專利名稱：：耐高溫α-淀粉酶生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程酶制劑的生產(chǎn)方法，具體涉及一種耐高溫a-淀粉酶的生產(chǎn)方法。技術(shù)背景耐高溫a-淀粉酶作為一種新型酶制劑在發(fā)酵與糧食深加工工業(yè)有廣泛的應(yīng)用和良好的市場(chǎng)前景，目前廣泛用于酒精、啤酒、味精、有機(jī)酸、淀粉糖及制藥等行業(yè)，其產(chǎn)量和銷售額逐年增加。我國從80年代起，開始耐高溫a-淀粉酶的生產(chǎn)技術(shù)研究，上海工業(yè)微生物研究所以地衣芽孢桿菌為出發(fā)菌株通過誘變處理，使產(chǎn)酶單位由l-2單位/毫升提高到100單位/毫升左右。直到1989年開始引進(jìn)國外菌種進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)過這十幾年的努力，發(fā)酵活力從不足500u/ml提高到8000u/ml，個(gè)別廠家達(dá)到8500-9000u/ml，但這與美國、丹麥等國家的耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵水平25000u/ml相比還有很大差距。目前，國內(nèi)對(duì)耐高溫a-淀粉酶的研究多集中于菌株傳統(tǒng)誘變選育或通過基因工程構(gòu)建基因工程菌研究上，對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究的不多，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。林劍、崔京春等(無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003年七月第22巻期)通過對(duì)培養(yǎng)劑配方或發(fā)酵工藝的調(diào)整，使發(fā)酵活力有所提高，但未對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化，活力提高也未超過10%;余詩慶等(食品與發(fā)酵工業(yè),2007年第33巻第七期)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，在50L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)酵活力提高了14%，達(dá)到14900u/ml，而沒有進(jìn)行更大的中試和工業(yè)化試生產(chǎn)。而中國專利2007100361599報(bào)道了一種高活性、高純度耐高溫a-淀粉酶生產(chǎn)工藝，采用二次發(fā)酵，基礎(chǔ)料加補(bǔ)料、脈沖進(jìn)氨，以熟豆粕為氮源的工藝，采用控制發(fā)酵溫度43i:，PH6.8進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)絮凝、壓濾、循環(huán)初濾、精濾得耐高溫a-淀粉酶產(chǎn)品，其工藝較為復(fù)雜，使其規(guī)?；茝V受到影響。目前，在耐高溫a-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，由于缺少系統(tǒng)的理論依據(jù)，生產(chǎn)廠家多根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)來指導(dǎo)生產(chǎn)，生產(chǎn)管理和技術(shù)指導(dǎo)盲目性大，加之耐高溫a-淀粉酶屬于中性發(fā)酵環(huán)境，發(fā)酵成功率不高，造成生產(chǎn)成本偏高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)。適時(shí)開展耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵工藝技術(shù)系統(tǒng)研究意義重大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種以玉米淀粉和玉米粉為碳源，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝同時(shí)優(yōu)化，工藝條件簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)的高活性、耐高溫a-淀粉酶新工藝。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案通過如下步驟實(shí)現(xiàn)1、選取菌種采用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，購于廣州微生物研究所。2、1.5噸種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉6%10%，玉米漿1%3%，豆粕2%5%，磷酸二氫鉀0.3%0.6%，磷酸氫二鉀0.5%2%，檸檬酸鈉0.1%0.3%，余量為水，各組分以重量百分比計(jì)；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.2—6.5。用茄子瓶接入種母，溫度37±1°C，通風(fēng)量25-40m3/h，pH值6.4，培養(yǎng)時(shí)間24-36小時(shí)。3.35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉15%30%，玉米粉5%10%,豆粕1%8%，玉米漿2%5%，磷酸二氫鉀0.1%0.8%，磷酸氫二鉀0.8%2%，檸檬酸鈉0.05%0.4%，余量為水，各組分以重量百分比計(jì)；加高溫淀粉酶液化，pH6.2—6.4。溫度42土1。C，風(fēng)量400—1000m3/h，pH值6.4—6.8，培養(yǎng)時(shí)間80—100小時(shí)；在上述條件下補(bǔ)料分批發(fā)酵以淀粉濃度為150280g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比40%70%的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補(bǔ)料物，在DE值降至10~60mg/ml時(shí)以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補(bǔ)料，維持發(fā)酵液中DE值約為10~60mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到220320g/L時(shí)停止補(bǔ)料。4.提取濃縮工藝經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用國外進(jìn)口超濾膜濃縮設(shè)備(超濾膜系美國星達(dá)公司生產(chǎn)，UF809型,截留分子量為10000)，加裝料液循環(huán)冷卻裝置進(jìn)行超濾，保持料液濃縮過程中溫度20°C-45°C，以減少酶活性損失；最后采用精濾板框過濾機(jī)，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出高質(zhì)量成品。本發(fā)明有益效果在于l.以產(chǎn)耐高溫a-淀粉酶的地衣芽孢桿菌為研究對(duì)象，通過大量實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化了發(fā)酵工藝技術(shù)，探討了耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基初始DE值對(duì)發(fā)酵的影響，以及發(fā)酵過程中溶氧、PH值等各種參數(shù)的變化與控制，掌握了該菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶規(guī)律；2.采用間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝生產(chǎn)耐高溫d-淀粉酶，經(jīng)過多批次的工業(yè)化生產(chǎn)試驗(yàn)，發(fā)酵單位最高達(dá)到13480u/ml，平均發(fā)酵產(chǎn)酶水平12360u/ml，較工藝優(yōu)化前的發(fā)酵水平7982u/ml提高54.5%;每標(biāo)噸酶消耗淀粉量19.8kg，較分批發(fā)酵24.8kg減少5kg，形成了一套完整的耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵補(bǔ)料工藝，實(shí)現(xiàn)了年產(chǎn)2000噸耐高溫a-淀粉酶工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)；3.開發(fā)出酶活力在40000u/ml的成品新劑型，填補(bǔ)了國內(nèi)耐高溫a-淀粉酶只有10000u/ml、20000u/ml劑型而沒有40000u/ml劑型的空白；4、產(chǎn)品提取工藝中增加了二次過濾、精濾及硅藻土預(yù)涂工藝過濾除菌，解決了產(chǎn)品耐溫性差、細(xì)菌總數(shù)居高不下難題，并開發(fā)出高活性產(chǎn)品。具體實(shí)施方式為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更好的說明，舉實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明工藝1、選取菌種采用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶能力為6000u/ml，購于廣州微生物研究所。2、1.5噸種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)基培養(yǎng)條件玉米淀粉8%，玉米漿3%，豆粕5%，磷酸二氫鉀0.4%，磷酸氫二鉀1%，檸檬酸鈉0.14%，余量為水，各組分以重量百分比計(jì)；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.5。用茄子瓶接入種母，溫度37土rC，通風(fēng)量40mVh，pH值6.4，培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。3、35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基培養(yǎng)條件玉米淀粉25%，玉米粉10%，豆粕5%，玉米漿2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，磷酸氫二鉀1%，檸檬酸鈉0.2%，余量為水，各組分以重量百分比計(jì)；加高溫淀粉酶液化，pH6.4;溫度42士rC，風(fēng)量800m3/h，pH值6.5，培養(yǎng)時(shí)間102小時(shí)。4、采用35噸發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，依據(jù)上述確定的參數(shù)，選擇以淀粉濃度為240g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比60%的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補(bǔ)料物，在DE值降至50mg/ml時(shí)以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補(bǔ)料，維持發(fā)酵液中DE值約為50mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到300g/L時(shí)停止補(bǔ)料。5、提取濃縮工藝經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用國外進(jìn)口超濾膜濃縮設(shè)備(超濾膜系美國星達(dá)公司生產(chǎn)，UF809型,截留分子量為10000)，加裝料液循環(huán)冷卻裝置進(jìn)行超濾，保持料液濃縮過程中溫度35°C，以減少酶活性損失；最后采用精濾板框過濾機(jī)，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出高質(zhì)量成品。硅藻土選用江西萍鄉(xiāng)助濾劑廠生產(chǎn)的300#硅藻土；精濾板框過濾機(jī)，是板框過濾機(jī)中的一種，它是利用特殊工藝材料編織而成的濾布(本試驗(yàn)選用杭州市興源板框過濾機(jī)廠提供的維尼綸合成纖維專用濾布)作過濾介質(zhì)，并配以硅藻土預(yù)涂工藝，達(dá)到除菌目的，其原理是利用硅藻土較大的比表面積(10-20m2/g)，較少粒度2-100um，這種顆粒具有較大的吸附和滲透能力，能濾降0.1-1.0um粒子和菌體，在以濾布為支持介質(zhì)的表面上預(yù)涂硅藻土薄層(預(yù)涂層)以保護(hù)支持介質(zhì)的毛細(xì)孔道在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不被懸浮液中的固體粒子所堵塞，從而提高過濾速度，達(dá)到穩(wěn)定過濾除菌效果。對(duì)比實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1.分批發(fā)酵與補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表表示不同工藝條件下，二者的變化趨勢(shì)基本相同,但補(bǔ)料分批發(fā)酵除發(fā)酵周期增加20h外，其余的酶活力、放罐體積、標(biāo)噸酶耗淀粉量等結(jié)果都明顯好于分批發(fā)酵。每標(biāo)噸酶耗淀粉量減少5kg，能耗也大幅下降，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著。補(bǔ)料分批發(fā)酵最終產(chǎn)酶12360u/ml，而分批發(fā)酵的最終酶活只有7982u/ml。這主要是由于分批發(fā)酵后期，原料已基本消耗，沒有足夠的原料用于產(chǎn)物合成，而補(bǔ)料分批發(fā)酵中原料能更加合理地被菌體利用，從而合成更多的耐高溫a-淀粉酶。1.國內(nèi)外同類產(chǎn)品對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>優(yōu)化了耐高溫a-淀粉酶發(fā)酵工藝技術(shù)，并開發(fā)出酶活力在40000u/ml的成品劑型，實(shí)現(xiàn)了年產(chǎn)2000噸耐高溫a-淀粉酶的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。與國內(nèi)外同類生產(chǎn)廠家相比較，優(yōu)化后的工藝技術(shù)更科學(xué)合理，開發(fā)的新劑型產(chǎn)品性能穩(wěn)定，填補(bǔ)了國內(nèi)耐高溫a-淀粉酶只有10000u/ml、20000u/ml劑型而沒有<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>主除菌率=(精濾前細(xì)菌總數(shù)一精濾后細(xì)菌總數(shù))/精濾前細(xì)菌總數(shù)X100X上述試驗(yàn)可以看出，通過精濾工藝成品中酶活力基本沒有損失，雜菌數(shù)大幅度降低，細(xì)菌總數(shù)控制在5000個(gè)/ml以下(標(biāo)準(zhǔn)為5X104個(gè)/ml)，除菌率穩(wěn)定在95%以上。產(chǎn)品經(jīng)成品精濾除菌后，常溫存放90天，雜菌數(shù)幾乎沒有增長(zhǎng)或增長(zhǎng)甚少，達(dá)到了試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的，效果明顯，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。權(quán)利要求1、耐高溫α-淀粉酶生產(chǎn)工藝，采用地衣芽孢桿菌為菌株，通過一級(jí)種子罐發(fā)酵、大罐發(fā)酵、過濾、成品處理制得，其特征在于，通過如下步驟實(shí)現(xiàn)(1)選取菌種采用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)；(2)、1.5噸種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉6％～10％，玉米漿1％～3％，豆粕2％～5％，磷酸二氫鉀0.3％～0.6％，磷酸氫二鉀0.5％～2％，檸檬酸鈉0.1％～0.3％，余量為水，各組分以重量百分比計(jì)；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.2-6.5；用茄子瓶接入種母，溫度37±1℃，通風(fēng)量25-40m3/h，pH值6.4，培養(yǎng)時(shí)間24-36小時(shí)；(3)、35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方玉米淀粉15％～30％，玉米粉5％～10％，豆粕1％～8％，玉米漿2％～5％，磷酸二氫鉀0.1％～0.8％，磷酸氫二鉀0.8％～2％，檸檬酸鈉0.05％～0.4％，余量為水，各組分以重量百分比計(jì)；加高溫淀粉酶液化，pH6.2-6.4；溫度42±1℃，風(fēng)量400-1000m3/h，pH值6.4-6.8，培養(yǎng)時(shí)間80-100小時(shí)；在上述條件下補(bǔ)料分批發(fā)酵以淀粉濃度為150～280g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比40％～70％的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補(bǔ)料物，在DE值降至10～60mg/ml時(shí)以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補(bǔ)料，維持發(fā)酵液中DE值約為10～60mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到220～320g/L時(shí)停止補(bǔ)料；(4)、提取濃縮工藝經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用超濾膜濃縮，保持料液濃縮過程中溫度20℃--45℃；最后采用精濾板框過濾機(jī)，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出成品。全文摘要本發(fā)明屬生物工程酶制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法。該生產(chǎn)方法采用地衣芽孢桿菌為菌株，以玉米為碳源、氮源，通過一級(jí)種子罐發(fā)酵、大罐補(bǔ)料分批發(fā)酵、精濾、殺菌處理生產(chǎn)出耐高溫、高活性α-淀粉酶。發(fā)酵單位最高達(dá)到13480u/ml，平均發(fā)酵產(chǎn)酶水平12360u/ml，較工藝優(yōu)化前的發(fā)酵水平7982u/ml提高54.5％；每標(biāo)噸酶消耗淀粉量19.8kg，較分批發(fā)酵24.8kg減少5kg，形成了一套完整的耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵補(bǔ)料工藝，實(shí)現(xiàn)了耐高溫α-淀粉酶工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12N9/28GK101402948SQ20081014134公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者崔躍遠(yuǎn),張新武,杜保安申請(qǐng)人:河南瑞馳生物科技有限公司