專利名稱：與肥胖癥和/或ⅱ型糖尿病相關(guān)的fto基因多態(tài)性的制作方法
與肥胖癥和/或I I型糖尿病相關(guān)的FTO基因多態(tài)性本發(fā)明涉及診斷、預(yù)測(cè)、治療和/或預(yù)防人類的肥胖癥和/或Ii型糖尿病的工具。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明提供人類的肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷 和/或預(yù)測(cè)的工具(means)和方法(methods)，該工具或方法是以核酸生物標(biāo)記的檢測(cè)為基 礎(chǔ)的，所述的生物標(biāo)記屬于肥胖基因(FTO)的一套SNP (單核苷酸多態(tài)性)，或與肥胖基因 (FTO)的一套SNP (單核苷酸多態(tài)性)相關(guān)。本發(fā)明還提供鑒定與人類的肥胖癥和/或II型糖尿病的易感性相關(guān)的SNP單倍 型(haplotype)的工具和方法，以及選擇用于預(yù)防和/或治療人類的肥胖癥和/或II型糖 尿病的藥物制劑的工具和方法。肥胖癥是這樣一種狀況，其中人類或其他哺乳動(dòng)物的脂肪組織中貯存的天然能量 儲(chǔ)藏增加到一個(gè)點(diǎn)，該點(diǎn)與某些健康狀況相關(guān)或增加死亡率。肥胖癥既是個(gè)體臨床狀況也日益被視為嚴(yán)重的公共的健康問題?，F(xiàn)在普遍已知， 體重超重易罹患各種疾病，尤其是心血管疾病，睡眠呼吸暫停，骨關(guān)節(jié)炎和II型糖尿病。更 準(zhǔn)確地說，肥胖癥，尤其是向心性肥胖癥(男性型肥胖癥或以腰部肥胖為主的肥胖癥)是集 合多種疾病的“代謝綜合征”(“綜合征X”)的重要的危險(xiǎn)因子，并是非常易于罹患心血管 疾病的危險(xiǎn)因子。這些危險(xiǎn)因子是II型糖尿病，高血壓，高血膽固醇和甘油三酯水平(合 并高脂血癥)。與上述一起出現(xiàn)的炎癥狀態(tài)參與形成動(dòng)脈硬化的高患病率，并且前血栓形成 狀態(tài)進(jìn)一步惡化心血管的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床環(huán)境中，典型地通過測(cè)定BMI (體重指數(shù))，腰圍和評(píng)價(jià)危險(xiǎn)因子和并發(fā)癥 的出現(xiàn)來評(píng)價(jià)肥胖癥。在流行病學(xué)研究中，BMI單獨(dú)用作肥胖癥的患病率和發(fā)病率指數(shù)。通 過將受試者的體重(千克)除以他/她身高(米)的平方而計(jì)算出BMI BMI = (kg/m2)或 BMI =[體重(磅)x703/ 身高(英寸)2]一般而言，認(rèn)為-BMI低于18. 5是體重過輕-BMI介于18. 5-24. 9是正常體重
-BMI 介于 25. 0-29. 9 是超重-BMI 介于 30. 0-39. 9 是肥胖-BMI為40. 0或更高是嚴(yán)重(或重度)肥胖-而且，BMI為35.0或更高，同時(shí)患有至少一種其他的明顯的并存疾病，則通常被 劃分為病理性肥胖癥。已經(jīng)提示有助于肥胖癥的發(fā)生發(fā)展的因素不僅包括進(jìn)食過多，還包括-遺傳因素和一些遺傳失調(diào)(如Prader-Willi綜合征)；-基礎(chǔ)性疾病(如甲狀腺功能低下)；-某些藥物(如非典型的抗精神病藥物)；_久坐的生活方法；等經(jīng)常認(rèn)為肥胖癥是遺傳和非遺傳因素聯(lián)合作用的結(jié)果。在這方面，仍需鑒定致病 基因。
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目前，肥胖癥是發(fā)達(dá)國(guó)家和新興國(guó)家面對(duì)的最大的健康問題。在所有對(duì)抗肥胖癥的可用的方法之中，應(yīng)用外科手術(shù)治療肥胖癥日益增多。這 一技術(shù)由沿胃的頂部放置硅樹脂環(huán)以幫助限制日常吃入的食物量組成。并且已經(jīng)使用其 它侵入性更大的外科技術(shù)，這些侵入性更大的外科技術(shù)將消化道的任何部分切除或再造 (reroute)。然而，所有這些外科技術(shù)給患者帶來風(fēng)險(xiǎn)，并且這些技術(shù)或者不能保證成功減 肥，或者不能降低發(fā)病率(morbidity)和死亡率(mortality)。因此，本領(lǐng)域需要新的對(duì)于對(duì)抗肥胖癥真正有效的藥物。在這方面，鑒定參與肥胖 癥的發(fā)病的，并因此是有希望的獲選治療靶的基因，是科學(xué)家和醫(yī)務(wù)人員更嚴(yán)重關(guān)心的問 題之一。確切地說，本發(fā)明旨在通過公開迄今為止在遺傳因素和肥胖癥之間的最顯著相關(guān) 性來滿足這種需要。實(shí)際上，本發(fā)明是基于在歐洲人群中，在肥胖基因(FTO)座位上的幾個(gè) SNP (單核苷酸多態(tài)性)與肥胖癥的早期發(fā)病和嚴(yán)重的肥胖癥之間，以及與與II型糖尿病相 關(guān)的肥胖癥之間具有高度的和顯著的相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)。SNP代表遺傳變異的最普遍的形式中的一種形式。當(dāng)基因組中的單個(gè)核苷酸發(fā)生 改變(如經(jīng)取代、添加或缺失)時(shí)，這些多態(tài)性出現(xiàn)。序列的就多態(tài)性位點(diǎn)而言的每一個(gè)版 本被稱為多態(tài)性位點(diǎn)的“等位基因”。SNP傾向于從一代之一代之間進(jìn)化得穩(wěn)定，因此SNP能 用于研究整個(gè)人群之中的特異性的遺傳異常。如果SNP出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼區(qū)，它能導(dǎo)致變 異形式的蛋白質(zhì)的表達(dá)，這些變異形式的蛋白質(zhì)有時(shí)是有缺陷的蛋白質(zhì)，這些形式的蛋白 質(zhì)的表達(dá)可導(dǎo)致遺傳性疾病的發(fā)生。一些SNP可出現(xiàn)在非編碼區(qū)，但是雖然如此，仍可導(dǎo)致 有差別的或缺陷性的剪切或改變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。因此，SNP能用作遺傳性疾病的有效 的指示。SNP還能用作鑒定對(duì)某種疾病具有遺傳易感性(predisposition)的個(gè)體的診斷工 具，用于對(duì)患病個(gè)體進(jìn)行基因分型的工具，和基于發(fā)現(xiàn)的靶蛋白在致病過程中的作用的知 識(shí)，用作促進(jìn)藥物開發(fā)的工具。為了避免被人懷疑，本發(fā)明所述的方法不包含在人體上實(shí)施的診斷方法。本發(fā)明 所述的方法優(yōu)選在以前自個(gè)體取出的樣品上進(jìn)行。在下文描述的本發(fā)明所述的試劑盒可包 括自個(gè)體提取樣品的方法。本發(fā)明所述的方法能夠在發(fā)病之初或發(fā)病之前精確評(píng)價(jià)個(gè)體健康罹患肥胖癥和/ 或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，因此，降低或減小了肥胖癥和/或II型糖尿病的負(fù)面效果。尤其是， 本發(fā)明能夠更好地預(yù)測(cè)患肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，并因此能夠更好地預(yù)測(cè)患后續(xù) 的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明所述的方法能應(yīng)用于無臨床癥狀和肥胖癥和/或II型糖尿病表 現(xiàn)的人，在這些人中有些已經(jīng)患有肥胖癥和/或II型糖尿病，有些具有肥胖癥和/或II型 糖尿病的家族史，或者有些已經(jīng)有肥胖癥和/或II型糖尿病的危險(xiǎn)因子的水平升高。在本發(fā)明的上下文中，“生物標(biāo)記”(本文也稱為“標(biāo)記”)是一種指示人類的肥胖 癥和/或II型糖尿病的遺傳標(biāo)記，也就是說，是一種其特異地和顯著地參與肥胖癥和/或 II型糖尿病發(fā)病的核酸序列。在本發(fā)明的上下文中，這種標(biāo)記可還被稱為“肥胖癥和/或 II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)SNP標(biāo)記”或“風(fēng)險(xiǎn)SNP標(biāo)記”或“風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記”或“SNP標(biāo)記”。通常，本發(fā)明所用的遺傳標(biāo)記是與肥胖癥和/或II型糖尿病相關(guān)的“多態(tài)位點(diǎn)” 的特定的等位基因?；蚪M中的在人群中在該位置上可能有一個(gè)以上的序列的核苷酸位置 被稱為“多態(tài)位點(diǎn)”。當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)是單個(gè)核苷酸長(zhǎng)時(shí)，該位點(diǎn)一般被稱為“SNP”。例如，如果在特定的染色體位置上，人群中一個(gè)成員是腺嘌呤，而在同一位置人群中另一個(gè)成員是胸 腺嘌呤，那么這個(gè)位置是多態(tài)性位點(diǎn)，并且更明確地說，該多態(tài)性位點(diǎn)是SNP。由于，例如，插 入、缺失、轉(zhuǎn)換、取代、復(fù)制或轉(zhuǎn)座，多態(tài)性位點(diǎn)可以是幾個(gè)核酸長(zhǎng)。就多態(tài)性位點(diǎn)而言的序 列的每個(gè)版本被稱為多態(tài)性位點(diǎn)的“等位基因”。因此，在之前的例子中，SNP可以是腺嘌呤 等位基因也可以是胸腺嘌呤等位基因。這些等位基因是“變異體”等位基因。核苷酸序列 變異體，其位于編碼區(qū)或者位于非編碼區(qū)，能導(dǎo)致編碼多肽的序列發(fā)生改變，因而影響其性 能(活性改變，分布改變，穩(wěn)定性改變等)?；蛘?，核苷酸序列變異體，其位于編碼或非編碼 區(qū)，能導(dǎo)致發(fā)生影響基因的轉(zhuǎn)錄或它的mRNA的翻譯的變化。在所有情況下，改變可定性或 定量，或既可定性也可定量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可容易地識(shí)別出能通過能夠確定在多態(tài)性位點(diǎn)存在核苷酸的 任何方法或技術(shù)進(jìn)行在個(gè)體的核酸中在本文所公開的一個(gè)或幾個(gè)SNP標(biāo)記上存在的核苷 酸的分析。例如，一個(gè)人能用本發(fā)明所述的方法通過進(jìn)行測(cè)序、微測(cè)序、雜交、限制性片段分 析、寡核苷酸連接檢測(cè)、等位基因特異性PCR或聯(lián)合應(yīng)用上述方法檢測(cè)生物標(biāo)記。當(dāng)然，這 一列表僅是示例性的，并且絕不用于限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何合適的方法 來實(shí)現(xiàn)這種檢測(cè)。存在于SNP標(biāo)記中的核苷酸能從任一核酸鏈或從雙鏈上被確定，這在本領(lǐng)域是顯 而易見的。在本發(fā)明的上下文中所用的生物標(biāo)記是與FTO基因“相關(guān)”的，這意味著所述的生 物標(biāo)記是結(jié)構(gòu)上與FTO基因相關(guān)，例如，該生物標(biāo)記或者在FTO基因座內(nèi)或者在與其高度近 似的基因座內(nèi)，和/或意味著所述的生物標(biāo)記與FTO基因功能相關(guān)，例如與FTO基因或其表 達(dá)產(chǎn)物相互作用或影響FTO基因或其表達(dá)產(chǎn)物的生物標(biāo)記。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的方法和試劑盒中所使用的生物標(biāo)記選自下表2、3和6-9 中任何一個(gè)表中所列出的單核苷酸多態(tài)性(SNP)(見下列實(shí)施例的第II部分)。然而優(yōu) 選地，表2、3和6-9中任何一個(gè)表中所列出的一些具有高度的顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值的SNP選 自 rs9940128、rsl421085、rsll21980、rsl7817449、rs3751812、rsll075990、rs9941349、 rs7206790、rs8047395、rsl0852521、rsl477196 或 rs4783819。在該組中，SNPrs9940128、 rsl421085、rsll21980、rs3751812、rs7206790、rs8047395 和 rsl7817449 尤其令人感興趣。 然而更優(yōu)選的是，將至少使用SNP rsl421085或rsl7817449。另外，生物標(biāo)記可以是選自下表2、3和6-9中任何一個(gè)表中所列的至少一個(gè)SNP 相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。正如以上定義，術(shù)語(yǔ)“相關(guān)”意味著所述的生物標(biāo)記與所述的SNP在結(jié) 構(gòu)上和/或功能上相關(guān)。更特異的是，術(shù)語(yǔ)“相關(guān)”意味著所述的生物標(biāo)記與所述的SNP高 度連鎖不平衡，即這些生物標(biāo)記與所述SNP在HapMap歐洲數(shù)據(jù)集中和/或在如下文所顯示 的發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性分析的人群中呈現(xiàn)出的關(guān)聯(lián)名為r2的至少0. 6，和/或名為D'的 為 0. 5。然而另外，生物標(biāo)記可以是與選自下表2、3和6-9中任何一個(gè)表中所列的至少一 個(gè)SNP完全連鎖不平衡的多態(tài)性位點(diǎn)。因此，本發(fā)明的第一方面涉及在人類受試者中進(jìn)行體外風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/ 或預(yù)測(cè)肥胖癥和/或II型糖尿病的方法，其至少包含a)檢測(cè)來自所述的人類受試者的樣品中的核苷酸中的至少一種與FTO基因相關(guān)的生物標(biāo)記；和b)將所述的人類受試者中獲得的在步驟a)中獲得的生物標(biāo)記的數(shù)據(jù)與健康和/ 或患病人群的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，對(duì)所述人類受試者做出肥胖癥和/或II型糖尿病的 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)。“風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)”在本文意味著本發(fā)明使評(píng)價(jià)或評(píng)估人類受試者發(fā)生肥胖癥和/或II 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)成為可能(也可稱作“易感性或敏感性評(píng)價(jià)”)。在這方面，處于患肥胖癥 和/或II型糖尿病“風(fēng)險(xiǎn)”的個(gè)體是至少具有一種帶有一個(gè)或多個(gè)“肥胖癥和/或II型糖 尿病風(fēng)險(xiǎn)SNP標(biāo)記”的風(fēng)險(xiǎn)等位基因或單倍型的個(gè)體。此外，“存在患病風(fēng)險(xiǎn)”的個(gè)體也可 有至少一種已知有助于發(fā)生肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)因子，包括例如-肥胖癥和/或II型糖尿病家族史；- 一些遺傳性疾病，如Prader-Wi 11 i綜合征；-基礎(chǔ)性疾病(如甲狀腺功能低下)；-高血壓和血壓升高；-與進(jìn)食有關(guān)的疾病；-某些藥物(如非典型的抗精神病藥物)；-久坐的生活方法；-高血糖(glycemic)飲食，由產(chǎn)生高餐后血糖的膳食組成；-體重反彈，由多次試圖通過節(jié)食減肥引起；-精神應(yīng)激；-睡眠不足；-戒煙等。預(yù)測(cè)或風(fēng)險(xiǎn)一般意味著風(fēng)險(xiǎn)增加或下降。對(duì)于可在本發(fā)明的上下文中使用的核苷酸的類型沒有限制。在這方面，可用例如 DNA樣品、基因組DNA樣品、RNA樣品、cDNA樣品、hnRNA樣品或mRNA樣品。“患病”的人在本發(fā)明所述的方法中是指患有肥胖癥和/或II型糖尿病的人們。根據(jù)各種具體實(shí)施方式
，上文描述的方法用于-鑒定人類受試者發(fā)生肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)；-診斷人類受試者的肥胖癥和/或II型糖尿?。?對(duì)患有肥胖癥和/或II型糖尿病的人類受試者選擇有效的和安全的治療方法；-監(jiān)測(cè)對(duì)患有肥胖癥和/或II型糖尿病的人類受試者所使用的治療方法的效果；-預(yù)測(cè)在由此治療需要的人類受試者中治療肥胖癥和/或II型糖尿病的有效性；-選擇對(duì)有發(fā)生肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者有效安全的預(yù)防性 的治療方法；-監(jiān)測(cè)對(duì)有發(fā)生肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者所使用的預(yù)防性的 治療方法的效果；-預(yù)測(cè)在有風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者中預(yù)防肥胖癥和/或II型糖尿病的治療方法的有效 性。術(shù)語(yǔ)“治療”和“治療方法”不僅是指減輕與肥胖癥和/或II型糖尿病相關(guān)的癥 狀，而且是指預(yù)防或延遲該病的發(fā)病，和/或還是指減輕該病的癥狀的嚴(yán)重程度或發(fā)生頻率，和/或也是指預(yù)防或延遲該病的另一次發(fā)作的發(fā)生。本發(fā)明的第二方面涉及在人類受試者中體外鑒定與肥胖癥和/或II型糖尿病的 敏感性相關(guān)的SNP單倍型的方法，其中所述的方法至少包含a)檢測(cè)所述的人類受試者的核酸樣品中的FTO基因的至少一種SNP，其中所述的 至少一種SNP預(yù)示肥胖癥和/或II型糖尿病的敏感性；和b)鑒定所述的人類受試者中的所述的SNP單倍型，其中所述的SNP單倍型包含步 驟a)中檢測(cè)的所述的至少一種SNP。正如本領(lǐng)域所熟知，“單倍型”是指遺傳標(biāo)記的任何組合。單倍型能包含兩個(gè)或更 多的等位基因。發(fā)現(xiàn)本文所述的單倍型(或“風(fēng)險(xiǎn)單倍型”)在具有患肥胖癥和/或II型 糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中比在無肥胖癥和/或II型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中更頻繁和更顯著。 因此，這些單倍型對(duì)于檢測(cè)肥胖癥和/或II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，或者個(gè)體對(duì)于肥胖癥和/或II 型糖尿病的敏感性具有預(yù)測(cè)價(jià)值?！帮L(fēng)險(xiǎn)單倍型”因此旨在包括本文所述的與肥胖癥和/或 II型糖尿病高度相關(guān)和顯著相關(guān)的標(biāo)記上的一種單倍型或單倍型組合。能通過本領(lǐng)域所熟知的檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的序列的方法來進(jìn)行單倍型的檢測(cè)。優(yōu)選地，在步驟a)中檢測(cè)的SNP(s)選自下表2、3和6至9中任何一個(gè)表中所列 的 SNP。本發(fā)明的第三方面提供檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒是在人類受試者中進(jìn)行肥胖癥和 /或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)的體外方法中使用，其中所述試劑盒包 含用于進(jìn)行下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ遖)評(píng)價(jià)至少一種與所述的人類受試者的核酸樣品中的FTO基因相關(guān)的生物標(biāo)記 的類型和/或水平；和b)將所述的人類受試者的在a)中評(píng)價(jià)的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)與健康的和/或患病的人 的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，來做出所述的人類受試者的肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng) 價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)。本發(fā)明的第四方面與檢測(cè)試劑盒有關(guān)，所述試劑盒在鑒定人類受試者中的與肥胖 癥和/或II型糖尿病敏感性相關(guān)的SNP單倍型的體外方法中使用，所述試劑盒包含用于進(jìn) 行下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ遖)檢測(cè)所述的人類受試者的核酸樣品中的FTO基因的至少一種SNP，其中所述至 少一種SNP預(yù)示著肥胖癥和/或II型糖尿病的敏感性；和b)鑒定所述的人類受試者的SNP單倍型，其中所述SNP單倍型包含所述在a)中檢 測(cè)的所述至少一種SNP。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試劑盒”和“試劑盒”是同義詞并可互換使用。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)是指檢測(cè)試劑盒時(shí)，術(shù)語(yǔ)“適當(dāng)?shù)墓ぞ摺笔侵溉魏斡糜谶_(dá) 到所指明的目的的任何技術(shù)手段。作為這種適當(dāng)?shù)墓ぞ叩姆窍拗菩岳?，能列舉試劑和/ 或材料和/或流程和/或說明書和/或軟件等。本發(fā)明所述的所有試劑盒可包含適當(dāng)?shù)陌?裝和說明書用于在本文所公開的方法中使用。試劑盒可進(jìn)一步包含適當(dāng)?shù)木彌_液和聚合 酶，如耐熱聚合酶，例如Taq聚合酶。這種試劑盒也包含對(duì)照引物和/或探針。根據(jù)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒可至少包含a) —對(duì)分離的PCR引物，其由正向引物和反向引物組成，用于特異性擴(kuò)增目的核酸；和/或b) 一對(duì)分離的用于特異性延伸目的核酸的引物；和/或c) 一對(duì)分離的用于與目的核酸特異性結(jié)合的核酸探針；和/或d) 一個(gè)分離的特異性結(jié)合目的核酸所編碼的蛋白質(zhì)的抗體；和/或e) 一塊微陣列或多孔板，其包含上述a)至d)中至少一個(gè)。術(shù)語(yǔ)“目的核酸”本文是指含有預(yù)示肥胖癥和/或II型糖尿病的生物標(biāo)記的核酸 區(qū)域或片段。在這方面，目的核酸可比生物標(biāo)記大，或者可將目的核酸限定為生物標(biāo)記。“探針”和“引物”是以堿基特異性的方法與核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的寡核苷酸。 “堿基特異性的方法”是指兩個(gè)序列必須具備足以使引物或探針與之雜交的核酸互補(bǔ)的程 度。因此，引物或探針序列不是必需的是與模板序列完全互補(bǔ)。如果堿基取代不會(huì)抑制雜 交的話，非互補(bǔ)堿基或修飾堿基能分散于引物或探針內(nèi)。探針或引物一般包含與核酸模板的至少約8個(gè)，優(yōu)選約10、12、15個(gè)，更優(yōu)選約20、 25、30、35個(gè)，且在某些情況下約40、50、60、70個(gè)連續(xù)的核苷酸雜交的核酸區(qū)域。引物或探針通常與連續(xù)的或互補(bǔ)的核酸序列(“模板”)具有至少70%的同一性。 同一性優(yōu)選是至少80%,90%,95%,且更優(yōu)選是98%、99%、99. 5%、99. 8%。有利地，引物和探針進(jìn)一步包含標(biāo)記，例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的 輔因子。本發(fā)明的第五方面是針對(duì)選擇用于預(yù)防和/或治療人類受試者的肥胖癥和/或II 型糖尿病的藥物制劑的方法，其至少包含a)將候選制劑施用于含有人的FTO基因的模型生命系統(tǒng)；b)測(cè)定所述的候選制劑對(duì)于涉及所述的FTO基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的生物機(jī)制的 效果；和c)選擇具有改變所述的生物機(jī)制的效果的制劑，其中所選定的制劑被認(rèn)為可用于 預(yù)防和/或治療人類受試者的肥胖癥和/或II型糖尿病?！八幬镏苿笔侵干镏苿┗蚧瘜W(xué)制劑或兩者都是，如果這些制劑能被認(rèn)為可用于 預(yù)防和/或治療人類受試者的肥胖癥和/或II型糖尿病。生物制劑的例子是核酸，包括 siRNA ；多肽，包括內(nèi)毒素、酶、抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)；核酸與多肽的組合，等。化 學(xué)制劑的例子包括化學(xué)分子、化學(xué)分子復(fù)合物、化學(xué)基元(chemical moieties)等(如放射 性同位素等)。在第六方面，本發(fā)明涉及含有人的FTO基因的模型生命系統(tǒng)在研究肥胖癥和/或 II型糖尿病中所涉及的病理生理學(xué)和/或分子機(jī)制中的用途。當(dāng)本文是指“模型生命系統(tǒng)”時(shí)，優(yōu)選是指非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或培養(yǎng)的微生物、昆 蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物組織或器官。更優(yōu)選的是，所述的模型生命系統(tǒng)表達(dá)或過表 達(dá)人的FTO基因。本發(fā)明的第七方面涉及一種在人類的受試者中進(jìn)行FTO基因單倍型分析的體外 的方法，其至少包含a)在所述的人類受試者的核酸樣品中檢測(cè)在“肥胖癥和/或II型糖尿病敏感性 單倍型”的每個(gè)等位基因位置上的核苷酸，該單倍型包括至少一種在表2、3和6至9中任何 一個(gè)表中所列的SNP，或者與其連鎖不平衡的多態(tài)性；和
9
b)根據(jù)在a)中檢測(cè)到的核苷酸，將所述人類受試者的確定為特定的單倍型。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該方法進(jìn)一步包含根據(jù)在步驟b)中確定的特定的單倍 型來確定所述的人類受試者發(fā)生肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的步驟。在每個(gè)等位基因的位置上的核苷酸可在上述方法中的步驟a)中用任何適當(dāng)技術(shù) 檢測(cè)。例如，該檢測(cè)可使用酶催化的擴(kuò)增來進(jìn)行，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或等位基因特異性擴(kuò)增 所述的核酸樣品。另外，所述的檢測(cè)可使用測(cè)序來檢測(cè)。此外，本文所公開的SNP和單倍型可對(duì)患者分層(stratification)。鑒定為發(fā)生 肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加或降低的個(gè)體的亞群能被用于，尤其是，用于定向臨 床試驗(yàn)項(xiàng)目和遺傳藥理學(xué)治療，其中對(duì)于多態(tài)性的了解用于幫助鑒定最適合用特定藥物制 劑進(jìn)行治療的患者。本文所述的SNP和單倍型代表有價(jià)值的信息資源，其有助于鑒定，例如，就它們的 同一性和對(duì)于疾病發(fā)病/發(fā)生的敏感性或用特定藥物進(jìn)行治療的敏感性而言的個(gè)體。因此，本發(fā)明的第八方面是針對(duì)選擇參與臨床試驗(yàn)的人類受試者以評(píng)價(jià)治療和/ 或預(yù)防肥胖癥和/或II型糖尿病的治療方法的有效性的方法，其至少包含a)將人類受試者根據(jù)每個(gè)人類受試者所屬的特定的FTO基因單倍型進(jìn)行分組；并 且b)從在a)中獲得的至少一個(gè)單倍型組中選擇至少一個(gè)人類受試者，使其包含在 所述的臨床試驗(yàn)中。在這個(gè)方法中，特定FTO基因單倍型是有利地在體外通過檢測(cè)每個(gè)人類受試者的 核酸樣品中的“肥胖癥和/或II型糖尿病敏感性單倍型”的每個(gè)等位基因的位置上的核苷 酸而測(cè)定，上述“肥胖癥和/或II型糖尿病敏感性單倍型”包括列在表2，3和6至9中任 何一個(gè)表中所列的至少一種SNP或與其連鎖不平衡的多態(tài)性。本發(fā)明的第九方面提供根據(jù)上述的方法用于體外進(jìn)行人類受試者FTO基因單倍 型分析的檢測(cè)試劑盒，其中所述的檢測(cè)試劑盒包含用于下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ遖)檢測(cè)所述人類受試者的核酸樣品中的“肥胖癥和/或II型糖尿病敏感性單倍 型”的每個(gè)等位基因的位置上的核苷酸，該單倍型包括選自列在表2、3和6至9中任何一個(gè) 表中所列的至少一種SNP或與其連鎖不平衡的多態(tài)性；和b)根據(jù)在a)中檢測(cè)到的核酸確定所述的人類受試者的特定的單倍型。此外，本發(fā)明于第十方面涉及上述的檢測(cè)試劑盒在將人類受試者分成特定單倍型 組的各層的用途。有利地，該檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步用于從至少一組單倍型組中選擇至少一個(gè)人類受試 者參與臨床試驗(yàn)以評(píng)價(jià)治療和/或預(yù)防肥胖癥和/或II型糖尿病的治療方法的有效性。第^^一方面，本發(fā)明涉及體外測(cè)定人類FTO基因的至少一種選自表2、3和6至9 中任何一個(gè)表中所列的SNP的同一性的檢測(cè)試劑盒，其包含進(jìn)行該測(cè)定的適當(dāng)?shù)墓ぞ?。通過非限制性的下列附圖來解釋本發(fā)明

圖1 連鎖不平衡結(jié)構(gòu)和在FTO區(qū)域內(nèi)的相關(guān)性。A)連鎖不平衡2個(gè)矩陣2個(gè)矩陣地出現(xiàn)，深灰色代表非常高的連鎖不平衡(r2)， 且白色代表SNP之間缺乏關(guān)聯(lián)性。b)顯示對(duì)于每個(gè)SNP而言，第III類肥胖癥(880人)比上對(duì)照(2700)分析的ρ值的log1Q。圖2 :FT0基因在人類組織中的表達(dá)。來自脂肪組織(BioChain Institute, USA)、胰島、FACS-純化的β細(xì)胞(由the Human Pancreatic Cell Core Facility, University Hospital, Lille, France 提供)禾口 多種組織 cDNA 嵌板(panel) (BD BiosciencesClontech)的人的 cDNA 中 FTO 表達(dá)，其中 1 FTO 陰性對(duì)照，2 =GAPDH, 3 =GAPDH 陰性對(duì)照，4 :GAPDH+FT0, 5 :GAPDH+FT0 陰性對(duì)照，6 分子 量標(biāo)記50bp、150bp、300bp、500bp、750bp和lkb，7 脂肪組織，8 脂肪組織RT陰性對(duì)照，9 胰島，10 胰島RT陰性對(duì)照，11 心臟，12 腦，13 胎盤，14 肺，15 肝，16 骨骼肌，17 腎， 18 胰腺，19 胰臟β細(xì)胞。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作內(nèi)對(duì)照。β細(xì)胞通過免 疫化學(xué)(98%胰島素陽(yáng)性細(xì)胞)和PCR(用外分泌細(xì)胞特異性的糜蛋白酶引物無擴(kuò)增，用β 細(xì)胞特異性的Pdxl引物有擴(kuò)增)。所用的FTO引物是5 ‘ -TGCCATCCTTGCCTCGCTCA-3 ‘ (S EQID Ν0.1)和 5' -TGGGGGCTGAATGGCTCACA-3‘ (SEQ ID No. 2)。這兩個(gè)引物經(jīng)高性能液 相層析純化。根據(jù)說明書，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，USA)隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄1 μ g脂肪組織、 胰島和β細(xì)胞RNA。根據(jù)說明書，以1. 25mmol/l MgCl2，每種引物0. 4 μ mol/1和5 μ 1單 鏈cDNA，用快速啟動(dòng)(FastStart)Taq DNA聚合酶試劑盒(Roche，Germany)進(jìn)行PCR，使用 如下的改良的熱啟動(dòng)PCR方法95°C 4min, 40個(gè)循環(huán)95°C，30s, 68°C，2min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)， 然后68°C，3min。在2% (wt/vol)瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，用溴化乙啶和在紫外線照 射下使之顯像。圖3 推定的成因基因座在FTO基因上的位置的分布的驗(yàn)后概率的分布。位置在 染色體16上以kb表示。點(diǎn)代表單SNP關(guān)聯(lián)性ρ值的log1(1。線代表95%、90%和75%可 信區(qū)間的界限。在讀完下列實(shí)施例后將理解本發(fā)明所述的其他具體實(shí)施方式
和優(yōu)勢(shì)。 實(shí)施例I.材料和方法I. 1 統(tǒng)計(jì)分析a)關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)。在多重模型(multiplicative model)下，使用對(duì)數(shù)回歸檢驗(yàn)病例 對(duì)照(case-control)中的關(guān)聯(lián)性，且一般關(guān)聯(lián)度模型用皮爾森卡方檢驗(yàn)。復(fù)制的ρ值是單尾的用于試驗(yàn)肥胖兒童和成人中SNP rsl421085(resp. rsl7817449)上等位基因C(resp. G)頻率增加的特定假說?；陉?duì)列的家族中的兩個(gè)SNP之間的關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)使用TDT檢驗(yàn)進(jìn)行，TDT檢驗(yàn) 將風(fēng)險(xiǎn)基因傳遞的數(shù)目與其預(yù)期進(jìn)行比較，所述風(fēng)險(xiǎn)基因來自異源親本傳遞至受累后代。 McNemar X2檢驗(yàn)評(píng)價(jià)顯著性。費(fèi)希爾法用于合并不同研究的ρ值，其中η個(gè)ρ值的自然對(duì)數(shù)的負(fù)和(negative sum)的2倍符合2η的自由度的χ 2分布。b)遺傳模型。計(jì)算BMI變量的比例，所述的BMI變量的比例在我們的家族研究的人群(法國(guó)肥 胖兒童的父母)中的成人建立者(founder)，且萊比錫隊(duì)列(the Leipzig cohort)研究中 的兒童中解釋。將BMI標(biāo)準(zhǔn)化并用SDS表達(dá)。
使用QTL傾向閾值模型，其具有定量的傾向性L (在整個(gè)人群中均值0且SDl)和 閾值T，在此之上個(gè)體被分為受影響一類。傾向性L后面跟著三個(gè)正態(tài)分布Ν( μ g，σΕ)的 混合?？?是基因型L均值(取值_a，0和a)，且O2k是非由于基因座的剩余方差的比例。 對(duì)于肥胖癥，傾向性L可通過BMI確定，因?yàn)橐訠MI超過某個(gè)閾值而定義肥胖癥。用這些參數(shù)，可通過術(shù)語(yǔ)基因型風(fēng)險(xiǎn)比例(Genotype Risk Ratios)來表達(dá)的患病 風(fēng)險(xiǎn)，GRRi = P(受累/G = i)/P(受累/G = 0)。所研究的基因座的方差直接來源于a和f 值，人群風(fēng)險(xiǎn)等位基因的頻率σ2α = 2. f. (l-f).a2(Eq 1)。以方差(。2α)解釋的變異百 分?jǐn)?shù)來源于線性回歸模型，通過插入Eq 1。然后，反復(fù)計(jì)算與10%的患病率對(duì)應(yīng)的用于普 通肥胖癥的GRR。I. 2基因型分析通過應(yīng)用生物信息公司(the Applied Biosystems)的基于寡核苷酸連接檢測(cè) (OLA)與多重 PCR 靶向擴(kuò)增(http://www.appliedbiosystems.com)的 SNPIex 技術(shù)進(jìn)行 最初的病例對(duì)照基因型分析。該檢測(cè)的化學(xué)反應(yīng)基于一套通用的核心試劑盒和一套SNP特 異性連接探針，能在一個(gè)樣品中同時(shí)進(jìn)行48個(gè)SNP的多重基因型分析。在檢測(cè)的每一個(gè)步 驟使用特異性內(nèi)參照來包含質(zhì)量控制的檢測(cè)(根據(jù)生產(chǎn)商說明書)。通過使用應(yīng)用生物信 息公司的3730xlDNA分析儀和GeneMapperf. 7軟件進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析來辨別等位基因。 雙份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其一致率為100%。雙份樣品中的變異體rsl421085和rsl7817449使用TaqMan SNPGenotypingAssays (Applied Biosystems, Foster City, Calif. USA)進(jìn)行高通量的基因 型分析。PCR引物和TaqMan探針根據(jù)生產(chǎn)商的流程通過Primer Express設(shè)計(jì)和優(yōu)化。所有SNP為哈迪-溫伯格平衡(ρ >0.05)。在除瑞士肥胖個(gè)體外的來自所有人群 的全部和病例組和對(duì)照組的通知率(call rate)在95%以上。通知率和HWE檢驗(yàn)的ρ值列于下表1中。表1基因型計(jì)數(shù)，哈迪_溫伯格檢驗(yàn)和成功進(jìn)行基因型分析的百分?jǐn)?shù)
權(quán)利要求
一種在人類受試者中進(jìn)行肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)的體外方法，其至少包含a)檢測(cè)所述的人類受試者的核酸樣品中的至少一個(gè)與FTO基因相關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)記；和b)將來自所述的人類受試者的在步驟a)中獲得的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)與來自健康和/或患病的人的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以作出所述的人類受試者的肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的至少一個(gè)生物標(biāo)記選自表2、3和6至9中 任何一個(gè)表中所列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的至少一個(gè)生物標(biāo)記是與至少一個(gè)選自表2、 3和6至9中任何一個(gè)表中所列的SNP相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的至少一個(gè)生物標(biāo)記是與選自表2、3和6至 9中任何一個(gè)表中所列的至少一個(gè)SNP完全連鎖不平衡的多態(tài)性位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的方法是用于鑒定有患肥胖癥 和/或II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于診斷人類受試者的 肥胖癥和/或II型糖尿病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于選擇對(duì)患有肥胖癥 和/或II型糖尿病的人類受試者有效和安全的治療方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于監(jiān)測(cè)施用于患有肥 胖癥和/或II型糖尿病的人類受試者的治療方法的效果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于預(yù)測(cè)治療需要此種 治療的人類受試者的治療肥胖癥和/或II型糖尿病的治療方法的有效性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于選擇對(duì)于有患肥胖 癥和/或II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者有效和安全的預(yù)防性治療方法。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于監(jiān)測(cè)施用于有患肥 胖癥和/或II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者的預(yù)防性治療方法的效果。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是用于預(yù)測(cè)有風(fēng)險(xiǎn)的人類 受試者中預(yù)防肥胖癥和/或Π型糖尿病的治療方法的有效性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中列于表2、3和6至9中任何一個(gè)表 中的所述的至少一個(gè) SNP 選自 rs9940128、rsl421085、rsll21980、rsl7817449、rs3751812、 rsll075990、rs9941349、rs7206790、rs8047395、rsl085252U rsl477196 或 rs4783819。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中列于表2、3和6至9中任何一個(gè)表中的所述的 至少一個(gè) SNP 選自 rs9940128、rsl421085、rsll21980、rs3751812、rs7206790、rs8047395 或rsl7817449。
15.一種在如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的體外方法中使用的檢測(cè)試劑盒，其包含 用于下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ遖)評(píng)價(jià)人類受試者的核酸樣品中與FTO基因相關(guān)聯(lián)的至少一種生物標(biāo)記的類型和/或 水平；和b)將所述的人類受試者的在a)中評(píng)價(jià)的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)與健康和/或患病的人的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行比較以作出所述的人類受試者的肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/ 或診斷和/或預(yù)測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供人類的肥胖癥和/或II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)的工具和方法，該方法是以檢測(cè)屬于fasto(FTO)基因上的一套SNP或與其相關(guān)的核酸生物標(biāo)記為基礎(chǔ)。本發(fā)明也提供用于鑒定人類的肥胖癥和/或II型糖尿病易感性相關(guān)的SNP單倍型的工具和方法，提供選擇預(yù)防和/或治療人類的肥胖癥和/或II型糖尿病的藥物制劑的工具和方法，提供用于進(jìn)行人類fasto(FTO)基因的單倍型分析的工具和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101960019SQ200880015075
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日
發(fā)明者C·R·迪納, D·J-C·梅雷, J-C·謝弗爾, P·弗羅蓋爾, S·C·加利納德拉馬爾 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心;里爾法律與醫(yī)療衛(wèi)生第二大學(xué);巴斯德研究院里爾分院