專利名稱：多環(huán)芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多環(huán)芳烴好氧降解 純菌種的分離純化方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)連在一起構(gòu)成的烴類化合物，是一類具有致 癌、致畸、致突變作用的有機(jī)物，在環(huán)境中分布廣泛且具有生物難降解性因而引起人們的廣 泛關(guān)注。由于PAHs分子中存在共軛大n鍵電子體系，因此具有較高的穩(wěn)定性，通常情況下 很難被微生物降解。為了提高PAHs的生物降解速率，馴化篩選出高效降解菌群是非常重要 的一個(gè)方面。PAHs的好氧生物降解比厭氧生物降解的速率要快很多倍，因此在PAHs污染土 壤的異位修復(fù)及水污染治理中常用好氧生物處理技術(shù)。然而由于很難分離到高效的多環(huán)芳烴 降解純菌種，對(duì)多環(huán)芳烴的降解機(jī)理與過程研究不夠深入，從而制約了多環(huán)芳烴污染土壤生 物修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，因此尋找一種能有效分離純化多環(huán)芳烴降解菌的方 法與技術(shù)非常有必要，對(duì)于治理和修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤有重要的意義。
由于PAHs是疏水性有機(jī)物，大多數(shù)多環(huán)芳烴化合物難溶于水，其可溶性隨苯環(huán)數(shù)量的 增多而減少。多環(huán)芳經(jīng)特別是高于四環(huán)的稠環(huán)芳烴，水溶解性很低且對(duì)微生物有較高的毒性 作用，這使得傳統(tǒng)微生物菌種的分離純化方法無法適用于多環(huán)芳烴降解純菌種的分離純化。 同時(shí)，分離純化的環(huán)境條件及過程參數(shù)選定等都與能否分離純化成功有密切的關(guān)系，這些條 件與參數(shù)都需要經(jīng)過一系列的試驗(yàn)研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種多環(huán)芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法與應(yīng)用。其具體步驟如
下
(1) 向體積為500 mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入400 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.0 mL微量金屬液、0.1 mL 維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4C1: 1.5 g七—1， KH2P04: 1.5 g.L"， MgCl2: 0.25 g'L"， CaCl2'2H20: 0.10 g'L"; 微量金屬液的組成為 CoCl2.6H20: 50 mgL1， CuCl2: 0.30 mg'L1, H3B03: 10.0 mg.!/1, MnCl24H2。 40 mgl/1， Na2Mo04.2H20: 5.0 mg.L墨1， NiCl2. 2H20: 2.5 mgL", ZnCl2: 3.5 mg!/1。
(2) 向體積為150mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.60 g瓊脂， 然后在溫度為12rC的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 7(TC時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將 其倒入體積為160 mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。
(3) 在超凈工作臺(tái)中向步驟(2)中的培養(yǎng)皿中加入0.5mL濃度為l g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使多環(huán)芳烴的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的丙酮將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。
(4) 向體積為25mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入10mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.25 g瓊脂，在溫度為12rC的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38 40'C。
(5) 在超凈工作臺(tái)中向步驟(4)的錐形瓶中加入l mL通過富集與馴化篩選得到的多環(huán)芳烴好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取l mL慢慢加入步驟(3)中的培養(yǎng)皿中，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為25t:的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，10 15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。
(6) 在超凈工作臺(tái)中向體積為25 mL的錐形瓶中加入4.0 mL濃度為1 g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。
(7) 按水與高分子樹脂吸附劑的質(zhì)量比為5:1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3:1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在超凈工作臺(tái)中放置2天。
(8) 向步驟(6)中的錐形瓶?jī)?nèi)加入10mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基，然后加入經(jīng)步驟(7)處理后的吸附劑0.15g,將其密封后放置在轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中平衡2天。
(9) 在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(5)培養(yǎng)皿中的菌落，將其接種至步驟(8)中的錐形瓶中，在溫度為25 3(TC、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天。
(10) 將步驟(2)至步驟(9)作為一個(gè)分離純化周期；重復(fù)步驟(2)至步驟(9),但每次用前一個(gè)分離純化周期中步驟(9)的菌液代替步驟(5)中用到的多環(huán)芳烴好氧降解菌群溶液。分離純化8個(gè)周期以上即可得到能夠高效好氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。
所述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠分離純化到對(duì)多環(huán)芳烴好氧降解性能好的微生物純菌種。
具體實(shí)施例方式
在超凈工作臺(tái)中制作以多環(huán)芳烴為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有多環(huán)芳烴好氧降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 15天。在超凈工作臺(tái)中向加入多環(huán)芳烴、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為25 3(TC、轉(zhuǎn)速為IOO r/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到能夠好氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。下面是運(yùn)用分離純化得到的菌種進(jìn)行了多環(huán)芳烴的好氧降解試驗(yàn)，以進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在好氧條件下進(jìn)行了萘的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)吝M(jìn)行有效的好氧降解，當(dāng)萘的初始濃度為26.1 mg/L時(shí)，2天后能降解到0.02mg/L以下。
實(shí)施例2
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在好氧條件下進(jìn)行了菲的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)Ψ七M(jìn)行有效的好氧降解，當(dāng)菲的初始濃度為1.05mg/L時(shí)，2天后能降解到0.01mg/L以下。
實(shí)施例3
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在好氧條件下進(jìn)行了芴的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)踢M(jìn)行有效的好氧降解，當(dāng)芴的初始濃度為0.11mg/L時(shí)，l天后能降解到0.01mg/L以下。
實(shí)施例4
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在好氧條件下進(jìn)行了芘的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)胚M(jìn)行有效的好氧降解，當(dāng)芘的初始濃度為0.10mg/L時(shí)，l天后能降解到0.01mg/L以下。
權(quán)利要求
1.一種多環(huán)芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)向體積為500mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4Cl1.5g·L-1，KH2PO41.5g·L-1，MgCl20.25g·L-1，CaCl2·2H2O0.10g·L-1；微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O50mg·L-1，CuCl20.30mg·L-1，H3BO310.0mg·L-1，MnCl2·4H2O40mg·L-1，Na2MoO4·2H2O5.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.5mg·L-1，ZnCl23.5mg·L-1 id="icf0001" file="A2008101471120002C1.tif" wi="1" he="5" top= "70" left = "149" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(2)向體積為150mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.60g瓊脂，然后在溫度為121℃的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65～70℃時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天 id="icf0002" file="A2008101471120002C2.tif" wi="3" he="3" top= "103" left = "33" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(3)在超凈工作臺(tái)中向步驟(2)中的培養(yǎng)皿中加入0.5mL濃度為1g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使多環(huán)芳烴的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的丙酮將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天 id="icf0003" file="A2008101471120002C3.tif" wi="2" he="3" top= "127" left = "76" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(4)向體積為25mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入10mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.25g瓊脂，在溫度為121℃的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38～40℃ id="icf0004" file="A2008101471120002C4.tif" wi="2" he="4" top= "144" left = "151" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(5)在超凈工作臺(tái)中向步驟(4)的錐形瓶中加入1mL通過富集與馴化篩選得到的多環(huán)芳烴好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取1mL慢慢加入步驟(3)中的培養(yǎng)皿中，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，10～15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn) id="icf0005" file="A2008101471120002C5.tif" wi="3" he="5" top= "177" left = "98" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(6)在超凈工作臺(tái)中向體積為25mL的錐形瓶中加入4.0mL濃度為1g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天 id="icf0006" file="A2008101471120002C6.tif" wi="5" he="3" top= "193" left = "104" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(7)按水與高分子樹脂吸附劑的質(zhì)量比為5∶1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3∶1的比例用99％的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在超凈工作臺(tái)中放置2天 id="icf0007" file="A2008101471120002C7.tif" wi="4" he="3" top= "218" left = "121" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(8)向步驟(6)中的錐形瓶?jī)?nèi)加入10mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基，然后加入經(jīng)步驟(7)處理后的吸附劑0.15g，將其密封后放置在轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中平衡2天 id="icf0008" file="A2008101471120002C8.tif" wi="2" he="3" top= "235" left = "187" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(9)在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(5)培養(yǎng)皿中的菌落，將其接種至步驟(8)中的錐形瓶中，在溫度為25～30℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5～7天 id="icf0009" file="A2008101471120002C9.tif" wi="4" he="3" top= "251" left = "134" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(10)將步驟(2)至步驟(9)作為一個(gè)分離純化周期；重復(fù)步驟(2)至步驟(9)，但每次用前一個(gè)分離純化周期中步驟(9)的菌液代替步驟(5)中用到的多環(huán)芳烴好氧降解菌群溶液。分離純化8個(gè)周期以上即可得到能夠高效好氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法，其特征在于，所述吸 附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
3. —種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳經(jīng)厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在好氧條件下進(jìn)行了萘的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)吝M(jìn)行有效的好氧 降解，當(dāng)萘的初始濃度為26.1mg/L時(shí)，2天后能降解到0.02mg/L以下。
4. 一種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在好氧條件下進(jìn)行了菲的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)Ψ七M(jìn)行有效的好氧 降解，當(dāng)菲的初始濃度為1.05mg/L時(shí)，2天后能降解到0.01mg/L以下。
5. —種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在好氧條件下進(jìn)行了芴的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分離出的純菌種能夠?qū)踢M(jìn)行有效的好氧 降解，當(dāng)芴的初始濃度為0.11mg/L時(shí)，l天后能降解到0.01mg/L以下。
6. 運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在好氧條件下進(jìn)行了芘的好氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明分 離出的純菌種能夠?qū)胚M(jìn)行有效的好氧降解，當(dāng)芘的初始濃度為0.10mg/L時(shí)，l天后能降解 到0.01mg/L以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種多環(huán)芳烴好氧降解純菌種的分離純化方法與應(yīng)用。超凈工作臺(tái)中制作以多環(huán)芳烴為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有多環(huán)芳烴好氧降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15天。在在超凈工作臺(tái)中向加入多環(huán)芳烴、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為25～30℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5～7天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到能夠好氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。本方法能夠分離純化得到對(duì)多環(huán)芳烴好氧降解性能好的微生物純菌種。
文檔編號(hào)C12N1/00GK101654656SQ20081014711
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者丁愛中, 豆俊峰 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)