專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速鑒定西花薊馬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于昆蟲(chóng)鑒定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種西花薊馬(包括其 成蟲(chóng)、若蟲(chóng)及蛹)的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
西花薊馬Frankliniella occidentals是一種食性極雜的害蟲(chóng)，已記載的寄主有66科244種植物，其還是番茄斑萎病毒(TSWV)等多種植物病毒的媒介昆蟲(chóng)，因此該蟲(chóng)已 被多個(gè)國(guó)家列為檢疫性害蟲(chóng)。西花薊馬原產(chǎn)于北美，后廣泛傳播于歐洲、亞洲(日本、韓國(guó) 等)、非洲(肯尼亞、南非等)、中南美洲(哥斯達(dá)黎加、哥倫比亞等)和大洋州(澳大利亞、 新西蘭)等地。我國(guó)于2003年在北京大棚辣椒上發(fā)現(xiàn)西花薊馬，后來(lái)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)也有發(fā) 現(xiàn)該蟲(chóng)的報(bào)道。由于薊馬體型小，形態(tài)鑒定時(shí)須先將蟲(chóng)體制成玻片標(biāo)本，具有一定難度；其若蟲(chóng)和 蛹的鑒定則更為困難。因此傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定不能完全滿足口岸檢驗(yàn)檢疫快速驗(yàn)放通關(guān)的需 求。當(dāng)前，西花薊馬快速鑒定已成為一個(gè)迫切需要解決的難題。現(xiàn)有技術(shù)中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，填補(bǔ)西花薊馬快速鑒定方面的空白，提供 一種快速鑒定西花薊馬的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供了一種快速鑒定西花薊馬的方法，該方法采用下述順序的步驟(1)對(duì)西花薊馬 Frankliniella occidentalis、花薊馬 Frankliniellaintonsa、 黃月匈I(mǎi)^J馬 Thrips hawaiiensis、^、"^黃I^J馬 Thripsflavidulus、煙I^j馬 Thrips tabaci、大 薊馬 Megalurothrips distalis 的形態(tài)鑒定；(2)運(yùn)用北京天根的TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒推薦的方法對(duì)步驟(1)所 述六種薊馬種類(lèi)分別提取其總DNA ；(3)采用簡(jiǎn)并引物 mtD-7. 2F :5，-ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCAT-T-3，，mtD-9. 2R :5， -CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTCTG-3’分別對(duì)六種薊馬種類(lèi)的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段 為mtDNA COI基因中的一部分，片段大小為450bp ；(4)針對(duì)所獲得6段序列設(shè)計(jì)2對(duì)西花薊馬特異性引物F. 0L1/F. OR和F. 012/ F. 0R，建PCR快速鑒定方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1.首次建立了西花薊馬PCR快速鑒定方法；與常規(guī)形態(tài)鑒定相比，本發(fā)明的鑒定 方法具有快速、準(zhǔn)確、特異性好等優(yōu)點(diǎn)；2.所述的特異性引物及PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序能擴(kuò)增出與預(yù)期片段；3.對(duì)滿足口岸檢驗(yàn)檢疫快速驗(yàn)放通關(guān)的需要，有效保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有重要意義。


圖1是運(yùn)用西花薊馬特異性引物F. 0L1/F. OR進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，1.西花薊馬2.花薊馬3.黃胸薊馬4.八節(jié)黃薊馬5.煙薊馬 6.大薊馬7.空白對(duì)照；圖2是運(yùn)用西花薊馬特異性引物F. 0L2/F. OR進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，1.西花薊馬2.花薊馬3.黃胸薊馬4.八節(jié)黃薊馬5.煙薊馬 6.大薊馬7.空白對(duì)照。具體實(shí)施方法下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但它并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例1——應(yīng)用西花薊馬特異性引物F. 0L1/F. OR進(jìn)行PCR鑒定分別對(duì)西花薊馬、花薊馬、黃胸薊馬、八節(jié)黃薊馬、煙薊馬、大薊馬六種薊馬種類(lèi)進(jìn) 行總DNA的提取，以西花薊馬特異性引物F. 0L1/F. OR進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積 為 50 μ L，其中10 XPCR Buffer 5μ L,25mMol/L MgCl2 4 μ L，2. 5mMol/L dNTP 2 μ L, Taq 聚合酶0.3“1^0^1 1儀，5。/^1^)，2(^11101 F. 0L1/F. OR 各 2 μ L，模板 DNA 2 μ L，然后加無(wú)菌 水止終體積50yL。反應(yīng)條件為95°C 5Min ； 94 °C 50s, 53 °C 40s, 72 °C 50s，共35個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸6Min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1，西花薊馬總DNA經(jīng) PCR擴(kuò)增后，在271bp處可以看到與預(yù)期片段大小一致的目的條帶(圖1，泳道1)。而其余 薊馬種類(lèi)及陰性對(duì)照沒(méi)有特異性擴(kuò)增條帶(圖1，泳道2-7)。實(shí)施例2——應(yīng)用西花薊馬特異性引物F. 0L2/F. OR進(jìn)行PCR鑒定分別對(duì)西花薊馬、花薊馬、黃胸薊馬、八節(jié)黃薊馬、煙薊馬、大薊馬六種薊馬種類(lèi)進(jìn) 行總DNA的提取，以西花薊馬特異性引物F. 0L1/F. OR進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積 為 50 μ L，其中10 XPCR Buffer 5μ L,25mMol/L MgCl2 4 μ L，2. 5mMol/L dNTP 2 μ L, Taq 聚合酶 0· 3μ L(Takara，5U/y L)，20pmol F. 0L2/F. OR 各 2 μ L，模板 DNA 2 μ L，然后加無(wú)菌 水止終體積50yL。反應(yīng)條件為95°C 5Min ； 94 °C 50s, 53 °C 40s, 72 °C 50s，共35個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸6Min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1，西花薊馬總DNA經(jīng) PCR擴(kuò)增后，在222bp處可以看到與預(yù)期片段大小一致的目的條帶(圖2，泳道1)。而其余 薊馬種類(lèi)及陰性對(duì)照沒(méi)有特異性擴(kuò)增條帶(圖2，泳道2-7)。所述的特異性引物為F. OLl :5，-TTTGTCAACTTTTTATCACTCTGGAC-3，F(xiàn). 0L2 :5，-TCCCTTCATTTAGCAGGT-3，F(xiàn). OR 5，-CGGATCAAAGAAGGATGTA-3，。
權(quán)利要求
一種快速鑒定西花薊馬的方法，其特征在于，采用以下步驟(1)對(duì)西花薊馬Frankliniella occidentalis、花薊馬Frankliniellaintonsa、黃胸薊馬Thrips hawaiiensis、八節(jié)黃薊馬Thripsflavidulus、煙薊馬Thrips tabaci、大薊馬Megalurothrips distalis的形態(tài)鑒定；(2)運(yùn)用北京天根的TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒推薦的方法對(duì)步驟(1)所述六種薊馬種類(lèi)分別提取其總DNA；(3)采用簡(jiǎn)并引物mtD-7.2F5’-ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCAT-T-3’，mtD-9.2R5’-CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTCTG-3’分別對(duì)六種薊馬種類(lèi)的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段為mtDNA COI基因中的一部分，片段大小為450bp；(4)針對(duì)所獲得6段序列設(shè)計(jì)2對(duì)西花薊馬特異性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，建立PCR快速鑒定方法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速鑒定西花薊馬的方法。該法基于西花薊馬等六種薊馬成蟲(chóng)形態(tài)鑒定結(jié)果，分別以2對(duì)西花薊馬特異性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立西花薊馬快速鑒定的方法。本發(fā)明快速、準(zhǔn)確、特異性好，為及時(shí)準(zhǔn)確鑒定西花薊馬這種檢疫害蟲(chóng)提供了有效的鑒定手段，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101805782SQ20091009480
公開(kāi)日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者丁元明, 劉忠善, 周劍, 周力兵, 寸東義, 王輝 申請(qǐng)人:云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心