專利名稱：：酶的抗癌治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供治療和抑制腫瘤(且尤其是惡性的實(shí)體瘤)的新方法，通過給藥腺苷脫氨酶以減少腺苷和脫氧腺苷的組織水平。
背景技術(shù)：
：腫瘤是異常的良性或惡性的細(xì)胞或組織生長(zhǎng)，其由不受控制的細(xì)胞增殖產(chǎn)生。惡性腫瘤是從其起源位點(diǎn)擴(kuò)散的腫瘤，且也稱為癌癥。因此，腫瘤和癌癥是具有不受控制的或不適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長(zhǎng)的共同特性的疾病家族。廣泛地,惡性腫瘤為血液衍生的腫瘤如白血病，或?qū)嶓w瘤。血液衍生的惡性腫瘤通常在血液中循環(huán)，但實(shí)體惡性腫瘤從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散遍及全身。然后該分布的腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移的過程中具有發(fā)展為多種繼發(fā)性瘤的潛力。為了實(shí)體瘤能經(jīng)歷這種轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，實(shí)體瘤細(xì)胞必須從原發(fā)或初始腫瘤逃逸，進(jìn)入血流或淋巴系統(tǒng)，并從那里侵入其它器官的組織，在該組織繁殖并形成新的腫瘤。轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的多步過程，其涉及腫瘤細(xì)胞粘附和活動(dòng)性的變化，蛋白水解酶、化學(xué)引誘物和蛋白聚糖和其它因子的分泌。此外，血管發(fā)生，或新血管的形成也是轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟(Folkman，1995,NatureMedicine1:27-31)。也已顯示免疫系統(tǒng)能抑制該惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，且已報(bào)道腺苷可抑制該免疫保護(hù)反應(yīng)。例如，Loshkin等人，(2006，CancerRes.66:7758-7765)報(bào)道了腺苷抑制殺傷T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生。腺苷不利地影響其它免疫功能，包括細(xì)胞組分和炎性功能(參見，例如，Spychala，2000，Pharmacology&Therapeutics87:161—173和Sitkovesky等人，2005NatureReviewsImmunology5:713-721的綜述)。Sitkovesky等人在2003年6月19日公開的WO03/050241中也描述了增加對(duì)抗原的免疫應(yīng)答和治療腫瘤的方法，其通過給藥腺苷受體拮抗劑，可包括腺苦脫氨酶進(jìn)行。也已顯示腺苷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和血管發(fā)生(Barcz等人，2000，Oncol.Rep.7(6):1285-91;Adair,2005，AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol289:R283-R296)且腺普刺激結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖(Mujoomdar等人2003，BiochemicalPharmacology661737—1747)。Asmar等人，1966,Proc.Am.Assoc.CancerRes,(摘要號(hào)")也已報(bào)道在超過50%的小鼠腹水模型中某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)通過注射ADA被抑制。這些為淋巴細(xì)胞性白血病L1210和L4946，淋巴肉瘤6C3HED,乳腺癌TA3和歐利希氏癌(Ehrlichcarcinoma)E2。在同一摘要中，報(bào)道了腺癌755對(duì)該作用有兩倍抗性且肉瘤180對(duì)該作用完全抵抗。WO03050241A2描述了腺苷受體抑制劑對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞的作用。盡管WO03050241A2提到ADA作為腺苷抑制劑，但沒有具體說明以將ADA應(yīng)用于治療具體癌癥，特別是卵巢癌和前列腺癌。因此，看起來對(duì)于一些肺瘤，腺苷的存在對(duì)腫瘤增生和腫瘤血管發(fā)生提供了"通行(go)，，信號(hào)，并對(duì)正常情況下殺死這些腫瘤的殺傷T細(xì)胞提供了"停止(st叩)，，信號(hào)。與上述發(fā)現(xiàn)相反，Lind,等人(美國(guó)專利號(hào)6，579，857)報(bào)道了腺苷與腺苷脫氨酶抑制劑的組合，和/或與抗癌劑如助間型霉素的組合，可用于增強(qiáng)上皮來源的腫瘤細(xì)胞死亡的方法。因此，該文獻(xiàn)暗示腺苷在癌癥中的作用更加復(fù)雜和未定。如上所述，用于降低內(nèi)源性腺苷水平的試劑為腺苷脫氨酶。腺苷脫氨酶("ADA"),指定為EC3.5.4.4，是重要的嘌呤再利用途徑(purinesalvagepathway)的酶。ADA將腺苷或脫氧腺苷在水的存在下轉(zhuǎn)化為肌苷或脫氧肌苷和氨。已知具有在ADA基因中的有害突變的個(gè)體可發(fā)展為不同程度的免疫缺陷疾病，從輕度至重度，即重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病("SCID")。已證實(shí)SCID是酶底物、腺苷和脫氧腺苷在未成熟的淋巴樣細(xì)胞中的毒性累積的結(jié)果。疾病的發(fā)作可從幼童至成人，取決于遺傳的突變。ADA的缺失是兒童中SCID的主要原因之一，且為基因治療方法的主要靶點(diǎn)之一(R.Parkman等人，2000，"Genetherapyfordenosinedeaminasedeficiency",Ann.Rev.Med.，51:33-47)。之前,ADA已從牛來源商業(yè)分離并用于治療多種疾病，包括SCID,其為綴合至聚乙二醇("PEG")聚合物的牛ADA的形式。用于醫(yī)藥用途的PEG化的ADA可從EnzonPharmaceuticals,Inc.作為ADAGEN,PEG化的ADA商5購。PEG部分與ADA的綴合使得酶獲得其完全治療效果，這是通過增加循環(huán)壽命和使得ADA基本上非抗原性，以最小化免疫源反應(yīng)的可能來實(shí)現(xiàn)的。也可制備以綴合形式使用的重組人或牛ADA酶，如以下所描述共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/738,012,其名稱為"StabilizedProteins",和共同擁有的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)_，名稱為"StableRecombinantAdenosineDeaminase",其于同一日提交且要求美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/913,009的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，均以其整體在此引入作為參考。因此，本領(lǐng)域存在治療或抑制癌癥生長(zhǎng)、擴(kuò)散和發(fā)展的新的和改善的方法的長(zhǎng)期需求。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明提供治療具有腫瘤的患者的方法，包括向需要的患者給藥有效量的ADA。有效量是易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的減少患者腺苷或脫氧腺芬的組織水平的量，且其中腫瘤的生長(zhǎng)或擴(kuò)散通過患者的腺苷組織水平實(shí)質(zhì)性降低(substantiallyreduced)所抑制。給藥途徑為例如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、吸入和經(jīng)尿道的途徑。該腫瘤可為惡性的或非惡性的，且優(yōu)選為實(shí)體瘤，例如，腫瘤如前列腺腫瘤，卵巢癌和/或結(jié)腸直腸癌。該腺苷脫氨酶優(yōu)選綴合至基本上非抗原性(substantiallynon-antigenic)聚合物，如聚環(huán)氧烷(polyalkyleneoxide)(PAO)。該P(yáng)AO優(yōu)選的大小范圍為約4,000至約45,000道爾頓。該P(yáng)AO優(yōu)選為聚乙二醇("PEG")。ADA與聚合物的摩爾比可為1:1,或可為每個(gè)聚合物2個(gè)或更多個(gè)ADA分子，或更優(yōu)選地，每個(gè)ADA分子約1至約20個(gè)聚合物分子(即11-18個(gè)PEG鏈)。該聚合物-綴合的ADA優(yōu)選的給藥劑量范圍為每kg約10U至約30U或更多，且維持足夠的時(shí)間以保持對(duì)腫瘤的抑制，例如，約1至約20天，或更長(zhǎng)。給予的腺苷脫氨酶的量有效地實(shí)質(zhì)性減少患者中腺苷或脫氧腺苷的組織水平，且其中腫瘤的生長(zhǎng)或擴(kuò)散^f皮所述患者中實(shí)質(zhì)性減少的腺苷組織水平所抑制。也就是說，例如，腺苷脫氨酶的劑量范圍為每kg約10U至約30U。重復(fù)該劑量足夠的時(shí)間以保持對(duì)腫瘤的抑制，例如，約1至約20天，或更長(zhǎng)。該劑量通過任何方便的途徑給藥，如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、吸入和經(jīng)尿道。該腺香脫氨酶任選從牛來源純化或?yàn)橹亟M腺苷脫氨酶。該重組腺苷脫氨酶為，例如，包含SEQIDNO:1的重組牛腺苷脫氨酶(Ser74-rbADA),包含SEQIDNO:3的重組人腺香脫氨酶(Ser74-rhADA)和包含SEQIDNO:5的重組牛腺香脫氨酶和/或其變體或多態(tài)(polymorphism)。重組產(chǎn)生的牛腺苦脫氨酶，例如，SEQIDNO:5，任選在Cys74封端(capped)，用于在水性介質(zhì)中保持穩(wěn)定。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"殘基"應(yīng)理解是指化合物的部分，其涉及，例如，PEG、ADA、氨基酸，等，其在經(jīng)歷被另一化合物的取代反應(yīng)后保留。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"聚合物殘基"例如，"PEG殘基"每個(gè)應(yīng)理解為聚合物或PEG的部分，其在與其它化合物、基團(tuán)(moieties)等反應(yīng)后保留。出于本發(fā)明的目的，本文使用的術(shù)語"烷基"是指飽和脂肪烴，包括直鏈，支鏈和環(huán)狀烷基。術(shù)語"烷基"還包括烷基-硫基-烷基，烷氧基烷基，環(huán)烷基烷基，雜環(huán)烷基和C,-6烷基羰基烷基。優(yōu)選地，該烷基具有1至12個(gè)碳。更優(yōu)選地，其為約1至7個(gè)碳的低級(jí)烷基，還更優(yōu)選約1至4個(gè)碳。該烷基可為取代的或未取代的。當(dāng)為取代的時(shí)，該取代的基團(tuán)優(yōu)選包括卣素、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-疏基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卣代曱基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基硅烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、烯基、炔基、C,-6烴基、芳基和氨基。出于本發(fā)明的目的，本文使用的術(shù)語"取代"是指添加選自以下的一個(gè)基團(tuán)或用選自以下的一個(gè)基團(tuán)替換官能團(tuán)或化合物中包含的一個(gè)或多個(gè)原子:鹵素、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卣代曱基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基硅烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、烯基、炔基、烷基羰基烷基、芳基和氨基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"烯基，，是指含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。優(yōu)選地，該烯基具有約2至12個(gè)碳。更優(yōu)選地，其為約2至7個(gè)碳的低級(jí)烯基，還更優(yōu)選約2至4個(gè)碳。該烯基可為取代的或未取代的。當(dāng)為取代的時(shí)，該取代的基團(tuán)優(yōu)選包括卣素、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卣代曱基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基硅烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、烯基、炔基、C"6烴基、芳基和氨基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"炔基"是指含至少一個(gè)碳-碳三鍵的基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。優(yōu)選地，該炔基具有約2至12個(gè)碳。更優(yōu)選地，其為約2至7個(gè)碳的低級(jí)炔基，還更優(yōu)選約2至4個(gè)碳。該炔基可為取代的或未取代的。當(dāng)為取代的時(shí)，該取代的基團(tuán)優(yōu)選包括卣素、氧基、疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基氨基、三卣代甲基、羥基、巰基、羥基、氰基、烷基硅烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、烯基、炔基、d-6烴基、芳基和氨基。"炔基"的實(shí)例包括炔丙基、丙炔和3-己炔。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"芳基"是指包含至少一個(gè)芳環(huán)的芳香烴環(huán)體系。該芳環(huán)可任選與其它芳香烴環(huán)或非芳香烴環(huán)稠合或連接。芳基的實(shí)例包括，例如，苯基、萘基、1,2,3，4-四氫萘和聯(lián)苯基。芳基的優(yōu)選實(shí)例包括苯基和萘基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"環(huán)烷基"是指C3-8環(huán)烴。環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"環(huán)烯基，，是指包含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的C3-8環(huán)烴。環(huán)烯基的實(shí)例包括環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、環(huán)己烯基、1，3-環(huán)己二烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)庚三烯基和環(huán)辛烯基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"環(huán)烷基烷基"是指被C3-8環(huán)烷基取代的烷基。環(huán)烷基烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基曱基和環(huán)戊基乙基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"烷氧基"是指通過氧橋連接至母體分子部分的指定碳原子數(shù)的烷基。烷氧基的實(shí)例包括，例如，曱氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。出于本發(fā)明的目的，"烷基芳基"是指被烷基取代的芳基。出于本發(fā)明的目的，"芳烷基"是指被芳基取代的烷基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"烷氧基烷基"是指被烷氧基取代的烷基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"烷基-硫基-烷基，，是指烷基-s-烷基硫醚，例如曱基硫基曱基或曱基硫基乙基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"氨基，，是指現(xiàn)有技術(shù)已知的從氨衍生的含氮基團(tuán)，其通過用有機(jī)基團(tuán)代替一個(gè)或多個(gè)氫基而得到。例如，術(shù)語"?；被?和"烷基氨基"分別是指具有酰基和烷基取代基的特定的N-取代的有機(jī)基團(tuán)。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"烷基羰基"是指被烷基取代的羰基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"卣素，或"鹵"是指氟、氯、溴和碘。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"雜環(huán)烷基"是指包含至少一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的非芳環(huán)體系。該雜環(huán)烷基環(huán)可任選與其它雜環(huán)烷基環(huán)和/或非芳香烴環(huán)稠合至或連接。優(yōu)選雜環(huán)烷基具有3至7元。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括，例如，哌嗪、嗎啉、哌啶、四氫呋喃、吡咯烷和吡唑。優(yōu)選雜環(huán)烷基包4舌哌咬基、哌。秦基、嗎啉基和吡咯烷基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"雜芳基"是指包含至少一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的芳環(huán)體系。該雜芳基環(huán)可與一個(gè)或多個(gè)雜芳基環(huán)、芳香或非芳香烴環(huán)或雜環(huán)烷基環(huán)稠合或連接。雜芳基的實(shí)例包括，例如、吡啶、呋喃、噻吩、5，6,7,8-四氫異喹啉和嘧啶。雜芳基的優(yōu)選實(shí)例包括噻喻基、苯并噻吩基、吡啶基、喹啉基、p比。秦基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、苯并噻唑基、異嗜唑基、^二唑基、異噻唑基、苯并異噻唑基、三唑基、四唑基、吡咯基、。引哚基、吡唑基和苯并吡唑基。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"雜原子"是指氮、氧和硫。在一些實(shí)施方案中，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羥基烷基和巰基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羥基烯基和巰基歸基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羥基炔基和巰基炔基；取代的環(huán)烷基包括基團(tuán)如4-氯環(huán)己基；芳基包括基團(tuán)如萘基；取代的芳基包括基團(tuán)如3-溴苯基；芳烷基包括基團(tuán)如曱笨基；雜烷基包括基團(tuán)如乙基噻吩；取代的雜烷基包括基團(tuán)如3-曱氧基-噻吩；烷氧基包括基團(tuán)如曱氧基；且苯氧基包括基團(tuán)如3-硝基苯氧基。由素應(yīng)理解為包括氟、氯、碘和溴。出于本發(fā)明的目的，"正整數(shù)"應(yīng)理解為包括等于或大于1的整數(shù)，且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在合理的范圍內(nèi)。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"連接"應(yīng)理解為包括共價(jià)(優(yōu)選)或非共價(jià)連接一個(gè)基團(tuán)至另一個(gè)基團(tuán)上，即，由于化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。術(shù)語"有效量"和"足夠量"出于本發(fā)明的目的應(yīng)是指達(dá)到所需效果或治療效杲的量，該效果是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"腺苷，，應(yīng)理解為包括核苷腺苷和脫氧腺苷。腺9苷還包括以AMP、ADP、ATP、dAMP、dADP或dATP形式存在的腺苦和脫氧腺苷。出于本發(fā)明的目的，"腺苷介導(dǎo)的腫瘤"或"腺苷脫氨酶-響應(yīng)性腫瘤"應(yīng)以廣義理解，包括任何受益于給藥ADA或其活性部分(activefraction)等的胂瘤類型，且不考慮給藥途徑。出于本發(fā)明的目的，"腺苷介導(dǎo)的腫瘤的治療"或"腺苷脫氨酶-響應(yīng)性腫瘤的治療"或"腺苷介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)的抑制"或"腺苷脫氨酶-響應(yīng)性腫瘤生長(zhǎng)的抑制"應(yīng)理解為是指當(dāng)與在沒有ADA治療的情況下觀察到的相比，該癥狀或疾病被最小化或減輕。該治療的癥狀可通過例如，肺瘤生長(zhǎng)的抑制和/或癌細(xì)胞或組織中腺苦水平的降低而證實(shí)。廣義地說，應(yīng)認(rèn)為在獲得所需臨床響應(yīng)(clinicalresponse)時(shí)獲得了成功的治療。例如，成功的治療可通過獲得例如10%或更高(即20%30%,40%)肺瘤生長(zhǎng)抑制而定義。或者與本文所述的在沒有ADA治療的情況下觀察到的相比，成功的治療可通過癌細(xì)胞或組織中獲得至少20%或優(yōu)選30%，更優(yōu)選40%或更高(即，50%或80%)的腺苷水平的減少而定義，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮的其它臨床指標(biāo)。而且，單數(shù)術(shù)語在說明書中的方便使用決不是為了限制。因此，例如，包含酶(anenzyme)的組合物涉及一個(gè)或多個(gè)分子的該酶。還應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文公開的具體構(gòu)型、方法步驟和材料，這些構(gòu)型、方法步驟和材料可稍加修改。還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅是用于描述具體實(shí)施方案的目的，不是為了限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將由所附權(quán)利要求和其等價(jià)物而限定。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供治療腫瘤、包括癌癥的新方法，該方法通過向需要的患者給藥以一定量的ADA酶，且持續(xù)時(shí)間足以減少患者組織和/或體液中存在的腺芬的量。優(yōu)選地，該ADA酶是聚合物綴合的。對(duì)于那些依賴于腺香的存在而生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的腫瘤，和/或?yàn)榱吮Ｗo(hù)患者的免疫系統(tǒng)，內(nèi)源性腺苷的充分減少將限制或防止癌癥生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和/或使得患者的免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性正常運(yùn)行。也考慮本發(fā)明的對(duì)腫瘤的ADA治療任選與一種或多種其它合適的現(xiàn)有技術(shù)已知的抗癌治療方法和藥物組合或協(xié)同進(jìn)行，其將在以下更詳細(xì)討論。本發(fā)明的組合治療包括單獨(dú)給藥有效量的本文的化合物，或與第二化學(xué)治療劑組合而同時(shí)或順序給藥。用于該組合治療的示例性的現(xiàn)有技術(shù)已知的抗癌劑包括，例如，Taxol,貝伐單抗(Avastin),長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，新霉素，考布他汀，鬼臼毒素，TNF-a，血管他丁，內(nèi)皮他丁，血管抑制素(vasculostatin),av-|33拮抗劑，鈣離子載體，鈣運(yùn)轉(zhuǎn)(calcium-flux)誘導(dǎo)劑，它們的任何衍生物或前藥。其它抗癌劑還包括化學(xué)治療劑，放射治療劑，細(xì)胞因子，抗血管形成劑，凋亡-誘導(dǎo)劑或抗癌免疫毒素或凝血配體(coaguligands)。一種該免疫毒素是例如Erbitux(西妥昔單抗)。本文所述的"化學(xué)治療劑"，是指用于治療惡性腫瘤的經(jīng)典化學(xué)治療劑或藥物。使用該術(shù)語，盡管事實(shí)上其它化合物技術(shù)上可描述為化學(xué)治療劑，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生抗癌作用。然而，"化學(xué)治療"已成為本領(lǐng)域明確的含義，且才艮據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)含義^f吏用。因此，本發(fā)明的方法可與一種或多種已知有效治療癌癥的化學(xué)治療劑組合使用，該化學(xué)治療劑包括但不限于，5-氮胞苷，5-氟尿嘧啶，任選與以下藥物組合曱酰四氫葉酸(leucovorin),5-氟脫氧尿苷，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，米托蒽醌，吖丙啶基苯醌(AZQ),卡莫司汀(Bristol-MyersSquibb的BCNU或BiCNU⑧)，博來霉素，卡鉑(CBDCA)，洛莫司汀(CCNU),曱基-CCNU或MeCCNU,苯丁酸氮芥，氯脫氧腺苷，順鉑，環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，放線菌素D,柔紅霉素，脫氧助間型霉素，多柔比星，doxycoformycin，DTIC(達(dá)卡巴。秦)，表柔比星，依托泊苷(VP-16),氟達(dá)拉濱，六曱蜜胺，羥基脲，伊達(dá)比星，異環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺和美司鈉，左旋咪唑，N-乙酰基半胱氨酸("NAC")，l-笨基丙氨酸氮芥(l-phenylalaminemustard),4'-(9-吖啶基氨基)曱磺酰胺-間-苯曱醚(4'-(9-acridinylamino)methanesulfon-m-anisidide)("mAMSA"),現(xiàn)有4支術(shù)已知的多藥耐藥性的抑制劑(即，MDR抑制劑)，美法侖，曱氨蝶呤，任選與以下藥物組合曱酰四氫葉酸，光神霉素，絲裂霉素-c,多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)的抑制劑("MRP"抑制劑)，紫杉醇，丙卡巴肼，鏈脲佐菌素，N，N'N'-三亞乙基硫代磷酰胺("塞替派")，拓樸異構(gòu)酶I和/或拓樸異構(gòu)酶II抑制劑，紫杉醇，長(zhǎng)春堿，vincristein,長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛，替尼泊苷(VM-26),和其它很多藥物。其它認(rèn)為與本發(fā)明的方法組合使用的治療癌癥的方法包括用X-射線、y射線直接或以體層攝影靶向輻射，用植入式放射性球團(tuán)或"種(seeds)"治療癌癥組織，中子束照射硼化合物預(yù)處理的組織，和/或其它類型本領(lǐng)域已知的粒子束治療。其它任選與本發(fā)明方法組合或協(xié)同給藥的抗腫瘤或抗癌劑(抗腫瘤劑)包括描述于"GOODMANANDGILMAN'S,THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS",TENTHEDITION,Eds.Hardman和Limbird的方法，以其整體在此引入作為參考.為更好理解本發(fā)明，對(duì)以下術(shù)語進(jìn)行了定義。除非另有所述，本文涉及的"腺苷"還包括脫氧腺苷，和其本領(lǐng)域已知的存在于體內(nèi)的變體和衍生物。提到腺苷脫氨酶或ADA包括任何本領(lǐng)域已知形式的酶，包括純化的天然酶，例如，純化天然ADA,重組人或牛ADA和其變體、多態(tài)性(polymorphisms)和衍生物。從牛來源純化的ADA酶具有根據(jù)SEQIDNO:5的序列，且其Cys74殘基天然被半胱氨酸封端或保護(hù)，且從編碼SEQIDNO:5的ADA的基因預(yù)測(cè)的6個(gè)C-末端殘基不存在。然而，預(yù)期本發(fā)明可使用天然牛ADA的替代變體進(jìn)行，包括替代等位基因和多態(tài)性(polymorphism),天然和重組產(chǎn)生的，有或沒有預(yù)測(cè)的6個(gè)C-末端殘基。牛ADA多態(tài)包括，例如，谷氨酰胺在198位代替賴氨酸；丙氨酸在245位代替蘇氨酸；精氨酸在351位代替甘氨酸。ADA酶的優(yōu)選衍生物包括重組產(chǎn)生的ADA酶，其被突變以相對(duì)于非突變的重組ADA酶增強(qiáng)穩(wěn)定性。這些包括，例如，從SEQIDNO:5和/或具有一個(gè)或多個(gè)上述多態(tài)性的SEQIDNO:5修飾的重組ADA酶，用合適的不可氧化(non-oxidizable)的氨基酸殘基替換暴露于溶劑的可氧化的Cys殘基。該不可氧化的殘基包括任何本領(lǐng)域已知的天然氨基酸殘基和/或任何其本領(lǐng)域已知的衍生物。例如，從首次從?；蛉藖碓捶蛛x的基因表達(dá)的成熟重組ADA具有優(yōu)選被不可氧化的氨基酸殘基(例如，被Ser74)替換的不穩(wěn)定的Cys74殘基。該重組ADA酶由SEQIDNO:1(牛ADA結(jié)構(gòu))和SEQIDNO:3(人ADA結(jié)構(gòu))表示。SEQIDNO:2和SEQIDNO:4表示用于表達(dá)它們的有用DNA分子，其具有為大腸桿菌表達(dá)優(yōu)化的密碼子。關(guān)于該重組ADA突變蛋白的其它細(xì)節(jié)以及這些蛋白質(zhì)的制備和純化由共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)所提供，其要求美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/913,009的優(yōu)先權(quán)，名稱為"穩(wěn)定的12重組腺苷脫氨酶，，且在同一天(evendate)提交，且以其整體在此引入作為參考。關(guān)于載體和純化方法的具體細(xì)節(jié)可在其中找到，特別是實(shí)施例部分，最特別為實(shí)施例1-4?；蛘逜DA酶可按需要通過封端暴露于溶劑的可氧化的Cys殘基而穩(wěn)定化，其通過在足以封端反應(yīng)性半胱氨酸的反應(yīng)條件下用足量的封端劑處理ADA酶，而基本不滅活該ADA蛋白。該方法優(yōu)選使用重組產(chǎn)生的ADA進(jìn)行，可為突變蛋白或?yàn)橐吧虯DA酶。例如，封端劑包括，但不限于，氧化的谷胱甘肽(優(yōu)選)，碘乙酰胺，碘乙酸，胱氨酸，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它二硫醇，及其混合物。本文所述方法的反應(yīng)階段中包含的封端劑的量和濃度將在一定程度上取決于具體使用的封端劑和技術(shù)人員的需求，但不需進(jìn)行過多的實(shí)驗(yàn)。使用氧化的谷胱甘肽作為原型，當(dāng)與重組蛋白質(zhì)如rhADA反應(yīng)時(shí)使用的濃度可為約25至約100mM。優(yōu)選地，該氧化的谷胱甘肽以約5nM至約25mM的濃度與重組蛋白質(zhì)反應(yīng)。封端劑和重組蛋白質(zhì)反應(yīng)過程中使用的反應(yīng)條件進(jìn)一步包括使用pH為約6.5至約8.4，優(yōu)選約7.2至約7.8的水性溶液。此外，該水性溶液優(yōu)選包括濃度為10至150mM的合適的緩沖液如磷酸鈉，磷酸鉀，Tris和Hepes及其混合物，(任選地，封端可超出該緩沖液范圍而進(jìn)行，低于IO或高于150mM)。該反應(yīng)條件進(jìn)一步包括使反應(yīng)在對(duì)于蛋白質(zhì)降解不利的溫度，即約4-37。C進(jìn)行。任選地，封端可超出該溫度范圍進(jìn)行，例如，在低于0-4。C或高于37°C的溫度范圍進(jìn)行。該反應(yīng)進(jìn)行足夠的時(shí)間以獲得反應(yīng)性半胱氨酸所需的穩(wěn)定作用。僅僅是作為實(shí)例，該反應(yīng)進(jìn)行約5秒至約8小時(shí)(例如，過夜)。其它關(guān)于封端的、穩(wěn)定的重組ADA的細(xì)節(jié)由共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/738,012名稱為"StabilizedProteins，，所提供，且特別是在實(shí)施例部分，其在此引入作為參考。而且，單數(shù)術(shù)語在說明書中是為了方便決不是為了限制。因此，例如，包含酶(anenzyme)的組合物涉及該酶的一個(gè)或多個(gè)分子。還應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文公開的具體構(gòu)型、方法步驟和材料，這些構(gòu)型、方法步驟和材料可稍加修改。A.聚合物-ADA綴合物ADA的優(yōu)選形式為聚合物綴合的酶形式。本發(fā)明的ADA-聚合綴合物(polymerconjugate)通常相應(yīng)于式(I):(I)[R畫NH]z-(ADA)其中(ADA)表示腺普脫氨酶或任選地，其衍生物或片段；NH-為ADA上的氨基酸的氨基、其衍生物或片段，用于連接至聚合物;(z)為正整數(shù)，優(yōu)選約1至約80,更優(yōu)選約5至約80，還更優(yōu)選約11至約18;且R為以可釋放或不可釋放的形式連接至ADA的基本上3夂抗原性聚合物殘基。綴合物(R)的非抗原性聚合物殘基部分可選自聚合物-基體系的非限制性實(shí)例,如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中Rio-n和R22.23可相同或不同且為獨(dú)立選擇的非抗原性聚合物殘基；R3-9，Rl2-21和R24(參見下文)相同或不同且各自獨(dú)立地選自氫，烷基，C3_l2支鏈烷基，C^環(huán)烷基，Q，6取代的烷基，C3，8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C,-6雜烷基，取代的C,.6雜烷基，C,-6烷氧基，苯氧基和C,—6雜烷氧基；Ar為形成多取代的芳香烴或多取代的雜環(huán)基的部分；Y，—，,和Y13可相同或不同且獨(dú)立地選自0,S和NR24;A選自烷基，靶向部分，診斷劑和生物活性部分；X為O,NQ，S,SO或S02;其中Q為H，C,-8烷基，C,-8支鏈烷基，C,-8取代的烷基，芳基或芳烷基；Z和Z，獨(dú)立地選自主動(dòng)運(yùn)輸至靶細(xì)胞的部分，疏水部分，雙官能連接部分及其組合；L,.6和L8可相同或不同且為獨(dú)立選擇的雙官能連接基；(a),(c)，(d)，(f)，(g),(i)，(j)，(j，)，(k),(1)，(n),(o)，(p),(q)和(t)可相同或不同且優(yōu)選地，在大多數(shù)方面獨(dú)立地為O或正整數(shù)；(b),(e),(r),(r，),(s),(h)，(h，)和(m)可相同或不同且獨(dú)立地為0或1;mPEG為曱氧基PEG且Cu)為正整數(shù)以提供總分子量為約2,000至約100,000Da，優(yōu)選約4,000至約45,000Da的聚合物。在上述中，優(yōu)選Yw,和Yn為0;R3.8，1112.21和1124各自獨(dú)立地為氫或C卜6烷基，且曱基和乙基是最優(yōu)選的烷基，且R7-9優(yōu)選為CH3。在本發(fā)明另一方面，該綴合物的聚合物部分可為ADA提供多個(gè)連接點(diǎn)。該體系的非限制性實(shí)例包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(xii)和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(xiii)其中所有變量與上述相同?；蛘吆?或優(yōu)選地，多個(gè)PEG鏈連接至ADA。在這些方面，該ADA聚合綴合物可包括至少5個(gè)聚乙二醇鏈至高達(dá)80個(gè)鏈連接至酶上的Lys的s氨基，但優(yōu)選地，可包括約11-18PEG鏈連接至酶上的Lys的￡氨基。盡管ADA每個(gè)酶分子通過賴氨酸連接綴合約11至約18個(gè)PEG分子,但可改變PEG與ADA的比例以修改組合的綴合物的物理和動(dòng)力特性以適合任何具體臨床情開可使用的制備ADA綴合物的活化的聚合物將自然與上述聚合物部分直接相應(yīng)。主要特征為離去基團(tuán)或活化基團(tuán)的存在，有時(shí)在本文指定為B,,其促進(jìn)聚合物體系連接至ADA上的胺基團(tuán)(例如，賴氨酸的s胺基團(tuán))。因此，化合物(i)-(xiii)包括離去基團(tuán)或活化基團(tuán)，如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>或其它合適的離去基團(tuán)或活化基團(tuán)如N-羥基苯并三唑基，卣素，N-羥基鄰苯二曱酰亞胺基(hydroxyphthalimidyl),咪唑基，O-酰基脲，五氟苯酚或2,4,6-三-氯苯酚或其它對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的合適離去基團(tuán)，這些基團(tuán)發(fā)現(xiàn)于綴合反應(yīng)后ADA連接的位置。一些優(yōu)選的活化的PEG包括公開于以下的那些共同授讓的美國(guó)專利號(hào)5,122,614,5,324,844,5,612,460和5,808,096(琥珀酰亞胺基碳酸酉旨-活化的聚乙二醇(SC-PEG)和相關(guān)活化的PEG's)，和美國(guó)專利號(hào)5,349,001(環(huán)狀亞胺硫酮活化的PEG's)，其內(nèi)容在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些綴合反應(yīng)通常在合適的緩沖液中使用幾倍摩爾過量的活化的PEG而進(jìn)行。一些優(yōu)選的用直鏈PEG(如上述SC-PEG)制備的綴合物每個(gè)酶可包含平均約1至約80個(gè)PEG鏈。結(jié)果，因此，可使用幾百倍摩爾過量，例如,200-1000倍。用于支鏈聚合物和連接至酶的聚合物的摩爾過量是較低的，且可使用下文所述的描述它們的專利和專利申請(qǐng)中描述的技術(shù)而確定。出于本發(fā)明的目的，活化的基團(tuán)應(yīng)理解為能與ADA上(例如Lys上)的胺基團(tuán)(親核基團(tuán))反應(yīng)的基團(tuán)。出于本發(fā)明的目的，上述也涉及活化的聚合物連接基。該聚合物殘基優(yōu)選基于聚環(huán)氧烷且更優(yōu)基于選聚乙二醇(PEG),其中所述PEG是直鏈、支鏈或多臂的。關(guān)于上述聚合物，可以看出Ar為形成多取代的芳香烴或多取代的雜環(huán)基的部分。關(guān)鍵特征為該Ar部分本質(zhì)上是芳香的。通常，作為芳香性，pi電子必須在環(huán)狀分子的平面上方和下方共享"電子云"。而且，pi電子的數(shù)量必須滿足Huckle規(guī)則(4n+2)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到眾多基團(tuán)將滿足基團(tuán)芳香性的需求，因此其都適合在此使用。在本發(fā)明一些優(yōu)選方面，基于芐基消除或三甲基鎖(lock)內(nèi)酯化的聚合物體系的活化的聚合物連接基根據(jù)共同授讓的美國(guó)專利號(hào)6,180,095，6,720,306,5,965,119,6,624,142和6,303,569制備，其內(nèi)容在此引入作為參考。在本文中，優(yōu)選以下活化的聚合物連接基HH和在本發(fā)明另一方面，該ADA聚合綴合物使用某些N-二(羥乙基)甘氨酸、，(bicine)聚合物殘基制備，如描述于以下的殘基共同授讓的美國(guó)專利號(hào)7,122,189和7,087,229和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/557,522，11/502,108，和11/011,818。該專利申請(qǐng)每一個(gè)的公開在此引入作為參考。一些優(yōu)選的活化的聚合物包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>還應(yīng)理解以上所示的離去基團(tuán)或活化基團(tuán)僅為合適基團(tuán)之一，本文提及的其它基團(tuán)也可使用，而沒有過多的實(shí)驗(yàn)。在其它方面，該活化的聚合物連接基使用支鏈的聚合物殘基制備，如描述于共同授讓的美國(guó)專利號(hào)5,681,567，5,756,593,5,643,575;5,919,455,6,113,906,6,153,655，6,395,266牙口6,638,499,6,251,382禾口6,824,766的那些，其各自的公開內(nèi)容在此引入作為參考。這些活化的聚合物相應(yīng)于聚合物體系(iv)-(ix)，且以下是有代表性的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中B，為活化基團(tuán)且所有變量如上定義。在其它方面，活化的聚合物可使用受阻的酯-基(hinderedester-based)連接基。參見PCT/US07〃8593,名稱為"PolypropyleneOxidesHavingHinderedEster-BasedBiodegradableLinkers",其內(nèi)容被？1入作為參考。例如，該化合物的非限制性實(shí)例包括CHrO(CH2CH20);^H:CH3-0(CH2CH20)「H2C\zNHTII人o/\。其中(u)為約10至約2300的整數(shù)，以優(yōu)選提供總分子量為約4,000至約45,000的聚合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該活化的聚乙二醇提供與蛋白質(zhì)的尿烷連接或酰胺-連接。制備高純度的具有末端羧酸的聚合物的方法描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/328,662，其內(nèi)容在此引入作為參考。該方法包括首先制備聚環(huán)氧烷的叔烷基酯，然后轉(zhuǎn)化為其羧酸衍生物。該方法制備PAO羧酸的第一步驟包括形成中間體如聚環(huán)氧烷羧酸的叔丁基酯。該中間體通過將PAO與卣代乙酸叔丁酯在堿如叔丁醇鉀的存在下反應(yīng)而形成。一旦該叔丁基酯中間體形成，聚環(huán)氧烷的羧酸衍生物可易于以超過92%,優(yōu)選超過97%，更優(yōu)選超過99%且21CHrO(CH2CH20)u\CHrO(CH2CH2OXr~tOCFVOCCHAO);;"H2C、zNIIOoCH和HNc=ocH2HcH最優(yōu)選超過99.5%的純度形成。在其它方面，可使用具有末端胺基團(tuán)的聚合物以制備ADA綴合物。以高純度制備含末端胺的聚合物的方法描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/508,507和11/537,172，其每個(gè)的內(nèi)容被引入作為參考。例如，具有疊氮化物的聚合物與膦-基還原劑如三苯基膦或堿金屬硼氫化物還原劑如NaBH4反應(yīng)?；蛘甙x去基團(tuán)的聚合物與保護(hù)的胺鹽如亞氨二曱酸曱基-叔丁基酯(methyl-tert-butylimidodicarbonate)(KNMeBoc)的鉀鹽或亞氨二曱酸二誅又丁酯(KNBoc2)的鉀鹽反應(yīng)，然后脫保護(hù)被保護(hù)的胺基。由這些方法形成的含該末端胺的聚合物的純度大于約95%且優(yōu)選大于99%。1.基本上非抗原性聚合物如上所述，Ru)-n和R22.23各自優(yōu)選為水溶性聚合物殘基，其優(yōu)選為基本上非抗原性的，如聚環(huán)氧烷(PAO，s)且更優(yōu)選聚乙二醇如mPEG。出于解釋而不是限制的目的，R,o.n和R22-23的聚乙二醇(PEG)殘基部分可選自J-0-(CH2CH20)u-J-0-(CH2CH20)u-CH2C(0)-0-，J-0-(CH2CH20)u-CH2CH2NR25-，和J-0-(CH2CH20)u-CH2CH2SH-,其中(u)為聚合度，即為約10至約2,300;R25選自氫，d-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基，C3-12支鏈烷基，C3-8環(huán)烷基，c,.6取代的烷基，C2-6取代的烯基，C2-6取代的炔基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C,_6雜烷基，取代的雜烷基，d-6烷氧基，苯氧基和c,.6雜烷氣基，和J為封端基團(tuán)，即，聚合物的末端發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)，且在一些方面，可選自NH2(或CH2CH2NH2),H,SH(或CH2CH2SH),C02H(或CH2C02H),C16烷基的任一種，優(yōu)選曱基，或其它PEG末端活化基團(tuán)，這些基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1(M1和&2-23選自，CH3-0-(CH2CH20)u-，CH3-0-(CH2CH20)u-CH2C(0)-0-,CH3-0-(CH2CH20)u-CH2CH2NH-和CH3-0-(CH2CH20)u-CH2CH2SH-，其中(u)為正整數(shù)，優(yōu)選加以選擇使得聚22合物部分的平均總分子量為約2,000至約100,000Da。更優(yōu)選地，和1122-23獨(dú)立地具有約4,000Da至約4,5000Da的平均總分子量，且最優(yōu)選重均分子量為約5,000Da以上。其它分子量也在考慮范圍以滿足^f支術(shù)人員的需要。PEG通常由以下結(jié)構(gòu)表示且R,o-n和1122-23優(yōu)選包括該式的殘基。聚合物的聚合度表示聚合物鏈中重復(fù)單元的數(shù)目且其取決于聚合物的分子量?；蛘弑景l(fā)明的聚乙二醇(PEG)殘基部分可由以下結(jié)構(gòu)表示-Y31-(CH2CH20)u-CH2CH2Y31-，-Y31-(CH2CH20)u-CH2C(=Y32)-Y31-,-Y31-C(=Y32)-(CH2)all-Y3r(CH2CH20)u-CH2CH2-Y33-(CH2)all-C(=Y32)-Y3廣，-Y31-(CR31R32)al2-Y33-(CH2)bll-0-(CH2CH20)u-(CH2)bll-Y33-(CR31R32)al2-Y3,-，-Y31-(CH2CH20)u-CH2CH2-，-Y3l-(CH2CH20)u-CH2C(=Y32)-，-C(=Y32)-(CH2)aII-Y33-(CH2CH20)u-CH2CH2-Y33-(CH2)all-C(=Y32)-，和-(CR31R32)al2-Y33-(CH2)bll-0-(CH2CH20)u-(CH2)b-Y33-(CR31R32)al2-,其中Y31和Y33獨(dú)立地為O,S,SO，S02,NR33或鍵；Y32為O,S或NR34;R3,.34獨(dú)立地選自氫，C,-6烷基，C2.6烯基，C2-6炔基，C3.19支鏈烷基，C3.8環(huán)烷基，C,.6取代的烷基，C2.6取代的烯基，C2-6取代的炔基，C3.8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，雜芳基，取代的雜芳基，雜烷基，取代的C,-6雜烷基，C,—6烷氧基，芳基氧基，Q.6雜烷氧基，雜芳基氧基，C2.6烷酰基,芳基羰基，c2.6烷氧基羰基，芳基氧基羰基,c2.6烷酰基氧基，芳基羰基氧基，c2.6取代的烷酰基，取代的芳基羰基，c2.6取代的烷?；趸〈姆蓟趸驶?C2.6取代的烷?；趸腿〈姆蓟驶趸?all),(al2)和(bll)獨(dú)立地為0或正整數(shù)，優(yōu)選0-6，且更優(yōu)選0,l,或2;和(u)為約10至約2300的整數(shù)。作為實(shí)例，該P(yáng)EG可以以下非限制性方式官能化-C(=Y34)-(CH2)mll-(CH2CH20)u-,-C(=Y34)-Y-(CH2)mlr(CH2CH20)u-，-C(=Y34)-NR31-(CH2)mll-(CH2CH20)u-,-CR35R36-(CH2)ml,-(CH2CH20)u-其中R3,，R35和R36獨(dú)立地選自H,d.6烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，雜烷基，取代的雜烷基和取代的C"6烷基；(mll)為O或?yàn)檎麛?shù)，且優(yōu)選1或2;Y34為0或S;和(u)表示聚合度。在這些方面，封端基團(tuán)(J)如曱基連接至PEG的末端。例如，本發(fā)明的綴合物可通過以下方法制備，其包括將如以下描述的多臂PEG-OH和"星狀(star)-PEG，，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為適當(dāng)活化的聚合物NOFCorp.DrugDeliverySystem目錄，Ver.8，2006年4月，其公開在此引入作為參考，并使用描述于上述美國(guó)專利號(hào)5,122,614或5,808,096的活化技術(shù)。還參見ShearwaterCorporation's2001目錄"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplication",在此引入作為參考。該多臂聚合物包含4個(gè)或更多個(gè)聚合物臂且優(yōu)選4或8個(gè)聚合物臂。出于解釋而不是限制的目的，該多臂聚乙二醇(PEG)殘基可為下式H2C—'O—'(CH2CH20)nHHC一-o—(CH2CH2〇)nHCH2丄O1CH2HC—i-o—(CH2CH20)nHCH2Tx0CH2HC——-O—'(CH2CH20)nHH2C——-o—-(CH2CH20)nH24其中.-(x)為0和正整數(shù)，即約0至約28;和(n)為聚合度。在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，該多臂PEG具有以下結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中(n)為正整數(shù)。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該聚合物的總分子量為約2,000Da至約100,000Da,且優(yōu)選4,000Da至45,000Da。具體地，和PEG可為下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中(u，)為約10至約570的整數(shù)，以優(yōu)選提供總分子量為約4,000至約45,000的聚合物；且殘基的至多3個(gè)末端部分被曱基或其它低級(jí)烷基封端。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG的所有4個(gè)臂轉(zhuǎn)化為合適的官能團(tuán)，即SC,等，以促進(jìn)連接至重組蛋白質(zhì)。該轉(zhuǎn)化之前的化合物包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>H3C-(OCH2CH2)u.—OHO-CH2CH2-(OCH2CH2)u.z00_(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u.—CH3H3C-(OCH2CH2)u,—OHO-CH2CH2-(OCH2CH2)u,z00—(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u.—CH2CH2—OHHO-CH2CH2-(OCH2CH2)u,—OH3C-(OCH2CH2)u<0.HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u.—O.HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u,z0和0—(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u.—CH2CH2—OH0—(CH2CH20)u-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u'—CH2CH2—OH本文包括的聚合物質(zhì)優(yōu)選在室溫是水溶性的。該聚合物的非限制性實(shí)例包括聚環(huán)氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多元醇,其共聚物及其嵌段共聚物，條件是保持嵌段共聚物的水溶性。在另一實(shí)施方案中，且作為PAO-基聚合物的代替物，Rkm,和R22.23各自任選選自一種或多種有效的非抗原性物質(zhì)如葡聚糖，聚乙烯醇，碳水化合物-基聚合物，羥基丙基甲基-丙烯酰胺(HPMA),聚環(huán)氧烷，和/或其共聚物。也參見共同指定的美國(guó)專利號(hào)6,153,655,其內(nèi)容在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本文使用的活化與對(duì)PAO's如PEG的活化類型相同。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到上述實(shí)例僅是解釋性的，所有具有本文所述特性的聚合物質(zhì)都被考慮，且其它聚環(huán)氧烷衍生物如聚丙二醇等也在考慮范2.雙官能連接基在本發(fā)明許多方面，Lw和L8為促進(jìn)聚合物鏈(例如R1Q.和/或1122.23)連接的連接基。提供的連接可為直接連接或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它偶聯(lián)基團(tuán)連接。在本發(fā)明該方面，L卜6和L8可相同或不同且可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種基團(tuán)，如雙官能和雜雙官能脂肪族和芳香-脂肪族基團(tuán)氨基酸，等。因此，Lw和Ls可相同或不同且包括基團(tuán)如-NH(CH2CH2)20-，-NH(CH2CH2)(CH2CH20)NH-，-0(CH2CH2)NH-,-0(CH2CH2)0-,-NH(CH2CH2)NH-,-NH(CH2CH2)(CH2CH20)-，-NH(CH2CH20)-,-NH(CH2CH20)(CH2)NH-,-NH(CH2CH20)2-,-0(CH2)3NH-,-0(CH2)30-，-0(CH2CH20)2NH-,CHNH-優(yōu)選地，L"6和Ls選自-C(0)CH2OCH2C(0)-;-C(0)CH2NHCH2C(0)_;-C(0)CH2SCH2C(0)-;-C(0)CH2CH2CH2C(0)-，和-C(0)CH2CH2C(0)-?；蛘吆线m的氨基酸殘基可選自任何已知的天然存在的L-氨基酸，例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，等和/或其組合，僅列出一些丄w和Ls也可包CH20--CH2NH-—CH70--NHCH-NHCH;括大小為例如，約2至約10個(gè)氨基酸殘基的肽。天然存在的氨基酸的衍生物和類似物，以及各種現(xiàn)有技術(shù)已知的非天然存在的氨基酸(D或L)，疏水的或非疏水的，也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。3.Z部分及其功能在本發(fā)明的一個(gè)方面，Z和Z'為L(zhǎng)7-C(=Y12)其中L7為選自限定L^的基團(tuán)，且Y,2選自與限定Y,的基團(tuán)相同的基團(tuán)的雙官能連接基。在本發(fā)明該方面，該Z基團(tuán)作為ADA和聚合物遞送體系的剩余部分之間的連接基。在本發(fā)明其它方面，Z為主動(dòng)運(yùn)輸至靶細(xì)胞的部分，疏水部分，及其組合。該Z，當(dāng)存在時(shí)可作為雙官能連接基，主動(dòng)運(yùn)輸至靶細(xì)胞的部分，疏水部分，及其組合。在本發(fā)明的該方面，制備該可釋放的聚合物體系以使體內(nèi)水解將聚合物從ADA裂解并釋放酶進(jìn)入細(xì)胞外液，同時(shí)仍連接至Z部分。例如，一些可能的Z-B組合為亮氨酸-ADA和Gly-Phe-Leu-Gly-ADA。B.制備ADA綴合物出于解釋的目的，合適的綴合反應(yīng)包括將ADA與本文所述的適當(dāng)活化的聚合物體系反應(yīng)。該反應(yīng)優(yōu)選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于蛋白質(zhì)修飾的條件進(jìn)行，包括使用PBS緩沖體系等，且pH范圍為約6.5-8.5。預(yù)期在大多數(shù)情況下，過量的活化的聚合物將與ADA反應(yīng)。這種反應(yīng)將經(jīng)常導(dǎo)致含連接至ADA的一個(gè)或多個(gè)聚合物的綴合物的形成。應(yīng)理解，經(jīng)常需要分離不同級(jí)分并提供更均一的產(chǎn)物。在本發(fā)明大多數(shù)方面，收集該反應(yīng)混合物，裝載至合適的柱樹脂上，且用增加量的緩沖液依序洗脫所需級(jí)分。通過合適的分析工具分析級(jí)分以測(cè)定進(jìn)一步加工前綴合的蛋白質(zhì)的純度。不考慮所選的合成路線和活化的聚合物，該綴合物將符合本文定義的式(I)。從本文所述合成技術(shù)形成的一些優(yōu)選綴合物包括其中mPEG的分子量為約4,000至約45,000。當(dāng)使用N-二(羥乙基)甘氨酸-基聚合物體系時(shí)，兩個(gè)優(yōu)選的綴合物為:(CH2)4CH一C-B一/mPEG—O、oOOomPEG—O—mPEG-O-C_(CH2)2-C—B其中B為ADA。根據(jù)本發(fā)明制備的其它綴合物包括:陽《3-c-—Y2——Ar—b-c一R4Y，.丫3一C一其中所有變量與上述相同，且B為ADA,其它綴合物包括丫slR11-c-R5-cR6C—B_ld|__l其中B為ADA。特別優(yōu)選的綴合物為omPEGmPEG一Oc=oBR--CIRHo=c<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>軟骨細(xì)胞瘤，等。肌肉和心臟腫瘤包括骨骼和平滑肌腫瘤，例如，平滑肌瘤(平滑肌良性腫瘤)、平滑肌肉瘤、橫紋肌瘤(骨骼肌良性腫瘤)、橫紋肌肉瘤、心臟肉瘤，等。胃腸道腫瘤包括例如，口腔腫瘤、食管、胃、小腸、結(jié)腸和結(jié)腸直腸的腫瘤，以及胃腸分泌器官如唾液腺、肝、胰腺、膽道的腫瘤等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤包括腦、視網(wǎng)膜和脊髓的肺瘤，且也可源自相關(guān)結(jié)締組織、骨、血管或神經(jīng)組織。也考慮治療外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤。此外，外周神經(jīng)系統(tǒng)的肺瘤包括惡性的外周神經(jīng)鞘瘤。腎系統(tǒng)的腫瘤包括腎的腫瘤，例如，腎細(xì)胞癌，以及輸尿管和膀胱的腫瘤。生殖系統(tǒng)的腫瘤包括子宮頸、子宮、卵巢、前列腺、睪丸和相關(guān)分泌腺的腫瘤。免疫系統(tǒng)的腫瘤包括基于血液的腫瘤和實(shí)體瘤，包括淋巴瘤，例如，霍奇金和非-霍奇金瘤。呼吸系統(tǒng)的腫瘤包括鼻通道、支氣管和肺的腫瘤。乳腺腫瘤包括，例如，小葉性和導(dǎo)管性癌。待治療的特別常見類型的惡性腫瘤包括，僅僅是作為實(shí)例前列腺癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、皮膚黑素瘤、淋巴瘤、非-霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、Wilms'腫瘤、橫紋肌肉瘤(產(chǎn)生自肌肉)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、骨肉瘤和Ewing's肉瘤，僅列出一些。D.劑量選擇技術(shù)人員將理解，在臨床環(huán)境，Adagen⑧的劑量根據(jù)腫瘤的臨床響應(yīng)和個(gè)體患者(無論動(dòng)物或人)的副作用特性而不同。在以下提供的實(shí)施例研究中,最高劑量為耐受的最大可行劑量。Adagen⑧以250U/mL商業(yè)提供。對(duì)于用0.2mlAdagen⑧注射的約25g小鼠相當(dāng)于2000U/kg。下文提供的實(shí)施例研究中使用的最低劑量近似于臨床的人劑量。治療人SCID患者中推薦的給藥方案為第一劑量10U/kg,第二劑量15U/kg，和第三劑量20U/kg。5U/kg/周的進(jìn)一步增加是允許的，直到最大單次劑量為30U/kg。以下示例的方案中的劑量(100U/kg)為約12U/kg臨床兒童劑量的小鼠等效劑量?；诿傅牧康膭┝繉?，例如，約0.10U/kg至約30U/kg,或更高，優(yōu)選約0.5U/kg至約20U/kg，且更優(yōu)選約0.5U/kg至約12U/kg(即每kg患者體重)如約0,5U/kg至約5U/kg?？傊軇┝靠筛哌_(dá)40U/kg,或更多，只要接受者耐受。5U/kg/周的進(jìn)一步增加是允許的，直到最大單次劑量為30U/kg,或更多，只要接受者耐受。通常，以15U/kg周注射ADAGEN⑧后,血漿中ADA活性的平均整體水平為20至25pmol/hr/mL。當(dāng)然，技術(shù)人員將理解聚合物-綴合的ADA的劑量還可根據(jù)具體聚合物大小、連接基化學(xué)物(linkerchemistiy)以及價(jià)態(tài)而調(diào)節(jié)。例如，相對(duì)于每個(gè)聚合物包含兩個(gè)或四個(gè)ADA酶的聚合綴合物，其給藥方案將根據(jù)任何具體的ADA聚合綴合物的每ml溶液中ADA的單位而調(diào)節(jié)。在通過注射提供ADA或ADAPEG-綴合物時(shí)，最佳劑量范圍可通過監(jiān)測(cè)血漿中的腺苷水平調(diào)節(jié)。通常需要向接受者提供以下劑量，其將保持血漿ADA活性(整體水平(troughlevels))為約10至100|imol/hr/mL，優(yōu)選約15至約35]Limol/hr/mL(在37。C測(cè)試)；且證實(shí)紅細(xì)胞腺苷的下降，即，在預(yù)注射樣品中測(cè)量，在濃縮的紅細(xì)胞(packederythrocyte)中dATP至《約0.001-0.057pmoI/mL，優(yōu)選約0.005-約0.015jumol/mL,或S約1%的總紅細(xì)胞腺芬(即，ATP+dATP含量)具有正常腺苷水平。dATP的正常值低于約0.001pmol/mL。ADA劑量信息的詳情描述于ADAGEN(Enzon,Inc.)中的處方插頁，其內(nèi)容在此引入。實(shí)施例以下實(shí)施例用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，但不以任何方式限制本發(fā)明的有效范圍。實(shí)施例1ADAGEN⑧在DU145人前列腺腫瘤異種移植模型中的抗腫瘤功效A)測(cè)試體系物種小鼠，小家鼠品系無胸腺棵鼠供應(yīng)商Harlan-SpragueDawley性別雌性平均初始重量27.2g研究的數(shù)量4033順應(yīng)期到來后7天鑒別籠號(hào)和耳穿孔B)方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)DU145人前列腺癌細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATTC),Manassas,VA。通過向右腋?jìng)?cè)皮下注射2.0x106DU145細(xì)胞/小鼠，在棵小鼠中建立腫瘤。每周兩次監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)且對(duì)可觸及的腫瘤測(cè)量一次。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均體積為78mr^時(shí)，將小鼠分為各個(gè)實(shí)驗(yàn)組(8/組)。小鼠用Adagen⑧以2000,500,或100IU/kg治療，每周兩次保持5周。作為陽性對(duì)照，小鼠以與Adagei^相同的頻率以5mg/kg劑量接受Avastin(貝伐單抗(Bevacizumab)，抗-VEGF單克隆抗體)。實(shí)驗(yàn)組按下表1所示建立。給藥的第一天指定為第1天。各小鼠的腫瘤體積通過用卡尺測(cè)量?jī)蓚€(gè)尺寸，并用下式計(jì)算而確定腫瘤體積=(長(zhǎng)x寬2)/2)。在研究開始時(shí)測(cè)量和在整個(gè)8周期間每周測(cè)兩次小鼠重量和腫瘤尺寸。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>劑量選擇Adagei^或Avastii^通過腹腔內(nèi)("i.p.")途徑每周給藥兩次，保持5周(總共10劑量)。Adagen:批號(hào)NV0604,濃度229IU/mlAvastin:批號(hào)M66781，濃度25mg/ml劑量計(jì)算基于在第1天測(cè)得的體重。臨床4全測(cè)小鼠在到來時(shí)可視檢測(cè)。之后，初始肺瘤可觸后將小鼠按個(gè)體每周檢測(cè)兩次，檢測(cè)臨床體征、一般行為變化，并監(jiān)測(cè)體重。記錄任意死亡和臨床體征。食物和水消耗未監(jiān)測(cè)。將帶有顯示開放壞死性損傷(opennecroticlesions)的腫瘤的小鼠處死。體重?fù)p失大于20%的小鼠也被人性化地處死。統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析比較不同治療間的腫瘤體積％變化的差異。使用Holm-Sidak方法進(jìn)行全配對(duì)多重比較。C)結(jié)果使用的術(shù)語的定義(a)%初始胂瘤體積(在任何指定天的腫瘤體積/第1天的腫瘤體積)x100(b)%腫瘤體積變化[(在任何指定天的腫瘤體積-第1天的腫瘤體積)/第1天的腫瘤體積]x100(c)%腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI):[(對(duì)照組的平均腫瘤體積-治療組的平均腫瘤體積)/對(duì)照組的平均腫瘤體積]x100(d)腫瘤的消退定義為相比第1天腫瘤體積減小(e)治愈定義為人肉眼觀察到的腫瘤的完全消失。研究開始時(shí)的平均腫瘤尺寸為78mm3。研究開始時(shí)的平均體重為27.20g。所有組中的小鼠體重增加，且到研究結(jié)束時(shí)各組中小鼠重量相比治療前的重量增加20至25%。該研究在第57天終止，此時(shí)大多數(shù)動(dòng)物具有潰瘍性腫瘤或腫瘤體積超過1500mm3。下表2和3總結(jié)了在研究第49天觀察到的最終結(jié)果(對(duì)照動(dòng)物100%存活的最后一天)，并提供了Adager^治療的動(dòng)物和Avastir^治療的動(dòng)物的組間存活比較。對(duì)照組中的肺瘤在整個(gè)研究中穩(wěn)定生長(zhǎng)。在第49天，平均腫瘤體積尺寸為783.1(士556.2)mm3。腫瘤生長(zhǎng)的百分比變化為833.3%(±622.7)。用Adager^在所有三個(gè)劑量水平的治療有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。應(yīng)注意對(duì)于所有治療組，腫瘤以緩慢速率生長(zhǎng)直到給藥最后一天(第33天)，之后腫瘤具有較快的生長(zhǎng)速率(數(shù)據(jù)未顯示)。與該觀察一致的是在Adager^所有三個(gè)劑量水平下肺瘤體積的％變化明顯不同于對(duì)照組，直到第36天(P〈0.05)(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明Adager^對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有細(xì)胞抑制作用。盡管在第36天后直到研究結(jié)束時(shí)，腫瘤體積的％變化與對(duì)照相比沒有顯著性差異，但用Adagen治療導(dǎo)致可^r測(cè)的肺瘤生長(zhǎng)抑制。特別是，用2000IU/kgAdager^治療的腫瘤的平均腫瘤體積在第49天為343.0(±249.8)mm3。腫瘤體積的平均變化為424.2%(±360.6)。2000IU/kg的Adager^顯示56%肺瘤生長(zhǎng)抑制。用500IU/kgAdagen⑧治療的腫瘤的平均腫瘤體積在第49天為696.3(±290.4)mm3。胂瘤體積的平均變化為797.6%(±492.7),且從初始腫瘤的變化為897.6%(±492.7)。腫瘤生長(zhǎng)抑制為11.1%。第40天前該組中的腫瘤具有與其它Adager^-治療組類似的腫瘤生長(zhǎng)速率，之后它們以更快的速率生長(zhǎng)。該差異的原因未知。用100IU/kgAdagei^治療的腫瘤的平均腫瘤體積在第49天為414.8(士219.0)mm3。腫瘤體積的平均變化為489.9%(±307.0)，且從初始腫瘤的平均百分變化為589.9%(士307.0)。腫瘤生長(zhǎng)抑制或TGI為47.0%。Adager^的治療效果在最低劑量100IU/kg達(dá)到最大效果。應(yīng)注意100IU7kg劑量近似于Adagen②的臨床人劑量(用于治療SCID兒童的劑量)。Avastin⑧顯示最有效地減少腫瘤尺寸，且腫瘤生長(zhǎng)抑制或TGI為92.5%?？傊肁dager^以所有三個(gè)劑量水平治療能在體內(nèi)有效抑制DU145腫瘤生長(zhǎng)。表2:最終總結(jié)(第49天)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>物種小鼠，小家鼠品系無胸腺棵鼠供應(yīng)商Harlan-SpragueDawley性別雌性平均初始重量22.18g研究的數(shù)量54順應(yīng)期到來后7天B)方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過向右腋?jìng)?cè)皮下注射3x106細(xì)胞/小鼠在棵小鼠中建立SK-OV-3人卵巢腺癌腫瘤。每周兩次監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)且對(duì)可觸及的腫瘤測(cè)量一次。各小鼠的腫瘤體積通過用卡尺測(cè)量?jī)蓚€(gè)尺寸，并用下式計(jì)算而確定腫瘤體積=(長(zhǎng)x寬2)/2)。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均體積為90mn^時(shí)，將小鼠分為各個(gè)實(shí)驗(yàn)組(9/組)。實(shí)驗(yàn)組按下表l所示建立。給藥的第一天指定為第1天。小鼠重量和腫瘤尺寸在研究開始時(shí)測(cè)量且每周測(cè)兩次直到研究終止。約7周(52天)后終止研究，此時(shí)大多數(shù)動(dòng)物具有大的或潰瘍性腫瘤塊。表4組#組存小鼠(n)劑量(U/kg)注射途徑給藥方案1對(duì)照9i卜7lC腹腔注射每周兩次x52Adagen92000腹腔注射每周兩次x53Adagen9500腹腔注射每周兩次x54Adagen9100腹腔注射每周兩次x55Avastin9100ug/小鼠腹腔注射每周兩次x56天然ADA92000腹腔注射每周兩次x5給藥方案Adagen、AvastiZ或天然ADA(NativeADA)每周兩次靜脈內(nèi)給藥，保持5周(總共10劑量)。試驗(yàn)樣品Adagen:批號(hào)NV0604,濃度Avastin:批號(hào)M66781,濃度天然ADA:批號(hào)06-0315-111劑量計(jì)算基于第1天測(cè)得的體重。臨床4企測(cè)小鼠在到來時(shí)可視檢測(cè)。之后，初始腫瘤可觸后將小鼠按個(gè)體每周檢測(cè)兩次，4僉測(cè)臨床體征、一般行為變化，并監(jiān)測(cè)體重。記錄任意死亡和臨床體征。食物和水消耗未監(jiān)測(cè)。將帶有顯示開放壞死性損傷(opennecroticlesions)的腫瘤的小鼠處死。體重?fù)p失大于20%的小鼠也被人性化地處死。統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析比較不同治療間的腫瘤體積％變化的差異。使用Tukey-Kramer方法進(jìn)行全配對(duì)多重比較。C)結(jié)果使用的術(shù)語的定義(a)%初始腫瘤體積(在任何指定天的腫瘤體積/第1天的腫瘤體積)x100(b)%肺瘤體積變化[(在任何指定天的腫瘤體積-第1天的腫瘤體積)/第1天的腫瘤體積]x100(c)%腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI):[(對(duì)照組的平均腫瘤體積-治療組的平均腫瘤體積)/對(duì)照組的平均腫瘤體積]x100(d)腫瘤的消退定義為相比第1天腫瘤體積減小(e)治愈定義為人肉眼觀察到的腫瘤的完全消失。研究開始時(shí)的平均腫瘤尺寸為90mm氣研究開始時(shí)的平均體重為22.2g。所有組中的平均體重在整個(gè)研究中沒有明顯變化。該研究在第52天終止。由于腫瘤生長(zhǎng)超過1500mn^處死四只小鼠。39229IU/ml25mg/ml下表5給出了在第32天的結(jié)果的最終總結(jié)(對(duì)照動(dòng)物66%存活的最后一天)。對(duì)照組中的肺瘤在整個(gè)研究中穩(wěn)定生長(zhǎng)。在第32天，平均腫瘤體積尺寸為754.9(±700.7)mm3。腫瘤生長(zhǎng)的百分比變化為693.2%(士673.6)。表5:最終總結(jié)(第32天)組號(hào)化合物最終平均腫瘤體積最終腫瘤體積中值腫瘤體積的％變化%初始胂瘤體積%初始腫瘤體積#消退#治愈%存活i鹽水754.9(700.7)485.5693.2(673.6)793.2(673.6)-00662Adagen(2000IU/kg)437.7(122.2)446.4402.1(177.7)502.1(177.7)42.000100Adagen(500謹(jǐn)g)471.1(60.0)465.8421.3(102.2)521.3(102.2)37.600894Adagen(100謹(jǐn)g)497.7(152.6)478.9450.7(172.7)550.7(172,7)34.1001005Avastin(5mg/kg)210.2(65.9)198.6161.6(88.3)261.6(88.3)72,2001006天然ADA(2000腿g)356.6(213.0)329.7340.1(239.1)440.1(239.1)52.80077用2000IU/kgAdage,治療的腫瘤的平均腫瘤體積在第32天為437.7(±122.2)mm3。腫瘤體積的平均變化為402.1%(±177.7)。2000IU/kg的Adagen⑧顯示42%腫瘤生長(zhǎng)抑制。用500IU/kgAdagei/治療的腫瘤的平均腫瘤體積在第32天為471.1(±60.0)mm3。腫瘤體積的平均變化為421.3%(±102.2)，且從初始腫瘤的變化為521.3%(±102.2)。腫瘤生長(zhǎng)抑制為37.6%。用100IU/kgAdagen⑧治療的腫瘤的平均腫瘤體積在第32天為497.7(±152.6)mm3。腫瘤體積的平均變化為450.7%(±172.7),且從初始腫瘤的平均百分比變化為550.7%(±172.7)。腫瘤生長(zhǎng)抑制為34.1%。用2000IU/kg天然ADA治療的腫瘤的平均胂瘤體積在第32天為356.6(213.0)mm3。腫瘤體積的平均變化為340.1%(±210.0)，且從初始腫瘤的平均百分比變化為440.1%(239.1)。腫瘤生長(zhǎng)抑制為52.8%。用任一劑量水平的Adagen的治療與對(duì)照組相當(dāng)。然而，各劑量水平的Adagen產(chǎn)生上述的TGI。Adagen⑧的治療效果以最低劑量100IU/kg達(dá)到最大效果。應(yīng)注意100IU/kg劑量近似于Adagen⑧的臨床人劑量(用于治療SCID兒童的劑量)。在該研究中作為陽性對(duì)照的Avastin⑧顯示最有效地減少腫瘤尺寸，且TGI為72%。總之，用Adagen以100,500或2000IU/kg治療導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制范圍為34-42%。用于本發(fā)明方法的其它重組ADA酶如下描述。實(shí)施例3表達(dá)重組人ADA的大腸桿菌表達(dá)菌抹的構(gòu)建，在成熟蛋白的74位具有Cys至Ser的變化分析報(bào)道的人腺苷脫氨酶的363氨基酸序列(GenBankNP_000013,在此引入作為參考)的半胱氨酸密碼子的存在。成熟(N-末端的Met被切割)多肽中的5個(gè)位置編碼半胱氨酸(C74，C152,C153,C168,C261)。在表達(dá)人ADA的設(shè)計(jì)的和修飾的基因中，這5個(gè)半胱氨酸密碼子中僅1個(gè)(半胱氨酸74，TGC)改變?yōu)榻z氨酸密碼子(TCC)(其為翻譯的蛋白質(zhì)中的75位)。使用重疊寡核苷酸片段的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)合成，將限定的多肽序列(參見SEQIDNO:3)提供給BlueHeronCorporation(Bothell,Washington,U.S.A.)用于全基因合成新基因，該新基因具有對(duì)為大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。簡(jiǎn)言之，按照用于大腸桿菌K12的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌密碼子優(yōu)化該序列用于細(xì)菌表達(dá)，使用描述于以下的密碼子數(shù)據(jù)GranthamR.等人；1981，"Codoncatalogueusageingenomestrategymodulatedforgeneexpressivity,"NucleicAcidRes.9:r43-r47，和Lathe,R.1985,"Syntheticoligonucleotideprobesdeducedfromaminoacidsequencedata,Theoreticalandpracticalconsiderations,"J.MolBiol;183:1-12。然后分析相應(yīng)的RNA序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成或環(huán)形成(loopformation)并進(jìn)行最小自由能計(jì)算。側(cè)翼限制位點(diǎn)Ndel和BamHI包含在基因的末端。在用限制酶Ndel和BamHI消化該合成DNA后，將1.1千堿基基因通過T4DNA連接酶連接至質(zhì)粒載體pET-28a(NovagenCorporation),該質(zhì)粒載體pET-28a也已用這兩種酶消化。通過電穿孔使用BTXElectroCellManipulator600根據(jù)制造商的說明將重組質(zhì)粒引入大腸桿菌菌林BLR(DE3)或HMS174(DE3)。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于含卡那霉素(15pg/ml)的LB瓊脂平板上，以允許選擇含質(zhì)粒pET-28a/ADAcysSer的菌落(命名為ADAc75s/pET28a:BLR(DE3)或ADAc75s/pET28a:畫S174(DE3》。該ADA變體基因核苷酸序列通過ABIPrism310GeneticAnalyzer使用BigDyeTerminators通過DNA序列分析證實(shí)。該編碼Ser74-rhADA可讀框的DNA序列根據(jù)SEQIDNO:4。分離的菌落進(jìn)一步通過鋪板純化并分析在LB培養(yǎng)基中IPTG可誘導(dǎo)的基因表達(dá)，其通過標(biāo)準(zhǔn)方法如描述于NovagenpETSystemManualNinthEdition的方法進(jìn)行，在此引入作為參考。檢測(cè)了幾個(gè)誘導(dǎo)參數(shù)，包括時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度。優(yōu)選條件是在25°C用50IPTG誘導(dǎo)12小時(shí)，其使得以總細(xì)胞蛋白質(zhì)的約20%在宿主細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高水平產(chǎn)生ADA。表達(dá)的ADA蛋白在SDSPAGE分析中證實(shí)，顯示正確分子量為約40kDa(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例4表達(dá)重組牛ADA的大腸桿菌表達(dá)菌抹的構(gòu)建，在成熟蛋白的74位具有Cys至Ser的變化源自牛腸制備物的純化的成熟ADA蛋白為從cDNA序列預(yù)測(cè)缺失N-末端蛋氨酸且還缺失最后6個(gè)C-末端殘基的356氨基酸蛋白質(zhì)(GenBankNP—776312,在此引入作為參考)。分析牛ADA氨基酸序列的半胱氨酸密碼子的存在。成熟多肽中的5個(gè)位置編碼半胱氨酸(C74，C152，C153，C168，C261)。在設(shè)計(jì)的和修飾的牛ADA合成基因中，這5個(gè)半胱氨酸位置中僅1個(gè)(半胱氨酸74)改變?yōu)榻z氨酸殘基。這通過插入絲氨酸密碼子(TCC)代替在成熟多肽的74位(或翻譯產(chǎn)物的75位)的正常半胱氨酸密碼子而進(jìn)行。該基因還是為在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。簡(jiǎn)言之，將限定的多肽序列(參見SEQIDNO:l)提供給BioCatalyticsInc.用于全基因合成新基因，該新基因具有為在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，使用包括化學(xué)合成重疊寡核苷酸片段的方法。該BioCatalytics方法由美國(guó)專利號(hào)6,366,860更詳細(xì)的描述，其內(nèi)容以其整體在此引入作為參考。42在幾種表達(dá)體系中研究牛ADA表達(dá)。例如，側(cè)翼限制位點(diǎn)Ndel和BamHI包含在基因的末端。在用限制酶Ndel和BamHI消化該合成DNA后，該1.1千堿基基因通過T4DNA連接酶連接入質(zhì)粒載體pET-9d(NovagenCorporation),該質(zhì)粒載體pET-9d也已用這兩種酶消化。通過電穿孔使用BTXElectroCellManipulator600根據(jù)制造商的說明將重組質(zhì)粒引入大腸桿菌菌抹BLR(DE3)或HMS174(DE3)。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于含卡那霉素(15pg/ml)的LB瓊脂平板上，以允許選擇含質(zhì)粒pET-9d/bADA的菌落(命名為bADA/pET9d:BLR(DE3)或bADA/pET9d:固S174(DE3))。該ADA變體基因才亥香酉臾序列通過ABIPrism310GeneticAnalyzer4吏用BigDyeTerminators通過DNA序列分析證實(shí)。該DNA的可讀框由SEQIDNO:2所示。分離的菌落通過鋪板進(jìn)一步純化并用于分析在LB培養(yǎng)基中IPTG可誘導(dǎo)的基因表達(dá)，其通過標(biāo)準(zhǔn)方法如描述于NovagenpETSystemManualNinthEdition的方法進(jìn)行。檢測(cè)了幾個(gè)誘導(dǎo)參數(shù)，包括時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度。優(yōu)選條件是在37°C用0.3%乳糖誘導(dǎo)12小時(shí)，其使得以總細(xì)胞蛋白質(zhì)的約20%在宿主細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高水平產(chǎn)生ADA。ADA產(chǎn)物在SDSPAGE分析中證實(shí)，顯示正確分子量為約40kDa。實(shí)施例5重組人突變蛋白ADA蛋白的純化rhADA的純化以Enzon開發(fā)的3色譜規(guī)程進(jìn)行。進(jìn)行大腸桿菌的細(xì)菌發(fā)酵，所述大腸桿菌由宿主細(xì)胞HMS174(DE3)中質(zhì)粒pET28a(Novagen)上的合成基因表達(dá)rhADA蛋白。將利福平(200pg/ml)和卡那霉素(30(ig/ml)包括在補(bǔ)充有酵母提取物(30g/l)的基本甘油培養(yǎng)基中，且當(dāng)添加誘導(dǎo)劑IPTG至5mM最終濃度時(shí)細(xì)胞在28。C生長(zhǎng)至OD,為11。40小時(shí)后(OD,~110),通過離心收獲細(xì)胞并在-20。C冷凍。簡(jiǎn)言之，將解凍的細(xì)胞漿(50g)重懸浮于1800ml的lOmMTris,ImMDTT，pH8.0的緩沖液中，并用TempestVirtis(Sentry,Microprocessor,Boston,MA)以1200RPM勻漿10秒。將該懸浮液通過不銹鋼篩網(wǎng)(開孔微米數(shù)(Openingmicrometer)250|a,No.60,W.STyler)以去除大顆粒。將均勻的細(xì)胞懸浮液在15,000psi微流化3個(gè)循環(huán)(設(shè)備用水浴冷卻)(MicroFluidizer,MicrofluidicsCorp.,Model#110Y，Boston,MA)。在微流化結(jié)束時(shí)，將200ml上述相同的援沖液用于沖洗該設(shè)備，且將該溶液與上述懸浮液合并。源自細(xì)胞裂解物的可溶蛋白質(zhì)通過以16，000rpm在4。C離心40分鐘而提取(Sorvall㊣RC5Cplus,轉(zhuǎn)子SLA-IOOO)。小心收集上清液以避免不希望的混合。將pH調(diào)節(jié)至8.0，且添加1mMMgCl2和20mg/mLDNase并在室溫培養(yǎng)2小時(shí)。然后將pH用1NHC1調(diào)節(jié)至6.5。如上進(jìn)行第二次離心，收集上清液，且調(diào)節(jié)至2mMEDTA，然后在Nalgene(90mm過濾裝置)上過濾。過濾的上清液的體積為500ml，通過BCA方法測(cè)定的總蛋白質(zhì)濃度為8.5mg/ml。將細(xì)胞提取物(IOOml)調(diào)節(jié)至pH7.2、4.5mS/cm,并以20mMBis-Tris，20mMNaCl,pH6.5加載至HiTrapDEAEff上，并用20mMBis-Tris,500mMNaCl,pH6.5洗脫。峰級(jí)分用酶測(cè)試和SDS-PAGE鑒定且調(diào)節(jié)至20mMNaHP04中的1.5M硫酸銨，pH6.5中，并裝載在HiTrapPhenylff柱上。蛋白質(zhì)用負(fù)載緩沖液和20mMNaHP04,pH6.5梯度洗脫。將峰級(jí)分(55ml;0.4mg/ml)相對(duì)20mMNaHP04,1mMEDTA，1mMDTT，pH6.5滲濾，并裝載在HiTrapSP-Sepharoseff上并用20mMNaHP04,500mMNaCl,1mMEDTA，1mMDTT，pH6.5洗脫。收集的級(jí)分包含純化的ADA蛋白(77ml;0.1mg/ml)。實(shí)施例6純化重組牛ADA蛋白實(shí)施例4的克隆所表達(dá)的rbADA的純化以Enzon開發(fā)的3色譜規(guī)程進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將儲(chǔ)存于-80。C的200g解凍的細(xì)胞漿(分別獲自BlueHereon或Biocatalytics)重懸于1800ml的20mMBis-Tris,lmMEDTA,pH7.4緩沖液，且用TempestVirtis(Sentry,Microprocessor,Boston,MA)以1200RPM勻漿5分鐘。將該懸浮液通過不銹鋼篩網(wǎng)(開孔微米數(shù)250ia,No.60,W.STyler)以去除大顆粒。將均勻的細(xì)胞懸浮液在15,000psi微流化3個(gè)循環(huán)(設(shè)備用冰浴冷卻)(MicroFluidizer,MicrofluidicsCorp.,型號(hào)#110Y，Boston,MA)。在微流化結(jié)束時(shí)，將200ml與上述相同的緩沖液用于沖洗該設(shè)備，且將該溶液與上述懸浮液合并。源自細(xì)胞裂解物的可溶蛋白質(zhì)通過在7100rpm(12000xg)在4。C離心60分鐘而提取(AvantiJ-201,BeckmanCoulter;Rotor#JLA8.1000)。小心收集上清液以避免不希望的混合。為去除該細(xì)胞提取物中的核苷酸，將聚乙烯亞胺(PEI)添加至上述上清液中(最終0.15%,wt/v)并通過攪拌充分混合10分鐘。然后將該細(xì)胞提取物在4。C靜置過夜。該過夜樣品中的沉淀物通過以7100rpm(12000xg)在4。C離心60分鐘而去除(AvantiJ-201,BeckmanCoulter;Rotor#JLA8.1000)。類似的，小心收集上清液以避免任何不希望的混合。為幫助ADA結(jié)合至第一柱，將10°/。PEG4600緩慢添加至該細(xì)胞提取物中且將該細(xì)胞提取物的pH用1NNaOH和1NHC1緩慢調(diào)節(jié)至6.5。在裝載至下一柱前，將該上清液以7100rpm(12000xg)在4。C再離心60分鐘(AvantiJ-201,BeckmanCoulter;Rotor#JLA8.1000)。將細(xì)月包4是耳又物加載至以20mMBis-Tris，1mMEDTA，pH6.5的緩沖液預(yù)平衡的CaptoQ柱上(Cat#17-5316-01,GEHealthcare,Piscataway，NJ.柱床體積350ml預(yù)裝在XK-50柱中)。在以平衡緩沖液中的80mMNaCl將ADA從柱洗脫前，首先進(jìn)行60mM和70mMNaCl的洗脫以去除雜質(zhì)。通過ADA活性、SDS-PAGE分析、蛋白質(zhì)印跡和RP-HPLC分析洗脫狀況。經(jīng)過CaptoQ柱后，使用兩個(gè)疏水作用色譜純化，一個(gè)接一個(gè)，以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的純度。第一個(gè)HIC為辛基瓊脂糖4FF(Cat#17-0946-02,GEHealthcare,Piscataway,NJ)。將源自CaptoQ柱的ADA級(jí)分的匯集物(pool)用硫酸銨粉末直接調(diào)節(jié)至1.5M(NH4)2S04并將pH調(diào)節(jié)至6.5。將過濾的樣品(NalgeneNunc,CAT#540887,MEMB0.2PES,Rochester,NY)加載至第一HIC柱上，該柱用1.5M(NH4)2S04,20mM磷酸鉀，1mMEDTA,pH6.5預(yù)平衡(柱床體積150ml,于XK-50中，GEHealthcare,Piscataway,NJ)。該ADA蛋白用硫酸銨梯度洗脫且該洗脫的純度狀況通過SDS-PAGE和RP-HPLC測(cè)定。匯集第一HIC柱的級(jí)分中的ADA蛋白且調(diào)節(jié)至1M(NH4)2S04并直接加載至第二HIC柱(柱床體積150ml，XK-50,HICPhenylHP,Cat#17-1082-01,Piscataway,NJ)，該柱用1M(NH4)2S04，20mMKH2P04-K2HP04,1mMEDTA，pH6.5預(yù)平衡。ADA用20mMKH2P04-K2HP04,1mMEDTA,pH6.5中的1M至300mM硫酸銨梯度洗脫。這些級(jí)分的ADA純度通過SDS-PAGE和RP-HPLC分析。純化的rbADA或rhADA進(jìn)一步在LabScaleTFF系統(tǒng)(MembraneBioMax5,Bedford,MA)中相對(duì)儲(chǔ)存緩沖液(例如，100mM磷酸鈉，1mMEDTA,pH6.5)脫鹽和濃縮。實(shí)施例7通過尿烷連接的PEG化的Ser74-rbADA的制備45在輕微攪拌下將SC-PEG(N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸S旨-活化的聚乙二醇:0.084mmol)添加至Ser74-rbADA(0.00027mmol)在3mL磷酸鈉緩沖液(0.1M，pH7.8)中的溶液中。該溶液在30。C攪拌30分鐘。使用GPC柱(ZorbaxGF450)監(jiān)測(cè)PEG綴合。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)(通過天然酶的缺失證實(shí))，該混合物用12mL配制緩沖液(0.05M磷酸鈉，0.85%氯化鈉，pH7.3)稀釋并用Centr;prep濃縮器(Ainicon)滲濾以去除未反應(yīng)的PEG。滲濾按需要在4°C繼續(xù)直到通過混合等量的濾液和0.1%PMA(0.1MHC1中的聚甲基丙烯酸)不再^r測(cè)到更多的游離PEG。實(shí)施例8通過尿烷連接的PEG化的Ser74-rhADA的制備使用與實(shí)施例7相同的條件將SC-PEG(0.084mmol)與Ser74-rhADA(0.00027mmol)反應(yīng)。實(shí)施例9通過酰胺連接的PEG化的Ser74-rbADA的制備在輕微攪拌下將SS-PEG(N-羥基琥珀酰亞胺基琥珀酸酯-活化的聚乙二醇，0.084mmol)添加至Ser74-rbADA(0.00027mmol)在3mL磷酸鈉緩沖液(0.1M,pH7.8)中的溶液中。該溶液在30°C攪拌30分鐘。使用GPC柱(ZorbaxGF-450)監(jiān)測(cè)PEG綴合。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)(通過天然酶的缺失證實(shí))，該混合物用12mL配制緩沖液(0.05M磷酸鈉，0.85%氯化鈉，pH7.3)稀釋并用Centriprep濃縮器(Amicon)滲濾以去除未反應(yīng)的PEG。滲濾按需要在4°C繼續(xù)直到通過混合等量的濾液和0.1%PMA(0.1MHCl中的聚曱基丙烯酸)不再檢測(cè)到更多的游離PEG。實(shí)施例10通過酰胺連接的PEG化的突變蛋白rhADA的制備使用與實(shí)施例9所述相同的條件將SS-PEG(0.084mmol)與突變蛋白rhADA(0.00027mmol)反應(yīng)。權(quán)利要求1.治療具有腫瘤的患者的方法，包括向需要的患者給藥有效量的腺苷脫氨酶。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤是惡性的。3.權(quán)利要求1的方法，其中給藥的腺苷脫氨酶的量有效地實(shí)質(zhì)性減少腺苷或脫氧腺苷在所述患者中的組織水平，且其中腫瘤的生長(zhǎng)或擴(kuò)散被所述患者中減少的腺苷組織水平所抑制。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤是實(shí)體瘤。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤選自前列腺腫瘤、卵巢癌和結(jié)腸直腸癌。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述腺苷脫氨酶綴合至基本上非抗原性聚合物。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基本上非抗原性聚合物為聚環(huán)氧烷。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述聚環(huán)氧烷為聚乙二醇。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述基本上非抗原性聚合物的大小范圍為約4,000至約45,000道爾頓。10.權(quán)利要求6的方法，其中所述綴合的腺苷脫氨酶的給藥劑量范圍為每kg約IOU至約30U。11.權(quán)利要求1的方法，其中給藥所述綴合的腺苷脫氨酶足夠的時(shí)間以保持腫瘤的抑制。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述腺苷脫氨酶的給藥時(shí)間為1至約20天。13.權(quán)利要求6的方法，其中相對(duì)于每個(gè)基本上非抗原性聚合物所述綴合物包含2個(gè)或更多個(gè)腺苷脫氨酶分子。14.權(quán)利要求6的方法，其中所述腺苷脫氨酶包含附接至腺苷脫氨酶的一個(gè)或多個(gè)Lys殘基的s氨基的約ll個(gè)至約18個(gè)聚乙二醇鏈。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述腺苷脫氨酶通過尿烷連接綴合至聚乙二醇。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述腺苷脫氨酶通過選自以下的途徑給藥皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、吸入和經(jīng)尿道。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述腺苷脫氨酶為從牛來源純化的腺苷脫氨酶或?yàn)橹亟M腺苷脫氨酶。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述重組腺苷脫氨酶選自包含SEQIDNO:1的重組牛腺苷脫氨酶、包含SEQIDNO:3的重組人腺苷脫氨酶和包含SEQIDNO:5的重組牛腺苷脫氨酶。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述包含SEQIDNO:5的重組牛腺苷脫氨酶包含Cys74，該Cys74被封端以防止在水性介質(zhì)中氧化。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述重組腺苷脫氨酶是根據(jù)SEQIDNO:1或SEQIDNO:5，且具有選自以下的氨基酸取代Gin代替Lys198;Ala代替Thr245;Arg代替Gly351,及其組合。21.抑制哺乳動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物給藥有效量的腺苦脫氨酶或其活性片段。全文摘要本文提供治療具有腫瘤的患者的方法，包括向需要的患者給藥有效量的腺苷脫氨酶，優(yōu)選聚環(huán)氧烷綴合的腺苷脫氨酶。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101680039SQ200880021105公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日發(fā)明者戴維·R·菲爾普拉,普賈·薩普拉申請(qǐng)人:安佐制藥股份有限公司