專利名稱：：針對TRAP-1樣蛋白基因的siRNA序列及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物技術，涉及基因工程
技術領域：
和生物信息學領域，具體地涉及針對TRAP-l樣蛋白(TLP)基因的siRNA靶序列的設計、合成及其在體外抑制肝臟腫瘤細胞生長、抑制肝纖維化形成的應用。
背景技術：
：RNA干擾(RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，被《SCIENCE》雜志和美國科學促進會評為2002年十大科學成就之一。RNA干擾是指同源雙鏈RNA的導入引起目標基因的不表達或減效表達，在哺乳動物細胞中，21—23個核苷酸長度的雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，可有效降解同源RNA，從而阻斷蛋白質的表達，這些特定長度的dsRNA被稱為siRNA(smallinterfering函As)。RNA干擾被稱為RNA基礎上的細胞"免疫"系統(tǒng)。經(jīng)證實RNA干擾技術具有以下特點(1)特異性高一個堿基的不同就可導致作用的顯著降低；(2)高效少量siRNA分子就能較徹底抑制細胞內相應基因的表達；(3)穩(wěn)定由于RNA干擾采用的是雙鏈RNA，它比較穩(wěn)定，不易被降解，因此RNA千擾不僅在體外，而且在動物體內亦具有較好的效果；(4)篩選周期短針對某一基因的有效siRNA序列篩選的方法較簡單，因此研發(fā)周期較短。RNAi在HIV的體外實驗中取得了較理想的結果。Rossi等將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉染293細胞，rev基因的表達被顯著抑制；同時將siRNA的抑制效應與反義RNA和核酶等進行了比較，發(fā)現(xiàn)只有siRNA組抑制了HIVrev-EGFP的表達，其抑制率達到90%,遠優(yōu)于反義RNA和核酶組，這一結果同樣被Novina等學者所證實。Novina等用針對CD4的dsRNA能將細胞表面HIV病毒的受體表達減少75%，從而抵抗HIV病毒的感染。因此，針對病毒基因的siRNA是慢性病毒性感染的最佳治療策略，具有廣闊的應用前景。目前我國有1.7億HBV感染者，其中慢性乙肝患者1,700萬人，每年有50萬人死于HBV引起的肝硬化和肝癌。因此，目前以及今后相當長的一段時間內，針對慢性乙型肝炎——肝纖維化、肝硬化治療的研究，仍具有十分重要的現(xiàn)實意義。體內外研究均證實轉化生長因子Pl(TGF-(31)是促進肝纖維化形成最強的剌激因子之一，是治療肝纖維化的理想靶點。但是由于TGF-(31體內普遍存在，具有廣泛的生物學作用，在細胞生理反應中起核心作用，包括細胞增生、粘附、凋亡、分化和特異性的發(fā)展，以及免疫調節(jié)等功能，把TGF-pi基因敲除將引起機體內所有與TGF-pi相關的一系列基礎功能的缺失或紊亂。更可行的方法是研究TGF-pi信號下傳中涉及的效應蛋白和調節(jié)蛋白，將他們按照TGF-pl不同的功能進行分類，最終找到阻斷TGF-pi某種單一功能的耙點。Smads通路是TGF-pl信號傳導中最重要的通路。其中，Smad2/Smad3是TGF-pl信號下傳的重要傳導分子。Smad3是介導TGF-(31誘導肝纖維化功能的關鍵分子，TGF-(31激活的HSC主要表達Smad3，缺失了Smad3的HSC雖然經(jīng)TGF-pl激活也不能分泌I型膠原，缺失了Smad3的小鼠可以抵抗放射、博來霉素和四氯化碳等各種原因引起的肝纖維化形成。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種針對TRAP-l樣蛋白(TLP)基因的siRNA序列，該針對TLP基因的siRNA，可抑制膠原的表達，可用于制備治療肝纖維化的藥物。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種針對TRAP-l樣蛋白基因的siRNA序列，其目標RNA耙序列的核苷酸序列為以下任意一種TLP-15，GCAACAAUUCAUCACAUCdtdt3，和TLP-25'CCAUGUGGUUUCCCAGUUUdtdt3'。dt是脫氧胸腺核苷酸，RNA干擾片段后加兩個核苷酸有利于增加干擾效果，一般加dtd域UU。本發(fā)明還提供了上述針對TRAP-l樣蛋白基因的siRNA序列在制備抑制肝臟腫瘤生長和/或抑制肝纖維化藥物中的應用。由于TLP是Smad3相關蛋白，受到特異的siRNAs的攻擊可特異性地降解，所以本發(fā)明利用RNA干擾技術特異性降解TLPm脂A達到抗纖維化的作用。本發(fā)明根據(jù)siRNA的設計原理，提供了針對TLP基因的siRNA的序列；根據(jù)TLPmRNA序列，化學合成法合成siRNA，轉染肌成纖維細胞Lx2細胞株后，可有效抑制膠原I的表達。因此，針對TLP基因的siRNA，可抑制膠原的表達，可在制備治療肝纖維化的藥物中應用。4下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是本發(fā)明的RNA干擾前后細胞形態(tài)的變化圖l中A代表陰性對照組干擾前的細胞形態(tài)，B代表陰性對照組干擾后的細胞形態(tài)，C代表TLP-1干擾前的細胞形態(tài)，D代表TLP-1干擾后的細胞形態(tài)，E代表TLP-2干擾前的細胞形態(tài)，F(xiàn)代表TLP-2干擾后的細胞形態(tài)；圖2是WesternBlot結果顯示本發(fā)明的RNA干擾后Lx-2細胞合成膠原的變化圖圖2中A代表膠原I(Col1)，B代表P肌動蛋白(eactin)，l和2是Lx2細胞空白對照；3:TLP—lRNAi預處理；4:TLP—2RNAi預處理；5:Smad3—lRNAi預處理；6:Smad3—2RNAi預處理；圖3是細胞芯片觀察Lx2細胞用TLP進行脂Ai后生長情況結果圖；圖4是細胞芯片觀察H印G2細胞用TLP進行RNAi后生長情況結果圖。具體實施例方式實施例1、合成干擾RNA體外抑制TLP基因的表達1、siRNA的設計根據(jù)siRNA的設計原理，從轉錄本AUG起始密碼子開始，搜尋TLP基因中的AA序列，記錄跟每個AA3'端相鄰的19nt作為候選的siRNA靶位點，選擇GC含量在40-55%的siRNA序列，通過Genebank的數(shù)據(jù)庫的Blast分析，將潛在的序列和相應的人基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列，設計針對TLP基因的2條siRNA的目標cDNA靶序列。序列如下TLP-15,GCAACAAUUCAUCACAUCdtdt3，(SEQIDNO:1)TLP-25'CCAUGUGGUUUCCCAGUUUdtdt3'(SEQIDNO:2)每條鏈的5'端為磷酸鹽，3'端羥基化，有兩個堿基外懸，通過常規(guī)方法化學合成而得。形成雙鏈siRNA的退火處理正義鏈和反義鏈各20^M，加入退火緩沖液(100uMKAc，30mMHEPES-K0H，pH7.4，2mMMgAc2),90。C水浴lmin,37。C水浴lh。實施例2、大鼠肝纖維化模型研究1)SD大鼠28只，購自浙江省醫(yī)學科學院，均為雄性，隨機分成四組，每組7只，處理第5周開始每周處死一組，因此A組、B組、C組、D組依次為造模后5周、6周、7周和8周。2)肝纖維化模型制備每只大鼠均用CCL4:橄欖油(4:6)0.3ml/100g體重皮下注射，2次/周，連續(xù)注射至實驗結束；3)病理學檢測SD大鼠處死后，取肝臟，浸于福爾馬林中，常規(guī)石蠟切片，以HE染色觀察肝臟炎癥程度、變性程度，以天狼紅染色觀察肝纖維化程度。標準如下A:炎癥活動半定量計分系統(tǒng)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>計分P+L+2X(PN+BN)B:肝纖維化半定量計分系統(tǒng)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>計分L+P+2(NXW)*:標本內僅一細纖維隔，W計分0.5;間隔寬度居二者之間者，計分取平均值。上述內容源自《肝纖維化診斷及療效評估共識》，中華肝臟病雜志，2002，10(5):327—328，作者曾民德，王泰齡，王寶恩。C:肝細胞脂肪變變性程度分級標準0級2°=1正常；I級2'=2散在脂肪變性；II級22=4小葉周灶狀脂肪變性；IV級24=16彌漫性脂肪變性。4)半定量PCR技術檢測大鼠肝臟中TLPmRNA水平SD大鼠處死后，取肝臟，經(jīng)液氮冷凍后勻漿，用RNA抽提試劑Trizol抽提RNA(美國GibcoBRL公司，操作按照說明書)，上述提取的RNA用DNAseRNAse-free3U消化后再加入逆轉錄反應混合液，其中含TLP的上、下游引物各100pmo1(TLP正義引物序列5'GTGAGATCATCCTGGC3，TLP反義引物序列5，CACACTAAAGTCCCCCTGC3')，總體積為20|^1。4rC水浴l小時，95。C滅活5分鐘。取4|_il上述cDNA產(chǎn)物，加至46|alPCR反應混合液中,其中含TLP上、下游引物各0.2|Lil,放入熒光定量PCR儀中檢測。以細胞骨架蛋白eactin為對照，計算TLP/Pactin密度掃描值，以觀察大鼠肝臟中TLPmRNA水平變化情況。5)結果第五周開始肝臟大體觀即可見邊緣變鈍，肝臟顏色偏白，表面油膩。病理切片觀察有少量纖維生成，隨著造模時間的延長，炎癥、脂肪和肝纖維化程度都逐漸加重，顯示肝纖維化模型造模成功。具體結果如表l所示表1、大鼠肝纖維化模型肝臟纖維化和TLPmRNA水平的變化情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>研究結果顯示，TLP與肝纖維化有關，隨著肝纖維化程度的加重，TLP表達增加。實施例3、Lx-2細胞水平觀察TLP抗肝纖維化效果將TLPRNAi序列1和序列2分別轉染人HSC細胞株Lx—2預處理后，由于已有較多文獻證實Smad3在肝纖維化形成中起重要作用，因此實驗還利用2種作為已知技術的S腿d3認Ai序列Smad3RNAi序列1(Smad3-15'CGCAGAACGUCAACACCAAdtdt3')和序列2(Smad3-25'CCAGUGACCACCAGAUGAAdtdt3')用作陽性對照組，用800pg/ml的TGF—P1刺激后，WesternBlot觀察Lx2細胞分泌I型膠原的變化。結果如圖2所示顯示TLP—l和Smad3效果類似，經(jīng)TLPRNAi-1干擾后膠原合成顯著下降，顯示針對TLP序列l(wèi)設計的RNAi片段可以有效的抑制肝纖維化，是治療肝纖維化的一個理想的治療靶點。實施例4、TLPsiRNA干擾后對細胞生長的影響將TLPRNAi序列1和序列2分別轉染人HSC細胞株Lx—2預處理，以無關序列為陰性對照，用800pg/ml的TGF—ei刺激后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。所得的結果如圖l所示，從該RNA干擾前后的細胞形態(tài)圖中，我們可以看到陰性對照干擾前(圖A)和干擾后(圖B)沒有顯著差異，TLPRNAi序列1和序列2干擾前(圖C和圖E),細胞貼壁好，偽足豐富，整體呈現(xiàn)"星狀"；干擾后(圖D和圖F)，細胞偽足減少甚至消失，整體呈現(xiàn)"扁圓狀"。由此說明TLPsiRNA干擾后，細胞偽足減少或消失，形態(tài)由多邊形改變?yōu)闄E圓形，以TLP—lRNAi干擾序列作用最明顯。實施例5、細胞芯片技術研究TLP對H印G2細胞和Lx-2細胞生長情況的影響16孔板準備H印G2細胞或Lx-2細胞，5000個/L，用不加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，細胞融和率40%左右，棄培養(yǎng)液，加無血清無抗生素0pti—MEM100p1，準備25n1RNAi禾口25p1Lipofectamine2000，分別是0.75ii1RNAi(分別采用smad3-2、TLP-1、TLP-2、Smad3-1)+24.25y10pti—MEM和0.25y1Lipofectamine2000+24.75y10pti—MEM，分別輕輕混勻，作用5分鐘后，將Lipofectamine2000和RNAi混勻，冰上作用20分鐘，全部加入培養(yǎng)板，每孔約加50ul。細胞芯片記錄細胞生長情況。Lx-2細胞芯片結果如圖3所示RNAi24小時后細胞生長出現(xiàn)不同情況，未加RNAi組(線1)生長最佳，而陽性對照GAPDH組細胞生長受到顯著影響(線6)，實驗組以smad3-2(線3)、TLP-1(線5)和TLP-2(線4)組對細胞生長的抑制作用最顯著，和陽性對照GAPDH組一致，Smad3-1組(線2)未見明顯抑制作用。H印G2細胞芯片結果如圖4所示RNAi24小時后細胞生長出現(xiàn)不同情況，未加RNAi組(線l)生長最佳，而陽性對照GAPDH組細胞生長受到顯著影響(線6)，實驗組以smad3-l(線2)、TLP-1(線5)和TLP-2(線4)組對細胞生長的抑制作用最顯著，和陽性對照GAPDH組一致，Smad3-2組(線3)抑制作用相對較弱。研究結果顯示，TLP-1和TLP-2的siRNA序列對H印G2細胞和Lx-2細胞的生長均有較為明顯的抑制作用，提示TLP是肝細胞生長過程中一個具有重要功能的分子。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。SEQIDNO:1GCAACAAUUCAUCACAUCdtdtSEQIDNO:2CCAUGUGGUUUCCCAGUUUdtdt權利要求1、針對TRAP-1樣蛋白基因的siRNA序列，其特征是其目標RNA靶序列的核苷酸序列為以下任意一種TLP-15’GCAACAAUUCAUCACAUCdtdt3’和TLP-25’CCAUGUGGUUUCCCAGUUUdtdt3’。2、如權利要求1所述的針對TRAP-l樣蛋白基因的siRNA序列在制備抑制肝臟腫瘤生長和/或抑制肝纖維化藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種針對TRAP-1樣蛋白基因的siRNA序列，其目標RNA靶序列的核苷酸序列為以下任意一種TLP-15’GCAACAAUUCAUCACAUCdtdt3’和TLP-25’CCAUGUGGUUUCCCAGUUUdtdt3’。本發(fā)明還同時公開了該siRNA序列在制備抑制肝臟腫瘤生長和/或抑制肝纖維化藥物中的應用。文檔編號C12N15/11GK101597606SQ200910100258公開日2009年12月9日申請日期2009年7月2日優(yōu)先權日2009年7月2日發(fā)明者劉東成,周林福,朱海紅,峰陳,智陳申請人:浙江大學