專利名稱：一種l-丙氨酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-丙氨酸的生產(chǎn)方法，具體涉及一種L-丙氨酸的微生物發(fā)酵生 產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
L-丙氨酸在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)有著十分廣泛的用途。L-丙氨酸在醫(yī)藥
上用途是Vb6的重要原料，是營養(yǎng)增補(bǔ)劑(補(bǔ)糖氨基酸營養(yǎng)輸液)的組成部分。
由L-丙氨酸組成的復(fù)合氨基酸注射液一14氨基酸注射液一800是主治肝腦病新
藥，可治療肝功能不全時(shí)氨基酸代謝紊亂，促使肝昏迷病人蘇醒，同時(shí)L-丙氨
酸還是一種很好的利尿藥。例如生產(chǎn)L-氨基丙醇、VB6、 S-2-氯乙酸、安尿通等。 L-丙氨酸一般是利用假單胞菌作為生物催化劑采用固定化或細(xì)胞懸液酶解
L-天門冬氨酸生產(chǎn)，收率大于90%。
國內(nèi)現(xiàn)有寧波科瑞生物工程公司、北京怡康盛達(dá)生物技術(shù)有限公司、安徽省 科苑(集團(tuán))股份有限公司等多家公司均生產(chǎn)L-丙氨酸產(chǎn)品，產(chǎn)品有食品級(jí)和
工業(yè)級(jí)，生產(chǎn)的方法大都是利用假單胞菌產(chǎn)生的L-天冬氨酸-e-脫羧酶，將L-
天冬氨酸轉(zhuǎn)化成L-丙氨酸。南京工業(yè)大學(xué)(南京化工大學(xué))開展L-丙氨酸酶法
合成的研究較早，利用假單胞菌獲得高活性的L-天冬氨酸-e-脫羧酶，以L-天
冬氨酸為底物，采用游離細(xì)胞法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸，平均收率為90%，產(chǎn)品質(zhì)量 達(dá)到美國藥典XXin版標(biāo)準(zhǔn)和日本味之素99版標(biāo)準(zhǔn)；并擁有酶法生產(chǎn)L-丙氨酸的 發(fā)明專利，該技術(shù)可生產(chǎn)得到光學(xué)純度的L-丙氨酸；同時(shí)成立了國家生化工程 技術(shù)中心，中心擁有年產(chǎn)1000噸L-丙氨酸的生產(chǎn)技術(shù)。大連輕工業(yè)學(xué)院對(duì)中空 纖維膜反應(yīng)器，利用假單胞菌轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氦酸，轉(zhuǎn)化率超過90%。 中國藥科大學(xué)也對(duì)L-丙氨酸酶法生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行了研究，采用循環(huán)式生物反應(yīng)器， 利用固定化德阿昆合假單胞菌體的L-天冬氨酸-e -脫羧酶，轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生 成L-丙氨酸。丙氨酸是細(xì)胞蛋白質(zhì)必不可少的組成成分，多數(shù)微生物使用葡萄糖丙酮酸轉(zhuǎn) 移酶來合成丙氨酸(Hashimoto and Kats咖ata, 1998)， 一些生物體如節(jié)桿菌
(Hashimoto and Katsumata, 1993， 1998; 1999)、球形芽孢桿菌(Ohashimaand Soda ，1979)、梭狀芽孢桿菌(Orlygs謹(jǐn)y等，1995)使用NADH-脫氫酶從丙酮 酸和氨基酸來生產(chǎn)丙氨酸。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因編碼NADH-脫氫酶作為實(shí)驗(yàn)手段用于促進(jìn)合成得到不同程度 的成功?；蚬こ叹臧l(fā)酵單胞菌mobolis CP4在5。/。葡萄糖厭氧發(fā)酵表達(dá)了低 水平生產(chǎn)消旋丙氨酸的能力(Uhlenbusch等，1991)。 一株ldh-標(biāo)記的含有丙 氨酸消旋酶突變基因工程乳酸菌在相似方法下發(fā)酵1. 8%葡萄糖產(chǎn)生12. 6g/l L-丙氨酸(Hols等，1999)。 一株雙突變大腸桿菌發(fā)酵通過好氧和厭氧2個(gè)階段 24小時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生32g/l丙氨酸濃度(Lee等，2004)。隨著進(jìn)一步的篩帥選和過 程優(yōu)化，消旋丙氨酸濃度在更加復(fù)雜的反應(yīng)體系達(dá)到88g/1，接近了理論最大值
(Smith等，2006)。但是，這種菌株志產(chǎn)生一種消旋丙氨酸，利用多類型質(zhì)粒 需要抗生素的選育，并且需要復(fù)雜的介質(zhì)復(fù)雜的多階段發(fā)酵過程(Smith等， 2006)。
己有的文獻(xiàn)及專利有如下報(bào)道
1、 L-丙氨酸酶法工業(yè)生產(chǎn)的研究
在800升氣升式發(fā)酵罐上配有假單胞菌Pse. NX-1 ，獲得高L-天冬氨酸-e -脫羧酶酶活。以L-天冬氨酸為底物游離細(xì)胞法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸，每升培養(yǎng)液 可轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸2kg，最高達(dá)2. 5kg,提取得到L-丙氨酸1. 2kg，平均收率90%， 產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到美國藥典XXIII版標(biāo)準(zhǔn)和日本味之素99版標(biāo)準(zhǔn)。(《工業(yè)微生物》 1997， 27 (2) ， 17-20頁);
2、 利用假單胞菌天冬氨酸-e-脫羧酶高效生產(chǎn)L-丙氨酸
通過右邊篩選得到一株具有高活性L-A印-e -脫羧酶的菌株
PseudomonasNX-l，對(duì)該株酶形成和酶反應(yīng)的條件進(jìn)行了詳細(xì)的研究，該株可以 高效地轉(zhuǎn)化L-Asp生成L-Ala，轉(zhuǎn)化4-5d，每L培養(yǎng)液可轉(zhuǎn)化L-Asp量高達(dá)1400g 左右，生成L-Ala濃度高達(dá)90。/。以上，摩爾轉(zhuǎn)化率近100%。(《南京化工學(xué)院學(xué) 報(bào)》1995， 17 (1) ， 1-6頁)；
3、 游離細(xì)胞法與固定化細(xì)胞法生產(chǎn)L-丙氨酸的比較利用假單胞菌的l-天冬氨酸-e -脫羧酶從L-天冬氨酸為底物生產(chǎn)L-丙氨酸， 具有2種方法， 一種為游離細(xì)胞法，另一種為固定化細(xì)胞法。該文比較這2種方
法的生產(chǎn)工藝、轉(zhuǎn)化率、提取收率和生產(chǎn)成本后得出結(jié)論采用游離細(xì)胞法生產(chǎn)
L-丙氨酸優(yōu)于固定化細(xì)胞法。(《工業(yè)微生物》1998， 28 (1) ， 38-39， 44頁)；
4、 D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法(《中國專利》申請(qǐng)(專利)號(hào)02138553. X; 公開(公告)號(hào)CN1405317;公開(公告)日2003.03.26)
該制備方法是培養(yǎng)假單胞菌屬微生物，產(chǎn)生高活力的L-天冬氨酸e-脫羧 酶，采用游離細(xì)胞法，將含酶細(xì)胞或培養(yǎng)液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸鹽的 溶液混合，32°C-45'C下進(jìn)行酶反應(yīng)，然后用等電點(diǎn)結(jié)晶結(jié)合離子交換樹脂法分 離反應(yīng)生成物，得到高化學(xué)純度和光學(xué)純度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
5、 中空纖維膜反應(yīng)器轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸 采用中空纖維膜反應(yīng)器，利用假單胞菌P. dacimhaeDQ-pl轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生
成L-丙氨酸，最適Ph6.0，最適溫度3(TC， EDTA和Tween-80對(duì)細(xì)胞產(chǎn)酶有促進(jìn) 作用，游離細(xì)胞半衰期為93h。采用對(duì)流擴(kuò)散式中空纖維膜反應(yīng)器轉(zhuǎn)化L-天冬氨 酸生成L-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率超過90%。(《食品與發(fā)酵工業(yè)》2003, 29 (1) ， 32-35 頁)；
6、 用循環(huán)式生物反應(yīng)器酶法生產(chǎn)L-丙氨酸 用固定化德阿昆合假單胞(Pseudomonas dacunhae)菌體的L-天冬氨酸e-
脫羧酶，在新設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。該反應(yīng)器能 不斷緩慢溶解固體L-天冬氨酸，使反應(yīng)系統(tǒng)的pH和底物濃度維持恒定。用80g 固定化菌體為酶源，在69h內(nèi)能將4. 2kgL-天冬氮酸全部轉(zhuǎn)化生成L-丙氨酸，且 僅消耗較少的PLP和氨水。(《藥物生物技術(shù)》1997， 4 (4) ， 212-215頁)。
7、 丙氨酸發(fā)酵法有效生產(chǎn)的原料與方法
UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH F0UNDTI0N ， INC的Xueli Zhang， Jantama Kae麗ich, Moore Jonathan等人在《丙氨酸有效生產(chǎn)的原料與方法》(國際申請(qǐng) 號(hào)PCT/US2008/058410)中利用獲得的基因工程菌株進(jìn)行常規(guī)發(fā)酵糖生產(chǎn)L-丙 氨酸。戊糖例如木糖、己糖例如葡萄糖可以用于有效地發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸。這 里描述的菌株具有代謝各種木質(zhì)纖維生物質(zhì)能和各種不同糖分的能力，包括乳 糖、麥芽糖和蔗糖。利用大腸桿菌采用一種新穎的生物催化劑，在D-乳酸(周等，2006)產(chǎn)生菌大腸桿菌(菌株SZ194)衍生的基礎(chǔ)上，在沒有質(zhì)粒、抗生素 和其他復(fù)雜營養(yǎng)成份的條件下，通過一批簡單的發(fā)酵產(chǎn)生純的手性L-丙氨酸。 菌株SZ194自身染色體ldhA基因從熱源被簡單的完整染色體拷貝的脫氫酶基因 取代，經(jīng)過另外的篩選和代謝處理，菌株利用金屬鹽培養(yǎng)基通過簡單的發(fā)酵能夠 產(chǎn)出較高產(chǎn)質(zhì)量和高濃度的L-丙氨酸。
由上可知，現(xiàn)有的酶法生產(chǎn)L-丙氨酸的研究及生產(chǎn)報(bào)道， 一般是利用假單 胞菌產(chǎn)生L-天冬氨酸-e-脫羧酶，轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，此法生產(chǎn)的 產(chǎn)品光學(xué)純度較低， 一般《95%，且生產(chǎn)環(huán)節(jié)多，成本高。
現(xiàn)有的發(fā)酵研究，其菌株只產(chǎn)生一種消旋丙氨酸(旋光度為0)，利用多類 型質(zhì)粒需要抗生素的選育，并且需要復(fù)雜的介質(zhì)復(fù)雜的多階段發(fā)酵過程，不適于 大規(guī)模的國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)。
現(xiàn)有酶法生產(chǎn)技術(shù)，固定化技術(shù)還不成熟，游離酶法一般釆用L-天門冬氨 酸為原料，生產(chǎn)成本很高，現(xiàn)有的生產(chǎn)廠家很多處于停產(chǎn)狀態(tài)，存活的也在處于 微利或虧損狀態(tài)，如果能夠利用單糖如葡萄糖為原料進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，將是丙氨 酸行業(yè)發(fā)展的唯一出路。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種L-丙氨酸的 微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，即用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸，采用該方法生產(chǎn) 的L-丙氨酸，其光學(xué)純度及收率高、生產(chǎn)環(huán)節(jié)簡化，成本低。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的所采取的技術(shù)方案包括搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵。本發(fā)明利 用大腸桿菌以葡萄糖培養(yǎng)基，直接生成L-丙氨酸。
種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(質(zhì)量百分比，以下同)葡萄糖12 20%，蛋白胨 0. 4 0. 6%，硫酸鎂(MgS04 *7H20) 0. 02 0. 03%,磷酸氫二鉀(K2HP04) 0. 01 0. 02%, 余量為水，用氨水調(diào)pH值至6.0 8.0;培養(yǎng)溫度30士rC;
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10 20%，玉米槳3 4%，硫酸鎂0. 02 0. 03%，磷酸 氫二鉀0(2朋04) 0.01 0.02%,氯化鈉0.2~0.3%，余量為水，用氨水調(diào)pH值至 6. 0 8. 0;發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30土2。C，通風(fēng)比l: 3,罐壓0.06MPa。 技術(shù)參數(shù)
① 種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件葡萄糖12 20%，蛋白胨0.4 0.6%，硫酸鎂 (MgS04*7H20) 0 . 02 0.03。/。，磷酸氫二鉀(K2HP0J 0.01 0.02%,余量為水，用氨 水調(diào)pH值至6.0 8.0;培養(yǎng)溫度30土rC;用氨水調(diào)pH值至7.0。在1000ml 三角瓶中分裝200ML培養(yǎng)基，接種后用搖床在30±1°C條件下培養(yǎng)18小時(shí)。
② 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10 20%，玉米漿3 4%，硫酸鎂0. 02 0. 03%, 磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.01 0.02%，氯化鈉0.2~0.3%，余量為水，用氨水調(diào)pH 值至7.0。
③發(fā)酵培養(yǎng)條件定容后，121"C滅菌15分鐘，冷卻后將培養(yǎng)好的種子液按 1%接種量接種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30±2°0，通風(fēng)比l: 3，罐壓0.06MPa，培養(yǎng)過程 測(cè)定菌體生長OD值、pH值和酶活力。
離心條件
離心溫度30。C，離心pH值7.5。
⑤ 提取條件
脫色溫度85"C。
⑥ 干燥條件
干燥溫度90"C，干燥時(shí)間15分鐘。
本發(fā)明的有益效果L-丙氨酸是一種具有光學(xué)活性的氦基酸，主要用于生產(chǎn) L-氨基丙醇、(S) _2-二氯乙酸。本發(fā)明以葡萄糖為發(fā)酵底物，通過菌體自身代 謝直接發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，L-丙氨酸收率高，光學(xué)純度》99.99%，滿足工業(yè)化 生產(chǎn)的需求，生產(chǎn)成本在8000元以下。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明先進(jìn)行無菌培養(yǎng)得到一級(jí)種子，再到發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后離心、 脫色、過濾、濃縮、結(jié)晶、離心、干燥，產(chǎn)品化驗(yàn)合格后入庫。實(shí)施例1
配種子液1000ml，種子液配比(質(zhì)量百分比，以下同)葡萄糖15%，蛋 白胨0. 4%，硫酸鎂(MgS04 7H20) 0. 02%,磷酸氫二鉀(K2HP04) 0. 01%,余量為水， 用氨水調(diào)pH值至7. 0。分裝在5只1000ml三角瓶滅菌后，30"C接種斜面，搖床 培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min，接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為葡萄糖15%， 玉米漿3%，硫酸鎂0. 02%，磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.01%,氯化鈉0.2%，余量為水， 用氨水調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30土2。C，通風(fēng)比l: 3，罐壓 0.06MPa，培養(yǎng)28h。 0D值凈增長到0.6， pH達(dá)到7.5后離心，離心溫度30°C， 85"C脫色，90。C干燥。得到產(chǎn)品8.9kg,產(chǎn)品純度》99.5。/。.
實(shí)施例2
配種子液1000ml，種子液配比(質(zhì)量百分比，以下同)葡萄糖20%，蛋 白胨0. 6%，硫酸鎂(MgS04 7H20) 0. 03%，磷酸氫二鉀(K異)0. 02%，余量為水， 用氨水調(diào)PH值至7. 0。分裝在5只1000ml三角瓶滅菌后，30°C接種斜面，搖床 培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為105r/min，接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為葡萄糖20%, 玉米漿4%，硫酸鎂0. 03%,磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.02%，氯化鈉0.3%，余量為水， 用氨水調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30土2。C,通風(fēng)比l: 3，罐壓 0.06MPa，培養(yǎng)28h。 OD值凈增長到O. 6， pH達(dá)到7. 5后離心，離心溫度30"C， 85t脫色，90。C干燥。得到產(chǎn)品9.2kg,產(chǎn)品純度》99.5呢.
實(shí)施例3
配種子液800ml，種子液配比(質(zhì)量百分比，以下同)葡萄糖18%，蛋白 胨0.5%，硫酸鎂(MgS04 7H20) 0.03%,磷酸氫二鉀0(2^04) 0. 03%，余量為水，用 氨水調(diào)pH值至7.0。分裝在4只1000ml三角瓶滅菌后，30t接種斜面，搖床培 養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min,接種100L發(fā)酵液，發(fā)酵液配比為葡萄糖18%,玉 米漿4%，硫酸鎂0. 02%,磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.02%,氯化鈉0.3%,余量為水， 用氨水調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30士2。C，通風(fēng)比l: 3,罐壓0.06MPa，培養(yǎng)28h。 0D值凈增長到0.6， pH達(dá)到7.5后離心，離心溫度30°C， 85"C脫色，90°C干燥。得到產(chǎn)品9. lkg，產(chǎn)品純度》99. 5%.
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
(1) 利用一種微生物直接發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)L-丙氨酸。
(2) 工藝過程簡單，控制條件粗放。
(3) 產(chǎn)品總生產(chǎn)成本降低40%。 本發(fā)明與國內(nèi)外同類技術(shù)主要區(qū)別在于
(1) 本技術(shù)只需要培養(yǎng)一種微生物直接發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)L-丙氨酸。而國內(nèi)外 同類技術(shù)大多利用L-天門冬氨酸作為原料。
(2) 現(xiàn)有的發(fā)酵法研究工藝首先得到的是無旋光性丙氨酸，然后需要進(jìn)一步消 旋處理才能得到L-丙氨酸。
(3) 本技術(shù)發(fā)酵水平能夠達(dá)到90-92g/l,比其他發(fā)酵水平明顯提高。
(4) 其它本技術(shù)工藝大大降低了生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
1、一種L-丙氨酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括利用大腸桿菌直接發(fā)酵葡萄糖培養(yǎng)基，其特征在于a、種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(質(zhì)量百分比)葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～0.6％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.02～0.03％，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.01～0.02％，余量為水，用氨水調(diào)pH值至6.0～8.0；培養(yǎng)溫度30±1℃；b、發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10～20％，玉米漿3～4％，硫酸鎂0.02～0.03％，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.01～0.02％，氯化鈉0.2～0.3％，余量為水，用氨水調(diào)pH值至6.0～8.0；發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30±2℃，通風(fēng)比1∶3，罐壓0.06MPa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L-丙氨酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，利用大腸桿菌直接發(fā)酵葡萄糖培養(yǎng)基生成L-丙氨酸。種子培養(yǎng)基葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～0.6％，硫酸鎂0.02～0.03％，磷酸氫二鉀0.01～0.02％，余量為水，用氨水調(diào)pH值至6.0～8.0；培養(yǎng)溫度30±1℃；發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10～20％，玉米漿3～4％，硫酸鎂0.02～0.03％，磷酸氫二鉀0.01～0.02％，氯化鈉0.2～0.3％，余量為水，用氨水調(diào)pH值至6.0～8.0；發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30±2℃，通風(fēng)比1∶3，罐壓0.06MPa。本發(fā)明工藝過程簡單，控制條件粗放。發(fā)酵水平達(dá)到90-92g/l，大大降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101665813SQ20091014492
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月14日
發(fā)明者劉迎偉, 張曉斌 申請(qǐng)人:安徽華恒生物工程有限公司