專利名稱：一種地衣芽孢桿菌201及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種內(nèi)生生防菌株，具體 地說涉及一種高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一種毀滅性病害，是香蕉生產(chǎn)的毀滅性土 傳病害。病原菌從受傷的根莖侵入，通過維管束向假莖及葉部蔓延， 堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管，直至植株枯萎死亡。香蕉枯萎病菌是土壤習(xí)居菌， 其厚垣孢子能夠在土壤中存活8 10年。香蕉枯萎病在中國珠江三 角洲香蕉產(chǎn)區(qū)的多個(gè)縣市均有分布，病園病株率約為10% 40%， 嚴(yán)重的達(dá)90%以上，以致蕉園丟荒。
目前對(duì)該病的防治尚無理想藥劑和抗病品種， 一些栽培管理措 施只能起到局部的控制作用，尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的防治措 施是當(dāng)務(wù)之急，生物防治不失為重要的輔助手段，其中拮抗細(xì)菌在 植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要優(yōu)勢(shì)在于1)種 類和數(shù)量眾多，在植物根際根內(nèi)、根際大量存在；2)對(duì)病原菌的作 用方式多種多樣，包括競(jìng)爭、拮抗、寄生、誘導(dǎo)植物抗性的產(chǎn)生等； 3)繁殖速度快；4)許多細(xì)菌在植物的根內(nèi)或根際定殖力強(qiáng)；5)細(xì) 菌大多能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；6)有些細(xì)菌不僅 能夠防治病害而且可以增加作物產(chǎn)量。從香蕉植株內(nèi)分離篩選獲得 對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)香蕉枯萎病的防治具有重要意義，但目前相關(guān)技術(shù)仍舊很薄弱甚至空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種高效防治香蕉枯
萎病的地衣芽孢桿菌201，地衣芽孢桿菌201是一種從香蕉植株內(nèi)分 離篩選獲得對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)香蕉 枯萎病的防治具有重要意義。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供了所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽 孢桿菌201在防止香蕉病災(zāi)害方面的多種應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢 桿菌201，」fe"'W〃s h'c力ey7j'/br啦's 201，于2007年7月2日在湖 北武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào) CCTCCNO: M207092,在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，圓形， 平展，無光澤，邊緣整齊，菌落直徑一般2 3mm，菌體直桿狀，大 小為2.06X0.70Mm，芽孢呈橢圓形。
本發(fā)明所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201可通過平 板對(duì)峙、盆栽試驗(yàn)篩選獲得。
本發(fā)明還提供了所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其一是對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的抑菌作用。
其二是在23 25'C的溫室條件下對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲 的抑制作用。
其三是對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲分生孢子萌發(fā)的抑制作用。 其四是對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的致畸作用。其五是對(duì)西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、膠胞炭 疽菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌或小麥赤霉病菌病原真菌具 有拮抗作用。
本發(fā)明的有益效果是
(1) 地衣芽孢桿菌201為植物內(nèi)生菌，對(duì)香蕉枯萎病菌抑制作 用強(qiáng)，對(duì)多種病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗細(xì)菌在植物病害生物 防治中所起到的非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多，在植物根 際根內(nèi)、根際大量存在；對(duì)病原菌的作用方式多種多樣；繁殖速度 快等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)香蕉枯萎病的防治具有重要意義。
(2) 本發(fā)明所述菌株培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生 產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1 10X40倍顯微鏡下測(cè)定抑菌帶的直徑觀察倍地衣芽孢桿菌
201對(duì)FOC4菌絲的抑制作用
圖2正常生長的FOC4菌絲(10X40倍)； 圖3地衣芽孢桿菌201對(duì)FOC4菌絲的致畸作用 圖4地衣芽孢桿菌201對(duì)FOC4菌絲的致畸作用 圖5正常萌發(fā)的FOC4分生大孢子(10X40倍) 圖6正常萌發(fā)的FOC4分生小孢子(10X40倍) 圖7經(jīng)菌株201處理48h后的FOC4分生大孢子 圖8經(jīng)菌株201處理48h后的FOC4分生的大孢子
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
所述地衣芽孢桿菌201， 5acW7ws h'c/ e/7i/o77^'s201，于2007 年7月2日在湖北武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏，保藏號(hào)CCTCCNO: M207092。
實(shí)施例1地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲FOC4的 抑制作用
將香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲FOC4直徑為5mm菌絲塊接入馬 鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA平板中央，將直徑為5mm的滅菌濾紙片三片等 距離接種于FOC4菌絲塊周圍，每片濾紙片上滴加培養(yǎng)24h的菌株 201培養(yǎng)液10PL。三次重復(fù)，25 28。C培養(yǎng)，5天后測(cè)定抑菌帶的直 徑。由附圖1可見地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌抑菌作用強(qiáng)。 實(shí)施例2地衣芽孢桿菌201在溫室條件下對(duì)香蕉枯萎病的抑制
將株高約為10cm的巴西香蕉幼苗浸入菌株201的培養(yǎng)液中，培 養(yǎng)液OD等于0.5， 30min后取出，種植于花盆中。分別在第2d、第 7d、第15d和第30d,將蕉苗撥起，浸入FOC4的孢子懸浮液中30min， 孢子懸浮液1X105個(gè)孢子/mL，再種植于花盆中，每個(gè)花盆處理36 株。接種后香蕉苗放置在23 25"C的溫室中培養(yǎng)，每日淋水一次。 接種FOC4后20天、30天、40天調(diào)査發(fā)病率和病情指數(shù)。結(jié)果表明， 菌株201接種15天、30天后挑戰(zhàn)接種FOC4，與對(duì)照相比，香蕉幼 苗發(fā)病率顯著下降，接種香蕉枯萎病菌后40天，香蕉苗發(fā)病率分別 為43.5%和29.8%，病情指數(shù)分別為82%和57%，而對(duì)照株發(fā)病率在 95%以上；病情指數(shù)在98%以上。實(shí)施例3 地衣芽孢桿菌201對(duì)FOC4菌絲的致畸作用
將玻璃紙剪成5mmX25mm的長條狀，12rC高壓滅菌，用鑷子 將其鋪放于菌株201和病原菌FOC4之間。28"C恒溫培養(yǎng)5 7天， 待菌株201和FOC4菌絲之間出現(xiàn)明顯抑菌帶后，將玻璃紙小心取下， 置于10X40倍的顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化，以不接菌株201的 病原菌為對(duì)照。觀察到菌絲前期膨大突出，后期明顯變細(xì)，分枝多而 短，形態(tài)不均勻，可通過10X40倍顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化了 解地衣芽孢桿菌201對(duì)FOC4菌絲的致畸作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖2 4，其中附圖1是正常生長的FOC4菌絲(10X40倍)；附圖2顯示 前期菌絲膨大突出(10X40倍)；附圖3顯示后期多數(shù)菌絲變尖細(xì)， 分枝多而短，形態(tài)不均勻(10X40倍)。
實(shí)施例4地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲FOC4分 生孢子萌發(fā)的抑制作用
吸取10PL的FOC4孢子懸浮液，滴加到凹玻片上。風(fēng)干后，滴 加菌株201的培養(yǎng)液，以滴加無菌水為對(duì)照。每處理重復(fù)5次， 置于28"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h以后鏡檢孢子萌發(fā)情況。觀察到分生孢 子大多變得細(xì)長，少數(shù)孢子的兩端出現(xiàn)泡狀物，通過10X40倍鏡檢 孢子萌發(fā)情況了解地衣芽孢桿菌201對(duì)FOC4分生孢子萌發(fā)的抑制 作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖5 附圖8，附圖5為48h后觀察到的正常萌 發(fā)的FOC4分生大孢子(10X40倍)；附圖6為正常萌發(fā)的FOC4分 生小孢子(10X40倍)；附圖7為菌株201處理48h后，多數(shù)FOC4 分生大孢子萌發(fā)被抑制，孢子變得細(xì)長(10X40倍)；附圖8為少數(shù)FOC4分生的大孢子兩端出現(xiàn)泡狀物(10X40倍)。 實(shí)施例5地衣芽孢桿菌201對(duì)多種病原菌的拮抗作用。
將振蕩培養(yǎng)40h的菌株201培養(yǎng)液配成濃度約為 1.0X109CFU/mL (OD值約為0.5)的懸浮液，10000g離心10min， 取上清液，在培養(yǎng)皿加入lmL上清液，再倒入10mLPDA培養(yǎng)基， 混勻，待平板冷卻凝固后，分別接入不同的病原真菌西瓜枯萎病菌， 番茄枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，膠胞炭疽菌，玉米彎孢葉斑病菌，棉 花黃萎病菌和小麥赤霉病菌。以加入lmL肉膏蛋白胨培養(yǎng)基NB為 空白對(duì)照，25 28i:培養(yǎng)5 7天，計(jì)算相對(duì)抑制率。從表l的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果可以得出地衣芽孢桿菌201對(duì)多種病原菌均具有較強(qiáng)的抑制作 用。
表1地衣芽孢桿菌201對(duì)多種病原菌的抑制作用
病原菌相對(duì)抑制率(％)
西瓜枯萎菌58.67士3.875b
番茄枯萎菌76.92士1.693b
香蕉炭疽菌91.39士2.236a
膠胞炭疽菌62.75士0.493a
彎孢葉斑菌60.10士1.163a
棉花黃萎菌82.38士0.953a
小麥赤霉菌65.07士l,222b
注相對(duì)抑制率為三次重復(fù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤。DMRT檢驗(yàn)法進(jìn)
8行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，同行具有相同字母的數(shù)據(jù)間無顯著差異(p=0.05)。
權(quán)利要求
1、一種地衣芽孢桿菌201，于2007年7月2日在湖北武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)CCTCC NOM207092。
2、權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌201的制備方法，其特征在于 所述地衣芽孢桿菌201通過平板對(duì)峙和盆栽試驗(yàn)篩選獲得。
3、 權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌201的應(yīng)用，其特征在于對(duì)香 蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的抑制作用。
4、 權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌201的應(yīng)用，其特征在于在23 25'C的溫室條件下對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的抑制。
5、 權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌201的應(yīng)用，其特征在于對(duì)香 蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲分生孢子萌發(fā)的抑制作用。
6、 權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌201的應(yīng)用，其特征在于對(duì)香 蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的致畸作用。
7、 權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌201的應(yīng)用，其特征在于對(duì)西 瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、膠胞炭疽菌、玉米彎孢 葉斑病菌、棉花黃萎病菌或小麥赤霉病菌病原真菌具有拮抗作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種地衣芽孢桿菌201，Bacillus licheniformis 201，于2007年7月2日在湖北武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)CCTCC NOM207092。本發(fā)明同時(shí)公開了其制備方法和應(yīng)用，地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌抑制作用強(qiáng)，抑菌譜廣，對(duì)香蕉枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，番茄枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，膠胞炭疽菌，玉米彎孢葉斑病菌，棉花黃萎病菌，小麥赤霉病菌等多種病原真菌都具有拮抗作用，防效高，環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101486978SQ20081018307
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者孫正祥, 王振中, 王春華, 紀(jì)春艷 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)