的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子； 5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有AtIBH1基因的重組表達(dá)載體。
所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用AtIBH1構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
所述重組表達(dá)載體具體可為將所述AtIBH1基因插入pSN1301的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。
所述質(zhì)粒pSN1301是將質(zhì)粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)間插入35S-Noster序列得到的；所述35S-Noster序列是用限制性內(nèi)切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切質(zhì)粒pUC19-35S-Noster得到的；所述質(zhì)粒pUC19-35S-Noster是將質(zhì)粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)間插入35S啟動(dòng)子片段得到的；所述35S啟動(dòng)子片段是用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切質(zhì)粒pBI221得到的；所述質(zhì)粒pUC19-Noster是將質(zhì)粒pUC19的SacI和EcoRI酶切位點(diǎn)間插入Noster poly A終止序列得到的；所述Noster poly A終止序列是用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pBI221得到的。
本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
該方法是如下1)或2)的方法 1)將上述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為與所述目的植物相比株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小的轉(zhuǎn)基因植物； 2)在目的植物中將上述基因進(jìn)行抑制表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的株型大小大于所述目的植物。該目的植物為含有上述AtIEH1基因的植物。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的AtIBH1基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小。攜帶有AtIBH1基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可為雙子葉植物，如擬南芥(Columbia擬南芥)。
上述方法1)中，上述基因可具體通過(guò)上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
上述方法2)中，抑制表達(dá)是將AtIBH1-RNAi導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的； 所述AtIBH1-RNAi是將序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段正向插入pTCK309的Spe I和Sac I酶切位點(diǎn)間構(gòu)成pTCK309-1，將序列表中序列5的白5’端第66-359位所示的片段反向插入pTCK309-1的BamH I和Kpn I酶切位點(diǎn)，構(gòu)成AtIBH1-RNAi； 所述pTCK309的構(gòu)建方法如下將序列表中序列6所示的片段插入pBluescriptII SK+的KpnI和SacI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成pTCK302；用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物從水稻(中花10號(hào))基因組DNA中擴(kuò)增出478bp的水稻內(nèi)含子，連入pGEM-T(Promega)載體，構(gòu)成重組T載體；以所述重組T載體為模板，用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Sal I和Cla I酶切并克隆到所述pTCK302載體中，構(gòu)成的載體命名為pTCK302-1；用KpnI和Sacl酶切pTCK302-1得到小片段插入所述pSN1301的KpnI和Sacl酶切位點(diǎn)間，構(gòu)成pTCK309。
上述目的植物為雙子葉植物，該雙子葉植物可為擬南芥，該擬南芥具體可為Columbia擬南芥。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新蛋白AtIBH1及其編碼基因AtIBH1。AtIBH1可以與PRE1相互作用并功能拮抗，因此兩個(gè)基因可以同時(shí)使用達(dá)到控制對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制。用組織特異性啟動(dòng)子可以特異性的控制特定器官(包括營(yíng)養(yǎng)和有性生殖器官)的生長(zhǎng)和大小。本發(fā)明還獲得了含有該編碼基因AtIBH1的重組表達(dá)載體，用重組載體轉(zhuǎn)化目的植物，可以得到成株株高變矮和/或葉柄變短和/或下胚軸變短和/或特定器官變小的轉(zhuǎn)基因植物。將AtIBH1抑制表達(dá)后發(fā)現(xiàn)擬南芥的整個(gè)植株變大。因此AtIBH1可以作為一種潛在的分子育種工具，改變植物細(xì)胞伸長(zhǎng)，從而改良植物株型，提高植物生物量。



圖1為實(shí)施例1中i1i1-D突變體植株和日本晴(WT)幼苗期的照片。
圖2為實(shí)施例1中i1i1-D突變體植株和日本晴(WT)分蘗期的照片。
圖3為實(shí)施例1中種植于大田的揚(yáng)花期的i1i1-D和日本晴(WT)的旗葉、旗下第一葉和旗下第二葉葉夾角測(cè)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖4為實(shí)施例1中i1i1-D突變體植株和日本晴(WT)幼苗葉枕部位近軸面細(xì)胞掃描電鏡的照片。
圖5為實(shí)施例1中i1i1-D突變體、日本晴(WT)、轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株R2和R5的表型和OsILI1的表達(dá)量；A陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的表型；B實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)OsILI1在轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)量。
圖6為實(shí)施例2中PRE1和AtIBH1在酵母中及植物體內(nèi)相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A是酵母雙雜交檢測(cè)PRE1和AtIBH1在體外的相互作用；B煙草體內(nèi)AtIBH1-myc和PRE1-YFP免疫共沉淀的結(jié)果。
圖7為為實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)用24-epiBL終濃度為100nM的水溶液處理擬南芥野生型col及det2突變體幼苗2小時(shí)后，AtIBH1的相對(duì)表達(dá)量。
圖8為為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)野生型擬南芥col的根，幼苗，蓮座葉，莖生葉，花序及角果部位中AtIBH1的相對(duì)表達(dá)量，R、S、RL、CL、F、Si分別代表根，幼苗，蓮座葉，莖生葉，花序及角果。
圖9為染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子BZR1與AtIBH1啟動(dòng)子體內(nèi)的結(jié)合，其中A，BZR1 ChIP-chip Genome Browser software在AtIBH1啟動(dòng)子區(qū)的分析示意圖，空心矩形框代表啟動(dòng)子區(qū)，實(shí)心矩形框代表編碼區(qū)，黑線代表非編碼區(qū)，空心圓圈代表E-box，實(shí)心圓圈代表BRRE結(jié)合域，a和b代表ChIP-qPCR分析區(qū)段；B，BZR1染色質(zhì)免疫共沉淀分析結(jié)果。Y軸指qPCR分析所選區(qū)段與BZR1共沉淀后的富積程度，CNX5為對(duì)照基因，Bar為三次生物重復(fù)后取平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖10為實(shí)施例3中AtIBH1過(guò)表達(dá)擬南芥植株的表型。
圖11為實(shí)施例3中AtIBH1過(guò)表達(dá)擬南芥植株在光下的下胚軸和根的情況，其中A是下胚軸和根的表型，B是下胚軸和根的相對(duì)長(zhǎng)度。
圖12為實(shí)施例3中AtIBH1過(guò)表達(dá)擬南芥植株在暗中的下胚軸和根的情況，其中A是下胚軸和根的表型，B是下胚軸和根的相對(duì)長(zhǎng)度。
圖13為實(shí)施例3中AtIBHI-RNAi的轉(zhuǎn)基因擬南芥Col的情況分析，其中A是表型分析；B是AtIBH1的表達(dá)量檢測(cè)。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。
本發(fā)明依賴的遺傳資源如下日本晴水稻和突變體植株i1i1-D于2004年5月從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獲得，其原始來(lái)源不清楚；擬南芥Columbia的直接來(lái)源是2004年6月從華盛頓卡內(nèi)基研究院獲得，原始來(lái)源不清楚。
日本晴水稻中國(guó)科學(xué)院植物研究所；毛建軍，楊秀芬，曾洪梅，袁京京，邱德文.水稻品種日本晴粳稻組培培養(yǎng)基的篩選及轉(zhuǎn)稻瘟菌蛋白激發(fā)子基因植株的獲得.《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》，2008年16卷5期，824-830。
中花10號(hào)中國(guó)科學(xué)院植物研究所；李國(guó)甫，倪丕沖，李梅芳.高頻水稻原生質(zhì)體植株再生.《植物學(xué)報(bào)》，1993年，35(3)234-237. 擬南芥Columbia中國(guó)科學(xué)院植物研究所；劉俊，蔡平鐘，馬林，張志雄，向躍武，王閔霞，張志勇.冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBF2基因的克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建.《西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》，2009年22卷2期，428-432。
擬南芥bri1-5中國(guó)科學(xué)院植物研究所；Xuelu Wang，Xiaoqing LI，JillMwisenhelder，Tony Hunter，Shigeo Yoshida，Tadao Asami，and Joanne Chory.Autoregulation and Homodimerization Are Involved in the Activation of thePlant Steroid Receptor BRI1.《Development Cell》，2005年第8期855-865. 農(nóng)桿菌GV3101中國(guó)科學(xué)院植物研究所；鄭銀英，崔百明，常明進(jìn)，彭明.轉(zhuǎn)擬南芥ICE1基因增強(qiáng)煙草抗寒性的研究.《西北植物學(xué)報(bào)》.2009年29卷1期.75-79。
以下實(shí)施例中的基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果，均是以野生型植株的目的基因表達(dá)量為1，其它植株的目的基因表達(dá)量與野生型植株的目的基因表達(dá)量進(jìn)行比較。
實(shí)施例1、OsILI1的發(fā)現(xiàn) 一、突變體植株i1i1-D的獲得和形態(tài)觀察 1、突變體植株i1i1-D的獲得 構(gòu)建日本晴水稻T-DNA插入突變體庫(kù)，從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)葉夾角明顯增大的突變體植株i1i1-D。
2、突變體植株i1i1-D的形態(tài)觀察 對(duì)突變體植株i1i1-D進(jìn)行如下形態(tài)觀察。
(1)葉夾角 i1i1-D最重要的表型是在其各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，均表現(xiàn)為葉夾角明顯增大。在幼苗期，突變體萌發(fā)后生長(zhǎng)5天左右，在第二葉發(fā)育完全后就可觀察到第二葉葉夾角彎曲已超過(guò)90度(見(jiàn)圖1)。在分蘗期，突變體的每個(gè)新生分蘗都表現(xiàn)為葉夾角明顯增大(見(jiàn)圖2)。
對(duì)種植于大田的揚(yáng)花期的日本晴及i1i1-D的旗葉、旗下第一葉和旗下第二葉葉夾角進(jìn)行測(cè)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明野生型旗葉、旗下第一葉和旗下第二葉葉夾角大小主要集中在0-30°之間，而突變體的葉夾角則主要分布于90-150°之間(見(jiàn)圖3)。
(2)種子長(zhǎng)度 分別檢測(cè)100粒日本晴種子和100粒i1i1-D種子的長(zhǎng)度。i1i1-D種子的平均長(zhǎng)度為5.3±0.1，日本晴種子的平均長(zhǎng)度為4.8±0.2，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，與日本晴相比，i1i1-D種子變長(zhǎng)。
(3)葉枕部位細(xì)胞的伸長(zhǎng) 用掃描電鏡的方法對(duì)幼苗期的日本晴及i1i1-D突變體葉枕部位近軸面的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，i1i1-D突變體葉枕部位近軸面的細(xì)胞比野生型日本晴相同部位細(xì)胞的伸長(zhǎng)更為明顯。
3、突變體植株i1i1-D的子代的形態(tài)觀察 將i1i1-D種子繁殖后，后代持續(xù)出現(xiàn)葉夾角增大的表型。這些結(jié)果表明i1i1-D葉夾角增大的表型在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中都是穩(wěn)定的，并且表型是可穩(wěn)定遺傳的。
二、OsILI1的發(fā)現(xiàn) 根據(jù)插入的T-DNA載體序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物回收，送至公司測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn比對(duì)。結(jié)果表明T-DNA插入于水稻4號(hào)染色體BAC克隆OsJNBa0063C所對(duì)應(yīng)的序列上。
用Real-time PCR的方法對(duì)T-DNA插入兩側(cè)各10kb的DNA片段在日本晴及iii1-D中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明其中一段DNA(序列2所示的DNA)在i1i1-D突變體中上調(diào)了近20倍，因此推測(cè)可能是由于T-DNA上的35S啟動(dòng)子插入在序列2所示的DNA附近，造成了序列2所示的DNA的過(guò)量表達(dá)，從而造成了OsILI1突變體的表型。
三、OsILI1的功能鑒定 將序列2自5′端第116位至第297位核苷酸構(gòu)建入RNAi載體中，轉(zhuǎn)化i1i1-D，以期用RNA干涉的方法降低突變體中序列2所示的DNA的表達(dá)量。共獲得了11個(gè)株系，大部分轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株都恢復(fù)了野生型表型。隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中的幾個(gè)株系進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，兩個(gè)株系R2和R5明顯恢復(fù)到了野生型的表型，經(jīng)檢測(cè)，序列2所示的DNA的在植株中表達(dá)量相對(duì)于i1i1-D突變體明顯降低(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明，序列2所示的DNA與轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)野生型的程度密切相關(guān)。
以上結(jié)果表明i1i1-D突變體的表型是由于T-DNA插入在序列2所示的DNA附近，T-DNA上的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)序列2所示的DNA過(guò)量表達(dá)造成的。序列表的序列2所示的DNA編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)，根據(jù)表型將序列1所示的蛋白質(zhì)命名為OsILI1(Oraza sativa increased leaf inclination-1)，將OsILI1的編碼基因命名為OsILI1。
實(shí)施例2、AtIBH1的發(fā)現(xiàn) 一、AtIBH1的發(fā)現(xiàn) 通過(guò)對(duì)OsILI1蛋白序列進(jìn)行分析可知，OsILI1屬于basic helix-loop-helix(bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子家族，但它并沒(méi)有典型的basic結(jié)構(gòu)域。此類bHLH蛋白被歸類為D類bHLH蛋白，它們不能直接結(jié)合DNA，主要通過(guò)與典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體以調(diào)節(jié)它們的功能。以O(shè)sILI1全長(zhǎng)蛋白作為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與OsILI1相互作用的蛋白。將OsILI1的編碼序列從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增后，連入pBD-GAL4載體，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入酵母AH109，制作成感受態(tài)細(xì)胞后，共轉(zhuǎn)化水稻三葉期酵母雙雜交文庫(kù)。篩庫(kù)的效率為3×105克隆/g DNA，總的篩庫(kù)量為3×106克隆，能在-His/-Trp/-Leu SD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆數(shù)為22個(gè)，最后能在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆數(shù)為10個(gè)。對(duì)這10個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其中有5個(gè)屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子，其中的克隆16在篩選中出現(xiàn)了3次，對(duì)這個(gè)克隆所對(duì)應(yīng)的蛋白序列進(jìn)行保守域分析，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)典型的含有basicdomain的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，因此我們選取這一蛋白進(jìn)行下一步的研究，在此將它命名為AtIBH1(OsILI1-binding bHLH protein 1)。
用OsIBH1的蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白序列的blastP比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中與OsIBH1相似度最高的蛋白對(duì)應(yīng)的編碼基因?yàn)锳t2g43060。因此將At2g43060命名為AtIBH1。AtIBH1的氨基酸序列如序列表中序列3所示，AtIBH1的編碼基因AtIBH1的編碼序列如序列表中序列4所示，其全序列如序列表中序列5所示，將AtIBH1的全長(zhǎng)編碼序列(序列表中序列4)從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出來(lái)后構(gòu)建到pAD-GAL4載體中構(gòu)建成pAD-AtIBH1，與pBD-PRE1共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布-Trp/-Leu SD平板，然后將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)入-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果表明含pBD-PRE1和pAD-AtIBH1的酵母菌落可以在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD平板上很好地生長(zhǎng)，而對(duì)照則不能生長(zhǎng)，這說(shuō)明PRE1和AtIBH1在酵母中確實(shí)存在著相互作用(圖6A)。
將AtIBH1的全長(zhǎng)編碼序列cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出來(lái)后構(gòu)建到35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的帶有myc標(biāo)簽的載體中，得到AtIBH1-myc載體。然后將AtIBH1-myc和PRE1-YFP以等量的比例在煙草中瞬時(shí)表達(dá)。在注射菌液后的煙草培養(yǎng)48小時(shí)后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的煙草葉片在熒光顯微鏡下觀察YFP熒光信號(hào)，并取少量組織分別用anti-GFP和anti-myc抗體做western雜交檢測(cè)組織內(nèi)融合蛋白的含量，anti-GFP和anti-myc雜交信號(hào)均一的用于下一步的免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)，單打了AtIBH1-myc的葉片作為負(fù)對(duì)照。結(jié)果表明在共沉淀之后，只有共轉(zhuǎn)化了AtIBH1-myc和PRE1-YFP的洗脫樣品用anti-myc雜交才有信號(hào)，而單轉(zhuǎn)了AtIBH1-myc的樣品在洗脫后則雜不出信號(hào)，這說(shuō)明AtIBH1-myc和PRE1-YFP在體內(nèi)也有著相互作用(圖6B)。
二、AtIBH1的功能鑒定 1、BR對(duì)AtIBH1基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 用24-epiBL終濃度為100nM的水溶液處理擬南芥野生型col及det2突變體幼苗2小時(shí)，未處理的擬南芥野生型col及det2突變體幼苗作為對(duì)照，提取RNA反轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析AtIBH1的表達(dá)情況，結(jié)果表明在BR合成缺陷突變體det2中，AtIBH1的表達(dá)量相對(duì)于在野生型中是上升的，而外源施加BR后，AtIBH1的表達(dá)量相比于對(duì)照下調(diào)，這說(shuō)明AtIBH1的表達(dá)是受BR抑制的(附圖7)。
2、AtIBH1基因表達(dá)模式的分析 分別取野生型擬南芥col的根，幼苗，蓮座葉，莖生葉，花序及角果部位提取RNA反轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析AtIBH1的表達(dá)情況，結(jié)果表明AtIBH1主要在根，蓮座葉，莖生葉等成熟組織表達(dá)，而在未開(kāi)放的花蕾等幼嫩部位表達(dá)量較低；PRE1則主要在幼嫩的部位表達(dá)，這表明AtIBH1與PRE1在擬南芥的這些器官共表達(dá)，既順序又重疊地調(diào)節(jié)著植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)(附圖8)。
3、轉(zhuǎn)錄因子BZR1對(duì)AtIBH1的調(diào)節(jié) BZR1是BR信號(hào)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合到BRs合成基因啟動(dòng)子上的CGTG(T/C)G保守序列，即BR反應(yīng)元件(BR responseelement，BRRE)，調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)AtIBH1啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，找到了若干BZR1可能的作用位點(diǎn)CGTG(T/C)G。為了確認(rèn)BZR1蛋白和PRE1、AtIBH1的啟動(dòng)子區(qū)域有著直接的相互作用，用pBZR1:BZR1-CFP的轉(zhuǎn)基因擬南芥來(lái)做染色質(zhì)免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation)。將pBZR1:BZR1-CFP的轉(zhuǎn)基因擬南芥在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法用anti-GFP抗體沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，ChIP DNA雜交到Affymetrix基因芯片上，結(jié)果用BZR1 ChIP-chip Genome Browser software進(jìn)行分析，結(jié)果表明AtIBH1在如圖9A所示的a區(qū)段有富集。再用根據(jù)AtIBH1啟動(dòng)子上BRs響應(yīng)元件富集區(qū)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明在免疫共沉淀后的pBZR1:BZR1-CFP樣品中，AtIBH1的啟動(dòng)子選定區(qū)域相對(duì)于在對(duì)照中有明顯的富集。這表明BZR1與AtIBH1啟動(dòng)子在體內(nèi)有直接相互作用(圖9B)。
實(shí)施例3、AtIBH1過(guò)表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的獲得 一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建 1、35S啟動(dòng)子片段的獲得 用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI對(duì)質(zhì)粒載體pBI221(Clontech)進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收長(zhǎng)度約為0.8kb的35S啟動(dòng)子片段。
2、用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質(zhì)粒載體pBI221(Clontech)上切下，連接到載體pUC19(TaKaRa公司)的相應(yīng)位點(diǎn)中，得到重組載體，命名為pUC19-Noster。再用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切pUC19-Noster，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與步驟1獲得的35S啟動(dòng)子片段相連，得到重組載體pUC19-35S-Noster。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切從步驟2構(gòu)建的重組載體切下包含35S和Noster的片段，將該片段克隆入質(zhì)粒載體pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)多克隆位點(diǎn)的EcoR I和HindIII位點(diǎn)處，得到重組載體，命名為pSN1301。
4、提取擬南芥野生型col的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備AtIBH1的編碼序列，PCR擴(kuò)增的引物如下 FCCGGGATCC

BamHI RGCGGGTACC

KpnI 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物具有序列表中序列5的自’端第54-600位所示的核苷酸，該擴(kuò)增產(chǎn)物包括了序列4所示的AtIBH1的編碼序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物連入pSN1301的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)，得到含有AtIBH1的重組表達(dá)載體，命名為AtIBH1-OX。重組表達(dá)載體經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)正確。
二、AtIBH1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的獲得 1、將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用于轉(zhuǎn)化擬南芥Col和BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體擬南芥bri1-5，獲得轉(zhuǎn)基因植物(AtIBH1-OX/Col和AtIBH1-OX/bri1-5)，具體步驟如下 1)在YEB平板上挑取含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單克隆，接種于10ml含抗生素(50mg/L卡納霉素)的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期。
2)按1∶50的比例轉(zhuǎn)接到50ml YEB培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右。
3)5,000rpm，離心15分鐘，收集菌體，重懸于滲透緩沖液(5％蔗糖，0.02％silwetL-77)，調(diào)OD600至0.6左右。
4)取正在開(kāi)花的擬南芥，剪去轉(zhuǎn)化前形成的果莢，然后將整個(gè)花序浸泡在步驟3)的菌懸液中15秒，使得農(nóng)桿菌很好的粘附在花序中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
5)農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥放于陰暗處保濕培養(yǎng)24小時(shí)，然后將擬南芥移到培養(yǎng)室中繼續(xù)正常培養(yǎng)，7-10天后再浸泡轉(zhuǎn)化一次。
6)收獲成熟的擬南芥種子，充分晾干后用10％次氯酸鈉消毒后，鋪在含有相應(yīng)抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上，篩選得到的抗性苗(T1代)移入土中繼續(xù)培養(yǎng)。
用pSN1301代替重組表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)空載體T1代植株，方法同上。
2、對(duì)轉(zhuǎn)AtIBH1-OX的轉(zhuǎn)基因擬南芥Col的1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)株系的T1代植株進(jìn)行進(jìn)一步的分析(用轉(zhuǎn)空載體T1代植株和非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col作為對(duì)照)。
將轉(zhuǎn)空載體T1代植株、非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col、以及1號(hào)株系、2號(hào)株系和3號(hào)株系植株在25℃條件下、培養(yǎng)三周時(shí)間，拍照的結(jié)果如圖10A所示，由于轉(zhuǎn)空載體T1代植株與擬南芥Col表型相同，圖10A中的對(duì)照僅顯示擬南芥Col。由圖10A可見(jiàn)，轉(zhuǎn)基因植株變小，緊湊，葉柄縮短，葉片變小變圓，葉色深綠，其中以3號(hào)的表型為最明顯。在成熟期，3號(hào)開(kāi)花明顯比其他株系及野生型要晚，它的主苔也非常矮小。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株中AtIBH1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的表型是與AtIBH1的表達(dá)量相對(duì)應(yīng)的，在表型最強(qiáng)的2號(hào)中，AtIBH1的表達(dá)量為最多。
3、對(duì)轉(zhuǎn)AtIBH1-OX的轉(zhuǎn)基因擬南芥bri1-5的1號(hào)株系的T1代植株進(jìn)行進(jìn)一步的分析(用轉(zhuǎn)空載體T1代植株和非轉(zhuǎn)基因擬南芥bri1-5作為對(duì)照)。
將將轉(zhuǎn)空載體T1代植株、非轉(zhuǎn)基因擬南芥bri1-5以及1號(hào)株系在25℃條件下、培養(yǎng)三周時(shí)間，拍照的結(jié)果如圖10B所示，因轉(zhuǎn)空載體T1代植株與擬南芥bri1-5表型相同，圖10B中的對(duì)照僅顯示擬南芥bri1-5。由圖10B可見(jiàn)，轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)于對(duì)照更小，緊湊，葉柄明顯縮短，葉片變小變圓，葉色深綠。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株中AtIBH1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的表型是與AtIBH1的表達(dá)量相對(duì)應(yīng)的。
4、ATIBH1過(guò)表達(dá)植株幼苗在光下下胚軸和根縮短 將AtIBH1-OX的轉(zhuǎn)基因擬南芥Col的3號(hào)株系、轉(zhuǎn)空載體T1代植株和非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col在1/2MS上4℃冰箱春化兩天，在相同的光照強(qiáng)度下(45umol m-2s-1)20小時(shí)光照，4小時(shí)黑暗22℃同時(shí)生長(zhǎng)六天后觀察表型和統(tǒng)計(jì)下胚軸和根的相對(duì)長(zhǎng)度。相對(duì)長(zhǎng)度測(cè)定方法是Col和AtIBH1-OX/Col分別測(cè)量45棵幼苗，取平均長(zhǎng)度后，以Col的平均長(zhǎng)度為1，ATIBH1-OX/Col與Col的長(zhǎng)度的比值為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖11所示，非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col與轉(zhuǎn)空載體T1代植株的表型一致，圖11中的對(duì)照只顯示非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col。由圖11可見(jiàn)，ATIBH1過(guò)表達(dá)植株幼苗與非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col相比，在光下培養(yǎng)后的下胚軸和根縮短。
5、ATIBH1過(guò)表達(dá)植株幼苗在暗中比野生型下胚軸和根縮短 將AtIBH1-OX的轉(zhuǎn)基因擬南芥Col的3號(hào)株系、轉(zhuǎn)空載體T1代植株和非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col在1/2MS培養(yǎng)基上、4℃冰箱春化處理兩天，光下22℃放置2小時(shí)，在完全黑暗中生長(zhǎng)6天后觀察表型、并且按照上述方法統(tǒng)計(jì)下胚軸和根的相對(duì)長(zhǎng)度。
結(jié)果如圖12所示，ATIBH1過(guò)表達(dá)植株幼苗與非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col相比，在暗中培養(yǎng)后下胚軸和根縮短。由于非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col與轉(zhuǎn)空載體T1代植株的表型一致，圖12中的對(duì)照僅顯示非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col。
實(shí)施例4、AtIBH1-RNAi擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的獲得 一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建 1、目標(biāo)片段的獲得 提取擬南芥野生型col的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的引物如下 FCGCGGTACC

KpnI Spe I RGCGGGATCC

BamH I Sac I 2、構(gòu)建重組表達(dá)載體 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(序列5的自5’端第66-359位所示的片段)酶切兩步法連入TCK309(先用Spe I和Sac I酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pTCK309連接，在此基礎(chǔ)上再用BamHI和KpnI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入反向片段)，得到含有AtIBH1的重組表達(dá)載體，命名為AtIBH1-RNAi。重組表達(dá)載體經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)正確。
其中，pTCK309的構(gòu)建方法如下 含有KpnI，XhoI，SalI，ClaI，SpeI，XbaI，SacI酶切位點(diǎn)的片段(序列表中序列6)插入pBluescript II SK+(Stratagene)載體的KpnI和SacI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成pTCK302； 然后用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物從水稻(中花10號(hào))基因組DNA中擴(kuò)增出478bp的水稻內(nèi)含子，連入pGEM-T(Promega)載體，構(gòu)成重組T載體； 用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’從作為模板的重組T載體中PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用Sal I和Cla I酶切并克隆到上述pTCK302載體中，構(gòu)成的載體命名為pTCK302-1。然后用KpnI和Sacl分別酶切pTCK302-1和實(shí)施例3中的pSN1301，回收pSN1301的大片段和pTCK302-1的小片段，將大片段和小片段連接，構(gòu)成pTCK309。
二、AtIBH1-RNAi擬南芥轉(zhuǎn)基因植株 1、將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體按照實(shí)施例3步驟二提供的方法導(dǎo)入擬南芥col，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥(AtIBH1-RNAi/Col)。
用pTCK309代替重組表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)空載體T1代植株，方法同上。
2、對(duì)轉(zhuǎn)AtIBH1-RNAi的轉(zhuǎn)基因擬南芥Col的8，1，5，9，4號(hào)株系的T1代植株進(jìn)行進(jìn)一步的分析 將轉(zhuǎn)空載體T1代植株、非轉(zhuǎn)基因擬南芥Col、以及8，1，5，9，4號(hào)株系植株在22℃條件下、培養(yǎng)30天時(shí)間，拍照的結(jié)果如圖13所示，因轉(zhuǎn)空載體T0代植株與擬南芥Col表型相同，圖中的對(duì)照僅為擬南芥Col。由圖13A可見(jiàn)，轉(zhuǎn)基因植株整個(gè)植株變大，其中以1號(hào)的表型為最明顯。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株中AtIBH1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的表型是與AtIBH1的表達(dá)量相對(duì)應(yīng)的(圖13B)，在表型最強(qiáng)的1號(hào)中，AtIBH1的表達(dá)量為最少。
序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院植物研究所
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
華盛頓卡內(nèi)基研究院
<120>一種控制植物生長(zhǎng)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
<160>6
<210>1
<211>104
<212>PRT
<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)
<400>1
Met Ser Ser Ser Arg Arg Ser Arg Ser Arg Arg Ala Gly Ser Ser Val
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Glu Asp Gln Ile
20 25 30
Ala Glu Leu Leu Ser Lys Leu Gln Ala Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ala
35 40 45
Arg Asn Gly Ala His Arg Gly Ser Ala Ala Arg Val Leu Gln Glu Thr
50 55 60
Cys Ser Tyr Ile Arg Ser Leu His Gln Glu Val Asp Ash Leu Ser Glu
65 70 75 80
Thr Leu Ala Gln Leu Leu Ala Ser Pro Asp Val Thr Ser Asp Gln Ala
85 90 95
Ala Val Ile Arg Ser Leu Leu Met
100
<210>2
<211>315
<212>DNA
<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)
<400>2
atgtcgagca gccggaggtc gcgctcacgg cgagccggga gctcggtgcc gtcgtcgtcg 60
tcgtcgtcga ggacgtcgat ctcggaggac cagatcgccg agcttctctc caagcttcag120
gccctgctcc cggagtctca ggctcgcaat ggcgcccata ggggctcggc ggcgagggtt180
ttgcaggaga cgtgcagcta catcaggagc ctgcaccagg aggtggacaa cctcagcgag240
acgctcgctc agctgctcgc ctcccccgac gtcaccagcg accaggcggc cgtcatcagg300
agcctcctca tgtga 315
<210>3
<211>156
<212PRT
<213>擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>3
Met Ala Ser Ala Asp Lys Leu Ile Asn Thr Asp Val Pro Glu Lys Asp
1 5 10 15
Val Phe Ala Phe His Phe Leu Gln Ser Leu Ser Asn Leu Arg Lys Gln
20 25 30
Asn Pro Phe Asp Thr Pro Asp Gln Lys Asn Tyr Arg Val Arg Lys Ile
35 40 45
Lys Lys Ala Ala Tyr Val Ser Met Ala Arg Ala Ala Gly Gly Ser Ser
50 55 60
Arg Leu Trp Ser Arg Ala Leu Leu Arg Arg Ala Asp Lys Asp Asp Asn
65 70 75 80
Lys Ile Val Arg Phe Ser Arg Arg Lys Trp Lys Ile Ser Ser Lys Arg
85 90 95
Arg Arg Ser Asn Gln Arg Ala Pro Val Val Glu Glu Ala Ala Glu Arg
100 105 110
Leu Arg Asn Leu Val Pro Gly Gly Gly Gly Met Glu Thr Ser Lys Leu
115 120 125
Met Glu Glu Thr Ala His Tyr Ile Lys Cys Leu Ser Met Gln Val Lys
130 135 140
Val Met Gln Cys Leu Val Asp Gly Leu Ser Pro Lys
145 150 155
<210>4
<211>471
<212>DNA
<213>擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>4
atggcctctg cagacaaact cataaacaca gatgtccctg aaaaggacgt ttttgccttc 60
cacttcctcc aatccctctc aaatctcaga aaacaaaacc cttttgatac tccggaccaa120
aaaaactacc gcgtgaggaa gatcaagaag gctgcgtacg tttccatggc cagagcagcc180
ggagggagta gccggctatg gagcagagcc ctcttgcgta gagcagacaa agatgacaac240
aagatcgtaa gattttcaag gaggaagtgg aagatatcat caaaacggag gaggagtaac300
cagagagctc cggtggtgga ggaggcggcg gagaggctga ggaatcttgt tccgggaggc360
ggaggaatgg agacgtcaaa gctgatggaa gagacggctc attacatcaa gtgccttagt420
atgcaggtca aggtcatgca gtgtctcgtt gatggcttat ctcccaaatg a 471
<210>5
<211>898
<212>DNA
<213>擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>5
aaaaaaaaaa aagttttata aaggttctca actcaagttc tcttctctaa aaaacccaaa 60
caatggcctc tgcagacaaa ctcataaaca cagatgtccc tgaaaaggac gtttttgcct120
tccacttcct ccaatccctc tcaaatctca gaaaacaaaa cccttttgat actccggacc180
aaaaaaacta ccgcgtgagg aagatcaaga aggctgcgta cgtttccatg gccagagcag240
ccggagggag tagccggcta tggagcagag ccctcttgcg tagagcagac aaagatgaca300
acaagatcgt aagattttca aggaggaagt ggaagatatc atcaaaacgg aggaggagta360
accagagagc tccggtggtg gaggaggcgg cggagaggct gaggaatctt gttccgggag420
gcggaggaat ggagacgtca aagctgatgg aagagacggc tcattacatc aagtgcctta480
gtatgcaggt caaggtcatg cagtgtctcg ttgatggctt atctcccaaa tgatcatcaa540
ttaatcatca acatcatcat caatgatcga tgtatataga gatacgacac atacatagtc600
tattggattg gggtaatcat aacgaatata tatgtgtata tatatatata tatatatata660
tatattctta tatatataca tacgtgtaag ataggataca tatatgaaat gtgtggatat720
gtattagtct cgaagtaacg aaagattttt ttctttttct tttcttgaat tttgataaaa780
ggggatttat tatttatcat atgctatggc cggtttaaac attagggctt ggtaacttgc840
ccttgtcata tgataaaagg ggatttatta cttatcatat gctaagagaa ttttcttt 898
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ggtaccctcg aggtcgacat cgatactagt tctagagagc tc4權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列表中序列3的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物發(fā)育相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)；所述植物發(fā)育體現(xiàn)在成株株高和/或葉柄長(zhǎng)度和/或下胚軸長(zhǎng)度和/或特定器官的大小等性狀上。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)或4)或5)的DNA分子
1)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
2)序列表中序列5的自’端第54-600位所示的DNA分子；
3)序列表中序列5所示的DNA分子；
4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；
5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入質(zhì)粒pSN1301的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體；
所述質(zhì)粒pSN1301是將質(zhì)粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)間插入35S-Noster序列得到的；
所述35S-Noster序列是用限制性內(nèi)切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切質(zhì)粒pUC19-35S-Noster得到的；
所述質(zhì)粒pUC19-35S-Noster是將質(zhì)粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)間插入35S啟動(dòng)子片段得到的；
所述35S啟動(dòng)子片段是用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切質(zhì)粒pBI221得到的；
所述質(zhì)粒pUC19-Noster是將質(zhì)粒pUC19的Sac I和EcoR I酶切位點(diǎn)間插入Nosterpoly A終止序列得到的；所述Noster poly A終止序列是用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pBI221得到的。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是如下1)或2)的方法
1)將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物為與所述目的植物相比株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小的轉(zhuǎn)基因植物；
2)在目的植物中將權(quán)利要求2或3所述基因進(jìn)行抑制表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的株型大小大于所述目的植物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法1)中，權(quán)利要求2或3所述基因通過(guò)權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法2)中，抑制表達(dá)是將AtIBH1-RNAi導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的；
所述AtIBH1-RNAi是將序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段正向插入pTCK309的Spe I和Sac I酶切位點(diǎn)間構(gòu)成pTCK309-1，將序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段反向插入pTCK309-1的BamH I和Kpn I酶切位點(diǎn)，構(gòu)成AtIBH1-RNAi；
所述pTCK309的構(gòu)建方法如下將序列表中序列6所示的片段插入pBluescriptII SK+的KpnI和SacI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成pTCK302；用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物從水稻(中花10號(hào))基因組DNA中擴(kuò)增出478bp的水稻內(nèi)含子，連入pGEM-T載體，構(gòu)成重組T載體；以所述重組T載體為模板，用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Sal I和Cla I酶切并克隆到所述pTCK302載體中，構(gòu)成的載體命名為pTCK302-1；用KpnI和Sacl酶切pTCK302-1得到小片段插入所述pSN1301的KpnI和Sacl酶切位點(diǎn)間，構(gòu)成pTCK309。
9.如權(quán)利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥；所述擬南芥為Columbia擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與植物株型相關(guān)的蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物發(fā)育相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)；所述植物發(fā)育體現(xiàn)在成株株高和/或葉柄長(zhǎng)度和/或下胚軸長(zhǎng)度和/或特定器官的大小性狀上。將上述蛋白的編碼基因過(guò)表達(dá)，可以得到株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小的轉(zhuǎn)基因植物；將上述蛋白的編碼基因進(jìn)行抑制表達(dá)，可是植株變大。因此AtIBH1可以作為一種潛在的分子育種工具，改良植物株型，提高植物產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101824078SQ20091024186
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者王志勇, 種康, 路鐵剛, 白明義, 張麗穎, 朱佳瑛, 王昊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 華盛頓卡內(nèi)基研究院