專利名稱：魚(yú)卵細(xì)胞提取物及其在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，具體涉及魚(yú)類(lèi)生殖細(xì)胞提取物及其在誘導(dǎo)已分 化成熟的各種成體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴怀墒斓亩嗄芨杉?xì)胞中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，公知的使成體細(xì)胞逆向分化為多能性干細(xì)胞的技術(shù)為基因重排技 術(shù)。基因重排技術(shù)是利用病毒載體，將干細(xì)胞相關(guān)的特定基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)而得 到的多能性干細(xì)胞。而攜帶基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體會(huì)導(dǎo)致由多能性干細(xì)胞細(xì)胞發(fā)
育成的組織中出現(xiàn)腫瘤和致癌基因c-Myc基因的表達(dá)，都存在很大的安全隱患， 并且成本很高、操作很復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期又長(zhǎng)等。
為了避免破壞早期胚胎；為了研究中不需要直接使用人類(lèi)胚胎來(lái)源干細(xì) 胞，避免了長(zhǎng)期存在倫理爭(zhēng)議；為了將來(lái)肴可能直接取患者的體細(xì)胞，在體外 再程序化為"多能干細(xì)胞"，或誘導(dǎo)分化為某種細(xì)胞，用于移植治療疾病并避 免免疫排斥反應(yīng)；為了能夠取代再程序化細(xì)胞的傳統(tǒng)方法一體細(xì)胞核移植；同 時(shí)也避免利用基因重組技術(shù)存在的安全隱患，本發(fā)明的技術(shù)方案作了新的嘗 試。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種魚(yú)卵細(xì)胞提取物，本發(fā)明的另 一目的是提供該魚(yú)卵細(xì)胞提取物在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用，用本發(fā)明的提取 物誘導(dǎo)人成體細(xì)胞，使其逆向分化為多能性干細(xì)胞，可以為治療疾病提供各種 細(xì)胞來(lái)源。
魚(yú)卵細(xì)胞提取物，包括以下方法取得
一、 取魚(yú)卵細(xì)胞，用生理鹽水清洗后置于容器中備用；
二、 將裝有魚(yú)卵細(xì)胞的容器放入-8(TC至-19(TC低溫冰箱或液氮中冷凍，待完 全凍結(jié)后取出，在常溫或不高于42。C溫水中隔水融化完全，如此凍融，反復(fù) 3-5次，使卵細(xì)胞破碎；
三、 在凍融處理后的魚(yú)卵細(xì)胞中按體積比1 : 1加入生理鹽水，充分?jǐn)嚲螅?離心取得上清液，上清液再經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾去除細(xì)菌和分子量大于等于20萬(wàn)道 爾頓的大分子成份，取得二次上清液，溯J定并調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為4毫克/毫升， 4'C保存?zhèn)溆茫藶楸景l(fā)明的魚(yú)卵細(xì)胞提取物。
步驟二凍融后的魚(yú)卵細(xì)胞，如未完全破碎，可以進(jìn)一步用常規(guī)的細(xì)胞破碎 方法處理，使細(xì)胞完全破碎后再加生理鹽水。處理方法可以是置于研缽中研磨 或用超聲手段。凍融或破碎處理的目的是使細(xì)胞完全破碎。
所述的二次上清液蛋白質(zhì)含量會(huì)因多種因素而不確定，當(dāng)所測(cè)定蛋白質(zhì)高 于4亳克/亳升時(shí)，可用生理鹽水稀釋為所需濃度，低于時(shí)，可用常規(guī)的蒸發(fā)、 凍干、自然干燥等方法將其濃縮為4亳克/毫升。本發(fā)明所述的二次上清液可 以先凍存，應(yīng)用前再調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為4毫克/亳升。
所述魚(yú)可以是淡水魚(yú)或海魚(yú)，優(yōu)選淡水魚(yú)中的鯉魚(yú)、鯽魚(yú)或草魚(yú)，優(yōu)選卵 細(xì)胞卵黃充滿時(shí)的魚(yú)。
離心技術(shù)條件優(yōu)選1000rpm離心10分鐘后，取上清液再3000rpm離10-30分鐘，過(guò)濾取得二次上清液。過(guò)濾是常規(guī)的正壓或負(fù)壓過(guò)濾。
所述魚(yú)卵細(xì)胞來(lái)自于新鮮活魚(yú)殺取或直接收購(gòu)新鮮魚(yú)卵。殺魚(yú)方法可以用
75%的酒精，將活魚(yú)浸泡15-30分鐘后處死取得卵細(xì)胞。該方法同時(shí)對(duì)魚(yú)身體 有殺菌作用。
魚(yú)卵細(xì)胞提取物在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用，按以下方 法應(yīng)用
一、 備人成體細(xì)胞，按常規(guī)方法分離培養(yǎng)獲得人原代成體細(xì)胞，取該原代成體 細(xì)胞或其增殖培養(yǎng)后第一代至第四代成體細(xì)胞備用；
二、 誘導(dǎo)培養(yǎng)，將上述成體細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是按體 積比，液體培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基魚(yú)卵細(xì)胞提取物=100 : 1-10培養(yǎng)基，在 37°C, 5%C02， 90%濕度條件下經(jīng)過(guò)12-72小時(shí)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞。
步驟一增殖培養(yǎng)的后代成體細(xì)胞來(lái)源可以是將分離培養(yǎng)的原代成體細(xì)胞 用0.25。/。胰酶-EDTA消化并傳代培養(yǎng)至第一代到第四代。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 70%-90%時(shí)，可以認(rèn)為達(dá)到使用時(shí)機(jī)。增殖培養(yǎng)是為了擴(kuò)增細(xì)胞，原代細(xì)胞或 第二至第四代細(xì)胞均可為本發(fā)明的成體細(xì)胞，第四代以后的傳代細(xì)胞活性相對(duì) 較低，但仍然可以用于向多能干細(xì)胞分化。
從成人全身各個(gè)組織獲取成熟的體細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，用
本發(fā)明的魚(yú)卵細(xì)胞提取物來(lái)誘導(dǎo)成體細(xì)胞，使其逆向分化為多能性干細(xì)胞。這
些多能干細(xì)胞經(jīng)過(guò)鑒定后，不僅可以提供各種細(xì)胞來(lái)源，而且還可以用來(lái)治療
各種疾病，為組織修復(fù)、替代、器官再造提供一條獲取干細(xì)胞的新途徑。
所述多能性干細(xì)胞具有再向神經(jīng)、血液皮膚、血管、肌肉等各種組織類(lèi)型
的成體細(xì)胞分化的特性，可用于移植治療各種損傷、退行性變和再生組織器官功能。
本發(fā)明的應(yīng)用與基因轉(zhuǎn)染和化學(xué)合成藥物相比較，具有不損傷細(xì)胞、培養(yǎng) 條件簡(jiǎn)單、無(wú)毒、誘導(dǎo)效率高等優(yōu)點(diǎn)，且能避免由基因轉(zhuǎn)染所帶來(lái)的不安全性 因素。操作簡(jiǎn)單、成本低廉、實(shí)驗(yàn)周期短。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 、
1) 成體細(xì)胞的分離培養(yǎng)
如人長(zhǎng)纖維細(xì)胞的獲得手術(shù)切取患者腹部2 ~ 3cra'的皮膚，置于含有100U Anl (U為國(guó)際單位unit)氨節(jié)青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶 液(The phosphate buffered solution, PBS)中，反復(fù)經(jīng)過(guò)PBS漂洗后，剪 棄脂肪和結(jié)締組織。將皮膚剪成lmm3左右的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、 透明質(zhì)酸酶300U/ml的DMEM培養(yǎng)基中，放置4。C過(guò)夜。1: l的比例加入含有 0. 25%胰酶和0. 02%的乙二胺四乙酸(ethylenediamin etetraacetic acid, EDTA)的PBS消化液，37。C空氣搖床180轉(zhuǎn)/分(revolutions per minute, rpm) 20min,血清終止。1000 rpm離心10min收集細(xì)胞。DMEM培養(yǎng)基洗脫2 次后，用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)定細(xì)胞密度以每亳升(2 ~ 4 ) x 105， 細(xì)胞接種，37°C, 5%C02， 90%濕度條件下培養(yǎng)。
2) 魚(yú)卵細(xì)胞提取物的制備
挑選卵細(xì)胞卵黃充滿時(shí)的鯽魚(yú)、，鯉魚(yú)或單魚(yú)甲的一種，用75%的酒精浸泡 15-30分鐘后處死。在無(wú)菌的條件下，將魚(yú)卵細(xì)胞50克取出，用生理鹽水清洗后放入50ml的離心管中，直接投入液氮中2小時(shí)完全凍結(jié)，然后投入37'C-38 'C水浴中解凍5-10分鐘至完全解凍，反復(fù)3次，加入等體積的生理鹽水， 1000rpm離心IO分鐘后，取上清液3000rpm離心30分鐘，取上清，過(guò)濾除去 細(xì)菌和分子量大于等于20萬(wàn)道爾頓的大分子成份后，得二次上清液50亳升， 測(cè)定蛋白質(zhì)含量為10亳克/毫升，用生理鹽水稀釋為蛋白質(zhì)4毫克/亳升，4'C 保存?zhèn)溆?，是為本發(fā)明的魚(yú)卵細(xì)胞提取物。
實(shí)驗(yàn)證明，鯽魚(yú)、鯉魚(yú)或草魚(yú)卵細(xì)胞組織均可作為本發(fā)明的魚(yú)卵細(xì)胞來(lái)源， 不論魚(yú)卵細(xì)胞是否充滿卵黃，都可作為本發(fā)明的卵細(xì)胞的來(lái)源。
3) 魚(yú)卵細(xì)胞提取物在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用
一、 備人成體細(xì)胞，按實(shí)施例l獲得人長(zhǎng)纖維細(xì)胞原代細(xì)胞，取該原代成體細(xì) 胞，用0.25%胰酶-EDTA消化并傳代培養(yǎng)第一代至第四代。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 70%-90%時(shí)，即可進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
二、 誘導(dǎo)培養(yǎng)，將上述長(zhǎng)纖雍細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是按 體積比，液體培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基:魚(yú)卵細(xì)胞提取物=100 : 1-10培養(yǎng)基， 在37。C, 5%C02， 90%濕度條件下經(jīng)過(guò)12-72小時(shí)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞。
本發(fā)明所述的DMEM培養(yǎng)基，DMEM/F12培養(yǎng)基均為常規(guī)培養(yǎng)基。
4) 鑒定方法及鑒定結(jié)果
1、免疫組織化學(xué) 一般誘導(dǎo)12小時(shí)細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)干細(xì)胞的表面標(biāo)志 0CT3/4、 S0X-2、 Nanog等，誘導(dǎo)72小時(shí)OCT3/4、 S0X-2、 Nanog等的陽(yáng)性表 達(dá)更為典型。2、 體外多潛能的分析誘導(dǎo)12小時(shí)后接種于裸鼠皮下有畸胎瘤的生成，其中 有血管、神經(jīng)、肌肉、脂肪等。
3、 表觀遺傳學(xué)分析主要通過(guò)分析DNA甲基化。來(lái)分析哪些基因是甲基化的， 哪些基因是不甲基化的。重點(diǎn)檢測(cè)的基因是OCT3/4、 Nanog等。其中實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示誘導(dǎo)組基因0CT3/4的陽(yáng)性表達(dá)率分別為54. 2%，誘導(dǎo)12小時(shí)30 / ，誘 導(dǎo)48小時(shí)29. 2%;誘導(dǎo)組基因Nanog的陽(yáng)性表達(dá)率分別為75%、誘導(dǎo)12小時(shí) 55%、誘導(dǎo)48小時(shí)35%。而對(duì)照組基因0CT3/4、 Nanog陽(yáng)性表達(dá)率均為:0%。 實(shí)施例2 、
1) 人成體細(xì)胞的分離培養(yǎng) 常規(guī)方法獲得人成體原代淋巴細(xì)胞。
2) 魚(yú)卵細(xì)胞提取物的制備
收購(gòu)新鮮的魚(yú)卵，除如實(shí)施例l的方法凍融、離心及過(guò)濾處理，在凍融后 增加研磨3分鐘。獲得二次上清液50亳升，測(cè)定蛋白質(zhì)含量為1毫克/亳升， 用凍干的方法濃縮，使蛋白質(zhì)含量達(dá)到4亳克/亳升，4匸保存?zhèn)溆?，是為本發(fā) 明的魚(yú)卵細(xì)胞提取物。
3) 魚(yú)卵細(xì)胞提取物在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用
一、 備人成體細(xì)胞，按實(shí)施例2獲得人淋巴細(xì)胞原代細(xì)胞，取該原代成體細(xì)胞， 即可進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
二、 誘導(dǎo)培養(yǎng)，將上述淋巴細(xì)胞原代細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng) 基是按體積比，液體培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基魚(yú)卵細(xì)胞提取物=100 : 1-10培養(yǎng)基，在37。C, 5%C02, 90%濕度條件下經(jīng)過(guò)12-72小時(shí)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出造血干細(xì) 胞。
4)鑒定方法及鑒定結(jié)果 同實(shí)施例l。
實(shí)驗(yàn)證明，用原代成體細(xì)胞或其增殖培養(yǎng)后的第二代至第四代成體細(xì)胞經(jīng) 本發(fā)明的卵細(xì)胞提取物誘導(dǎo)培養(yǎng)后，產(chǎn)生的多能干細(xì)胞表達(dá)均符合上述鑒定結(jié) 果。
用同樣的手段和方法可以將人各種組織成熟的體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多能干 細(xì)胞，產(chǎn)生的多能干細(xì)胞表達(dá)均符合上述鑒定結(jié)果。實(shí)施例2選用人成體血液 白細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案不限于上述實(shí)施例。
權(quán)利要求
1、魚(yú)卵細(xì)胞提取物，其特征在于，主要由以下方法取得一、取魚(yú)卵細(xì)胞，用生理鹽水清洗后置于容器中備用；二、將裝有魚(yú)卵細(xì)胞的容器放入-80℃至-190℃低溫冰箱或液氮中冷凍，待完全凍結(jié)后取出，在常溫或不高于42℃溫水中隔水融化完全，如此凍融，反復(fù)3-5次，使卵細(xì)胞破碎；三、在凍融處理后的魚(yú)卵細(xì)胞中按體積比1∶1加入生理鹽水，充分?jǐn)嚲?，離心取得上清液，上清液再經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾去除細(xì)菌和分子量大于等于20萬(wàn)道爾頓的大分子成份，取得二次上清液，測(cè)定并調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為4毫克/毫升，4℃保存?zhèn)溆茫藶楸景l(fā)明的魚(yú)卵細(xì)胞提取物。
2、 如權(quán)利要求1所述的魚(yú)卵細(xì)胞提取物，其特征在于，步驟二凍融后的魚(yú)卵 細(xì)胞，再置于研缽中研磨，使細(xì)胞完全破碎。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的魚(yú)卵細(xì)胞提取物，其特征在于，所述魚(yú)卵細(xì)胞來(lái) 自于新鮮活魚(yú)殺取或直接收購(gòu)新鮮魚(yú)卵。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的魚(yú)卵細(xì)胞提取物，其特征在于，所述魚(yú)是淡水鯉 魚(yú)、淡水鯽魚(yú)或淡水草魚(yú)中的一種。
5、 如權(quán)利要求3所述的魚(yú)卵細(xì)胞提取物，其特征在于，魚(yú)卵是卵細(xì)胞卵黃充 滿時(shí)的魚(yú)卵。
6、 如權(quán)利要求1或2所述的魚(yú)卵細(xì)胞提取物，其特征在于，離心條件是在 1000rpm離心IO分鐘后,取上清液再3000rpm離心10-30分鐘。
7、 魚(yú)卵細(xì)胞提取物在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在 于，按以下方法應(yīng)用一、 備人成體細(xì)胞，按常規(guī)方法分離培養(yǎng)獲得人原代成體細(xì)胞，取該原代成體細(xì)胞或其增殖培養(yǎng)后第二代至第四代成體細(xì)胞備用；二、 誘導(dǎo)培養(yǎng)，將上述成體細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是按體積比，液體培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基魚(yú)卵細(xì)胞提取物=100 : 1-10培養(yǎng)基，在 37°C， 5%C02， 90°/ 濕度條件下經(jīng)過(guò)12-72小時(shí)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞。
8、如權(quán)利要求7所述的魚(yú)卵細(xì)胞提取物在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞 中的應(yīng)用，其特征在于，步驟一的人成體細(xì)胞原代至后代細(xì)胞密度達(dá)到70%-90% 時(shí)，即為下一步的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)機(jī)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種魚(yú)卵細(xì)胞提取物及其在誘導(dǎo)人成體細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞中的應(yīng)用。殺魚(yú)取卵，經(jīng)過(guò)凍融，離心，過(guò)濾、蛋白濃度4毫克/毫升，為卵細(xì)胞提取物。從成人全身各個(gè)組織獲取成熟的體細(xì)胞原代細(xì)胞或傳代二至四后代細(xì)胞，用本發(fā)明的提取物來(lái)誘導(dǎo)成體細(xì)胞，使其逆向分化為多能性干細(xì)胞，可以為臨床提供各種細(xì)胞來(lái)源，還可以用來(lái)治療各種疾病。與現(xiàn)有技術(shù)相比具有不損傷細(xì)胞、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、無(wú)毒、誘導(dǎo)效率高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也避免利用基因重組技術(shù)存在的安全隱患。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101481679SQ20091009405
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者朱向情, 潘興華 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院;潘興華