專利名稱：：一種通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬草酸濃度的酶分析領(lǐng)域，特別是涉及一種通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法。
背景技術(shù)：
：目前草酸含量的測定方法主要有滴定法、原子吸收法、比色法、酶法和高壓液相色譜法(HPLC)，另外還有離子色譜法、毛細管電泳法(CE)等。滴定法建立最早，作為一種經(jīng)典方法至今仍在食品分析中廣泛應(yīng)用，但發(fā)展不大，其靈敏度低，操作較繁瑣、耗時的缺陷沒有改善。比色法廉價、靈敏度高，但預(yù)沉淀操作難于完全將草酸提取出來，操作繁瑣且重復(fù)性較差；毛細管電泳靈敏度高，操作也較簡便，但該儀器尚未普及。高壓液相色譜法靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便，快捷，但分離過程中無機酸的干擾較嚴重，且儀器昂貴，對操作人員的要求較高，普及困難，較適于在專業(yè)部門使用。酶法及酶-電極法檢測草酸簡便快速，靈敏度高，選擇性好，回收率高，將酶法的放大作用、良好選擇性與電極法的快速簡便有機的結(jié)合了起來，是一種很有前途的檢測方法?，F(xiàn)在研究報道較多的利用酶測定草酸的方法，是利用草酸氧化酶催化草酸與氧氣生成二氧化碳和過氧化氫的特性，再通過檢測氧氣的消耗量、二氧化碳或過氧化氫的生成量來定量草酸。這種方法簡便、精確度高，是目前測定草酸的經(jīng)典方法。但是由于草酸氧化酶造價較高，該法的大范圍推廣應(yīng)用受到了很大的限制。因此大家都在尋找一種可替代該經(jīng)典方法，且耗時短、價格較便宜、精確度與該方法相近的測定草酸的分析方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法，該方法操作簡便，所用的酶試劑較便宜，成本低，靈敏度高，與其它市售的測定草酸的試劑盒相比精確度相近，有很好的實用性。本發(fā)明的一種通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法，包括(1)第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)體系的構(gòu)建空白樣品的準備量取0.3mL200mmol/L醋酸緩沖液，O.lmL草酸及O.lmL失活的草酸脫羧酶，混合備用；待測樣品的準備量取0.3mL200mmol/L醋酸緩沖液，O.lmL草酸及O.lmL酶活>0.8U/mL的草酸脫羧酶，混合備用；第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)體系總體積V2為0.5mL，反應(yīng)pH為3.0-5.5，反應(yīng)溫度為20-37°C，反應(yīng)時間為30-60min;(2)第二反應(yīng)體系分別準備2管各lmL的C02測定試劑樣品，于37t:溫育5min，pH7.38.5，32/5頁380nm條件下測得A!;其中C02測定試劑的組成8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的蘋果酸脫氫酶，66-100mMTris-HCl緩沖液，pH7.38.5;[OOM](3)第三反應(yīng)體系空白樣品組混合lmLC02測定試劑和0.010.05mL第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)空白樣品液V"待測樣品組混合lmLC02測定試劑和0.010.05mL第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)待測樣品液V"第三反應(yīng)體系總體積V!為lmL+V3，37°C，5min，pH7.38.5，380nm條件下測得空白組八2及待測組八3;(4)計算草酸濃度mmol/L草酸濃度(mM):^^，xV2公式(1)￡T!XdXV',XV其中，V,——最后的反應(yīng)液總體積(mL)v—加入待測樣草酸體積(mL)V2——第一步酶反應(yīng)液總體積(mL)V3——第三步參加酶反應(yīng)液的體積(mL)d-比色皿光徑(cm)e!-NADH的吸收系數(shù)1.33Lmmor1.cm—1，在380nm處AA3S0nm=△A待測-AA空白；AA空白=A^A!，AA待測=ArA!。本發(fā)明通過酶法測定草酸含量的原理是利用草酸脫羧酶催化分解草酸生成甲酸和二氧化碳，再通過烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和蘋果酸脫氫酶(MDH)體系，采用分光光度法在380nm波長下檢測NADH濃度的變化計算二氧化碳的濃度，從而計算草酸濃度，具體流程如下所示草酸草,羧氣甲酸+co2反應(yīng)總體積為0.5mL,pH3.0"5.5,20-37t:,0.MhCO2+0H--^HGCVurn-A豳4#繊*市1驗鑀烯,式爾酸羧化+磷酵儘醇式丙國,一教徵7麼！.n燈蘋果酸驟蠻隨草酰乙酸+NADH-蘋果酸+NAD+反應(yīng)體S1mL,pH8.0，37iC,溫育5mh,3翻nm測A,C02+OH—-HC03'磷酸烯醇式丙酮酸羧化HC03—+磷酸烯醇式丙酮酸-草酰乙靉+磷黷蘋果酸JK餓,草驗乙酸+NADH~---蘋果酸+NAD*反應(yīng)體系(,反魔液+1〉mL,,8.0,37*C,膽5min，380nm測A2及A3有益效果本發(fā)明的通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法，操作簡便，所用的酶試劑較便宜，成本低，靈敏度高，與其它市售的測定草酸的試劑盒相比精確度相近，有很好的實用性。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注[1]C02測定試劑的組成8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的蘋果酸脫氫酶，66mMTris-HCl緩沖液，pH8.0;[2]參見公式(1)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>計算草酸緣度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>實施例2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(mU3。C溫育5min,pi-18,0,380鵬條件下測A,上述第一步,反s液(mL.)(V3)0,020,02反應(yīng)體系3總體積(V,)為U+V3)mL.37°C，5min,pH8.0,380nm條件下測A及A3,AAji's=A:-ApAAw=A3-A1厶A'zaAArt計筧草,濃度(mM)草酸濃度(mM.)=V'X叢胸XV-，|2，qxdxV,xv注[1]C02測定試劑的組成8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的蘋果酸脫氫酶，66mMTris-HCl緩沖液，pH8.0;[2]參見公式(1)。1.02x().0鄰xO-5計算草酸濃度(mM)=V，x,，xV2xdxV，xvB3)小0.()2x(U實施例36反應(yīng)試劑樣品空廣l待測樣品反應(yīng)條件200mM醋酸緩沖液(mL)草酸樣(mL)(v)草酸殷羧酶(mL，X).8U/mL)草酸脫羧R(mL,處理失活)0.30.10,10.30.10.1第一步酶催化反應(yīng)體系總體積(V2)為0.5mL,反應(yīng)pH為3,0,反應(yīng)溫度為25t:,反應(yīng)時間為30min。CCb測定試劑f11(mL.)1.037t'溫育5min,pH8.0,380鵬條件F職A,上述第一步反應(yīng)液';0.05(mL)(V3)i0,05反應(yīng)體系3總體積(V》為(〗+V3)mL.37。C,Smin,pH8.0，380nni條件下測A2及A3,AA和=ArA,'狄=A3-A，AA徹咖！AA幼it算草酸濃度(mM)草酸濃度(mM)=V!X叢湖，XV2121xdxV,xv注[1]C02測定試劑的組成8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的蘋果酸脫氫酶，66-100mMTris-HCl緩沖液，pH8.0;[2]參見公式(1)。1,05x0,113x0」計算草酸緣度(mM)=V|XAAmxVqxdxV3xv1,33x1x0.05x0,1=8,9權(quán)利要求一種通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法，包括(1)第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)體系的構(gòu)建空白樣品的準備量取0.3mL200mmol/L醋酸緩沖液，0.1mL草酸及0.1mL失活的草酸脫羧酶，混合備用；待測樣品的準備量取0.3mL200mmol/L醋酸緩沖液，0.1mL草酸及0.1mL酶活＞0.8U/mL的草酸脫羧酶，混合備用；第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)體系總體積V2為0.5mL，反應(yīng)pH為3.0-5.5，反應(yīng)溫度為20-37℃，反應(yīng)時間為30-60min；(2)第二反應(yīng)體系分別準備2管各1mL的CO2測定試劑，于37℃溫育5min，pH7.3～8.5，380nm條件下測得A1；其中CO2測定試劑的組成8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的蘋果酸脫氫酶，66-100mMTris-HCl緩沖液，pH7.3～8.5；(3)第三反應(yīng)體系空白樣品組混合1mLCO2測定試劑和0.01～0.05ml第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)空白樣品液V3；待測樣品組混合1mLCO2測定試劑和0.01～0.05ml第一步反應(yīng)酶催化反應(yīng)待測樣品液V3；第三反應(yīng)體系總體積V1為1mL+V3，37℃，5min，pH7.3～8.5，380nm條件下測得空白組A2及待測組A3；(4)計算草酸濃度mmol/L公式(1)其中，V1——最后的反應(yīng)液總體積(mL)v——加入待測樣草酸體積(mL)V2——第一步酶反應(yīng)液總體積(mL)V3——第三步參加酶反應(yīng)液的體積(mL)d——比色皿光徑(cm)ε1——NADH的吸收系數(shù)1.33L·mmol-1·cm-1，在380nm處ΔA380nm＝ΔA待測-ΔA空白；ΔA空白＝A2-A1，ΔA待測＝A3-A1。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過酶法測定二氧化碳濃度來確定草酸濃度的方法，包括(1)草酸+草酸脫羧酶+醋酸緩沖溶液，20～37℃，反應(yīng)30～60min；(2)配制pH7.3～8.5的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH、蘋果酸脫氫酶的Tris-HCl緩沖液，37℃溫育，380nm處測A1；(3)在步驟2中添加步驟1反應(yīng)液，37℃反應(yīng)5min，380nm處測A2及A3；(4)根據(jù)ΔA380nm＝ΔA待測-ΔA空白計算NADH減少量，再根據(jù)反應(yīng)原理計算生成二氧化碳的濃度，從而計算草酸脫羧酶的濃度。該方法操作簡便，所用的酶試劑較便宜，成本低，靈敏度高，與其它市售的測定草酸的試劑盒相比精確度相近，有很好的實用性。文檔編號C12Q1/32GK101691601SQ200910055038公開日2010年4月7日申請日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日發(fā)明者洪楓申請人:東華大學(xué)