專利名稱：：重組微生物以及聚-γ-谷氨酸的制造方法重組微生物以及聚-Y-谷氨酸的制造方法技術(shù)區(qū)域本發(fā)明涉及具有聚_Y_谷氨酸產(chǎn)生能力的重組微生物，以及使用該重組微生物制造聚_Y_谷氨酸的制造方法。
背景技術(shù)：
：聚-Y-谷氨酸是谷氨酸的Y-位羧基和α-位氨基通過肽鍵連接而成的高分子化合物。聚-Y-谷氨酸有時也被稱為Y-聚谷氨酸。聚-Y-谷氨酸作為納豆桿菌(Bacillussubtilisvar.natto)所產(chǎn)生的粘性物質(zhì)已為人所知，且近年來，由于其具有各種性質(zhì)，作為新型的高分子材料備受關(guān)注。下面的說明中將聚-Y-谷氨酸簡稱為PGA。作為產(chǎn)生PGA的微生物，可以舉出包括納豆桿菌在內(nèi)的部分芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌及其近親禾中(Bacillussubtilisvar.chunRkookjanR>Bacillusicheniformis、Baci1IusmeRaterium>Bacillusanthracis>Baci1lushalodurans)、NatrialbaaeRyptiaca.Hydra等(例如，參照非專利文獻(xiàn)1)。另外，雖然在分類學(xué)上，微生物中具有PGA產(chǎn)生能力的納豆桿菌被認(rèn)為是不具有PGA產(chǎn)生能力的枯草桿菌的亞種，但是，已知任意菌株都在相同的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域、翻譯起始調(diào)控區(qū)域的下游處存在編碼PGA合成酶的_、_及基因，具有基因簇(cluster)結(jié)構(gòu)(操縱子)(例如，參照非專利文獻(xiàn)3、6及8)。并且，推測納豆桿菌的PGA產(chǎn)生調(diào)控機(jī)制與枯草桿菌轉(zhuǎn)化能力獲得機(jī)制一起受到細(xì)胞內(nèi)的很多調(diào)控因子所參與的復(fù)雜調(diào)控(例如，參照非專利文獻(xiàn)9及10)。作為PGA的產(chǎn)生方法，可以通過上述PGA產(chǎn)生菌的育種來提高其產(chǎn)生能力，但是，在消除野生株的嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制、消除野生株的復(fù)雜的營養(yǎng)需求性、或者為了得到穩(wěn)定的產(chǎn)生能力而進(jìn)行優(yōu)化等方面需要耗費(fèi)大量的勞力，因而被認(rèn)為是沒有效率的PGA產(chǎn)生方法。為此，作為代替這些野生株的育種的有效率的手法，考慮嘗試?yán)没蛑亟M技術(shù)。作為迄今為止所知的利用基因重組技術(shù)來產(chǎn)生PGA的例子，已公開在質(zhì)粒中導(dǎo)入了基因的重組枯草桿菌(BacillussubtilisISW1214株)中約9.Og/L/5日(參照非專利文獻(xiàn)2)的產(chǎn)生能力，以及在質(zhì)粒中導(dǎo)入了基因的重組大腸桿菌中約4g/L/l.5日(參照非專利文獻(xiàn)7)的產(chǎn)生能力，或2.5mg/40mg-干燥菌體(參照非專利文獻(xiàn)6)的產(chǎn)生能力。然而，上述所公開的產(chǎn)生方法都被認(rèn)為沒有達(dá)到充分的產(chǎn)生能力。另外，公開了在納豆桿菌中憑借稱作PgsBCA的膜結(jié)合型酶系，非核糖體依賴性地產(chǎn)生PGA(例如，參照非專利文獻(xiàn)4)。在這些PGA合成酶系PgsBCA中，已知PgsB(另稱為ywsC)參與了作用于谷氨酸的Y-位的羧基的酰胺連接酶反應(yīng)(例如，參照非專利文獻(xiàn)3、5)。而根據(jù)非專利文獻(xiàn)3可推定，PgsC(另稱為YwtA)通過膜結(jié)合型蛋白質(zhì)參與將PGA排出到細(xì)胞外；根據(jù)非專利文獻(xiàn)4及5可知，PgsC與PgsB—起參與谷氨酸的連接反應(yīng)，而PgsC的功能迄今尚不明確。并目.，非專利文獻(xiàn)2中公開了，對在染餼體上缺失DgsB基因、DgsC基因以及DgsA基因的枯草桿菌中，導(dǎo)入單獨(dú)表汰詵自DgsB基因、DgsC基因及DgsA基因中的1個基因的載體或者組合多個基因進(jìn)行表達(dá)的載體，所得到的PGA產(chǎn)生能力進(jìn)行研討的結(jié)果。根據(jù)非專利文獻(xiàn)2可以得到結(jié)論，如果ηκ巡基因、_基因及^KM基因不全部表達(dá)，則PGA不能產(chǎn)生。另外，在非專利文獻(xiàn)3中，在具有PGA產(chǎn)生能力的納豆桿菌(IF016449株)中，構(gòu)建盛基因(另稱為基因)缺失株、基因(另稱為IiM基因)缺失株以及DgsA基因(另稱為M邊基因)缺失株，對各個缺失株的PGA產(chǎn)生能力進(jìn)行了驗(yàn)證。其中根據(jù)非專利文獻(xiàn)3可以得到結(jié)論，在具有PGA產(chǎn)生能力的納豆桿菌中，_基因及_基因?qū)τ诋a(chǎn)生PGA是必需的，并且ηκΜ基因?qū)τ诟弋a(chǎn)生PGA也是必需的。并且，在專利文獻(xiàn)1中公開了通過使用桉DgsB基因、DgsC基因及DgsA基因的順序?qū)脒@些基因的載體來轉(zhuǎn)化大腸桿菌，原本不具有PGA產(chǎn)生能力的大腸桿菌也被賦予了PGA產(chǎn)生能力，但是，根據(jù)非專利文獻(xiàn)6可知，雖然在重組大腸桿菌中導(dǎo)入PgsBCA基因的條件下產(chǎn)生了PGA，但是，在導(dǎo)入DgsBC基因的條件下不產(chǎn)生PGA。另外，在專利文獻(xiàn)25中公開了通過用各種營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)納豆桿菌等可產(chǎn)生PGA的微生物，產(chǎn)生平均分子量為數(shù)千200萬的PGA；另外，在專利文獻(xiàn)6中公開了通過給納豆桿菌施加外部壓力來產(chǎn)生300萬以上的PGA。另一方面，非專利文獻(xiàn)11、專利文獻(xiàn)7及8中公開了可以用微生物產(chǎn)生光學(xué)純度高的PGA;專利文獻(xiàn)7中公開了使用巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)株，可以以大約10g/L/5日的量產(chǎn)生L-谷氨酸含量為90%以上的PGA；在專利文獻(xiàn)8中公開了埃及鈉白菌(NatrialbaaeRyptiaca)的突變株以大約5g/L/6日的量產(chǎn)生分子量130萬以上的聚-Y-L-谷氨酸。非專禾Ij文獻(xiàn)1:Ashiuchi，M.，etal.:Appl.Microbiol.Biotechnol.，59，pp.9-14(2002)#專禾IjJC^2:Ashiuchi,Μ.,etal.:Biosci.Biotechnol.Biochem.,70,pp.1794-1797(2006)非專利文獻(xiàn)3=Urushibata,Y.，etal.J.Bacteriol.，184，pp.337—343(2002)非專利文獻(xiàn)4蘆內(nèi)誠等未來材料，3，pp.44-50(2003)非專利文獻(xiàn)5:Ashiuchi，M.，etal.:Eur.J.Biochem.,268,pp.5321-5328(2001)非專禾lJ文獻(xiàn)6:Ashiuchi,Μ.,etal.:Biochem.Biophys.Res.Commun.,263,pp.6-12(1999)非專利文獻(xiàn)7Jiang,H.，etal.=Biotechnol.Lett.，28，pp.1241—1246(2006)非專利文獻(xiàn)8=Presecan,Ε.，etal.=Microbiology,143，pp.3313—3328(1997)非專禾Ij文獻(xiàn)9:Itaya，M.，etal.:Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,pp.2034-2037(1999)非專利文獻(xiàn)10今中忠行等微生物利用的大展開，第1章第4節(jié)，pp.657-663(2002)非專禾Ij文獻(xiàn)11:Shimizu，K.，etal.:Appl.Environ.Microbiol.,73,pp.2378-2379(2007)專利文獻(xiàn)1日本特開2001-17182號公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本特公昭43-24472號公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本特開平1-174397號公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本特開平3-47087號公報(bào)專利文獻(xiàn)5日本專利第3081901號說明書專利文獻(xiàn)6日本特開2006-42617號公報(bào)專利文獻(xiàn)7日本特開2007-228957號公報(bào)專利文獻(xiàn)8日本特開2007-314434號公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容然而，上述非專利文獻(xiàn)13、7以及專利文獻(xiàn)1中并沒有公開用于提高產(chǎn)生PGA的技術(shù)，在現(xiàn)有的見解中存在不能高效地產(chǎn)生PGA的問題。而且，迄今為止也沒有關(guān)于使用基因工程學(xué)的手法來調(diào)整PGA的分子量的報(bào)道。鑒于上述情況，本發(fā)明旨在提供能高效地產(chǎn)生PGA的重組微生物、使用該微生物的PGA的制造方法，以及，提供通過基因?qū)雭硖岣逷GA的產(chǎn)生能力的方法、PGA的分子量調(diào)整方法以及調(diào)整PGA的光學(xué)純度的方法。本發(fā)明人對此進(jìn)行了努力研究討論，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用將ηκ巡基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸锼玫降闹亟M微生物，能夠?qū)崿F(xiàn)PGA的高產(chǎn)出、PGA的分子量調(diào)整和/或光學(xué)純度的調(diào)整。本發(fā)明是基于上述認(rèn)識而完成的。本發(fā)明所涉及的重組微生物是將參與PGA合成的基因群(DgsBCA某因)中的枯草桿菌的ηκ巡基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的_基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸?，并且不將枯草桿菌的nsM基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)朐撍拗魑⑸?。即，與現(xiàn)有的見解相反，本發(fā)明所涉及的重組微生物基于的見解是不導(dǎo)入枯草桿菌的MM基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕蚍炊哂谐錾腜GA產(chǎn)生能力。在此，優(yōu)選上述M盛基因?yàn)榫幋a下列(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因。(a)含有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)含有在序列號2所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且具有酰胺連接酶活性的蛋白質(zhì)。另外，優(yōu)選上述PgSC基因?yàn)榫幋a下列(C)或(d)的蛋白質(zhì)的基因。(c)含有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(d)含有在序列號4所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且，具有在上述基因所編碼的PgsB蛋白質(zhì)的存在下生成PGA的功能的蛋白質(zhì)。并且，本發(fā)明所涉及的重組微生物中，所導(dǎo)入的基因優(yōu)選為上述M盛基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及上述ES叢基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕蜻B接于在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的、且表達(dá)受正調(diào)控的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域、翻譯起始調(diào)控區(qū)域的下游處。并且，本發(fā)明所涉及的重組微生物優(yōu)選為作為宿主的微生物為芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌。作為芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌，例如可以舉出枯草桿菌(Bacillussubtilis)。另一方面，本發(fā)明所涉及的PGA的制造方法為，培養(yǎng)上述本發(fā)明所涉及的重組微生物，從而獲得生成的PGA的方法。另一方面，本發(fā)明所涉及的PGA的產(chǎn)生能力提高方法，其特征在于，將參與PGA合成的基因群中的枯草桿菌的—基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的—基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸飦淼玫街亟M微生物，使用該重組微生物來使PGA的產(chǎn)生能力提高。另一方面，本發(fā)明所涉及的PGA的分子量調(diào)整方法，其特征在于，將參與PGA合成的基因群中的枯草桿菌的—基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颉⒁约翱莶輻U菌的_基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸飦淼玫街亟M微生物，使用該重組微生物來調(diào)整PGA的分子量(優(yōu)選使PGA高分子量化)。另一方面，本發(fā)明所涉及的PGA的光學(xué)純度調(diào)整方法，其特征在于，將參與PGA合成的基因群中的枯草桿菌的—基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的—基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸飦淼玫街亟M微生物，使用該重組微生物來調(diào)整PGA的光學(xué)純度(優(yōu)選使PGA的L-異構(gòu)體的比率增加)。圖1是流程圖，用于說明參與PGA合成的基因群的克隆工序的一個例子，從而構(gòu)建用于產(chǎn)生PGA的重組載體。圖2是流程圖，用于說明在制造例5中，通過利用SOE-PCR片段的雙交換法(doublecrossingmethod)而進(jìn)行的靶基因缺失順序。圖3是流程圖，用于說明在制造例2及制造例3中，參與PGA合成的基因群的克隆工序，從而構(gòu)建用于產(chǎn)生PGA的重組載體。圖4是流程圖，用于說明在制造例4中，參與PGA合成的基因群的克隆工序，從而構(gòu)建用于產(chǎn)生PGA的重組載體。參照附圖，從下述記載可以更明確本發(fā)明的上述以及其他特征及優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明所涉及的重組微生物是，在作為宿主的微生物中，除了參與PGA合成的基因群中的枯草桿菌的DgsA基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕蛞酝?，將枯草桿菌的DgsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的M巡基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸锒玫降?，并且具有聚_Y_谷氨酸產(chǎn)生能力。在此，參與PGA合成的基因群是指，在枯草桿菌中，由pgSB基因(另稱為BG1253111叢基因、或迎迪基因)、M巡基因(另稱為BG12532:ywtA基因、或capC基因、)以及MM基因(另稱為BG12533:n坦基因、或迎M基因)構(gòu)成的基因群。作為基因重組的宿主微生物而被廣泛利用的BacillussubtilisMarburgNo.168系統(tǒng)株，雖然其染色體上具有這些_基因、MsC基因以及MM基因，卻沒有PGA產(chǎn)生能力。與此相同，納豆桿菌(Bacillussubtilisvar.natto)在其染色體(基因組)上具有這些PrsB基因、M巡基因以及MM基因，但是，卻具有PGA產(chǎn)生能力。另外，基因的名稱、編號都是基于JAFAN[JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BS0RFDB)]網(wǎng)上公開(http://Bacillus,genome,ad.jp/,2006年1月18日更新)的枯草桿菌基因組數(shù)據(jù)的記載的。序列號1表示DgsB基因的堿基序列，序列號2表示DgsB基因所編碼的PgsB蛋白質(zhì)的氨基酸序列。另外，本發(fā)明中的ηκ巡基因并不限定于由序列號ι所示的堿基序列構(gòu)成的基因，而是包括編碼以下蛋白質(zhì)的基因該蛋白質(zhì)含有在序列號2所示的氨基酸序列中使ι個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，且以谷氨酸作為基質(zhì)而具有酰胺連接酶活性。在此，多個是指，例如可以為280個，優(yōu)選為240個，更優(yōu)選為220個，進(jìn)一步優(yōu)選為210個，最優(yōu)選為25個。另外，本發(fā)明中的_基因包括以下基因該基因含有相對于序列號1所示的堿基序列具有80%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別優(yōu)選為99%以上的遺傳一致性(geneticidentity)的堿基序列，且編碼具有酰胺連接酶活性的蛋白質(zhì)。在此，堿基序列的同源性利用Lipman-Pearson法[參照Lipman，DJ.，Pearson,WR.=Science,227,PP.1435-1441(1985)]計(jì)算。具體而言，使用基因信息處理軟件Genetyx-Win(Software開發(fā))的同源性解析(Searchhomology)程序，將Unitsizetocompare(ktup)設(shè)定為2進(jìn)行解析并由此計(jì)算。另外，上述酰胺連接酶活性的測定如下在以谷氨酸和ATP作為基質(zhì)，在其中加入氯化錳后作為反應(yīng)溶液使用的情況下，通過確認(rèn)反應(yīng)溶液中PGA的生成來進(jìn)行測定[例如，參照Urushibata,Y.，etal.:J.Bacteriol.，184，pp.337-343(2002)]。并且，本發(fā)明中的_基因包括以下基因該基因在嚴(yán)格條件下與序列號1所示的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交，且編碼具有酰胺連接酶活性的蛋白質(zhì)。在此，作為“嚴(yán)格條件下”，例如可以舉出分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版(MolecularCloning-ΑLABORATORYMANUALTHIRDEDITION)[JosephSambrook,DavidW.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)]記載的條件。例如，可以舉出將探針置于含6XSSC(1XSSC的組成0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5%SDS、5XDenhardt以及100mg/mL鯡魚精子DNA的溶液中，并且在65°C下恒溫培養(yǎng)816小時，并使之雜交的條件。另外，如下面具體說明的實(shí)施例所示，上述酰胺連接酶活性是指，DgsB基因與ES叢基因一起被導(dǎo)入宿主微生物的時候，在菌體外產(chǎn)生PGA的能力。對規(guī)定的微生物中的PGA產(chǎn)生能力的評價，可以按照以下方法進(jìn)行，例如在含有谷氨酸或其鹽的PGA產(chǎn)生瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的時候，對形成在菌落周邊的半透明粘性物質(zhì)進(jìn)行目測觀察的方法；根據(jù)SDS-PAGE檢測PGA的方法[例如，參照Yamaguchi，F(xiàn).，etal.=Biosci.Biotechnol.Biochem.60,pp.255-258(1996)]；或是在酸解后使用氨基酸分析裝置進(jìn)行定量的方法[例如，參照Ogawa，Y.，etal.=Biosci.Biotechnol.Biochem.,61,pp.1684-1687(1997)]；精制培養(yǎng)液后求出干燥重量的定量法[例如，參照Ashiuchi，Μ.，etal.=Biochem.Biophys.Res.Commun.，263:pp.6-12(1999)]；根據(jù)采用了凝膠過濾色譜柱的HPLC(高效液相色譜法)的定量/定性法[例如，參照Kubota,H.，etal.=Biosci.Biotechnol.Biochem.，57，pp.1212-1213(1993)]。序列號3表示M巡基因的堿基序列，序列號4表示PgSC基因所編碼的PgsC蛋白質(zhì)的氨基酸序列。另外，本發(fā)明中的M巡基因并不限定于由序列號3所示的堿基序列構(gòu)成的基因，而是包括編碼以下蛋白質(zhì)的基因該蛋白質(zhì)含有在序列號4所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且具有在上述PgsB蛋白質(zhì)的存在下生成PGA的功能。在此，多個是指，例如可以為230個，優(yōu)選為215個，更優(yōu)選為28個，進(jìn)一步優(yōu)選為24個，最優(yōu)選為2個。另外，本發(fā)明中的_基因包括以下基因該基因含有相對于序列號3所示的堿基序列具有80%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別為優(yōu)選99%以上的遺傳一致性的堿基序列，且對具有在上述Eg巡蛋白質(zhì)的存在下生成PGA的功能的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。在此，堿基序列的遺傳一致性的定義與上述相同。另外，本發(fā)明中的_基因包括以下基因該基因在嚴(yán)格條件下與序列號3所示的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交，且對具有在上述Ek^蛋白質(zhì)的存在下生成PGA的功能的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。在此，“嚴(yán)格條件下”的定義與上述相同。另外，所謂在上述Ek盛蛋白質(zhì)的存在下生成PGA的￡￡巡蛋白質(zhì)功能是指，使_基因和DgsC基因一起在宿主微牛物中表汰的時候,在菌體外產(chǎn)牛PGA的能力。具體如下面實(shí)施例及參考例所示，在使ηκ巡基因單獨(dú)表達(dá)的宿主微生物中不產(chǎn)生PGA，而在使_基因和DgsC基因一起表汰的時候則產(chǎn)牛PGA,這是基于本發(fā)明人提出的見解。另一方面，本發(fā)明所涉及的重組微生物并不限定于將上述那樣的來自枯草桿菌的DgsB基因和Dgsc基因?qū)胨拗魑⑴Ｎ?例如也可以在來自枯草桿菌以外的微牛物的PGA合成關(guān)聯(lián)基因所構(gòu)成的基因群中，將與ηκ巡基因相當(dāng)?shù)幕?Μ巡同源基因)以及與_基因相當(dāng)?shù)幕蛲椿?導(dǎo)入宿主微牛物。DgsB同源基因以及DgsC同源基因，可以按照常法由公知的產(chǎn)生PGA的微生物分離和鑒定得到。作為具有PGA產(chǎn)生能力的微生物，除TBacillussubtilis以夕卜，還可以舉出Bacilluslicheniformis、BaciIlusmegaterium、Bacillusanthracis、Bacillushalodurans、Natrialbaaegyptiaca、Hydra等，可以從這㈣微牛物分離和鑒定PRSB同源基因以及DgsC同源基因。例如，可以從上述微生物提取基因組DNA，通過將由上述序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的多核甙酸作為探針的Southern雜交來分離DgsB同源基因。對于M巡同源基因也可以進(jìn)行同樣的分離。并且，隨著近年來基因組測序的迅速發(fā)展，即使是不產(chǎn)生PGA的微生物，也可以基于其基因組序列信息，來分離和鑒定如上述那樣定義的枯草桿菌M盛同源基因。并目.，對于枯草桿菌DgsC同源基因也可以同樣地分離和鑒定。本發(fā)明所涉及的重組微生物通過將上述M盛基因或M盛同源基因、以及M叢基因或M巡同源基因?qū)胨拗魑⑸飦碇圃斓玫?。在此，本發(fā)明中所使用的宿主微生物沒有特別限定，但是，具體而言，可以舉出Bacilluslicheniformis、Bacillusmegaterium、Bacillusanthracis>Bacillushalodurans>Bacillussubtilis等芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌，梭菌(Clostridium)屬細(xì)菌，棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細(xì)菌，大腸桿菌(Escherichiacoli)或酵母等，其中優(yōu)選芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌。并且，從其全基因組信息已明確，且基因工程學(xué)、基因組工學(xué)技術(shù)已確立的觀點(diǎn)，以及作為宿主微生物的安全性及優(yōu)良性已得到認(rèn)可的微生物菌株已開發(fā)的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選枯草桿菌(Bacillussubtilis)。并且，所選擇的宿主細(xì)胞可以使用野生型的細(xì)胞、或?qū)⒁?guī)定的突變導(dǎo)入野生型細(xì)胞而得到的突變株中的任一種。并且，在突變株中，尤其是通過使編碼PGA分解酶的基因(PGA分解酶基因)缺失的突變株作為宿主來使用，可以期待更好的效果。作為枯草桿菌中的PGA分解酶基因，已知的有^rt基因[例如，參照Kimura，K.，etal.Microbiology，150，pp.4115-4123(2004)]。序列號7表示sgi基因的堿基序列，序列號8表示被sgi基因編碼的PGA分解酶的氨基酸序列。另外，在使用枯草桿菌以外的微生物作為宿主的情況下，也優(yōu)選使用與KSi基因相當(dāng)?shù)幕蛞讶笔У耐蛔冎辍Ａ硗?，本發(fā)明中的SSi基因并不限定于由序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的基因，而是包括編碼以下蛋白質(zhì)的基因該蛋白質(zhì)含有在序列號8所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，且編碼具有PGA分解活性的蛋白質(zhì)。在此，所謂多個，例如可以為2120個，優(yōu)選為260個，更優(yōu)選為230個，進(jìn)一步優(yōu)選為215個，最優(yōu)選為28個。另外，本發(fā)明中的SSt基因包括以下基因該基因含有相對于序列號7所示的堿基序列具有80%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別優(yōu)選為99%以上的遺傳一致性的堿基序列，且編碼具有PGA分解活性的蛋白質(zhì)。在此，堿基序列的遺傳一致性的定義與上述同樣。并且，本發(fā)明中的Sgi基因包括以下基因該基因在嚴(yán)格條件下與序列號8所示的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交，且編碼具有PGA分解活性的蛋白質(zhì)。在此，“嚴(yán)格條件下”采用與上述同樣的定義。作為使SSi基因或其同源基因缺失的方法，可以適當(dāng)采用現(xiàn)有公知的手法。例如，將含有部分SSt基因的DNA片段克隆在適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒(載體)上得到環(huán)狀的重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入親本微生物細(xì)胞內(nèi)，利用靶基因的部分區(qū)域中的同源重組，來分割親本微生物基因組上的靶基因并使其失活[例如，參照Leenhouts，K.，etal.:Mol.Gen.Genet.，253，pp.217-224(1996)]。尤其是在使用枯草桿菌作為用于構(gòu)建本發(fā)明微生物的親本微生物的情況下，對于利用同源重組來使靶基因缺失或失活的方法，已有幾個報(bào)道例[例如，參照Itaya，Μ.，Tanaka,Τ.:Mol.Gen.Genet.,223,pp.268-272(1990)]，通過反復(fù)使用該方法，可得到目標(biāo)宿主微生物。另外，作為使隨機(jī)基因失活的方法，還可通過使用突變誘發(fā)劑以及對親本微生物實(shí)施紫外線、Y射線等照射。在這種情況下，除了向M結(jié)構(gòu)基因內(nèi)進(jìn)行堿取代、堿插入或部分缺失等突變導(dǎo)入以外，還可以向啟動子區(qū)域等調(diào)控區(qū)域進(jìn)行同樣的突變導(dǎo)入，或向與M基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行同樣的突變導(dǎo)入，都能獲得同等的效果。并且，作為更有效率的手法，也可以實(shí)施以下手法通過利用S0E(spliCingbyoverlapextension)-PCR法[例如，參照Horton，RM.，etal.:Gene,77,pp.61-68(1989)]構(gòu)建含有_基因的上游、下游區(qū)域、但不含腿t基因的直鏈狀的DNA片段，將該DNA片段插入親本微生物細(xì)胞內(nèi)，在親本微生物基因組上的M基因外側(cè)的兩個位點(diǎn)處發(fā)生雙交換的同源重組，從而使基因組上的M基因缺失(參照圖1)。另外，所選擇的宿主細(xì)胞，可以是原本具有PGA產(chǎn)生能力的微生物，即使是原來不具有PGA產(chǎn)生能力的微生物也可以。即，可以是在染色體(基因組)上具有DgsBCA基因、且具有PGA產(chǎn)生能力的微生物，或是在染色體上具有prsBCA基因、但不具有PGA產(chǎn)生能力的微生物，以及不具有DgsBCA基因的微牛物中的仵意一種。在具有PGA產(chǎn)生能力的微生物中導(dǎo)入上述M盛基因或M盛同源基因、以及M巡基因或M巡同源基因的情況下，PGA產(chǎn)生能力被強(qiáng)化、及/或PGA被高分子量化。另一方面，在不具有PGA產(chǎn)生能力的微生物中導(dǎo)入上述M盛基因或M盛同源基因、以及M巡基因或M巡同源基因的情況下，賦予PGA產(chǎn)生能力。作為宿主細(xì)胞，也可以使用在染色體(基因組)上所具有的枯草桿菌WpgSBCA基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕蛏嫌翁帲ㄟ^導(dǎo)入在微生物中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域及/或翻譯起始調(diào)控區(qū)域等而具有PGA產(chǎn)生能力的微生物。作為在本發(fā)明的宿主微生物中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域及/或翻譯起始調(diào)控區(qū)域(下面稱為“調(diào)控區(qū)域”)，優(yōu)選以適當(dāng)?shù)男问竭B接，最優(yōu)選連接轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域及翻譯起始區(qū)域。所述調(diào)控區(qū)域，更優(yōu)選組成性地表達(dá)所連接的下游基因，并提高該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。作為這樣的調(diào)控區(qū)域，可以舉出芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌來源的α-淀粉酶基因的調(diào)控區(qū)域、蛋白酶基因的調(diào)控區(qū)域、aorE基因的調(diào)控區(qū)域、sdoVG基因的調(diào)控區(qū)域、_基因的調(diào)控區(qū)域、Bacillussp.KSM-S237株的纖維素酶基因的調(diào)控區(qū)域、Staphylococcusaureus來源的卡那霉素抗件基因的調(diào)控區(qū)域、氯霉素抗件基因的調(diào)控區(qū)域等。在DgsBCA基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕虻幕蚪M上的上游講行的所沭調(diào)控區(qū)域的導(dǎo)入，只要取代枯草桿菌的ηκ^Δ基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕虻脑镜恼{(diào)控區(qū)域中的部分或全部即可。所述調(diào)控區(qū)域的取代，例如可以采用公知的同源重組的方法(Mol.Gen.Genet.，223，268，1990記載的方法等)進(jìn)行。例如，首先利用SOE-PCR法(上述)等通常的方法該方法將含有DgsBCA基因的原本的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域的上游區(qū)域的DNA片段、以及耐藥性基因片段連接在含有所涉及的調(diào)控區(qū)域的DNA片段上游處另一方面，將含有pgSBCA基因的翻譯起始調(diào)控區(qū)域和結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的部分或全部、或者PgsBCA基因的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的部分或全部的DNA片段連接在下游處。通過如此，可以得到以下DNA片段該DNA片段是按順序連接含有pgSBCA基因的原本的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域的上游區(qū)域的DNA片段，耐藥性基因片段，含有上述調(diào)控區(qū)域的DNA片段，以及含有pgSBCA基因的翻譯起始調(diào)控區(qū)域和結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的部分或全部、或者PRsBCA基因的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的部分或全部的DNA片段而得到的(參照圖3)。其次，根據(jù)通常的方法將所涉及的DNA片段插入親本微生物細(xì)胞內(nèi)，在親本微生物基因組的PgsBCA基因的本來的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域的上游區(qū)域、以及PgSBCA基因的翻譯起始調(diào)控區(qū)域和結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的部分或全部、或者M(jìn)^SA基因的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的部分或全部的區(qū)域的兩處位置上，發(fā)生雙交換的同源重組。其結(jié)果是，轉(zhuǎn)化體可以采用上述耐藥性基因作為指標(biāo)來分離，其中，該轉(zhuǎn)化體原本的調(diào)控區(qū)域被上述調(diào)控區(qū)域取代。由此，被導(dǎo)入到基因組上的PgsBCA基因上游處的調(diào)控區(qū)域可以保持遺傳穩(wěn)定。另外，本發(fā)明所涉及的重組微生物不將參與PGA合成的基因群中的MM基因?qū)胨拗魑⑸?。序列?表示PgSA基因的堿基序列，序列號6表示被PgSA基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。雖然啟示了被MM基因編碼的蛋白質(zhì)是參與將PGA排出到菌體外的蛋白質(zhì)(例如，參照非專利文獻(xiàn)5)，但是迄今為止其功能尚不明確。另一方面，本發(fā)明所涉及的重組微生物，其具有的特征為無論是否導(dǎo)入^sM基因，PGA的產(chǎn)生能力都出色。本發(fā)明中的nsM基因并不限定于由序列號5所示的堿基序列構(gòu)成的基因，而是包括編碼以下蛋白質(zhì)的基因該蛋白質(zhì)含有在序列號6所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，且被推定為與EK盛和E^—起具有PGA合成活性的蛋白質(zhì)。在此，多個是指，例如可以為280個，優(yōu)選為240個，更優(yōu)選為220個，進(jìn)一步優(yōu)選為210個，最優(yōu)選為25個。另外，本發(fā)明中的ηκΜ基因包括，含有相對于序列號5所示的堿基序列具有80%以上、優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別優(yōu)選為99%以上的遺傳一致性的堿基序列，且對被推定為與Eg盛和一起具有PGA合成活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。在此，堿基序列的遺傳一致性的定義與上述相同。并且，在本發(fā)明中的基因包括以下基因該基因在嚴(yán)格條件下與序列號5所示的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交，且對被推定為與Ek巡和￡￡巡一起具有PGA合成活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。在此，“嚴(yán)格條件下”采用與上述同樣的定義。在此，“不將膽M基因?qū)胨拗魑⑸铩笔侵?，不?dǎo)入對PGA合成過程中發(fā)揮作用的EkM蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因。因此，本發(fā)明的技術(shù)范圍中也包括即使導(dǎo)入與序列號5所示的基因具有很高的遺傳一致性的基因，但是該基因沒有表達(dá)的情況，或是由該基因表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在PGA合成過程中不發(fā)揮作用的情況。另外，本發(fā)明所渉及的重組微牛物，優(yōu)詵上沭DgsB基因或DgsB同源基因、以及_基因或_同源基因在其上游處連接有在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用、且表達(dá)受正調(diào)控的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域、翻譯起始調(diào)控區(qū)域。所述調(diào)控區(qū)域，更優(yōu)選使所連接的下游基因表達(dá)，并能夠提高該基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，特別優(yōu)選使下游基因組成性表達(dá)或/及高表達(dá)。作為這樣的調(diào)控區(qū)域，可以舉出芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌來源的α-淀粉酶基因的調(diào)控區(qū)域、蛋白酶基因的調(diào)控區(qū)域、aprE基因的調(diào)控區(qū)域、spoVG基因的調(diào)控區(qū)域、rapA基因的調(diào)控區(qū)域、Bacillussp.KSM-S237株的纖維素酶基因的調(diào)控區(qū)域、Staphylococcusaureus來源的卡那霉素抗性基因的調(diào)控區(qū)域、氯霉素抗性基因的調(diào)控區(qū)域等，但是沒有特別限定。序列號9表示作為上述Bacillussp.KSM-S237株的纖維素酶基因調(diào)控區(qū)域的、來源于纖維素酶基因的翻譯起始點(diǎn)上游0.41.Okb區(qū)域的調(diào)控區(qū)域的堿基序列。另外，所述調(diào)控區(qū)域并不限定于序列號9所示的堿基序列，例如可以為相對于序列號9所示的堿基序列具有70%以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別優(yōu)選為99%以上的遺傳一致性的堿基序列。在此，堿基序列的遺傳一致性采用與上述相同的定義。另外，序列號10表示枯草桿菌來源的spoVG基因(BG10112)的上述調(diào)控區(qū)域的堿基序列。作為上述調(diào)控區(qū)域并不限定于序列號10所示的堿基序列，例如可以為相對于序列號10所示的堿基序列具有70%以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別優(yōu)選為99%以上的遺傳一致性的堿基序列。在此，堿基序列的遺傳一致性采用與上述相同的定義。并且，序列號11表示枯草桿菌來源的rapA基因(BG10652)的上述調(diào)控區(qū)域的堿基序列。另外，所述調(diào)控區(qū)域并不限定于序列號11所示的堿基序列，例如可以為相對于序列號11所示的堿基序列具有70%以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為96%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為97%以上、最優(yōu)選為98%以上、特別優(yōu)選為99%以上的遺傳一致性的堿基序列。在此，堿基序列的遺傳一致性采用與上述相同的定義。在將上述M盛基因或M盛同源基因、以及M巡基因或M巡同源基因?qū)胨拗魑⑸锏臅r候，可以使用通常的質(zhì)粒(載體)。另外，可以根據(jù)基因?qū)雽ο蟮乃拗魑⑸锏姆N類來適當(dāng)選擇質(zhì)粒。在將枯草桿菌作為宿主的情況下，例如，可以舉出PT181、pC194、pUBllO、pE194、pSN2、pHY300PLK等。所選擇的質(zhì)粒，優(yōu)選在宿主細(xì)胞內(nèi)可以自我復(fù)制的質(zhì)粒，更優(yōu)選其質(zhì)粒為多拷貝。并且，其質(zhì)粒的拷貝數(shù)相對于宿主基因組(染色體)為2以上且100拷貝以下即可，優(yōu)選為2以上且50拷貝以下，更優(yōu)選為2以上且30拷貝以下即可。另外，在利用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，可以應(yīng)用通常的手法，例如原生質(zhì)體法[例如，參照Chamg,S.,Cohen,SH.:Mol.Gen.Genet.,168,pp.111-115(1979)]或感受態(tài)細(xì)胞法[例如，參照Young，F(xiàn)E.，Spizizen,J.J.Bacteriol.，86，pp.392-400(1963)]。通過使用以上已說明的本發(fā)明所涉及的重組微生物，能夠以出色的產(chǎn)生能力制造PGA0所制造的PGA可以用于化妝品、醫(yī)藥品、食品、水質(zhì)凈化劑、保水材料、增粘劑等各種用途中。特別是在本發(fā)明所涉及的重組微生物中，與現(xiàn)有的基因重組技術(shù)中的PGA產(chǎn)生法相比較，具有出色的產(chǎn)生能力，因此能夠大幅降低在上述用途中利用的PGA的生產(chǎn)成本。特別是，在使用本發(fā)明所涉及的重組微生物來制造PGA的時候，首先，在恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)該重組微生物，從培養(yǎng)基回收產(chǎn)生在菌體外的PGA。作為培養(yǎng)基，可以使用含有下述組分的培養(yǎng)基，下述組分為甘油、葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯糖和各種有機(jī)酸等碳源；各種氨基酸、多聚蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨和尿素等氮源；鈉鹽等無機(jī)鹽類；以及其他必要的營養(yǎng)源；微量金屬鹽等。另外，作為培養(yǎng)基可以是合成培養(yǎng)基，也可以是天然培養(yǎng)基。特別是，為了使PGA的產(chǎn)生能力提高，優(yōu)選使用添加了谷氨酸的培養(yǎng)基，其中谷氨酸的量較作為培養(yǎng)對象的重組微生物生長所必需的谷氨酸的量為過量。具體而言，培養(yǎng)基中優(yōu)選添加谷氨酸鈉，其濃度例如可以為0.005600g/L，優(yōu)選為0.05500g/L，更優(yōu)選為0.1400g/L，最優(yōu)選為0.5300g/L。在培養(yǎng)基中的谷氨酸鈉濃度過低的情況下，培養(yǎng)基中的谷氨酸被重組微生物的生長所消耗，會有PGA的產(chǎn)生能力無法提高的擔(dān)憂。另外，在培養(yǎng)基中的谷氨酸濃度過高的情況下，由于超過谷氨酸鈉的飽和溶解度，會有產(chǎn)生谷氨酸鈉和其他培養(yǎng)基成分析出的問題的擔(dān)憂。在回收培養(yǎng)基中積累的PGA的時候，必須除去產(chǎn)生PGA的微生物菌體，進(jìn)行該操作可以舉出憑借離心分離的方法、使用超濾膜的方法、電滲析法、將PH維持在PGA的等電點(diǎn)附近使其沉淀來進(jìn)行回收的方法等，并且也可以組合使用上述手法。如上操作，從而能夠通過利用本發(fā)明所涉及的重組微生物來進(jìn)行PGA的制造。而且，如后述的實(shí)施例所示，本發(fā)明所涉及的重組微生物表示出1.5g/L以上的高產(chǎn)生能力，與利用現(xiàn)有公知的基因重組技術(shù)的產(chǎn)生PGA的微生物相比較，本發(fā)明的重組微生物導(dǎo)入了枯草桿菌的M盛基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颉⒁约翱莶輻U菌的M叢基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?，并且，沒有導(dǎo)入枯草桿菌的MM基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颍琍GA產(chǎn)生能力出色，因而可用于PGA的工業(yè)生產(chǎn)。如后述實(shí)施例所示，如果在賦予了PGA產(chǎn)生能力的微生物中導(dǎo)入枯草桿菌的prsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颉⒁约癉gsC基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?，則能夠使PGA高分子化；因而，如果在賦予了PGA產(chǎn)生能力的微生物中導(dǎo)入上述基因，則能夠調(diào)整PGA的分子量；進(jìn)而，如果使用所得到的重組微生物，則能夠高效地制造具有所希望的分子量的PGA。特別是，在使用prsBCA基因的上游的調(diào)控區(qū)域連接有上述Bacillussp.KSM-S237株的纖維素酶基因的調(diào)控區(qū)域的微生物的情況下，能夠產(chǎn)生重均分子量約7，000,0007，800,000的高分子PGA；如果在該微生物中導(dǎo)入枯草桿菌的M盛基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?，則能夠調(diào)整PGA的分子量，使PGA高分子化至優(yōu)選為110115%。另外，在使用prsBCA基因上游的調(diào)控區(qū)域連接有上述_基因的調(diào)控區(qū)域的微生物來作為宿主細(xì)胞的情況下，則能夠產(chǎn)生重均分子量約590,000600,000的中分子PGA;如果在該微生物中導(dǎo)入枯草桿菌的_基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及μ巡基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颍瑒t能夠調(diào)整PGA的分子量，使PGA高分子化至優(yōu)選為1，2001，600%。并目.，通過在不具有PGA產(chǎn)牛能力的微牛物中導(dǎo)入枯草桿菌的DgsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颉⒁约盎蚧蚺c該基因相當(dāng)?shù)幕?，則能夠使L-谷氨酸的含有率優(yōu)選為80%以上，更優(yōu)選為90%以上。而且，根據(jù)本發(fā)明，能夠制造光學(xué)純度高的PGA(例如，光學(xué)純度優(yōu)選為80100%，更優(yōu)選為90100%)。本發(fā)明所涉及的重組微生物，能夠適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生根據(jù)各種用途而分子量有所不同的PGA，而且能夠大幅降低用于各種用途的PGA的產(chǎn)生成本，并且由于能夠產(chǎn)生光學(xué)純度高的PGA,因而也可用于PGA的工業(yè)生產(chǎn)。實(shí)施例下面，采用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于下列實(shí)施例。表1中一并示出了本實(shí)施例中使用的引物的名稱、其序列以及序列號。另外，在表1所示的堿基序列中，下劃線的部分表示添加的限制酶識別序列。表1基序列序列號pgsB-FATTTAGGAGGTAATATGATGTGGTTACTCATTATAGCCTG12pgsA-RCGAAGCTTAGATGGCTTTGACAAATTTCATC13pgsC-RCCCAAGCTTGACCTTCGGCGTTTCCGCT14pgsB-RCCCAAGCTTGGCAGCGAATTTTCTGCGTCC15P—S237-FWCAACTAAAGCACCCATTAGGGATCCAACAGGCTTATATTTAGAG16P—S237-RVCATCATATTACCTCCTAAATATTTTTAAAGTA17ggt-FTCCTTCATGTCTTTCGTATA18ggt/Cm-RCTAATGGGTGCTTTAGTTGGTTCTCCCTCCTATATGAA19ggt/Cm-FCTGCCCCGTTAGTTGAAGATAAAAAACTGTACTCGCTTC20ggt-RTAGCCAATATCACTTTTCATC21<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>〔制造例1〕載體的構(gòu)建(1)本制造例表示參與PGA合成的基因群的克隆方法(參照圖1)。首先，將由Bacillussp.KSM-366株(FERMBP-6262)制備的染色體DNA作為模板，使用表1所示的pgsB-F(序列號12)和pgsA-R(序列號13)的引物對，制備DgsBCA基因2.9kb的DNA片段(A)。另外，序列號47表示Bacillussp.KSM-366株的膽盛基因的堿基序列，序列號48表示上述膽盛基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，序列號49表示_基因的堿基序列，序列號50表示上述_基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，序列號51表示^kM基因的堿基序列，序列號52表示上述ηκΜ基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。另外，使用表1所示的PgsB-F和pgsC-R(序列號14)的引物對，制備膽巡C基因1.7kb的DNA片段(B)。講而，將由Bacillussp.KSM-S237株(FERMBP-7875)制備的染色體DNA作為模板，使用表1所示的P_S237-FW(序列號16)和P_S237_RV(序列號17)的引物對，制備來自KSM-S237株的纖維素酶基因(參照日本特開2000-210081號公報(bào))啟動子區(qū)域0.6kb的DNA片段(C)。其次，將所得到的片段㈧和(C)作為模板，使用P_S237-FW和PgsA-R的引物對，按照SOE-PCR法得到含有㈧和(C)片段的3.5kb的DNA片段(AC)。同樣地，將片段(B)和(C)作為模板，使用P_S237-FW和pgsC-R的引物對，按照SOE-PCR法得到含有⑶和(C)片段的2.3kb的DNA片段(BC)。分別用限制酶MmHI及一111來對這些DNA片段(AC)和(BC)進(jìn)行限制酶處理，使用已實(shí)施了同樣的限制酶處理的質(zhì)粒載體pHY300PLK(Takara)和DNALigationkitVer.2(Takara)進(jìn)行連接反應(yīng)(結(jié)合化)。使用上述連接試料，按照感受態(tài)細(xì)胞法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(HB101株)，將在添加有15ppm四環(huán)素-鹽酸鹽(SIGMA-ALDRICH)的LB瓊脂培養(yǎng)基(LBTc瓊脂培養(yǎng)基)上出現(xiàn)的菌落作為轉(zhuǎn)化體。再使所得到的轉(zhuǎn)化體在LBTc瓊脂培養(yǎng)基中生長，采用高純度質(zhì)粒分離試劑盒(HighPurePlasmidIsolationKit)(RocheDiagnostics)由所得到的菌體制備重組質(zhì)粒。用限制酶MmHI及HMIII對這些重組質(zhì)粒進(jìn)行限制酶處理，根據(jù)電泳法確認(rèn)在質(zhì)粒載體上的BamHI及HindIII限制酶識別部位上插入作為目標(biāo)的上述DNA片段(AC)和(BC)。在本制造例中，將已確認(rèn)插入了DNA片段(AC)和(BC)的重組質(zhì)粒分別作為用于產(chǎn)生PGA的重組載體pHY-P_S237/pgsBCA、pHY-P_S237/pgsBC。另外，采用GeneAmp9700(ΡΕAppliedBiosystems)和TaKaRaLATaq(Takara)，按照試劑盒中附加的操作規(guī)范來實(shí)施PCR反應(yīng)。〔制造例2〕載體的構(gòu)建(2)本制造例表示參與PGA合成的基因群的克隆方法(參照圖3)。首先，將由BacillussubtilisMarburgNo.168株(枯草桿菌168株)制備的染色體DNA作為模板，使用表1所示的P_spoVGFW2(序列號24)和P_spoVG/CmR(序列號25)的引物對，制備上游側(cè)0.9kb的DNA片段(spoVG-UP)，用于在spoVG基因ORF大約0.6kb上游處插入來源于質(zhì)粒PC194[例如，參照Horinouchi，S.，Weisblum，B.J.Bacteriol.，150，pp.815-825(1982)]的氯霉素抗性基因(Cmr)。同樣地，使用表1所示的P_spoVG/CmF與(序列號26)P_spoVGRV(序列號27)的引物對，制備下游側(cè)0.6kb的DNA片段(spoVG-DW)(此時P_spoVGRV的引物被設(shè)計(jì)成將spoVG基因ORF的起始密碼子gtg改變?yōu)閍tg)。另夕卜，將質(zhì)粒PC194作為模板，使用表1所示的comp_CmFW(序列號28)和comp_CmRV(序列號29)的引物對，制備氯霉素抗性基因0.9kb的DNA片段(Comp_Cm)。其次，將所得到的片段(spoVG-UP)、(spoVG-DW)和(Comp_Cm)作為模板，使用P_spoVGFW2和P_spoVGRV的引物對，按照SOE-PCR法得到連接上述3種片段而成的2.4kb的DNA片段(Cm-P_spoVG)。并且，使用上述操作得到的DNA片段，根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞法(上述)進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化，將在已添加IOppm氯霉素(SIGMA-ALDRICH)的LB瓊脂培養(yǎng)基(LBCm瓊脂培養(yǎng)基)上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離。其次，將從所得到的轉(zhuǎn)化體提取的基因組DNA作為模板，使用表1所示的Comp_CmFff和P_spoVGRV的引物對，按照PCR法制備由氯霉素抗性基因和spoVG基因啟動子區(qū)域構(gòu)成的1.5kb的DNA片段(P-spoVG_Cm2)。并且，使用comp_P_spoVGR/BSpgsBatgFW(序列號30)和pgsCFW(序列號31)的引物對，將從枯草桿菌168株制備的基因組DNA作為模板，按照PCR法制備膽巡基因1.2kb的DNA片段(膽巡1)，使用pgsB/CmF(序列號32)和pgsBRV(序列號33)的引物對，制備膽巡基因ORF上游側(cè)1.Ikb的DNA片段(pgsB-UP)。并且，將所得到的上述(PgsBl)、(P-spoVG-Cm2)以及(pgsB-UP)的3片段作為模板，使用pgsCFff和pgsBRV的引物對，根據(jù)SOE-PCR法制備3.6kb的DNA片段。接著，使用上述操作得到的DNA片段，按照感受態(tài)細(xì)胞法進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化，將LBCm瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離(下面，將所得到的重組枯草桿菌作為lCp-P_SpoVG/pgSBCACm株)。將從得到的轉(zhuǎn)化體提取的基因組DNA作為模板，使用PgsC-R和BamHI_PspoVGFW(序列號34)的引物對,制備在枯草桿菌DgsBC基因的上游處具有枯草桿菌sdoVG基因啟動子的2.3kb的DNA片段(P_sp0VG/pgsBC)。并且，按照與制造例1同樣順序，將所得到的DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上，將得到的用于產(chǎn)生PGA的重組載體作為pHY-P_spoVG/pgsBC?！仓圃炖?〕載體的構(gòu)建(3)本制造例，與制造例2同樣地表示參與PGA合成的基因群的克隆方法(參照圖3)。將從枯草桿菌168株制備的染色體DNA作為模板，使用表1所示的rapAFW(序列號35)和P_rapA/CmR(序列號36)的引物對，制備上游側(cè)0.5kb的DNA片段(rapA-UP)，用于在_基因ORF大約0.5kb上游處插入來源于質(zhì)粒pC194的氯霉素抗性基因。同樣地，使用表1所示的P_rapA/CmF(序列號37)和P_rapARV(序列號38)的引物對，制備下游側(cè)0.5kb的DNA片段(rapA-DW)(此時P_rapARV的引物被設(shè)計(jì)成將_基因ORF的起始密碼子ttg改變?yōu)閍tg)。其次，將所得到的片段(rapA-UP)、(rapA-DW)以及制造例2中制備的DNA片段(comp_Cm)作為模板，使用rapAFW和P_rapARV的引物對，按照SOE-PCR法得到連接上述3片段而成的1.9kb的DNA片段(Cm-P_rapA)。并且，使用上述操作得到的DNA片段，根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞法進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化，將LBCm瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離。其次，將從所得到的轉(zhuǎn)化體提取的基因組DNA作為模板，使用表1所示的Comp_CmFW和P_rapARV的引物對，根據(jù)PCR制備由氯霉素抗性基因和rapA基因啟動子區(qū)域構(gòu)成的1.4kb的DNA片段(P-rapA_Cm2)。另外，使用comp_P_rapAR/BSpgsBatgFff(序列號39)和pgsCFff的引物對，將從枯草桿菌168株制備的基因組DNA作為模板，根據(jù)PCR制備μ盛基因1.2kb的DNA片段(pgsB2)。并且，將所得到的上述(pgsB2)、(P-rapA-Cm2)以及制造例2中制備的DNA片段(pgsB-UP)3片段作為模板，使用pgsCFff和pgsBRV的引物對，根據(jù)SOE-PCR制備3.5kb的DNA片段。接著，使用按照與制造例2同樣的順序得到的DNA片段，根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞法進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化(下面，將得到的重組枯草桿菌作為lcp-PjapA/pgaBCAcm株)。從所得到的轉(zhuǎn)化體制備基因組DNA，將該基因組DNA作為模板，使用pgsC-R和BamHI_PrapAFff(序列號40)的引物對，制備在枯草桿菌基因的上游處具有枯草桿菌X^A基因啟動子的2.2kb的DNA片段(P_rapA/pgsBC)。并且，按照與制造例1同樣的順序?qū)NA片段克隆到質(zhì)粒載體上，將所得到的重組質(zhì)粒作為用于產(chǎn)生PGA的重組載體pHY-P_rapA/pgSBC。〔制造例4〕載體的構(gòu)建(4)本制造例，與制造例2同樣地表示參與PGA合成的基因群的克隆方法(參照圖4)。將制造例1中制備的pHY-P_S237/pgsBCA作為模板，使用表1所示的pgsC-R和tet4_l(序列號41)的引物對，制備質(zhì)粒上含有四環(huán)素抗性基因(Tet1O、且在上游處具有S237纖維素酶啟動子序列的DgsB基因DNA片段3.3kb(tet-P_B)。另外，將從枯草桿菌168株制備的染色體DNA作為模板，使用tet4-l_COmp/pgSBFff(序列號42)和pgsBRV的引物對，制備枯草桿菌基因組上的PRsBCA基因的上游1.Okb的DNA片段(pgsB-DWl)。將上述片段(tet_P_B)和(pgsB-DWl)作為模板，使用pgsC-R和pgsBRV的引物對，按照SOE-PCR法連接2片段，得到DNA片段(tet_P_S237)，該DNA片段用于取代枯草桿菌某因纟目卜.的DgsBCA某因橾縱子的卜.游啟動子。并且，用所得到的DNA片段(tet-P_S237)按照感受態(tài)細(xì)胞法進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化，將LBTc瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離。另外，從所得到的轉(zhuǎn)化體提取基因組DNA，將其作為模板，根據(jù)PCR確認(rèn)該轉(zhuǎn)化體是在DgsBCA基因操縱子上游導(dǎo)入S237纖維素酶啟動子的枯草桿菌突變株(下面作為lcp-P_S237/pgsBCAtet株)。其次，將從Bacillussp.KSM-S237株(FERMBP-7875)制備的染色體DNA作為模板，使用P_S237-RV和P_S237-F的引物對，根據(jù)PCR法制備S237纖維素酶啟動子區(qū)域大約0.6kb的DNA片段(PS237-Cm)。另外，將質(zhì)粒pC194作為模板，使用P_S237_Comp/CmFff(序列號43)和CmRV(序列號23)的引物對，制備氯霉素抗性基因0.9kb的DNA片段(Cm-PS237)。接著，混合上述DNA片段(PS237-Cm)、(Cm_PS237)以及在后述制造例6中制備的DNA片段(BCA-UP)作為模板，使用P_S237-RV和pgsBRV的引物對，根據(jù)SOE-PCR得到3.2kb的DNA片段。使用該得到的DNA片段，根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞法對枯草桿菌突變株(lcp-P_S237/PRsBCAtet)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將LBCm瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離(下面將得到的轉(zhuǎn)化體作為lcp-P_S237/pgsBCAcm株)。其次，將從得到的轉(zhuǎn)化體制備的染色體DNA作為模板，使用pgsC-R和pC194CmRV/HindIIIRV(序列號44)的引物對，制備含有氯霉素抗性基因、且在上游處具有S237纖維素酶啟動子序列的M^S基因片段3.4kb。將得到的DNA片段精制、回收后，用限制酶HindIII進(jìn)行處理，使用進(jìn)行了同樣的限制酶處理的質(zhì)粒載體PHY300PLK和DNALigationkitVer.2進(jìn)行連接反應(yīng)(結(jié)合化)。采用上述連接試料，按照原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化枯草桿菌168株，將已添加了氯霉素5ppm的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基(DM3培養(yǎng)基)上出現(xiàn)的菌落作為轉(zhuǎn)化體。再使所得到的轉(zhuǎn)化體在LBCm瓊脂培養(yǎng)基中生長，采用高純度質(zhì)粒分離試劑盒從得到的菌體制備質(zhì)粒，將所得到的質(zhì)粒作為用于產(chǎn)生PGA的重組載體pHY-P_S237/pgsBC-Cm?！仓圃炖?〕枯草桿菌突變體的制作(1)本制造例表示用于導(dǎo)入制造例1中得到的載體的枯草桿菌突變株的制作方法(參照圖2)。首先，將從枯草桿菌168株制備的基因組DNA作為模板，使用表1所示的ggt-F(序列號18)和ggt/Cm-R(序列號19)的引物對、以及ggt/Cm_F(序列號20)和ggt_R(序列號21)的引物對，分別制作鄰接基因組上的Μ基因上游處的1.Okb的DNA片段(D)和鄰接下游處的1.Okb的DNA片段(E)。另一方面，將質(zhì)粒pC194作為模板，使用表1所示的CmFW(序列號22)和CmRV的引物對，制備含有氯霉素抗性基因的0.9kb的DNA片段(F)。其次，混合所得到的3個DNA片段⑶、(E)和(F)作為模板，使用ggt_F和ggt_R的引物對，按照SOE-PCR法按(D)-(F)-(E)的順序連接3片段，得到用于基因缺失的2.9kb的DNA片段。其次，用該DNA片段，根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞法進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化，將LBCm瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離。并且，從所得到的轉(zhuǎn)化體提取基因組DNA，將其作為模板，根據(jù)PCR確認(rèn)該轉(zhuǎn)化體是基因的結(jié)構(gòu)基因(ORF)被氯霉素抗性基因(片段F)取代的目標(biāo)枯草桿菌突變株(下面作為△ggt株)?！仓圃炖?〕枯草桿菌突變株的制作(2)本制造例表示用于導(dǎo)入制造例1中得到的載體的枯草桿菌突變株的制作方法(參照圖2)。首先，將從枯草桿菌168株制備的基因組DNA作為模板，分別使用表1所示的pgsAFW(序列號45)和pgsA/CmR(序列號46)的弓I物對，制作與基因組上的PgsBCA基因下游處鄰接的1.Okb的DNA片段(BCA-UP)，進(jìn)而使用pgsB/CmF和pgsBRV的引物對，制作與基因組上的PrsBCA基因上游處鄰接的1.Okb的DNA片段(BCA-DW2)。其次，混合所得到的DNA片段(BCA-UP)、(BCA-DW2)以及制造例5中制備的DNA片段(F)作為模板，使用pgsAFff和pgsBRV的引物對，按照S0E-PCR按(BCA-UP)-(F)-(BCA-DW2)的順序連接3片段，得到用于基因缺失的2.9kb的DNA片段。其次，使用該基因缺失用DNA片段，根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞法進(jìn)行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化，將LBCm瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分離。并且，從所得到的轉(zhuǎn)化體提取基因組DNAJf其作為模板，根據(jù)PCR確認(rèn)該轉(zhuǎn)化體是prsBCA基因操縱子被氯霉素抗件基因(片段F)取代的目標(biāo)枯草桿菌突變株(下面作為ABCA株)?！仓圃炖?〕導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行的轉(zhuǎn)化本制造例表示成為宿主的枯草桿菌株及其突變株、其他芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化法。針對枯草桿菌(BacillussubtilisMarburgNo.168株、NCIMBl1623株及IF03215株)、制造例5中制造的枯草桿菌突變株(Aggt株)、制造例6中制造的枯草桿菌突變株(ABCA株)、制造例4中制造的lcp-P_S237/pgsBCAcm株以及制造例3中制造的lcp_P_rapA/pRsBCAcm株、以及BacillusmeRateriumATCC14581株及WH320株，采用制造例1、2禾口3中得到的用于產(chǎn)生PGA的重組載體(pHY-P_S237/pgsBCA、pHY_P_S237/pgsBC、pHY_P_spoVG/pgsBC及pHY-P_rapA/pgsBC、以及調(diào)控載體(pHY300PLK)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對于從上述野生株及突變體通過溶菌酶處理制備而成原生質(zhì)體IO5IO6個，提供上述質(zhì)粒DNA20IOOng,從而進(jìn)行質(zhì)粒導(dǎo)入。選出在添加有四環(huán)素_鹽酸鹽20ppm的DM3原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基(DM3培養(yǎng)基)上生長的菌落作為導(dǎo)入了質(zhì)粒的目標(biāo)枯草桿菌轉(zhuǎn)化體。在BacilluslicheniformisATCC9945a株中，使用制造例4中得到的用于產(chǎn)生PGA的重組載體(pHY-P_S237/pgsBC-Cm)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用添加了15ppm氯霉素的DM3原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基(DM3培養(yǎng)基)，選出在再生培養(yǎng)基上生長的菌落作為導(dǎo)入了質(zhì)粒的目標(biāo)轉(zhuǎn)化體?！矊?shí)施例1〕產(chǎn)生能力評價(1)將制造例7中制備的在枯草桿菌168株中導(dǎo)入pHY-P_S237/pgsBCA或pHY_P_S237/pgsBC而得到的轉(zhuǎn)化體分別接種到LBTc瓊脂培養(yǎng)基上，在30°C下靜置培養(yǎng)一晚之后，將該LBTc瓊脂培養(yǎng)基上生長的枯草桿菌轉(zhuǎn)化體在已預(yù)先殺菌的2.OmL的微量離心管內(nèi)，在可有0.81.6mL改變的2xL/麥芽糖培養(yǎng)基(triptone2.O%、酵母提取物1.0%、氯化鈉1.0%、麥芽糖7.5%、7.5ppm硫酸錳4_5水合物、15ppm四環(huán)素-鹽酸鹽)中進(jìn)行攪拌/懸浮，靜置之后將上清液作為種培養(yǎng)液。將該種培養(yǎng)液以(ν/ν)接種到新的可變2xL/麥芽糖培養(yǎng)基中，在Sakaguchi燒瓶中，在37°C、120rpm下往復(fù)振蕩培養(yǎng)3天(TB-20R-3F，高崎科學(xué)機(jī)器)。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表2所示，與作為對照的導(dǎo)入了PgsBCA基因的菌株相比較，導(dǎo)入了pgSBC基因的菌株具有更高的PGA產(chǎn)生能力。〔實(shí)施例2〕產(chǎn)生能力評價(2)將制造例7中制備的在枯草桿菌168株中導(dǎo)入pHY-P_S237/pgsBCA或pHY_P_S237/pgsBC而得到的轉(zhuǎn)化體分別接種到LBTc瓊脂培養(yǎng)基上，在30°C下靜置培養(yǎng)一晚之后，在可變的2xL/麥芽糖+MSG培養(yǎng)基(triptone2.0%、酵母提取物1.0%、氯化鈉1.0%、麥芽糖7.5%、8.0%谷氨酸鈉一水合物、7.5ppm硫酸錳4_5水合物、15ppm四環(huán)素-鹽酸鹽)進(jìn)行攪拌/懸浮，靜置之后將上清液作為種培養(yǎng)液。將該種培養(yǎng)液以(ν/ν)接種到新的可變2xL/麥芽糖+MSG培養(yǎng)基中，在Sakaguchi燒瓶中，在37°C、120rpm下往復(fù)振蕩培養(yǎng)3天(TB-20R-3F,高崎科學(xué)機(jī)器)。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表3所示，可知在培養(yǎng)基中含有過量的谷氨酸的情況下，PGA的產(chǎn)生能力尤其得到提高。并且，可知在培養(yǎng)基中含有過量的谷氨酸的情況下，即使從培養(yǎng)開始3日后PGA的產(chǎn)生能力也不降低，表現(xiàn)出較高的值?！矊?shí)施例3〕產(chǎn)生能力評價(3)對制造例7中制備的在枯草桿菌168株以及制造例5中制造的枯草桿菌突變株(ΔΜ株)中導(dǎo)入DHY-PS237/prsBC而得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例1同樣的順序進(jìn)行PGA產(chǎn)生能力評價。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表4所示，可知在將Aggt株作為宿主的情況下，與將作為野生株的枯草桿菌168株作為宿主的情況相比較，其PGA產(chǎn)生能力出色，且即使從培養(yǎng)開始3日后也能夠維持較高的產(chǎn)生能力?！矊?shí)施例4〕產(chǎn)生能力評價(4)對制造例7中制備的在枯草桿菌168株以及制造例6中制造的枯草桿菌突變株株)中導(dǎo)入pHY-P_S237/pgsBC得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例1同樣的順序進(jìn)行PGA產(chǎn)生能力評價。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表5所示，不但是在枯草桿菌168株中，而且在ABCA株中都能獲得較高的PGA產(chǎn)生能力，其中，枯草桿菌168株不具有PGA產(chǎn)生能力，但在染色體上具有prsBCA基因，而ΔBCA株缺失了pgsBCA基因?！矊?shí)施例5〕產(chǎn)生能力評價(5)對制造例7中制備的在枯草桿菌168株中導(dǎo)入pHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_spoVG/pgsBC、或pHY-P_rapA/pgSBC而得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例2同樣的順序進(jìn)行PGA產(chǎn)生能力評價。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表6所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表6所示，不僅通過使用S237纖維素酶啟動子，而且通過使用枯草桿菌來源的sdoVG基因和_基因啟動子，導(dǎo)入了具有PRsBC基因的用于產(chǎn)生PGA的重組載體的枯草桿菌轉(zhuǎn)化體也能獲得較高的PGA產(chǎn)生能力。〔實(shí)施例6〕產(chǎn)生能力評價(6)對制造例7中制備的在枯草桿菌(NCIMB11623株及IF03215株)中導(dǎo)入pHY_P_S237/pgsBC而得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例2同樣的順序進(jìn)行PGA產(chǎn)生能力評價。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表7所示，可知不僅是在枯草桿菌168株中，而且在其他的枯草桿菌中導(dǎo)入只具有prsBC基因的用于PGA產(chǎn)生的重組載體，也能夠產(chǎn)生PGA。〔實(shí)施例7〕產(chǎn)生能力評價(7)對制造例7中制備的在BacilluslicheniformisATCC9945a株中導(dǎo)入了pHY_P_S237/PRsBC-Cm而得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例2同樣的順序進(jìn)行PGA重組產(chǎn)生能力評價(所使用的抗生素從15ppm四環(huán)素變更為5ppm氯霉素)。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表8所示，可知不僅是在枯草桿菌中，而且在其他的芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌中導(dǎo)入具有膽迴基因的用于PGA產(chǎn)生的重組載體，PGA的產(chǎn)生能力也得到提高?！矊?shí)施例8〕產(chǎn)生能力評價(8)分別對制造例7中制備的在BacillusmegateriumATCC14581株中導(dǎo)入了pHY_P_spoVG/pgsBC而得到的轉(zhuǎn)化體、以及制造例7中制備的在BacillusmegateriumWH320株中導(dǎo)入了pHY-P_S237/pgsBC而得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例2同樣的順序進(jìn)行PGA重組產(chǎn)生能力評價。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量，評價結(jié)果如表9所示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表9所示，可知不僅是在枯草桿菌中，而且在其他的芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌中導(dǎo)入只具有膽迴基因的用于PGA產(chǎn)生的重組載體，PGA產(chǎn)生能力得到提高?！矊?shí)施例9〕產(chǎn)生能力評價(9)(分子量評價)對制造例7中制備的、在制造例3及4所制造的lCp-P_rapA/pgSBCACm株以及l(fā)cp-P_S237/pgsBCAcm株中導(dǎo)入了pHY_P_S237/pgsBC而得到的轉(zhuǎn)化體，采用與實(shí)施例2同樣的順序進(jìn)行PGA重組產(chǎn)生能力評價。評價培養(yǎng)結(jié)束后，在下面測定例所示的分析條件下測定PGA產(chǎn)生量及分子量，評價結(jié)果如表10及11表示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表10所示，確認(rèn)在產(chǎn)牛PGA的枯草桿菌突變體中導(dǎo)入R具有DgsBC基因的用于PGA產(chǎn)生的重組載體，與基因?qū)肭跋啾容^，其PGA產(chǎn)生能力得到提高。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表11所示，確認(rèn)在產(chǎn)生PGA的枯草桿菌突變體中導(dǎo)入R具有DgsBC基因的用于PGA產(chǎn)生的重組載體，與基因?qū)肭跋啾容^，其所產(chǎn)生的PGA得到高分子量化?！矞y定例〕PGA的定量及分子量測定法將實(shí)施例19所示的評價培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液試料，在室溫下以14，SOOrpm進(jìn)行離心分離(商品名稱himacCF15RX，日立工機(jī))30分鐘，對離心分離所得到的培養(yǎng)液的上清液中的重組PGA產(chǎn)生量進(jìn)行測定。上清液試料中的PGA檢出按照Yamaguchi等人的方法(上述)，將試料供給瓊脂糖凝膠電泳之后，進(jìn)行亞甲基藍(lán)的凝膠染色，根據(jù)有無來源于PGA的染色物質(zhì)來確認(rèn)重組PGA的產(chǎn)生。并且，對于已檢出重組PGA的試料，采用TSKGelG4000PWXL以及TSKGe1G6000PWXL凝膠過濾色譜柱(商品名稱，Tosoh)實(shí)施HPLC分析。另夕卜，分析條件如下洗提液使用0.IM硫酸鈉，流速為1.OmL/分鐘，株溫為50°C，UV檢測波長為210nm。另外，使用分子量80萬的PGA(MeijiFoodMateria)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度測定。并且，分子量測定采用已使用普魯藍(lán)(ShodexSTANDRDP_82，商品名稱，昭和電工)預(yù)先求出了重均分子量的各種分子量不相同的聚谷氨酸[和光純藥工業(yè)(162-21411，162-21401)、SIGMA-ALDRICH(P-4886，P-4761)、MeijiFoodMateria(分子量88萬)]。另夕卜，表示評價結(jié)果的表中的表示PGA產(chǎn)生能力的數(shù)值單位是(g/L)。另外，表示評價結(jié)果的表中的記號“ND”表示低于檢測限?！矊?shí)施例10〕產(chǎn)生能力評價(10)(PGA組成的光學(xué)純度測定)將從在實(shí)施例2中導(dǎo)入了pHY-P_S237/pgsBCA的枯草桿菌168株轉(zhuǎn)化體所得到的培養(yǎng)液、以及從在實(shí)施例4中導(dǎo)入了pHY-P_S237/pgsBC的枯草桿菌突變株(ABCA株)轉(zhuǎn)化體所得到的培養(yǎng)液作為試料來使用。在培養(yǎng)液的上清液中添加等量的乙醇，離心分離回收生成的沉淀。接著，干燥所回收的沉淀生成物，在其中加入6N鹽酸進(jìn)行氮封，在115120°C下進(jìn)行加熱處理24小時。加熱處理后，在氮?dú)鈿饬飨抡麴s除去鹽酸和水分，作為水解試料進(jìn)行回收。接著，采用全自動氨基酸分析計(jì)L-8500(商品名稱，日立計(jì)測機(jī)器)以及L-谷氨酸測定試劑盒(Yamasa醬油)，進(jìn)行上述水解物試料的氨基酸組成和L-谷氨酸的定量分析。另外，根據(jù)全自動氨基酸分析計(jì)分析得到旋光異構(gòu)體(D-異構(gòu)體及L-異構(gòu)體)的總量作為定量結(jié)果，從總量中減去根據(jù)L-異構(gòu)體測定試劑盒得到的定量結(jié)果，差值作為D-異構(gòu)體的量。另外，將從Bacillussp.KSM-366株(FERMBP-6262)制備的PGA作為Bacillus屬細(xì)菌的野生株所產(chǎn)生的PGA標(biāo)準(zhǔn)品，用于上述分析。并且，為了評價水解反應(yīng)中的氨基酸的外消旋率，使用D-谷氨酸及L-谷氨酸(和光純藥工業(yè))作為標(biāo)準(zhǔn)品。其結(jié)果如表12所不。表12^tMM谷氨酸組成比_料寺_D-異構(gòu)體L-異構(gòu)體已導(dǎo)入pHY-P_S237/pgsBCA的168株的培養(yǎng)液~~的上清液_____I_己導(dǎo)入pHY-P_S237/pgsBC的ABCA株的培養(yǎng)液的上清液____Bacillussp.KSM-366株產(chǎn)生的PGA__79__21谷氨酸(試劑用于評價外消旋率)793)-谷氨酸(試劑用于評價外消旋率)I91I9如表12所示，確認(rèn)導(dǎo)入R具有DgsBC基因的用于PGA產(chǎn)牛的重組載體而成的重組枯草桿菌所產(chǎn)生的PGA是具有L-谷氨酸的含量為90%以上的純度的光學(xué)純度高的PGA。而且，由于在同時討論的水解處理?xiàng)l件下的氨基酸的外消旋率約為10%，因此，可以推定從R導(dǎo)入了DgsBC基因的重組枯草桿菌所得到的PGA的光學(xué)純度為80100%?！矃⒖祭撑c制造例1同樣將從Bacillussp.KSM-366株(FERMBP-6262)制備的染色體DNA作為模板，使用表1所示的PgsB-F和pgsB-R(序列號15)的引物對，制備膽巡基因1.2kb的DNA片段(G)。將該片段和KSM-S237株來源的纖維素酶基因啟動子區(qū)域的DNA片段(C)作為模板，使用P_S237-FW和pgsB-R的引物對，按照SOE-PCR法得到具有(G)和(C)片段的1.8kb的DNA片段(GC)。下面，根據(jù)與制造例1所示相同的實(shí)驗(yàn)方法，將已確認(rèn)在質(zhì)粒載體pHY300PLK(Takara)的MlHI及HindIII限制酶識別部位上插入了上述DNA片段(GC)的重組質(zhì)粒，作為用于產(chǎn)生PGA的重組載體pHY-P_S237/pgsB。在使用PGA合成基因?qū)肭暗腄HY300PLK、以及上沭DgsB基因單獨(dú)表汰的質(zhì)粒(pHY-P_S237/pgsB)，對實(shí)施例1及2所示的PGA產(chǎn)生能力進(jìn)行評價的時候可以確認(rèn)，在任意的實(shí)驗(yàn)條件下都沒有PGA生成。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的重組微生物具有聚-Y-谷氨酸產(chǎn)生能力。因此，本發(fā)明的重組微生物能夠適用于聚_Y_谷氨酸的制造。另外，通過使用本發(fā)明的重組微生物，能夠制造具有希望的分子量以及結(jié)構(gòu)的聚_Y_谷氨酸。因此，本發(fā)明的重組微生物能夠適用于聚_Y_谷氨酸的產(chǎn)生能力的提高、分子量的調(diào)整方法、以及光學(xué)純度的調(diào)整方法。盡管將本發(fā)明與其實(shí)施方式一起進(jìn)行了說明，但是，除非另有規(guī)定，本發(fā)明并不限于說明書中的任何細(xì)節(jié)，而且，在不違反所附的權(quán)利要求所示的發(fā)明的宗旨和范圍內(nèi)，應(yīng)作寬泛的解釋。本發(fā)明基于2007年9月20日在日本進(jìn)行專利申請的特愿2007-244023要求優(yōu)先權(quán)，在此引入其內(nèi)容作為本說明書所記載的一部分進(jìn)行參考。權(quán)利要求一種具有聚-γ-谷氨酸產(chǎn)生能力的重組微生物，其特征在于，將參與聚-γ-谷氨酸合成的基因群中的枯草桿菌的pgsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的pgsC基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸?，且，不將枯草桿菌的pgsA基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨鏊拗魑⑸铩?.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的重組微生物，其特征在于，所述_基因?yàn)榫幋a下列(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因(a)含有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)含有在序列號2所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且具有酰胺連接酶活性的蛋白質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組微生物，其特征在于，所述_基因?yàn)榫幋a下列(c)或⑷的蛋白質(zhì)的基因(c)含有序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(d)含有在序列號4所示的氨基酸序列中使1個或多個氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且，具有在所述盛基因所編碼的PgsB蛋白質(zhì)的存在下生成聚-Y-谷氨酸的功能的蛋白質(zhì)。4.根據(jù)權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其特征在于，所述巡基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及所述_基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕虮恢亟M入在所述微生物的宿主細(xì)胞內(nèi)能夠自我復(fù)制的質(zhì)粒(載體)中。5.根據(jù)權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其特征在于，所述M盛基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及所述M叢基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕蛟谄渖嫌翁幘哂性谖⑸镏邪l(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)域及/或翻譯起始調(diào)控區(qū)域。6.根據(jù)權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其特征在于，所述宿主微生物為芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，其特征在于，所述芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌為枯草桿菌(Bacillussubtilis)。8.—種聚-Y-谷氨酸的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的重組微生物，從而獲得所生成的聚_Y_谷氨酸。9.一種聚-Y-谷氨酸的產(chǎn)生能力提高方法，其特征在于，將參與聚-Y-谷氨酸合成的基因群中的枯草桿菌的DgsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颉⒁约翱莶輻U菌的M叢基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸飦淼玫街亟M微生物，使用該重組微生物來使聚_Y_谷氨酸的產(chǎn)生能力提高。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的聚-Y-谷氨酸的產(chǎn)生能力提高方法，其特征在于，所述重組微生物為權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的重組微生物。11.一種聚-Y-谷氨酸的分子量調(diào)整方法，其特征在于，將參與聚_Y_谷氨酸合成的基因群中的枯草桿菌的M盛基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕颉⒁约翱莶輻U菌的M巡基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸飦淼玫街亟M微生物，使用該重組微生物來調(diào)整聚_Y_谷氨酸的分子量。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的聚_Y_谷氨酸的分子量調(diào)整方法，其特征在于，所述重組微生物為權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的重組微生物。13.一種高分子量聚_Y_谷氨酸的制造方法，其特征在于，采用權(quán)利要求11或12所述的聚-Y-谷氨酸的分子量調(diào)整方法。14.一種聚-γ-谷氨酸的光學(xué)純度調(diào)整方法，其特征在于，在使用微生物來產(chǎn)生聚_Y_谷氨酸時，將參與聚_Y_谷氨酸合成的基因群中的枯草桿菌的pgsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的pgsC基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸飦淼玫街亟M微生物，使用該重組微生物來調(diào)整聚-Y-谷氨酸的L-異構(gòu)體的比率。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的聚-Y-谷氨酸的光學(xué)純度調(diào)整方法，其特征在于，所述重組微生物為權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的重組微生物。16.一種L-異構(gòu)體的比率高的聚_Y_谷氨酸的制造方法，其特征在于，采用權(quán)利要求14或15所述的聚-Y-谷氨酸的光學(xué)純度調(diào)整方法。17.一種權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的重組微生物的使用。全文摘要本發(fā)明涉及具有聚-γ-谷氨酸產(chǎn)生能力的重組微生物，以及使用所述重組微生物的聚-γ-谷氨酸的制造方法。其中，將參與聚-γ-谷氨酸合成的基因群中的枯草桿菌的pgsB基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕?、以及枯草桿菌的pgsC基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨拗魑⑸铮也粚⒖莶輻U菌的pgsA基因或與該基因相當(dāng)?shù)幕驅(qū)胨鏊拗魑⑸?。文檔編號C12N1/21GK101802169SQ20088010749公開日2010年8月11日申請日期2008年9月19日優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日發(fā)明者澤田和久,萩原浩申請人:花王株式會社