專利名稱：：細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株培育篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物選育技術(shù)，特別涉及一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌林培育篩選的方法。
背景技術(shù)：
：纖維素是地球上最豐富的天然聚合體，廣泛存在樹木、棉花等植物中，每年由植物產(chǎn)生的纖維素達(dá)億萬噸。但是，合成纖維素并不是植物特有的功能，某些細(xì)菌也以異養(yǎng)方式比植物更高效的產(chǎn)生胞外纖維素，我們把這種細(xì)菌來源的纖維素稱為"細(xì)菌纖維素"。細(xì)菌合成纖維素是在1886年由Brown首次報(bào)道的，是木醋酸菌Uceto6ac^j^//mwO在靜置培養(yǎng)時(shí)于培養(yǎng)基表面形成的一層白色纖維狀物質(zhì)。后來在許多革蘭氏陰性細(xì)菌，如土壤桿菌、致瘤膿桿菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如八疊球菌中也發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生。細(xì)菌纖維素與天然纖維素結(jié)構(gòu)非常相似，都是D-葡萄糖以(3-1,4糖苦鍵連接而成的鏈狀高分于，具有(C6Hn)05)n的組成。但與之相比，細(xì)菌纖維素具有更優(yōu)越.的特性，它是以純纖維素的形式存在，而植物纖維素的存在形式是與半纖維素和木質(zhì)素等組成三級(jí)立體結(jié)構(gòu)。同時(shí)細(xì)菌纖維素還具有高結(jié)晶度、高強(qiáng)度及良好的親水性能。目前細(xì)菌纖維素已經(jīng)在食品、醫(yī)藥、化工、造紙、高級(jí)音響設(shè)備、濾膜滲透膜和精紡等方面取得成功應(yīng)用。但由于它的低產(chǎn)量所造成的高成本，限制了它的廣泛應(yīng)用。因此有必要篩選出高產(chǎn)的纖維素產(chǎn)生菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，以提高產(chǎn)量，降低成本。木醋桿菌(A^o6ac^j^/z'm/m)是產(chǎn)纖維素能力最強(qiáng)的菌抹，是專性好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，它在正常的代謝條件下，可以分泌細(xì)菌纖維素。通?？梢酝ㄟ^各種物理誘變或化學(xué)誘變的方式選育高產(chǎn)纖維素菌抹，以提高纖維素的產(chǎn)量。木醋桿菌在產(chǎn)纖維素的過程中，會(huì)被自身生成的纖維素包裹起來，所以制備高濃度的菌體細(xì)胞懸液是個(gè)難題。木醋桿菌在利用碳源(濕糖、葡萄糖)代謝產(chǎn)生纖維素的同時(shí)，會(huì)把葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸及酮葡萄糖酸等，使發(fā)酵液pH值降低。當(dāng)pH降低到一定程度，就會(huì)限制木醋桿菌自身的生長(zhǎng)，導(dǎo)致纖維素產(chǎn)量的降低。'因此，提供一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌抹培育篩選的方法，有效解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，是該
技術(shù)領(lǐng)域：
科研人員急需開發(fā)的新課題之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足之處，提供一種實(shí)施步驟簡(jiǎn)單、效果非常顯著的細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌抹培育篩選的方法。.為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的實(shí)施步驟如下(1)加入纖維素酶制備木醋桿菌菌懸液將木醋桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入過濾除菌的纖維素酶，每毫升培養(yǎng)基中纖維素酶的量在0.5U-8U,然后在27-3(TC下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間14_20h,獲得的菌懸液的菌體濃度在106-1()S個(gè)/ml;(2)對(duì)獲得的菌懸液進(jìn)行誘變處理將制得的菌懸液轉(zhuǎn)入滅過菌的培養(yǎng)皿中，放在磁力攪拌器上，進(jìn)行紫外i秀變，i秀變時(shí)間為1-5min;(3)通過NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)子自殺方法進(jìn)行篩選將誘變后的木醋桿菌菌懸液的菌體濃度稀釋到103-105個(gè)/1111，涂布于含有NaBr和NaBr03的瓊脂培養(yǎng)基上，NaBr和NaBr03以重量比5:1的比例加入到培養(yǎng)基中，使NaBr在固體培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到lmmol/L-5mmol/L;在27-30。C下培養(yǎng)，從NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基上^沐存活的菌落進(jìn)行纖維素的產(chǎn)量測(cè)定。在培養(yǎng)基中添加溴化物和溴酸鹽，當(dāng)菌株利用糖類產(chǎn)酸時(shí)，pH值就會(huì)下降，培養(yǎng)基酸性增加。在較高的酸性條件下，溴化物和溴酸鹽發(fā)生反應(yīng)生成溴，即Br(V+2Br+2H^Br2+BrO2_+H20。有毒的溴會(huì)將菌林殺死，這就是質(zhì)子自殺方法。而那些沒有被殺死而在培養(yǎng)基上存活下來的菌株，就是葡萄糖酸缺陷菌株。本發(fā)明采用向培養(yǎng)基中加入纖維素酶的方式，發(fā)現(xiàn)纖維素酶不會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且不會(huì)產(chǎn)生纖維素膜，這樣就可以獲得高濃度的菌懸液。當(dāng)纖維素酶的濃度被稀釋或被從培養(yǎng)液中除去，菌體仍然可以合成細(xì)菌纖維素。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌林培育篩選的方法，加酶制備木醋桿菌菌懸液，并對(duì)根據(jù)此法制得的高濃度的菌懸液進(jìn)行后續(xù)的誘變或其它處理。同時(shí)，加酶制備木醋桿菌菌懸液的方法還可用于大體積的發(fā)酵罐接種，解決了木醋桿菌無法獲得大量種子的難題。通過采用加酶法制備木醋桿菌菌懸液，對(duì)菌懸液進(jìn)行誘變處理，并將誘變后的菌抹接種與NaBr和NaBr03篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。篩選得到.的高產(chǎn)菌株，纖維素產(chǎn)量提高了54%以上。采用本發(fā)明的質(zhì)子自殺的篩選方法，可以快速高效的篩選到高產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌種，獲得葡萄糖缺陷型木醋桿菌，使培養(yǎng)基pH值的不會(huì)降到酸性范圍，有利于細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的提高，對(duì)細(xì)菌纖維素商業(yè)化的成功應(yīng)用具有重要意義。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式詳述如下實(shí)施例1一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株培育篩選的方法，實(shí)施步驟如下(1)加入纖維素酶制備木醋桿菌菌懸液取初始菌林木醋桿菌Z5200|ul接種到裝有40ml種子培養(yǎng)基的三角瓶中。種子培養(yǎng)基的成分為70g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉，溶于1L蒸餾水中，pH5.0。然后加入過濾的纖維素酶液，4吏每毫升培養(yǎng)基中纖維素酶的量在0.5U，27。C靜止培養(yǎng)14h，制得的菌懸液的濃度為2.2xl(^個(gè)/ml。(2)對(duì)獲得的菌懸液進(jìn)行誘變處理將制得的15mlZ5菌懸液轉(zhuǎn)入滅過菌的直徑9cm培養(yǎng)恥中，放在磁力攪拌器上。紫外燈254nm、20W，置于培養(yǎng)基表面20cm的地方，打開磁力攪拌器攪拌使菌懸液保持均一狀態(tài)。打開紫外燈預(yù)熱20min。然后打開培^蓋進(jìn)-f亍誘變，誘變時(shí)間lmin。.(3)通過NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)子自殺方法進(jìn)行篩選首先制備NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基，即將含有NaBr5mol/L和NaBr032mol/L的溶液分別進(jìn)行高溫滅菌，121°C,20min,然后將NaBr和NaBr03以重量比5:1的比例加入固體培養(yǎng)基50g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉及15g瓊脂溶于1L蒸餾水中，pH5.0，使固體培養(yǎng)基中NaBr的濃度為lmmol/L。取出lml的誘變處理樣品用生理鹽水0.85%NaCl進(jìn)行1:10的梯度稀釋。菌體濃度稀釋到103-1()5個(gè)/ml,取菌液100fxl平鋪在NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基上。27。C避光培養(yǎng)8d,觀察存活菌林。如果菌林產(chǎn)酸強(qiáng)烈，就會(huì)有有毒的溴積累，所以只有葡萄糖酸缺陷型菌抹能存活下來。從NaBr和NaBr03瓊脂富集培養(yǎng)基上挑起殘活菌落，轉(zhuǎn)入試管進(jìn)行初篩，然后轉(zhuǎn)入三角瓶測(cè)定產(chǎn)量進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見表l。各誘變菌種相比木醋桿菌Z5，產(chǎn)量有大幅度提高。其中30號(hào)菌林產(chǎn)量最高，命名為木醋桿菌突變抹Z530(A;qy/z'mw2Z530)，A;qv"mw2Z530的產(chǎn)量為4.32g/L,終點(diǎn)pH在4.5，產(chǎn)量相比原始菌抹提高了54%。將獲得的高產(chǎn)木醋桿菌突變抹Z530連續(xù)傳代5次，測(cè)定這5次纖維素產(chǎn)量，結(jié)果證明此菌產(chǎn)纖維素性能穩(wěn)定。表l本發(fā)明質(zhì)子殺菌方法篩選得到的高產(chǎn)菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌抹培育篩選的方法，實(shí)施步驟如下(1)加入纖維素酶制備木醋桿菌菌懸液.取初始菌抹木醋桿菌Z5200inl接種到裝有40ml種子培養(yǎng)基的三角瓶中。種子培養(yǎng)基的成分為70g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉，溶于1L蒸餾水中，pH5.0。然后加入過濾的纖維素酶液，使每毫升培養(yǎng)基中纖維素酶的量在8U，30。C靜止培養(yǎng)20h，制得的菌懸液的濃度為8.0xl0個(gè)/ml。(2)對(duì)獲得的菌懸液進(jìn)行誘變處理將制得的15mlZ5菌懸液轉(zhuǎn)入滅過菌的直徑9cm培養(yǎng)亞中，放在磁力攪拌器上。紫外燈254nm、20W，置于培養(yǎng)基表面20cm的地方，打開磁力攪拌器攪拌使菌懸液保持均一狀態(tài)。打開紫外燈預(yù)熱20min。然后打開培養(yǎng)皿蓋進(jìn)4亍i秀變，i秀變時(shí)間5min。(3)通過NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行篩選首先制備NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基，即將含有NaBr5mol/L和NaBr032mol/L的溶液分別進(jìn)行高溫滅菌121。C，20min，然后將NaBr和NaBr03以重量比5:1的比例加入固體培養(yǎng)基50g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉及15g瓊脂溶于1L蒸餾水中，pH5.0，^使固體培養(yǎng)基中NaBr的濃度為5mmol/L。取出lml的誘變處理樣品用生理鹽水0.85%NaCl進(jìn)行1:10的梯度稀釋。菌體濃度稀釋到103-1()S個(gè)/ml,取菌液100pl平鋪在NaBr和NaBr03瓊脂培養(yǎng)基上。30。C避光培養(yǎng)8d，觀察存活菌林。如果菌抹產(chǎn)酸強(qiáng)烈，就會(huì)有有毒的溴積累，所以只有葡萄糖敘缺陷型菌株能存活下來。從NaBr和NaBr03瓊脂富集培養(yǎng)基上挑起殘活菌落，轉(zhuǎn)入試管進(jìn)行初篩，然后轉(zhuǎn)入三角瓶測(cè)定產(chǎn)量進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果篩選到72號(hào)菌林產(chǎn)量最高，命名'為木醋桿菌突變抹257204.砂//"2^2572)，A:^/z'm/mZ572的產(chǎn)量為4.36g/L，終點(diǎn)pH4.2，相比原始菌株產(chǎn)量提高了56%'。將獲得的高產(chǎn)木醋桿菌突變株Z572連續(xù)傳代5次，測(cè)定這5次纖維素產(chǎn)量，結(jié)果證明此菌產(chǎn)纖維素性能穩(wěn)定。實(shí)施例3,一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌抹培育篩選的方法，實(shí)施步驟如下(1)加入纖維素酶制備木醋桿菌菌懸液.取初始菌抹木醋桿菌Z5200|il接種到裝有7.5ml種子培養(yǎng)基的試管中，種子培養(yǎng)基的成分為70g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉，溶于1L蒸餾水中，pH5.0。然后取3ml種子液接種到含有70ml誘變液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)jEL中。誘變液體培養(yǎng)基的成分為50g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉溶于1L蒸餾水中，pH5.0。培養(yǎng)皿直徑為12cm，30。C培養(yǎng)9d。然后將成形的纖維素膜在無菌的條件下移入一滅過菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)亞直徑為12cm，隨后將這個(gè)培養(yǎng)皿放在搖床上，200轉(zhuǎn)/min,加入105U/ml的纖維素酶1.5ml,進(jìn)行酶解，酶解溫度30。C，酶解時(shí)間12h,使木醋桿菌從被降解的纖維網(wǎng)絡(luò)中釋放出來。將酶解后培養(yǎng)皿中的菌液吸入滅過菌的離心管中，分兩次向培養(yǎng)皿中加入15ml誘變液體培養(yǎng)基，將菌體充分洗下。然后離心棄上清，將菌體懸浮于15ml培養(yǎng)液中。離心洗滌兩次，10000轉(zhuǎn)/分，20min,4°C,將酶液洗去。最后將菌體重新懸浮于15ml培養(yǎng)液中，制得的菌懸液的濃度為5.0xl()8個(gè)/ml。(2)對(duì)獲得的菌懸液進(jìn)行誘變處理將制得的15ml菌懸液轉(zhuǎn)入滅過菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)嚴(yán)直徑9cm,放在磁力攪拌器上。紫外燈254nm,20W,置于培養(yǎng)基表面20cm的地方，打開磁力攪拌器攪拌使菌懸液保持均一狀態(tài)。打開紫外燈預(yù)熱20min。然后打開培#蓋進(jìn)4亍誘變，誘變時(shí)間3min。(3)通過NaBr和NaBr03瓊脂富集培養(yǎng)基進(jìn)行篩選首先制備NaBr和NaBr03瓊脂富集培養(yǎng)基，即將含有NaBr5mol/L和NaBr032mol/L的溶液分別進(jìn)《亍高溫滅菌21min,121°C,然后將NaBr和NaBr03以5:1的比例加入固體培養(yǎng)基50g葡萄糖、10g蛋白胨、2gMgS04、lg檸檬酸鈉及15g瓊脂溶于1L蒸餾水中，pH5.0,使固體培養(yǎng)基中NaBr的濃度為4mmol/L。取出lml的誘變處理樣品用生理鹽水.0.85。/。NaCl進(jìn)行1:10的梯度稀釋。菌體濃度稀釋到103-105個(gè)/1111,取菌液100fil平鋪在NaBr和NaBr03瓊脂富集培養(yǎng)基上。30。C避光培養(yǎng)8d，觀察存活菌林。(4)菌種初篩如果菌林產(chǎn)酸強(qiáng)烈，就會(huì)有有毒的Br的積累，所以只有葡萄糖酸缺陷型菌林能存活下來。從NaBr和NaBr03瓊脂富集培養(yǎng)基上挑起殘活菌落，.將這些菌落轉(zhuǎn)到含有7.5ml誘變液體培養(yǎng)基的試管中。30。C下靜態(tài)培養(yǎng)8d，以木醋桿菌Z5作對(duì)照，試管中纖維素合成的厚度可以通過—見覺判斷，選擇產(chǎn)量比木醋桿菌Z5大的誘變菌抹進(jìn)行下一步的復(fù)'滯。(5)菌種復(fù)篩，初篩后的誘變菌林和木醋桿菌Z5—起，轉(zhuǎn)入裝有40ml誘變液體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種量5%，30。C培養(yǎng)8d，測(cè)定纖維素的產(chǎn)量。結(jié)果篩選到48號(hào)菌抹產(chǎn)量最高，命名為木醋桿菌突變4朱Z548.(^."http://m/mZ548)，Ax_y//m^7Z548的產(chǎn)量為4.36g/L，終點(diǎn)pH4.5,相比原始菌林產(chǎn)量提高了57%。(6)穩(wěn)定性試驗(yàn)'將獲得的高產(chǎn)木醋桿菌突變林Z548連續(xù)傳代5次，測(cè)定這5次纖維素產(chǎn)量，結(jié)果證明此菌產(chǎn)纖維素性能穩(wěn)定。該方法可以快速高效地培育篩選出細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌種。利用質(zhì)子自殺方法篩選出的醋桿菌葡萄糖酸缺陷林，在發(fā)酵后期pH不降低到酸性范圍，有效提高纖維素的產(chǎn)量。上述參照實(shí)施例對(duì)細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌抹培育篩選的方法詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株培育篩選的方法，實(shí)施步驟如下(1)加入纖維素酶制備木醋桿菌菌懸液將木醋桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入過濾除菌的纖維素酶，每毫升培養(yǎng)基中纖維素酶的量在0.5U-8U，然后在27-30℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間14-20h，獲得的菌懸液的菌體濃度在106-108個(gè)/ml；(2)對(duì)獲得的菌懸液進(jìn)行誘變處理將制得的菌懸液轉(zhuǎn)入滅過菌的培養(yǎng)皿中，放在磁力攪拌器上，進(jìn)行紫外誘變，誘變時(shí)間為1-5min；(3)通過NaBr和NaBrO3瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)子自殺方法進(jìn)行篩選將誘變后的木醋桿菌菌懸液的菌體濃度稀釋到103-105個(gè)/ml，涂布于含有NaBr和NaBrO3的瓊脂培養(yǎng)基上，NaBr和NaBrO3以重量比5∶1的比例加入到培養(yǎng)基中，使NaBr在固體培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到1mmol/L-5mmol/L；在27-30℃下培養(yǎng)，從NaBr和NaBrO3瓊脂培養(yǎng)基上挑取存活的菌落進(jìn)行纖維素的產(chǎn)量測(cè)定。全文摘要本發(fā)明涉及一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株培育篩選的方法，實(shí)施步驟如下(1)將木醋桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，同時(shí)向培養(yǎng)基中加入過濾除菌的纖維素酶，每毫升培養(yǎng)基中纖維素酶的量在0.5U-8U，然后在27-30℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間14-20h，獲得的菌懸液的菌體濃度在10⁶-10⁸個(gè)/ml；(2)對(duì)獲得的菌懸液進(jìn)行誘變處理(3)將誘變后的木醋桿菌菌懸液的菌體濃度稀釋到10³-10⁵個(gè)/ml，涂布于含有NaBr和NaBrO₃的瓊脂培養(yǎng)基上，NaBr和NaBrO₃以重量比5∶1的比例加入到培養(yǎng)基中，使NaBr在固體培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到1mmol/L-5mmol/L；在27-30℃下培養(yǎng)，從NaBr和NaBrO₃瓊脂培養(yǎng)基上挑取存活的菌落進(jìn)行纖維素的產(chǎn)量測(cè)定。本發(fā)明方法培育篩選得到的高產(chǎn)菌株，對(duì)細(xì)菌纖維素商業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101314788SQ20081005382公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者謙楊,武曉煒,王祥河,瓊趙申請(qǐng)人:天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司