專利名稱：：細胞疾病靶標的負選擇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用基于RNAi的負篩選測定對參與活化調(diào)節(jié)元件之基因的鑒定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面是鑒定宿主細胞中促進調(diào)節(jié)元件之活性的基因組序列的方法，其包括確定在經(jīng)暴露于篩選劑后仍存活的宿主細胞中表達的小發(fā)夾RNA分子的多核苷酸序列，其中(a)所述細胞經(jīng)改造而含有表達效應(yīng)子蛋白的表達盒，該效應(yīng)子蛋白在所述細胞暴露于所述篩選劑時變成有細胞毒性，(b)編碼該效應(yīng)子蛋白的序列與促進所述效應(yīng)子蛋白表達的調(diào)節(jié)元件可操作性連接，和(c)用至少一種表達小發(fā)夾RNA分子的載體轉(zhuǎn)化所述細胞，其中所述小發(fā)夾RNA分子(i)具有與宿主細胞基因組序列互補的多核香酸序列，和(ii)靶向具有上述基因組序列的核酸并由此阻止該基因組序列的表達，其中所述小發(fā)夾RNA分子的互補多核苷酸序列的身份指示了宿主細胞的所述基因組序列，當宿主細胞中缺少該小發(fā)夾RNA時所述基因組序列促進所述表達盒中調(diào)節(jié)元件的活化。本發(fā)明的另一個方面是鑒定靶基因的方法，其包括(A)改造宿主細胞以包含效應(yīng)子基因，其中在篩選劑存在時所述效應(yīng)子基因的表達對宿主細胞是有細胞毒性的；(B)用編碼小發(fā)夾RNA分子的表達盒轉(zhuǎn)化(A)的宿主細胞群，其中每個所述小發(fā)夾RNA分子具有與宿主細胞基因組的多核苷酸序列互補的序列；(C)通過在一定條件下用所述篩選劑與(B)中所述的已轉(zhuǎn)化宿主細胞群體相接觸來選擇至少一種抗效應(yīng)子的存活的已轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中所述已轉(zhuǎn)化宿主細胞表達至少一種由所述表達盒編碼的小發(fā)夾RNA分子，并且其中所述效應(yīng)子基因的表達殺傷對效應(yīng)子敏感的已轉(zhuǎn)化宿主細胞但不殺傷所述至少一種對效應(yīng)子有抗性的已轉(zhuǎn)化宿主細胞；(D)分離(C)中所述的至少一種對效應(yīng)子有抗性的已轉(zhuǎn)化宿主細胞；(E)確定與由(D)中所分離的抗效應(yīng)子的已轉(zhuǎn)化宿主細胞表達的所述小發(fā)夾RNA分子互補的多核苷酸序列；和(F)將由(E)中確定的由所述對效應(yīng)子有抗性的已轉(zhuǎn)化宿主細胞表達的所述至少一種小發(fā)夾RNA分子互補的多核苷酸序列與所述宿主細胞基因組的至少一個多核苷酸序列進行比較，以鑒定包含所述多核普酸序列的宿主基因，其中該多核苷酸序列與由所述抗效應(yīng)子的已轉(zhuǎn)化宿主細胞表達的至少一種小發(fā)夾RNA分子互補，從而鑒定作為該宿主細胞中靶基因的宿主細胞基因。在一個實施方案中，所述效應(yīng)子基因是單純皰療病毒胸苷激酶。在另一個實施方案中，所述篩選劑是更昔洛韋(ganciclovir,GCV)。在一個實施方案中，所述效應(yīng)子基因與誘導(dǎo)其表達的調(diào)節(jié)元件可操作性連接。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件選自啟動子、增強子元件、鐵調(diào)節(jié)元件(ironregulatoryelement,IRE)、5，非翻譯區(qū)、反式作用元件和順式作用元件。在又一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件選自病毒、細菌或真菌調(diào)節(jié)元件。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件是乙肝病毒Pre-Sl啟動子。在另一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方案中，所述哺乳動物細胞是癌細胞。在另一個實施方案中，所述癌細胞選自HepG2、Huh7和HEK293。在又一個實施方案中，所述表達盒聯(lián)合編碼小發(fā)夾環(huán)RNA分子文庫。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)化所述宿主細胞包括用慢病毒表達栽體轉(zhuǎn)染宿主細胞。在一個實施方案中，所述慢病毒表達載體是非靈長類慢病毒表達載體，其來源于EIAV、FIV、BIV、CAEV或MVV。在所述方法的一個實施方案中，確定(E)中多核苷酸序列的步驟包括對有效應(yīng)子抗性的已轉(zhuǎn)化宿主細胞的核酸提取物進行PCR擴增反應(yīng)。本發(fā)明的另一個方面是產(chǎn)生分離的抗效應(yīng)子的已轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，其包括(A)改造宿主細胞以包含效應(yīng)子基因，其中當篩選劑存在時所述效應(yīng)子基因的表達對所述宿主細胞有細胞毒性；(B)用編碼小發(fā)夾RNA分子的表達盒轉(zhuǎn)化(A)的宿主細胞群，其中每個所述小發(fā)夾RNA分子具有與宿主細胞基因組的多核苷酸序列互補的序列；(C)通過在一定條件下用所述篩選劑與(B)中所述的已轉(zhuǎn)化宿主細胞群體相接觸來選擇至少一種抗效應(yīng)子的存活的已轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中所述已轉(zhuǎn)化宿主細胞表達至少一種由所述表達盒編碼的小發(fā)夾RNA分子，并且其中所述效應(yīng)子基因的表達殺傷對效應(yīng)子敏感的已轉(zhuǎn)化宿主細胞但不殺傷所述至少一種抗效應(yīng)子的已轉(zhuǎn)化宿主細胞；和(D)分離(C)中的至少一種抗效應(yīng)子的已轉(zhuǎn)化宿主細胞，由此產(chǎn)生分離的抗效應(yīng)子的已轉(zhuǎn)化宿主細胞。在該方法的一個實施方案中，所述效應(yīng)子基因是單純皰瘆病毒胸苷激酶。在另一個實施方案中，所述篩選劑是更昔洛韋。在一個實施方案中，所述效應(yīng)子基因與誘導(dǎo)其表達的調(diào)節(jié)元件可操作性連接。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件選自啟動子、增強子元件、鐵調(diào)節(jié)元件(IRE)、5'非翻譯區(qū)、反式作用元件和順式作用元件。在又一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件選自病毒、細菌或真菌調(diào)節(jié)元件。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件是乙肝病毒Pre-Sl啟動子。在另一個實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方案中，所述哺乳動物細胞是癌細胞。在另一個實施方案中，所述癌細胞選自HepG2、Huh7和HEK293。本發(fā)明的另一方面是分離的重組抗效應(yīng)子的宿主細胞，其包含(i)可誘導(dǎo)細胞毒性效應(yīng)子基因和(ii)具有與內(nèi)源靶基因區(qū)域互補之序列的小發(fā)夾RNA分子，所述內(nèi)源靶基因編碼調(diào)節(jié)細胞毒性效應(yīng)子基因表達的多肽。在一個實施方案中，當篩選劑存在時所述效應(yīng)子基因的表達對所述宿主細胞有細胞毒性，所述小分子發(fā)夾RNA分子通過降低效應(yīng)子基因的表達賦予了對篩選劑細胞毒效應(yīng)的抗性。在另一個實施方案中，所述效應(yīng)子基因是單純皰滲病毒胸苷激酶。在一個實施方案中，當更昔洛韋存在時所述效應(yīng)子基因變得有毒。在一個實施方案中，所述效應(yīng)子基因與誘導(dǎo)其表達的調(diào)節(jié)元件可操作性連接。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件選自啟動子、增強子元件、鐵調(diào)節(jié)元件(IRE)、5，非翻譯區(qū)、反式作用元件和順式作用元件。在又一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件選自病毒、細菌或真菌調(diào)節(jié)元件。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)元件是乙肝病毒Pre-Sl啟動子。在另一個實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方案中，所述哺乳動物細胞是癌細胞。在另一個實施方案中；所述癌細胞選自HepG2、Huh7和HEK293。圖1."負選擇"原理示例的示意圖。圖2.shRNA文庫制備示例的流程圖，方法來自Luo等，PNAS，101(15):5494-5499(2004)，并為清楚描述而進行了一些改進。圖3.對用于本發(fā)明中shRNA文庫的慢病毒載體圖示例的示意圖。圖4.本發(fā)明中為假型慢病毒復(fù)制和分泌提供蛋白質(zhì)的輔助質(zhì)粒實例的示意圖。圖5.本發(fā)明中HBVPre-Sl啟動子/TK基因構(gòu)建物質(zhì)粒pLenti醒dPRESl誦TKl(SEQIDNO:13)的圖鐠示意圖。發(fā)明詳述在下述詳細說明中，對附圖的參考構(gòu)成其一部分。在附圖中，類似的符號通常表示類似的內(nèi)容，除非另外指明。在此詳細說明中描述的示例性實施方案、附圖和權(quán)利要求不意味著限制?？稍诓幻撾x本發(fā)明精神或范圍的情況下應(yīng)用其它實施方案以及進行其它改變。RNA干擾(RNAi)是細胞內(nèi)存在某些類型雙鏈RNA分子時引發(fā)的關(guān)閉某些基因表達的細胞機制。小發(fā)夾RNA(shRNA)是一種類型的雙鏈RNA分子，其是由含序列互補區(qū)的轉(zhuǎn)錄物形成的。所述互補序列彼此退火形成莖，而非互補序列在該莖結(jié)構(gòu)每個臂之間形成環(huán)。shRNA在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄自含有聚合酶III啟動子的栽體。所述shRNA含有由環(huán)所連接的來自靶基因的有義和反義序列，它從細胞核被運送到細胞質(zhì)，在此所述shRNA被酶加工成小/短干擾RNA(siRNA)。細胞質(zhì)中的短21-23RNA雙鏈體引發(fā)了Dicer酶活性，其最終導(dǎo)致該雙鏈體的反義鏈依靠所述雙鏈體與基因轉(zhuǎn)錄物之間互補序列的結(jié)合與內(nèi)源基因的RNA轉(zhuǎn)錄物退火。所得非天然的局部雙鏈RNA分子導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄物的酶促破壞。因此，與靶基因序列具有序列同源性的dsRNA雙鏈體的存在導(dǎo)致該乾基因的沉默。參見Clark和Ding,J.Biomed.AndBiotech.,Vol.2006:1-7(2006)，其通過參考并入本文。因此，可以i史計特異性乾向并沉默乾基因表達的dsRNA分子。本發(fā)明不受到任何特定理論的限制，但是其涉及RNAi級聯(lián)，由此本方法將shRNA導(dǎo)入細胞，從而導(dǎo)致靶基因的沉默。在本發(fā)明的一個方面，所述靶基因是負責活化特定調(diào)節(jié)元件的基因。所述方法可以用來鑒定哪個基因有助于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)元件活性，以表達與之可操作性連接的核酸。所述調(diào)節(jié)元件對于細胞基因組來說可以是外源的或者天然的。例如，病毒所感染，所表達的蛋白質(zhì)會損害或殺死所述細胞。本方法可以用來鑒定參與活化表達不想要核酸或蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)元件的細胞基因產(chǎn)物。因此，在病毒的例子中，所述方法可以用來鑒定表達例如哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動物基因，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合與殺傷細胞的病毒蛋白編碼序列可操作性連接的病毒啟動子并由此使之活化。通過鑒定哪個內(nèi)源基因參與激活這些啟動子活性，可以^1計化合物和組合物來下調(diào)或沉默該內(nèi)源基因活性。因此，這些化合物和組合物可用于關(guān)掉該特定基因，由此排除了不想要的啟動子或調(diào)節(jié)元件活性。但是，本發(fā)明不限于鑒定細胞中促進外源調(diào)節(jié)元件活性的基因。所述方法包括鑒定在正常情況下在相同細胞中與內(nèi)源(即天然)調(diào)節(jié)元件活性相關(guān)聯(lián)的基因。但是，也可如此操作、關(guān)閉或沉默其它非宿主基因。例如，可以設(shè)計靶向特定病毒、細菌或病原基因組的特定序列或基因的shRNA分子，使得可以使用本文所述的shRNA負選擇方法沉默參與表達不想要外源蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物的基因。因此，本發(fā)明可用于鑒定涉及多種疾病的基因，例如傳染性病毒疾病，并且可用于鑒定涉及任何其它疾病的基因，例如癌癥、糖尿病、高血壓和自身免疫疾病。一方面，可使用負選擇細胞毒性篩選測定并暴露于小發(fā)夾RNA來實施本方法。在一個實施方案中，具體而言，"效應(yīng)子"基因與調(diào)節(jié)元件可操作性連接，所述元件在特定宿主細胞中會使用一種或多種宿主細胞聚合酶以及其它一些轉(zhuǎn)錄蛋白和酶來表達該效應(yīng)子基因。所述效應(yīng)子基因產(chǎn)物單獨不具有細胞毒性。但是，當所述細胞暴露于篩選劑時所述效應(yīng)子基因產(chǎn)物變得有細胞毒性并殺傷細胞。通過在表達該效應(yīng)子基因的細胞暴露于誘導(dǎo)細胞毒性的篩選劑之前，將該細胞暴露于與細胞中的基因組序列部分互補的RNA分子(例如小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA))，從而實施本方法。不受到任何特定作用機制理論的限制，shRNA分子可在細胞中引發(fā)RNA干擾(RNAi)級聯(lián)，并沉默與其部分互補的基因表達。因此，被敲除的內(nèi)源基因不能表達其產(chǎn)物，例如功能性RNA或多肽或蛋白。因此，該功能性產(chǎn)物的缺失意味著靶標調(diào)節(jié)元件保持去活化狀態(tài)。因為所述調(diào)節(jié)元件是去活化的，所以它不表達與其可操作性連接的下游效應(yīng)子基因。因此，將此細胞暴露于篩選劑不誘導(dǎo)細胞毒性，所以該細胞不死亡或凋亡。本發(fā)明方法不限于當篩選劑存在時具有細胞毒性的效應(yīng)子基因。也可利用其它一些功能性配對。例如，效應(yīng)子基因可表達熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)，當篩選劑化合物存在時其可改變熒光，或者如果shRNA活性導(dǎo)致與GFP可操作性連接的調(diào)節(jié)元件去活化則其根本不表達。在這種情況下，不發(fā)出熒光的細胞含有被沉默的參與促進該調(diào)節(jié)元件活性的基因。可通過標準實驗室設(shè)備和技術(shù)例如熒光活化細胞分選儀(FACS)容易地對熒光和非熒光細胞進行分選。因此，本發(fā)明方法的總體思想;U^測效應(yīng)子基因產(chǎn)物與篩選劑之間的關(guān)系，并闡明細胞在暴露于shRNA分子之前和之后的表型差異?？赏ㄟ^用栽體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞來將宿主細胞暴露于RNA分子，所述載體或質(zhì)粒含有當轉(zhuǎn)錄時將產(chǎn)生雙鏈RNA分子的多核苷酸序列?？稍O(shè)計所述多核苷酸序列以使得它含有至少兩個彼此倒置重復(fù)或互補的區(qū)域，使得所得RNA轉(zhuǎn)錄物自我折疊，例如編碼的多核苷酸可包含回文核苷酸序列。此設(shè)計允許所得RNA轉(zhuǎn)錄物自我折疊，并形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，即前述的shRNA分子。在暴露于篩選劑后仍存活的細胞中，shRNA表達之后編碼shRNA的載體可以繼續(xù)存在一，時間。在此情況下，有可能通過標準實驗方法確定載體在細胞中的存^，例如通過載體特異性PCR擴增、限制性消化或者Southern印跡探針雜交。通過鑒定細胞中存在哪個載體，有可能進一步鑒定該栽體中編碼的shRNA多核苷酸。也就是說，栽體身份使技術(shù)人員知曉了所述的身份，該shRNA被設(shè)計用來耙向細胞基因組中的特定基因組序列。因此，shRNA身份為技術(shù)人員提供了有關(guān)在該細胞中被沉默的靶基因的信息。由此得出以下結(jié)論，該特定乾基因的下調(diào)或敲除沉默阻止了調(diào)節(jié)元件的活化，否則所述元件會表達可誘導(dǎo)細胞毒性的效應(yīng)子基因。因此，在此分析結(jié)束時，有可能鑒定出當所述shRNA不存在時在正常情況下在該特定細胞中是哪個基因負責活化該特定調(diào)節(jié)元件。細胞可暴露于不止一種shRNA分子。也就是說，細胞群可聯(lián)合暴露于整個shRNA文庫，然后暴露于篩選劑。這些細胞可以被一種或多種shRNA編碼栽體所感染，使得每個細胞中存在多種栽體。shRNA文庫栽體的一種設(shè)計確保它們含有通用PCR引物，例如T7和Sp6，這允許從樣品擴增所有載體，而不論它們表達何種具體的編碼shRNA的多核普酸。因此，本發(fā)明方法的一個或多個任選步驟可如下描述(1)用含有目的調(diào)節(jié)元件的表達盒轉(zhuǎn)染宿主細胞，所述元件在正常情況下驅(qū)動可誘導(dǎo)細胞毒性的效應(yīng)子基因的表達；(2)用表達RNA分子例如shRNA分子的載體再次轉(zhuǎn)染該宿主細胞，所述RNA分子具有與細胞基因組中靶序列互補的序列；(3)將已改造的宿主細胞暴露于篩選劑，其使得效應(yīng)子基因產(chǎn)物具有細胞毒性；(4)鑒定暴露于篩選劑后仍存活的細胞；(5)鑒定存活細胞中的栽體；以及(6)由此鑒定編碼shRNA的多核普酸，這使得技術(shù)人員知曉在細胞中被shRNA分子所靶向接著被下調(diào)或沉默的基因組序列。shRNA分子shRNA由包含至少兩個彼此互補的多核苷酸亞區(qū)域(例如一個序列及其倒置互補序列)的多核普酸所編碼。目的是設(shè)計表達具有彼此相互結(jié)合之內(nèi)部序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的多核苷酸，例如含有至少一組回文核苷酸序列的多核苷酸。RNA轉(zhuǎn)錄物因此自我折疊產(chǎn)生發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)一shRNA分子。另外，所述多核苷酸具有與宿主細胞基因組序列互補的序列。發(fā)夾序列可以由21個威基的莖和6個g的環(huán)構(gòu)成，盡管本發(fā)明方法不僅限于這些核苷酸參數(shù)的發(fā)夾shRNA。每個部分的長度一般小于30個核苷酸，例如29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個核苷酸。在一些實施方案中，每個部分的長度是約19至30個核苷酸、約20至29個核苷酸、約21至28個核苷酸、約22至27個核苷酸、或者約23至26個核苷酸。在一些shRNA分子中，RNA分子的互補的第一和第二部分是良夾結(jié)構(gòu)的"莖"。這兩個部分可通過連接序列進行連接，所述連接序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的環(huán)。所述連接序列的長度可有所不同。在一些實施方案中，所述連接序列可以長5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸。代表性連接序列是5，-TTCAGAAGG-3，，但許多序列都可用于連接第一和第二部分。所述第一和第二部分互補但不必是完全對稱的，因為發(fā)夾結(jié)構(gòu)可^^有3，或5，突出核苷酸(例如1、2、3、4或5個或者長于5個核苷酸的突出)。所述shRNA分子可包含具有與粑基因序列至少約80%、約85%、約90%、約95%或約99%—致性的序列。與靶基因序列同源的shRNA序列的長度可以是5-10、10-15或15-20個核苷酸?；パa靶核苷酸序列可位于RNA雙鏈體區(qū)域的一條鏈中。環(huán)的大小可以是100bp或者更長。所述環(huán)的長度大小范圍可以是4-20個核苷酸、20-50個核苷酸、50-100個核苷酸或者大于100個核苷酸。將每個發(fā)夾序列分別克隆進期望栽體，并進行測序驗證。對每個靶基因制備多個例如3-6個shRNA構(gòu)建體，以提供不同的敲低(knockdown)水平以及靶向特定mRNA轉(zhuǎn)錄物的不同區(qū)域。因此shRNA文庫可含有聯(lián)合靶向特定細胞類型中所有基因的shRNA分子。例如，shRNA文庫可以由表達RNA轉(zhuǎn)錄物的栽體構(gòu)成，所述RNA轉(zhuǎn)錄物折疊成小發(fā)夾環(huán)并且其具有一個或多個與一個或多個靶基因具有序列一致性的序列。因此，在一個實施方案中，所述文庫的每個栽體可含有產(chǎn)生靶向一個靶基因的shRNA的核苷酸序列。作為替代，所述文庫的每個栽體可以是靶向兩個或多個基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板。也就是說，所述文庫的每個栽體可以是耙向兩個基因、三個基因、四個基因、五個基因、六個基因、七個基因、八個基因、九個基因、十個基因或多于十個基因的shRNA的轉(zhuǎn)錄模板。所述靶基因可以是彼此的同源物，例如相關(guān)等位基因或特定基因家族的成員。作為替代，所述靶基因可以各不相同。shRNA分子還可具有隨機生成的乾序列。也就是說，除了促進形成小發(fā)夾RNA的回文序列之外，所述shRNA可含有未知的并且并入編碼DNA序列之中的隨機基因組序列。靶序列的位置可以在shRNA分子轉(zhuǎn)錄物的任意位置。也就是說，編碼DNA序列在成為對應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物發(fā)夾莖的區(qū)域中可含有隨機基因組序列。所述序列可以是在shRNA莖一條臂的一部分中以及其互補序列在莖的另一條臂上，使得所述靶序列彼此退火形成雙鏈莖結(jié)構(gòu)。或者，所述靶序列可以在雙鏈shRNA莖的單鏈部分中，例如在shRNA莖的回文序列之中。也就是說，所述乾序列可位于所述RNA轉(zhuǎn)錄物的5，或3，突出部分。或者，所述靶序列可位于所述shRNA發(fā)夾的單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)中。shRNA中靶序列的長度可以是約10個核苷酸、約ll個核普酸、約12個核苷酸、約13個核苷酸、約14個核苷酸、約15個核苷酸、約16個核苷酸、約17個核香酸、約18個核苷酸、約19個核苷酸、約20個核苷酸、約25個核苷酸、約30個核苷酸、約35個核苷酸、約40個核苷酸、約45個核苷酸、約50個核苷酸或超過約50個核普酸，例如約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約100個核香酸、約200個核苷酸、約300個核普酸或超過約300個核苷酸。因此，乾序列長度可以是例如15-25個核普酸、16-24個核苷酸、17-23個核普酸、18-22個核苷酸或19-21個核苷酸。因此，在此情況下，不需要事先知道shRNA身份或者用于靶向的細胞中特定基因身份。一旦鑒定了接觸篩選劑后仍存活的細胞，就可鑒定出shRNA中的特定靶向序列以及繼而鑒定出被沉默的同源性內(nèi)源基因。shRNA文庫一般有約三種類型技術(shù)人員公知的siRNA表達策略。參見Zhaoetal.,JournalofCancerMolecules1(1):19-24，2005，其通過參考并入本文.本發(fā)明方法不限于任何具體的文庫。本發(fā)明方法中可使用任意類型siRNA或shRNA文庫。例如，酶促產(chǎn)生的siRNA文庫、合成的siRNA文庫、siRNA文庫、shRNA文庫、shRNA-mir文庫是可用于本發(fā)明的文庫的一些實例?？深A(yù)先設(shè)計或隨機產(chǎn)生RNAi文庫，其核酸片段與靶標核酸序列(例如宿主細胞基因組的基因序列)完全或部分互補?？赏ㄟ^以下方法制備RNAi文庫(1)核酸內(nèi)切酶制備siRNA，(2)酶促制備shRNA,(3)化學合成，或者(4)合成法制備。參見Buchholz等，NatureMethods,3(9):696-700(2006)，其通過參考并入本文。因此，一種制備shRNA文庫的方法是使用cDNA作為靶材料，其被消化成為小片段，例如通過DNA酶I或通過使所述cDNA接觸限制性酶混合物或者通過限制性酶CviKI-l,其具有4個預(yù)期識別位點，識別序列5，-RGACY-3，(互補序列為3，-YCAGR5，)，其中"A"表示切割位點，其還具有多達11個的松散非同源位點(relaxednon-cognatesite)("星號位點")。然后，可操作所得片段或者將其連接到其它接頭(adaptor)或預(yù)先制備的發(fā)夾DNA上以得到所需回文自退火序列，接著將其亞克隆到聚合酶III啟動子的下游。Buchholz等，NatureMethods,3(9):696-700(2006)。酶促制備的shRNA文庫是靈活的，可用于鑒定靶向單基因的最優(yōu)shRNA。因此，如上所述，可使用特定基因的完整cDNA以產(chǎn)生多個短片段，然后測試每個短片段以確定所得shRNA分子沉默該模板基因的有效性。因此，可以通過消化編碼細胞類型特異性基因的cDNA來設(shè)計細胞類型特異性shRNA分子。所以，可以制備含有靶向在腎細胞中表達但不在肝細胞中表達之基因的片段的shRNA文庫。此細胞類型偏好可以得到這樣的shRNA分子，它們可用于鑒定涉及器官特異性疾病的基因，或者被感染性疾病病原所劫持而產(chǎn)生病原、細菌或病毒蛋白質(zhì)的天然基因。參見Shirane等，NatureGenetics，36(2):190-196(2004);Sen等，NatureGenetics36(2):183-189(2004);Zhao等，J.CancerMol.，1(1):19-24(2005);Clark和Ding,J.Biomed.andBiotech.,Vol.2006:1-7(2006);Silva等，NatureGenetics,37(11):1281-1288(2005);和Chang等，NatureMethods,3(9):707-714(2006)，其通過參考全部并入本文。在一個實施方案中，本文所述方法可使用人肝癌細胞系H印G2的cDNA來篩選輔助HBV啟動子/增強子的細胞因子基因。一種可用于制備shRNA的方法描述于Luo等(PNAS,101(15):5494-5499(2004))，其通過參考整體并入本文。shRNA文庫也有市售的，例如以下'〉司ThermoScientific(Waltham，MA，USA)和Sigma-AldrichCompany(St.Louis，MO，USA)。shRNA栽體制備shRNA構(gòu)建物的一種常用方法是合成、退火兩個互補寡核苷酸并將其連接到表達載體中。另一種方法是以啟動子序列為模板的PCR方法。反向引物中含有所述發(fā)夾序列，PCR得到包含啟動子和發(fā)夾的克隆盒(cloningcassette)。反向引物的二級結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致錯誤產(chǎn)物的擴增，其可通過將長反向引物替換為兩個較短引物來避免。然后將上述反應(yīng)修改為兩輪巢式PCR，其中每輪使用其中一個引物來引入半個發(fā)夾。另一種方法是以啟動子序列為模板的PCR方法。反向引物中含有所述發(fā)夾序列，PCR得到包含啟動子和發(fā)夾的克隆盒?？梢詫⑸鲜龇磻?yīng)修改為兩輪巢式PCR,其中每輪使用其中一個引物來引入半個發(fā)夾。第三種方法基于聚合酶延伸重疊寡核苷酸的3，端的原理。在一個實例中，從兩個3，端重疊的長度大約相等的部分互補的序列產(chǎn)生shRNA模板。每個序列既用作模板(用于延伸相反序列)又用作引物(用于復(fù)制相反序列)。延伸和重復(fù)的循環(huán)產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物。參見Mclntyre和Fanning,BMCBiotechnology,6:1-8(2006)，其通過參考并入本文。shRNA載體也有市售的，例如BLOCK-iTTMPolIImiRRNAi載體(Invitrogen)、BLOCK-iTTMU6RNAi入門栽體(EntryVector)提供了shRNA的組成型表達(Invitrogen)和BLOCK-iTTM資導(dǎo)型HI入門載體^f吏用啟動子在四環(huán)素謙導(dǎo)下表達shRNA序列(Invitrogen);MissionRNAi(SigmaAldrich)。還可使用慢病毒shRNA載體，例如Dharmacon的SMART載體shRNA慢病毒技術(shù)，其使用了整合進慢病毒遞送平臺的miRNA支架特異性特征，以進行有效的RNAi加工。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)化宿主細胞包括用慢病毒表達栽體轉(zhuǎn)染宿主細胞。在一個實施方案中，所述慢病毒表達栽體是來自馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)或者維斯納梅迪病毒(MVV)的非靈長類慢病毒表達載體。插入到細胞中的RNAi選擇盒可作為RNA或DNA插入細胞。因此，所述載體任選地包括基于DNA或RNA的載體。栽體可含有聚合酶III依賴性啟動子，例如，Hl、tRNA-val或U6啟動子或者其它的聚合酶III依賴性啟動子，如5SrRNA、snRNA和tRNA啟動子(參見Mittal，V.2004:ImprovingtheefficiencyofRNAinterference.NatureReviewsGenetics,5:355-365)。polII啟動子的例子包括CMV和MSCV長末端重復(fù)。還可使用含有誘導(dǎo)型調(diào)控序列的栽體，其包括但不限于四環(huán)素誘導(dǎo)或蛻皮素誘導(dǎo)型調(diào)控序列?？?吏用數(shù)種技術(shù)來測試不同siRNA構(gòu)建物在細胞mRNA和/或蛋白質(zhì)水平的影響。例如，雙GFP轉(zhuǎn)染、基于抗體/表位特異性的CHO-細胞雙轉(zhuǎn)染、定量RT-PCR、Northern印跡、Western印跡、免疫熒光和Hygro/Neo選擇。這些方法是本領(lǐng)域公知的。用于遞送shRNA載體的病毒及顆粒慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄顆?？捎糜谶f送shRNA載體到細胞中。用于引入慢病毒包裝和栽體組分到個體細胞中的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，一種方法是通過瞬時三轉(zhuǎn)染將產(chǎn)生慢病毒載體顆粒所需的不同DNA序列同時引入到細胞內(nèi)，例如ewv編碼序列、gag-pol編碼序列以及缺陷型慢病毒基因組(Landau&Littman1992J.Virol.66，66(8):5110-3;Soneka等，1995NucleicAcidsRes.，23:628-633)。在一個實施方案中，作為其生產(chǎn)系統(tǒng)，栽體構(gòu)造^^用三個轉(zhuǎn)錄單元表達基因組、gag-pol組合和包膜。包膜表達盒可包含數(shù)種包膜之一，例如VSV-G或多種鼠逆轉(zhuǎn)錄包膜例如4070A。通常，這三個盒可表達自瞬時轉(zhuǎn)染進合適細胞系例如293T的三種質(zhì)?；蛘弑磉_自穩(wěn)定產(chǎn)生細胞系的整合拷貝。一種替代性方法是使用另一種病毒作為三個盒的表達系統(tǒng)，例如桿狀病毒或腺病毒。它們都是核表達系統(tǒng)。調(diào)節(jié)元件本發(fā)明的一個方面是鑒定負責活化正常情況下表達有害于宿主細胞的蛋白質(zhì)或核酸之目的調(diào)節(jié)元件的基因。通過了解有助于促進或誘導(dǎo)該調(diào)節(jié)序列活性的天然或外源基因，可以設(shè)計下調(diào)或沉默該調(diào)節(jié)元件的療法。因此，目的調(diào)節(jié)序列可以是啟動子、增強子元件、鐵調(diào)節(jié)元件(IRE)、5，非翻譯區(qū)、反式作用元件或者順式作用元件。調(diào)節(jié)元件序列可以來自哺乳動物基因組、病毒基因組、細菌基因組、酵母基因組、真菌基因組、爬行類基因組、鳥基因組或者魚基因組。一種目的調(diào)節(jié)元件是乙肝病毒Pre-Sl啟動子。對于HBV，可用調(diào)節(jié)元件包括但不限于，例如HBVPre-S2啟動子、HBVX啟動子/增強子和HBV核心啟動子/增強子元件。所述調(diào)節(jié)元件序列還可以是病毒5，或3，末端序列中的序列，例如HIV的5，和3，長末端重復(fù)、HCV5，或3，非翻譯區(qū)、病毒內(nèi)部核糖體進入位點序列和其它病毒順式作用元件，其可參與病毒基因的表達和調(diào)控、病毒衣殼包裝或者病毒復(fù)制。例如，假病毒基因組載體中與通用啟動子例如CMV啟動子可操作性連接的TK表達盒的表達依賴于假病毒基因組的復(fù)制。該病毒基因組中的某些順式作用元件在病毒和細胞蛋白的輔助下負責所述復(fù)制。當所轉(zhuǎn)錄的RNA分子使得復(fù)制所需細胞蛋白質(zhì)沉默時，細胞在暴露于相關(guān)篩選劑后會存活，對于TK來說是暴露于更昔洛韋。效應(yīng)子基因可用于本發(fā)明的一個具體效應(yīng)子基因是單純皰疹病毒胸苷激酶。其它胸苷激酶效應(yīng)子基因包括巨細胞病毒胸苷激酶和水痘帶狀皰療病毒胸苷激酶。胞嘧咬脫氨基酶賦予了哺乳動物細胞對5-氟胞嘧啶的致死敏感性。參見Mullen等，PNASJanuary1，1992vol.89no.133-37。本發(fā)明可用的其它自殺基因/篩選劑配對可以在WorldJournalofSurgery2002;26(7):783-789中找到，其通過參考并入本文Cwww.SDringerlink.com/content/lrlmgm61i4knlk71/除了本文所述的HSV-tk/GCV對之外，例如，負篩選系統(tǒng)還可基于市售的Tet-開/關(guān)系統(tǒng)或者高級Tet-開/關(guān)系統(tǒng)(Clontech)。參見Yin等Anal.Biochem.1996;235:195-201。此系統(tǒng)使用四環(huán)素或強力霉素作為結(jié)合tTA/rtTA的篩選劑，tTA/rtTA由目的調(diào)節(jié)元件表達，以誘導(dǎo)有毒蛋白質(zhì)的表達。有毒蛋白質(zhì)可以是細菌、病毒、真菌、植物或動物來源的肽毒素。它也可以是任意細胞裂解蛋白(如穿孔素和粒酶B(granzymeB))或凋亡資導(dǎo)蛋白(如FAS配體、TRAIL)。在使用肽毒素殺傷細胞的方法中，由于調(diào)節(jié)元件組成型表達所述毒素基因，可以忽略四環(huán)素或強力霉素誘導(dǎo)。在此情況下，不需要使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，siRNA文庫和效應(yīng)子基因構(gòu)建物可以共轉(zhuǎn)染，或者在效應(yīng)子基因構(gòu)建物之前轉(zhuǎn)染siRNA文庫，以確保細胞刺激因子在有毒效應(yīng)子表達之前被沉默。篩選劑17在一個實施方案中，效應(yīng)子基因是單純皰療病毒胸苷激酶，當篩選劑更昔洛韋存在時變得有毒。其它的篩選劑例如可參見WorldJournalofSurgery2002;26(7):783-789(見上文)。可用效應(yīng)子基因/毒性誘導(dǎo)劑對包括但不限于，例如(1)單純皰療病毒胸苷激酶效應(yīng)子基因(HSV-TK)和選自下列的篩選劑更昔洛韋、阿昔洛韋、膦甲酸(Foscarnet，phosphonoformicacid,PFA)和9-[4-羥基-2-(羥曱基)丁基l鳥噤呤(2HM-HBG)。參見ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,1990;34(12):2417-2419，其通過參考并入本文。(2)胞嘧啶脫氨基酶(cytosinedeaminase,CD)效應(yīng)子基因和5-氟胞嘧啶篩選劑。(3)水痘帶狀皰滲病毒胸香激酶(varicella-zostervirusthymidinekinase,VZV-TK)效應(yīng)子基因和6-甲氧基噪呤阿糖核苷篩選劑。U)硝基還原酶(NTR)效應(yīng)子基因和CB1954[5-(氮丙咬-1-基)-2,4-二硝基苯曱酰胺篩選劑。(5)大腸桿菌gpt效應(yīng)子基因和6-硫代黃嘌呤篩選劑。(6)大腸桿菌Deo效應(yīng)子基因和甲基嘌呤脫氧核苷篩選劑。根據(jù)負選擇方法可以使用任意這些組合以鑒定已被所表達的RNA分子沉默的內(nèi)源基因，并因此阻止具體所述基因的表達。特定目標效應(yīng)子基因不能表達意味著暴露于相應(yīng)篩選劑后宿主細胞仍存活。如文中所述，被沉默的內(nèi)源基因的身份可以通過鑒定表達的RNA分子序列來確定，所述RNA分子由具有與該內(nèi)源基因互補序列的shRNA文庫來表達。宿主細胞可使用調(diào)節(jié)元件/效應(yīng)子基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染任意細胞，然后暴露于shRNA編碼載體。例如，所述細胞可以是哺乳動物細胞。或者所述細胞可以是器官特異性細胞，例如但不限于腎細胞、肝細胞、肺細胞、胰細胞、腸細胞、乳腺細胞、心臟細胞或者角質(zhì)形成細胞?？梢宰鳛楸疚乃鲚d體宿主的其它細胞類型包括但不限于例如角化型上皮細胞、濕潤復(fù)層屏障上皮細胞(wetstratifiedbarrierepithelialcells)、外分泌上皮細胞、激素分泌細胞、代謝和儲藏細胞、屏障功能細胞(肺、腸、外分泌腺和泌尿生殖道)、腎、緊靠內(nèi)體腔的上皮細胞襯層、具有推進功能的纖毛細胞、細胞外基質(zhì)分泌細胞、收縮細胞、血液和免疫系統(tǒng)細胞、感覺傳導(dǎo)細胞、自主性神經(jīng)元細胞、感覺器官和外周神經(jīng)元支持細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞、晶狀體細胞、色素細胞、生殖細胞、滋養(yǎng)細胞和間質(zhì)細胞。宿主細胞可以是健康細胞或者被感染或患病細胞。因此。細胞可以是例如癌細胞。本發(fā)明可用的癌細胞包括但不限于，例如HepG2，Huh7和HEK293。可以根據(jù)本發(fā)明的負選擇方法d吏用任意宿主細胞。因此，為了鑒定與特定疾病相關(guān)的疾病靶標，可檢測患病的特定組織的細胞以鑒定基因靶標。例如，為了搜尋肺癌靶標，分析肺細胞系。對于病毒性肝炎，分析例如HepG2或Huh7的肝癌細胞系。例如，根據(jù)本發(fā)明方法可4吏用下述細胞和細胞系A(chǔ)172(膠質(zhì)瘤)、A549(肺癌)、BCP-1(PEL)、H1299(肺癌)、HEK293細胞(腎-原始HEK系被Hela污染)、HeLa(宮頸癌)、HL60(早幼粒細胞白血病)、K562(慢性髓性白血病)、KG-1(骨髄性白血病)、Jurkat細胞系(來源于T細胞白血病患者)、Lncap(前列腺癌)、MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB-438(乳腺癌)、T47D(乳^癌)、THP-l(急性髄性白血病)、U87(膠質(zhì)母細胞瘤)和SHSY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞(克隆自骨髓瘤)。實施例通過下述實施例進一步舉例說明本發(fā)明，其不以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例1設(shè)計shRNA/siRNA分子如圖1所示，用質(zhì)粒構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染本發(fā)明中可用的細胞，所述質(zhì)粒構(gòu)建物表達處于已知疾病基因調(diào)節(jié)元件控制下的效應(yīng)子基因。將shRNA文庫轉(zhuǎn)染/感染進入上述細胞，將篩選劑孵育于培養(yǎng)基中以篩選能夠沉默效應(yīng)子表達的shRNA。因為shRNA來源于不含有效應(yīng)子基因(如TK)的細胞系，存活的細胞有可能含有沉默已知疾病基因調(diào)節(jié)元件功能所需細胞基因的shRNA。這些基因可編碼直接或間接刺激已知疾病基因調(diào)節(jié)元件的反式作用因子。間接剌激因子包括直接作用蛋白質(zhì)的輔助因子和調(diào)節(jié)那些直接作用蛋白質(zhì)功能的很多其它基因，例如參與對直接作用蛋白進行上調(diào)、磷酸化、曱基化的基因，等等。AC:直接作用蛋白。Co-AC，直接作用蛋白的輔助因子。RE，已知疾病基因調(diào)節(jié)元件。shRNA分子經(jīng)過以下步驟來源于人肝細胞瘤細胞系HepG2的cDNA:(Luo等，Proc.Nat，l.Acad.Sci.(USA)，101(15):5494-5499(2004)圖1，步驟A中用于cDNA片段化的CV/KI-1)。步驟A:發(fā)夾連接子連接。從期望細胞培養(yǎng)物中提取mRNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用內(nèi)切酶CV/KI-1切割所述cDNA，CV/KI-1識別序列5，-RGCY-3，(互補序列是3，-YCGR-5，)，并連接到自退火發(fā)夾連接子5，-pCGGTCGGAGTCTTCATGATTCAAGAGATCATGAAGACTCCGACCG-3，(SEQIDNO:1)。所述發(fā)夾連接子具有3f附el(TCCGAC)和(GAAGAC)的識別序列。然后用Mmel消化連接產(chǎn)物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化約40個核苷酸大小的所得延長發(fā)夾。步驟B:將延長發(fā)夾轉(zhuǎn)變?yōu)榛匚碾p鏈DNA。延長發(fā)夾與三個寡核苷酸組成的延伸接頭相連(1)延伸引發(fā)寡核普酸5，-GACTCTGATACACTGTCT-3，(SEQIDNO:2)，3，端最后兩個堿基被硫代磷酸酯修飾以保護該寡核苷酸免受DNA聚合酶的3，—5，核酸外切酶降解活性；(2)延伸正向引物，5'國CAGAGTCGGTCTCAAAAANN陽3，(SEQIDNO:3);和(3)延伸反向寡聚物，5，國TTTTTGAGACCGACTGACAGACAGTGTATCAGAGTCGGG-3，(SEQIDNO:4)。所述延伸正向引物含有Bsal的識別序列GGTCTC。;單鏈DNA結(jié)合蛋白的存在下通過DNA聚合酶大亞基的聚合酶和鏈置換活性將連接產(chǎn)物重新形成為雙鏈DNA(dsDNA)分子。步驟C:克隆進逆轉(zhuǎn)錄表達載體。用消化來自步驟B的延伸產(chǎn)物，兩端留下了5，-AAAA的突出。通過PCR擴增人U6啟動子來構(gòu)建PolIII啟動子表達載體pLenti-U6A，其使用了引物5，-GACggtaccGCTAGCAAAAAACTGTCTTCGAAGACTCTTTTTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCA-3，(SEQIDNO:5)和5，-GGCCggatecCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCATG-3，(SEQIDNO:6)，其將串聯(lián)56sl位點置于位于U6啟動子立即下游。用丑&I消化留下兩個5，-TTTT突出，隨后其與Bsal消化的回文cDNA延伸產(chǎn)物的5，-AAAA突出相連接。步驟D:產(chǎn)生發(fā)夾環(huán)。用朋sI消化DNA以除去大部分最初的發(fā)夾連接子序列，每一端留下CGAC單鏈5，突出。用DNAPolI的Klenow片段填平所得突出，接著平端自連接產(chǎn)生在兩個20-21bpcDNA回文序列之間含有7Vjt"I位點的8bp序列(GTCGCGAC)。實施例2shRNA載體細節(jié)和'匱病毒包裝shRNA載體pLenti國U6A來源于InvitrogenViraPowerTM(tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/virapower—lentiviral一system一man.pdf)，通過用含多克隆位點5，-CATATGAAGCTTGGATCCGAATTCGGGCCCGTCGACGGTACC-3戰(zhàn)QIDNO:7)的寡核苷酸連接子替換Ndel/Kpnl來進行構(gòu)建，得到空的慢病毒載體"pLenti-link"。通過定點誘變除去2120nt處的單fi&I位點。通過PCR從人基因組DNA擴增人U6啟動子，其使用引物5，-GACggtaccGCTAGCAAAAAACTGTCTTCGAAGACTCTTTTTTTCGTCCTTTCCACAAGATATATAAAGCCA國3，(SEQIDNO:5)和5，-GGCCggatecCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCATG國3，(SEQIDNO:6)，所述PCR產(chǎn)物被插入到上述空質(zhì)粒pLenti-link的單5"附HI/J/wI位點之間，得到在U6啟動子立即下游具有兩個串聯(lián)5AsI位點的shRNA表達栽體pLenti-U6。用56sl消化得到兩個5，-TTTT突出，然后其與Bsal消化的回文cDNA延伸產(chǎn)物的5，-AAAA突出相連接(圖2;步驟C)。為了包裝vsv-G假型慢病毒，三個輔助質(zhì)粒(圖4)與表達shRNA分子的慢病毒栽體一起共轉(zhuǎn)染進Hek-293FT細胞。這些質(zhì)粒是(1)質(zhì)粒g"g-/w/，其提供fflV-1gag和pol蛋白，(2)質(zhì)粒及ev，其提供HIVRev蛋白，和(3)質(zhì)粒vsv-G，其提供VSV糖蛋白?；旌先?種質(zhì)粒(慢病毒載體和其它三種輔助質(zhì)粒)，使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen,CA)共轉(zhuǎn)染進Hek國293FT細胞，以分泌表達各種shRNA分子的vsv-G假型重組慢病毒。從細胞培養(yǎng)基中收集所述慢病毒，用于感染HBVPre-Sl啟動子/TK基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞。此慢病毒載體的特征在圖3中顯示。實施例321設(shè)計效應(yīng)子基因/調(diào)節(jié)元件表達盒為了構(gòu)建效應(yīng)子基因/調(diào)節(jié)元件構(gòu)建物，將部分重復(fù)(1.5拷貝)的HBV基因組(adw2亞型)插入進pLenti-link的單￡"RI位點，產(chǎn)生稱為pLenti-HBV1.5的質(zhì)粒。進行定點誘變刪除HBVPre-SlORF并插入兩個單限制性位點at^I和5cfl，其產(chǎn)生臨時質(zhì)粒pLenti-HBV-dPRESl。參見下表1中的SEQIDNO13。使用兩個引物從質(zhì)粒pHSV-106擴增HSVTKORF以引入限制性位點7V/^I和5cAI。然后將TKORF克隆進臨時質(zhì)粒pLenti-HBV-dPreSl而產(chǎn)生最終構(gòu)建物pLenti-dPRESl-TKl。參見圖5^的質(zhì)粒圖鐠和SEQIDNO:13。(注pLenti-U6A可用于在U6啟動子控制下表達shRNA文庫。)pLenti-dPRESl-TKl質(zhì)粒用于在HBVPre-Sl啟動子控制下表達TK基因。TK表達載體不需要一定是慢病毒載體。此處可使用任何載體。TK表達栽體用于構(gòu)建穩(wěn)定細胞系。因為在此載體中沒有例如Neo基因的選擇標記，可以期望共轉(zhuǎn)染例如pcDNA3.1的輔助質(zhì)粒以提供選擇標記。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>5821atstsicatcgtttccatggctgctaggctgtactgccssctggstccttcgcgggacgtc5881ctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcgcggggccgcttggg5941actctctcgtccccttctccgtctgccgttccagccgaccacggggcgcacctctcttta6001cgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggtccgtgtgcacttcgcttcacctct6061gcacgttgcatggagaccaccgtgaacgcccatcagatcctgcccaaggtcttacataag6121aggactcttggactcccagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcctacttcaaagactgt6181gtgtttaaggactgggaggagctgggggaggagattaggttaaaggtctttgtattagga6241ggctgtaggcataaattggtctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaa6301tcatctcttgtacatgtcccactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggg6361gcatggacattgacccttataaagaatttggagctactgtggagttactctcgtttttgc6421cttctgacttctttccttccgtcagagatctcctagacaccgcctcagctctgtatcgag6481aagccttagagtctcctgagcattgctcacctcaccatactgcactcaggcaagccattc6541tctgctggggggaattgatgactctagctacctgggtgggtaataatttggaagatccag6601catccagggatctagtagtcaattatgttaatactaacatgggtttaaagatcaggcaac6661tattgtggtttcatatatcttgccttacttttggaagagagactgtacttgaatatttgg6721tctctttcggagtgtggattcgcactcctccagcctatagaccaccaaatgcccctccaa6781ttcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtga6841ctgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccag6901aattcgggcccgtcgacggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatctt6961agccacttttt站aagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaa7021gatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatetgagcctgggagctc7081tctggctaactagggaacccactgettaagcctcaataaagettgecttgagtgcttcaa7141gtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcsgacccttttsg7201tcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattsttcagtatttataa7261ettgeaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgeagettataatggt7321tacaaataaagcaatagcatcaca站tttcac站ataaagcatttttttcactgeattet7381agttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgc7441ccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatg7501gctgactaattttttttatttatgeagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattcc7561agaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggaegtacccaattcgccctatagtga7621gtegtattaegcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctgg7681cgttaccc站ctt站tcgccttgeagcacstccccctttcgccsgctggcgt站tagcga7741agaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgegcagectgaatggcgaatgggacgc7801gccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac7861acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgtt7921cgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgc7981tttaeggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatc8041gecctgatagaeggtttttegccctttgacgttggagtccaegttctttaatagtggact8101cttgttcc站actggaacaacactcaaccctatcteggtctattcttttgatttataagg8161gattttgecgattteggectattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaaege8221gaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcaetttteggggaaatgtgcgc8281ggaacccctatttgtttatttttct站atacattcaaatatgtatccgetcatgagacaa8341t&accctgat站atgcttcaatsatattgs站站gg站gsigtstgsgtsttc站catttc8401cgtgtcgcccttattcccttttttgeggeattttgecttectgtttttgctcacccagaa8461acgctggtgaaagtaa站gatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaa8521ctggatctcaacageggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatg8581atgagcacttttaaagttctgctatgtggcgeggtattatcccgtattgacgccgggcaa8641gagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtc8701acagaaaagcatettaeggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataacc8761atgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgateggaggacegaaggagcta8821acegcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaceggag8881ctg站tgaagccataccaaaegacgagegtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaaca8941acgttgcgcaaactattaactggegaactacttactctagcttcccggcaacaattaata9001gactggatggaggeggataaagttgcaggaccscttctgcgctcggcccttccggctggc9061tggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtetcgeggtatcattgeagea9121ctggggccagatggt站gccctcccgtatcgtagttatctacacgaeggggagtcaggca9181actatggatgaacgaaatagacagatcgetgagataggtgcctcactgattaagcattgg9241taactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattg3tttaa3acttcatttttaa9301tttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgt279361gagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaaga9421cctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaa9481gtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccga9541gcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagt9601tctgtagcaccgcctacstacctcgctctgctaatcctgt9661ggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgat9721cggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagct9781g站ctgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgcca9841gcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag9901gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttc9961pgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatgga10021tttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcaca10081cctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgag10141cgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg10201ccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagct10261tggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagtt10321caggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtg10381tttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagc10441agggaacaaaagctggagctgcaagctt實施例4用效應(yīng)子基因/調(diào)節(jié)元件轉(zhuǎn)化細胞使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen)將效應(yīng)子基因/調(diào)節(jié)元件表達慢病毒栽體pLenti-dPRESl-TKl和質(zhì)粒pcDNA3.1(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，pcDNA3.1質(zhì)粒表達neo基因以用于geneticin(G418)選擇穩(wěn)定細胞系。詳細的轉(zhuǎn)染步驟獲得自Invitrogen網(wǎng)頁(tools.invitrogen.com/Content/SFS/Pn)ductNotes/F_Lipofectamineo/o202000b-040923-RD-MKT-TL-HL050602.pdf),其通過i考并入本文。為了檢查TK基因的表達，使用RT-PCR，其中使用5，-ATGGGAGGTTGGTCATCAAA醒3(SEQIDNO:8)和5，畫AAAATACCGCCGTGTGGAGG-3，(SEQIDNO:9)。為了確認TK基因的表達，使用藥物GCV殺傷細胞。使用抗TK抗體的Western印跡分析是確認TK表達的筒便方法。也可用4吏用抗TK抗體的ELISA測定。實施例5細胞暴露于shRNA文庫為了包裝假型慢病毒，三個輔助質(zhì)粒(圖4)與表達shRNA分子文庫的慢病毒載體(圖3)共轉(zhuǎn)染。這三個輔助質(zhì)粒是(1)質(zhì)粒(圖4)，其提供HIV-1gag和pol蛋白，(2)質(zhì)粒及ev(圖4),其提供tcaaaggatcaaccaccgctaggtaactggtsggccaccataccagtggcagttaccggatggagcgaaccgcttcccgaagcgcacgaggccacctctg站aacgccagtgttctttccctgataccgcaagagcgcccggcacgacagagctcactcagaattgtgaggcgcaattaattcttgagataccagcggtgcttcagcagacttcaagaactgctgccsgttaaggcgcaggacctacaccagggag站agggagcttccaacttgagcgtc站cgcggcctgcgttatcctcgccgcagc站tacgcaaagtttcccgacttaggcaccccgg3t站c站ccctcactaaHIVRev蛋白，和(3)質(zhì)粒vsv-G(圖4)，其提供VSV糖蛋白。混合這4種質(zhì)粒，使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen)將其共轉(zhuǎn)染進Hek-293FT細胞，以包裝和分泌表達各種shRNA分子的假型重組慢病毒。從細胞培養(yǎng)基中收集所述慢病毒，用于感染HBVPre-Sl啟動子/TK基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞。使用LIPOFECTAMINETM2000試劑轉(zhuǎn)染的方案改進自產(chǎn)品說明書(InvitrogenCorporation,CA)。下述方案用于24孔板但是可針對;UJ^進行修改貼壁細胞轉(zhuǎn)染前一天，將500微升無抗生素培養(yǎng)基中的0.5-2xio5個細胞鋪板，使細胞在轉(zhuǎn)染時達到90-95%匯合。對于每個轉(zhuǎn)染樣品，按照如下制備復(fù)合物在50微升無血清的Opti-MEMIReducedSerum培養(yǎng)基(或其它無血清培養(yǎng)基)中稀釋DNA。輕輕混合。使用前輕輕混合LIPOFECTAMINETM2000，然后在50微升Opti-MEMI培養(yǎng)基中稀釋合適的量。室溫孵育5分鐘。孵育5分鐘之后，并且在lipofectamine步驟的25分鐘之內(nèi)，將稀釋的DNA與稀釋的LIPOFECTAMINETM2000合并(總體積=100微升)。輕輕混合并在室溫下孵育20分鐘(溶液可能呈渾濁)。注意復(fù)合物在室溫下保#^、定6小時。將100微升復(fù)合物加入到含有細胞和培養(yǎng)基的每個孔中。通過前后搖動培養(yǎng)板輕輕混合。在37C的C02孵箱中孵育細胞18-48小時，然后測定轉(zhuǎn)基因表達。4-6小時后可更換培養(yǎng)基。對于穩(wěn)定細胞系轉(zhuǎn)染后24小時，以l:10(或更高的稀釋比)傳代細胞到新鮮培養(yǎng)基中。第二天加入選擇性培養(yǎng)基(如果需要的話)。實施例6篩選和細胞選擇方案測試TK基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞對于多種濃度(1-1000微克/毫升)更昔洛韋的敏感性，例如培養(yǎng)基中10微克/毫升的GCV，以誘導(dǎo)細胞死亡。處理開始后第5天，通過MTT方法測定細胞存活力。MTT方案可獲得自www.biotium.com/Droduct/productinfo/Protocol/30006.pdf，其通過參考并入本文。約5天之后，撤去GCV，然后測定細胞存活力。實施例7在存活細胞中鑒定shRNA載體用于擴增并由此鑒定宿主細胞中表達的特定RNA分子序列的通用引物選自表達慢病毒栽體的文庫中shRNA回文序列側(cè)翼的區(qū)域。可使用例如正向引物(5，-GCAGGAAGAGGGCCTATTTC-3，；SEQIDNO:10)和反向引物(5，-TGAATTAGCCCTTCCAGTCC-3，；SEQIDNO:11)以擴增shRNA序列。對于合并的存活細胞，DNA序列分析之前進行克隆步驟。對于用GCV選擇建立的特定細胞集落或細胞系，使用上述正向或反向引物進行直接PCR測序以確定shRNA序列。一旦確定了shRNA序列，就可通過NCBI網(wǎng)頁上的核普酸blast分析推導(dǎo)出mRNA乾標序列(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgiPAGE=Nucleotides&PROGRAM-blastn&MEGABLAST=on&BLAST_PROGRAMS=megaBIast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on)。為了確認shRNA分子的功能，期望克隆shRNA分子并測試其在含有TK基因構(gòu)建物的幼稚細胞中的功能。為了確認本方法所鑒定的細胞疾病靶標的功能，使用所鑒定的shRNA/siRNA沉默乾基因，并雙重檢驗此基因的沉默降低或消除HBVPre-Sl表達。等同物本公開內(nèi)容不限于本申請所述的特定實施方案，所述實施方案旨在舉例說明其各個方面。在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行許多修飾和變化，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。從前述內(nèi)容出發(fā)，除了本文列出的那些之外，本公開內(nèi)容范圍內(nèi)的功能等同的方法和裝置對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修飾和變化落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本公開內(nèi)容僅僅受到所附權(quán)利要求以及這些權(quán)利要求的全部等同范圍的限制。應(yīng)理解此公開內(nèi)容不限于特定方法、試劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng)，它們當然可以變化。還應(yīng)理30解，本文所用的術(shù)語目的僅僅是描述特定實施方案，而不意味著限制。關(guān)于本文復(fù)數(shù)和/或單數(shù)形式的使用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)內(nèi)容和/或應(yīng)用對單復(fù)數(shù)形式進行合理轉(zhuǎn)換。為了清楚起見，本文中使用了多種單復(fù)數(shù)變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一般地，本文所用術(shù)語特別是在權(quán)利要求中(例如所附權(quán)利要求部分)通常指"開放式"術(shù)語(例如術(shù)語"包括"應(yīng)理解為"包括但不限于"，術(shù)語"具有"應(yīng)理解為"至少具有"，等等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，如果在權(quán)利要求中意圖限定特定數(shù)量的某種表述，那么此意圖會在權(quán)利要求中明確描述；當不存在這樣的表述時，就不存在這樣的意圖。例如，為了便于理解，以下權(quán)利要求可使用修飾性短語"至少一個"和"一個或多個"來限定權(quán)利要求中的表述。但是，使用這些短語不應(yīng)視為暗示在任何權(quán)利要求中沒有數(shù)量限定的表述將表示該權(quán)利要求限制在僅僅含有一個這種表述的實施方案，即使當同一權(quán)利要求中包括修飾性短語"一個或多個"或"至少一個"以及沒有數(shù)量限定時也是如此；對于使用"所述"等修飾的表述也是如此。另外，盡管明確限定了特定數(shù)量的表述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道這種表述應(yīng)理解為表示至少所述的數(shù)量(例如，沒有其它修飾的表述"兩個表述"意味著至少兩個表述或者兩個或更多)。另外，在使用"A、B和C等中至少之一"類似的慣常說法時，一般來說，這種表示方式意思是指本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解這種表述方式(例如"具有A、B和C至少之一的系統(tǒng)"包括但不限于僅有A、僅有B、僅有C、有A和B、有A和C、有B和C、和/或同時有A、B和C，等等)。當使用類似表述"A、B或C中至少之一"時，一般來說，這種表述意思是指本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解這種表述(例如"具有A、B或C至少之一的系統(tǒng)"包括但不限于僅有A、僅有B、僅有C、有A和B、有A和C、有B和C、和/或同時有A、B和C，等等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，無論在說明書、權(quán)利要求或附圖中，用于提出兩個或多個可替代項目的幾乎任何連接詞和/或短語，都應(yīng)理解為涵蓋包括項目之一、項目任一或全部項目的可能性。例如，短語"A或B"應(yīng)理解為包括"A"或"B"或"A和B"的可能性。另外，當以馬庫什形式描述本公開內(nèi)容的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道由此本公開內(nèi)容還描述了馬庫什組合的任何單個成員或成員亞組。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，對于任意和所有目的，例如以提供書面說明的形式，本文所公開的所有范圍還包括其任何以及全部的亞范圍以及其亞范圍組合。任意所列范圍可以很容易認識到，這相當于已經(jīng)充分描述并實現(xiàn)該范圍被分為至少相等的兩半、三份、四份、五份、十份等的范圍。作為非限制性實例，本文所述每個范圍都可方便地分為下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，所有例如"至多"、"至少"、"多于"、"少于"等的語言都包括所表述的數(shù)量，以及還表示所述范圍可以隨后分成如上所述的亞范圍。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，每個范圍都包括其每個成員。因此，例如具有l(wèi)-3個細胞的組指具有1、2或3個細胞的組。相似地，具有1-5個細胞的組指具有l(wèi)、2、3、4或5個細胞的組等等。盡管本文公開了多個方面和實施方案，其它方面和實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本文公開的多個方面和實施方案旨在舉例說明，而不意為限制。本發(fā)明的真實范圍和精神由權(quán)利要求書來確定。32序列表<110>童貽剛安小平張昕<120>細胞疾病把標的負選擇<130>091619-0121<140><141><160>14<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>45<212>DNA<213>人工序歹'J<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸<400>1cggtcggagtcttcatgattcaagagatcatgaagactccgaccg45<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成引物<400>2gactctgatacactgtct18<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序歹ij<220><223>人工序列描述合成引物<220><221>修飾械基<222>(19)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其它<400>3cagagtcggtctcaaaaann20<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序歹'J<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸<400>4tttttgagaccgactgacagacagtgtatcagagtcggg39<210>5<211>72<212>DNA<213>人工序歹'J<220><223>人工序列描述合成引物<400>5gacggtaccgctagcaaaaaactgtcttcgaagactctttttttcgtcctttccacaaga60tatataaagcca72<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成引物<400>6ggccggatcccccgagtccaacacccgtgggaatcccatg40<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸<400>7catatgaagcttggatccgaattcgggcccgtcgacggtacc42<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成引物<400>8atgggaggttggtcatcaaa20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成引物<400>9aaaataccgccgtgtggagg20<210>10'<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>35<223>人工序列描述合成引物<400>10gcaggaagagggcctatttc20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成引物<400>11tgaattagcccttccagtcc20<210>12<211>6062<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成多核苦酸<400>12aatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaaca60tgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacga120tcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaatt180gccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctg240gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcc300tcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctgg360taactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccg420aacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggctt480gctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttg540actagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaga600attagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgtcagaagaacttagatcattatataatacaatagagataaaagacaccaaggaagctttaaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcaattggagaagtgaattatataaatataaacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcatttgttccttgggttcttgggagcagcagggacggtacaggccagacaattattgtctggggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctttgctctggaaaactcatttgcaccactgcatctctggaacagatttggaatcacacgacttacacaagcttaatacactccttsattgaacaagaattattggaattagataaatgggcttggctgtggtatataaaattattcataatagtttttgctgtactttctatagtgaatagtcagacccacctcccaaccccgaggggacctggagagagagacagagacagatccattcgagcttgggagttccgcgttacataacttaccgacccccgcccattgscgtcaatastgactttccattgacgtcaatgggtggagtatttaggccagggggaaagaaaaaatataaatta660gaacgattcgcagttaatcctggcctgtta720ggacagctacaaccatcccttcagacagga780gtagcaaccctctattgtgtgcatcaaagg840gacaagatagaggaagagcaaaacaaaagt900cttcagacctggaggaggagatatgaggga960agtagtaaaaattgaaccattaggagtagc1020gagagaaaaaagagcagtgggaataggagc1080aagcactatgggcgcagcgtcaatgacgct1140tatagtgcagcagcagaacaatttgctgag1200actcacagtctggggcatcaagcagctcca1260aaaggatcaacagctcctggggatttgggg1320tgtgccttggaatgctagttggagtaataa1380ctggatggagtgggacagagaaattaacaei1440agaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatga1500aagtttgtggaattggtttaacataacaaa1560gatagtaggaggcttggtaggtttaagaat1620agttaggcagggatattcaccattatcgtt1680cgacaggcccg站ggaatagaagaagaagg1740attagtgaacggatctcgacggtatcgata1800ggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa1860gtatgttcccatagtaacgccaatagggac1920acggtaaactgcccacttggcagtacatca198037agtgtatcatatgaagcttggatcccccgacatggcccctcgctccaaaaatgctttcgcgatcagcgtttgagtaagagcccgcgtctgaagacgcgcaggcaaaacgcaccacgtgacaggtcgggcaggaagagggcctatttcccaaggctgttagagagataattagaattaattatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgaaatggactatcatatgcttaccgtaactttcttgtggaaaggacgaaaaaaagagtcttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagaactggaagggctaattcactcccaacgaagtctctggttagaccagatctgagcctgggataagcctcaataaagcttgccttgagtgctctctggtaactagagatccctcagaccctttsgttcstgtcstctt3tt3ttcagtsttttgagaggaacttgtttattgcagcttataatttcacaaataaagcatttttttcactgcatgtatcttatcatgtctggctctagctatcactccgcccagttccgcccattctccgcccgaggccgaggccgcctcggcctctgagctaggcctagggacgtacccaattcgccctatatcgttttacaacgtcgtgactgggaaaacccacatccccctttcgccagctggcgtaatagtccaacacccgtgggaatcccatgggcac2040gtcgcgcagacactgctcggtagtttcggg2100aaccctccgcgccgccccggccccagtgga2160ggagcgtgaccgcgcgccgagcgcgcgcca2220tgattccttcatatttgcatatacgataca2280tgactgtaaacacaaagatattagtacaaa2340ggtagtttgcagttttaaaattatgtttta2400gaaagtatttcgatttcttggctttatata2460cgaagacagttttttgctagcggtaccttt2520tcttagccactttttaaaagaaaagggggg2580acaagatctgctttttgcttgtactgggtc2640gctctctggctaactagggaacccactgct2700tcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtga2760ttagtcagtgtggaaaatctctagcagtag2820ataacttgcaaagaaatgaatatcagagag2880tggttacaaataaagcaatagcatcacaaa2940ttctagttgtggtttgtccaaactcatcaa3000ccgcccctaactccgcccatcccgccccta3060catggctgactaattttttttatttatgca3120ttccagaagtagtgaggaggcttttttgga3180gtgagtcgtattacgcgcgctcactggccg3240ctggcgttacccaacttaatcgccttgcag3300gcgaagaggcccgcaccgatcgcccttccc3360aacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcgg3420cgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac為cttgcc縣gcgccct為gcgcccgctc3480ctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaa3540atcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaac3600ttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctt3660tgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactca3720accctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggt3780taaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgctta3840caatttaggtggcacttttcggggaaat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表達盒轉(zhuǎn)化(A)的宿主細胞群，其中每個所述小發(fā)夾RNA分子具有與宿主細胞基因組的多核普酸序列互補的序列；(C)通過在一定條件下使(B)中的所述轉(zhuǎn)化宿主細胞群接觸所述篩選劑來選擇存活的至少一種有效應(yīng)子抗性的轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述條件為其中所述轉(zhuǎn)化宿主細胞表達至少一種由所述表達盒編碼的小發(fā)夾RNA分子并且其中效應(yīng)子基因的表達殺傷對效應(yīng)子敏感的轉(zhuǎn)化宿主細胞但不殺傷所述至少一種有效應(yīng)子抗性的轉(zhuǎn)化宿主細胞；和(D)分離(C)中的所述至少一種有效應(yīng)子抗性的轉(zhuǎn)化宿主細胞，由此產(chǎn)生分離的有效應(yīng)子抗性的轉(zhuǎn)化宿主細胞。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述效應(yīng)子基因是單純皰滲病毒胸香激酶。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述篩選劑是更昔洛韋。18.權(quán)利要求15-17中任一項的方法，其中所述效應(yīng)子基因與誘導(dǎo)其表達的調(diào)節(jié)元件可操作性連接。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述調(diào)節(jié)元件選自啟動子、增強子元件、鐵調(diào)節(jié)元件(IRE)、5，非翻譯區(qū)、反式作用元件和順式作用元件.20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述調(diào)節(jié)元件選自病毒、細菌或真菌調(diào)節(jié)元件。21.權(quán)利要求18-20中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)元件是乙肝病毒Pre-Sl啟動子。22.權(quán)利要求15-21中任一項的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述哺乳動物細胞是癌細胞.24.權(quán)利要求23的方法，其中所述癌細胞選自H印G2、Huh7和HEK293。25.分離的對效應(yīng)子有抗性的重組宿主細胞，其包含(i)誘導(dǎo)型細胞毒性效應(yīng)子基因和(ii)具有與內(nèi)源乾基因的區(qū)域相互補之序列的小發(fā)夾RNA分子，所述內(nèi)源靶基因編碼調(diào)節(jié)所述細胞毒性效應(yīng)子基因表達的多肽。26.權(quán)利要求25的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中當篩選劑存在時所述效應(yīng)子基因的表達對所述宿主細胞有細胞毒性，并且所述小發(fā)夾RNA分子通過降低效應(yīng)子基因的表達而賦予對篩選劑細胞毒效應(yīng)的抗性。27.權(quán)利要求26的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述效應(yīng)子基因是單純皰疹病毒胸苷激酶。28.權(quán)利要求27的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中當更昔洛韋存在時所述效應(yīng)子基因變得有毒。29.權(quán)利要求25-28中任一項的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述效應(yīng)子基因與誘導(dǎo)其表達的調(diào)節(jié)元件可操作性連接。30.權(quán)利要求29的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述調(diào)節(jié)元件選自啟動子、增強子元件、鐵調(diào)節(jié)元件(IRE)、5，非翻譯區(qū)、反式作用元件和順式作用元件。31.權(quán)利要求29或30的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述調(diào)節(jié)元件選自病毒、細菌或真菌調(diào)節(jié)元件。32.權(quán)利要求29-31中任一項的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述調(diào)節(jié)元件是乙肝病毒Pre-Sl啟動子。33.權(quán)利要求25-32中任一項的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。34.權(quán)利要求33的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述哺乳動物細胞是癌細胞。35.權(quán)利要求34的分離的對效應(yīng)子有抗性的宿主細胞，其中所述癌細胞選自HepG2、Huh7和HEK293。全文摘要本發(fā)明涉及細胞疾病靶標的負選擇，更具體地說，本發(fā)明涉及使用基于RNAi的負篩選測定來鑒定參與活化調(diào)節(jié)元件的基因。文檔編號C12Q1/68GK101659990SQ20081014679公開日2010年3月3日申請日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者安小平,昕張,童貽剛申請人:北京微生物流行病研究所