專利名稱：：抗人cd44單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可以特異性識別人CD44分子，用于白血病的診斷、預(yù)后判斷，或治療白血病的抗人CD44單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：白血病是威脅人類生命健康的主要幾種疾病之一，在我國發(fā)病率大約為2.76/100000人。其中急性淋巴細胞白血病多見于兒童，急性髓系白血病多見于成年人，而慢性白血病多發(fā)于40歲以上人群。它是一類起源于造血(或淋巴)干細胞的惡性疾病。由于干細胞受損，白血病細胞失去進一步分化成熟的能力，或者增殖與分化能力不平衡，而停滯在細胞發(fā)育的不同階段，具體表現(xiàn)為細胞在體內(nèi)無限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白血病與其它癌癥一樣，一直因為沒有特應(yīng)性的標志導(dǎo)致無法用常規(guī)藥物準確殺傷白血病細胞。白血病細胞與正常細胞的區(qū)別目前認為主要在于某些生物分子的表達量不同，利用這些特征，特別是與造血干/祖細胞的區(qū)別可以在一定程度上殺傷白血病細胞而不影響造血的重建。特異性識別某種細胞膜表面分子的抗體正是實現(xiàn)這一目的的最好工具，目前利用抗體治療白血病主要是通過以下三種途徑抗體結(jié)合白血病細胞后通過補體依賴的細胞毒和抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒直接殺傷白血病細胞；抗體結(jié)合白血病細胞表面分子，通過所引發(fā)的下游信號誘導(dǎo)白血病細胞分化或凋亡；通過抗體的靶向作用將殺傷性藥物或效應(yīng)物帶入白血病細胞內(nèi)達到局部殺傷的目的等。目前白血病治療主要采用控制增殖、誘導(dǎo)凋亡的化療藥物，包括垸化劑、抗代謝藥物等。這些藥物在殺死白血病細胞的同時，對正常造血細胞也有嚴重損傷，故對機體存在嚴重的毒副作用。此外，白血病細胞常會對化療藥物產(chǎn)生耐藥，同時化療后復(fù)發(fā)率較高，嚴重影響臨床化療藥物治療的有效性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可特異性識別正常細胞和白血病細胞表達的人CD44分子，并可用于白血病的診斷、預(yù)后判斷，殺傷白血病細胞或抑制其生長的抗人CD44單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途，提供的單克隆抗可以在體外抑制多種白血病細胞系的增殖并誘導(dǎo)其凋亡；提供的抗人CD44單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因及其表達產(chǎn)物，兩者重組后表達產(chǎn)生的抗CD44ScFv片段，能夠特異性結(jié)合人CD44分子并能夠降低鼠源性抗人CD44抗體的免疫源性。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗人CD44單克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCCNO.2176。一種抗人CD44單克隆抗體由保藏號為CGMCCNO.2176雜交瘤分泌。所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgGl亞型?？谷薈D44的工程抗體，由保藏號為CGMCCNO.2176雜交瘤細胞系經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式合成反應(yīng)制備產(chǎn)生。所述的抗人CD44的工程抗體，由SEQIDNO.2重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQIDN0.4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列組成。所述的抗人CD44的工程抗體，編碼所述SEQIDNO.2重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼所述SEQIDNO.4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，分別含有SEQIDNO.1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQIDNO.3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T載體。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，含有SEQIDNO.1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列、SEQIDNO.3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。所述的抗人CD44的單克隆抗體、工程抗體或載體在制備白血病診斷試劑、免疫抑制類藥物或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。一種免疫檢測試劑盒，包含上述的單克隆抗體或工程抗體或載體。所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤或自身免疫性疾??；或評價惡性腫瘤或自身免疫性疾病的發(fā)展和預(yù)后；或指導(dǎo)惡性腫瘤或自身免疫性疾病的治療中的用途?？谷薈D44的工程抗體由保藏號為CGMCCNO.2176(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCN0.2176，保藏日2007-9-18)雜交瘤經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式合成反應(yīng)制備產(chǎn)生，屬于IgGl亞型，該抗體能特異性結(jié)合人CD44分子，在體外對于多種白血病細胞系具有一定的生長抑制和促分化作用。CD44分子在很多急性白血病亞型的白血病原始細胞表面均有表達，參與正常髓系分化，具有信號分子功能，是一個誘導(dǎo)急性白血病原始細胞分化的可能靶點。因此抗人CD44單克隆抗體是一種具有巨大潛力藥用抗體。人體對鼠源性抗體的免疫反應(yīng)(HAMA反應(yīng))是鼠源性抗體應(yīng)用于臨床治療的主要障礙，而基因工程抗體較好的解決了這個問題，它既保留了鼠源單抗的特異親和力，又大大降低了鼠單抗的異源性，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。我們應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，成功的從雜交瘤細胞中克隆到抗人CD44抗體的輕重鏈可變區(qū)基因，并將抗CD44抗體的輕重鏈可變區(qū)基因克隆到原核表達載體，構(gòu)建抗人CD44抗體的單鏈抗體，降低鼠源性抗人CD44抗體的免疫原性，并在大腸桿菌中進行高效分泌性表達，從而提高其產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。單鏈抗體的優(yōu)勢在于較全抗分子量小，穿透能力強，構(gòu)建周期短，抗原性低，易于基因工程操作，為進一步研究其它工程抗體奠定基礎(chǔ)?？稍诖竽c桿菌中表達，易于大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低。圖1是抗人CD44單克隆抗體HI313結(jié)合CD44陽性白血病細胞系的實驗。圖2是根據(jù)兩種CD44陽性細胞系來檢測HI313對CD44抗原的親和力。圖3是HI313對白血病急性髓系白血病細胞系的生長抑制實驗。圖4是CD44抗體處理后NB4細胞周期的測量。圖5是HI313對NB4細胞S期和Gl期的影響。圖6是HI313誘導(dǎo)急性髓系白血病原始細胞的分化情況圖7是PCR擴增VL，VH基因片段電泳圖。圖8是重疊延伸拼接法構(gòu)建HI313-ScFv電泳圖。圖9是重建載體Pet22b(+)ScFv的結(jié)構(gòu)示意圖。圖10是ScFv表達產(chǎn)物的SDS-PAGE(10%)結(jié)果。圖11是HI313-ScFv與CD44陽性細胞系的結(jié)合檢測。具體實施例方式制備抗人CD44的工程抗體的雜交瘤保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCNO.2176，保藏日期2007-9-18，分類命名為小鼠抗人CD44雜交瘤細胞系。下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的可特異性識別正常細胞和白血病細胞表達的人CD44分子，并可用于清除正常免疫細胞或殺傷白血病細胞的抗人CD44工程抗體、載體、試劑盒及其用途作進一步的詳細說明一種抗人CD44單克隆抗體由保藏號為CGMCCNO.2176雜交瘤分泌。所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgGl亞型?？谷薈D44的工程抗體，由保藏號為CGMCCNO.2176雜交瘤細胞系經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式合成反應(yīng)制備產(chǎn)生。所述的抗人CD44的工程抗體，由SEQIDNO.2重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQIDN0.4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列組成。所述的抗人CD44的工程抗體，編碼所述SEQIDNO.2重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼所述SEQIDNO.4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，分別含有SEQIDNO.1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQIDNO.3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T載體。含有所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，含有SEQIDNO.1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列、SEQIDNO.3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。所述的抗人CD44的單克隆抗體、工程抗體或載體在制備白血病診斷試劑、免疫抑制類藥物或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。一種免疫檢測試劑盒，上述的單克隆抗體或工程抗體或載體。所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后；或指導(dǎo)惡性腫瘤的治療中的用途。實施例1小鼠抗人CD44單克隆抗體的制備及熒光標記以分離的人周血單個核細胞為抗原，常規(guī)方法免疫6周齡Balb/c小鼠，首次基礎(chǔ)免疫使用福氏完全佐劑，每隔3周進行一次基礎(chǔ)免疫，共三次，2X107細胞/只"次，最后一次基礎(chǔ)免疫后3周后脾內(nèi)注射加強免疫，1X107細胞/只；3天后取脾，與NS1小鼠骨髓瘤細胞進行融合，按常規(guī)雜交瘤制備方法進行。融合12天后，收集單克隆生長的融合孔上清，利用間接免疫熒光法，選擇CD44陽性的靶細胞系進行篩選鑒定，選擇反應(yīng)性好，生長狀態(tài)好的雜交瘤細胞進行亞克隆，得到穩(wěn)定分泌抗人CD44單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為HI313，液氮凍存。于2000年提交國際白細胞分化抗原會議，被確認為識別人類CD44抗原。制備的抗人CD44單克隆抗體的雜交瘤細胞系保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCNO:2176，分類命名為小鼠抗人CD44雜交瘤細胞系。采用小鼠腹腔內(nèi)誘生法，將HI313細胞株接種Balb/c小鼠腹腔，1.5X107只，l周后采集腹水，經(jīng)ProteinGS印harose4FF親和層析柱層析，制備HI313抗體純品。利用共價連接的方法把熒光素偶聯(lián)到抗體上，經(jīng)分離純化制備出偶聯(lián)復(fù)合物，即熒光標記抗體。實施例2抗人CD44單克隆抗體檢測白血病細胞系細胞表面的CD44表達情況取生長良好的KGla細胞離心收集，用PBS調(diào)制1X107ml，每100^1加入流式管，一管加入FITC標記ffl313抗體，一管加入FITC標記的小鼠IgGl同型對照，室溫避光反應(yīng)20分鐘。加入約2mlPBS洗一次，1000rpm離心10分鐘棄上清，加入30(HdPBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。見圖l。實施例3檢測HI313的親和力HI313抗體采取倍比稀釋的方法，起始濃度為初100嗎/ml，共15個點，終濃度為0.0075嗎/ml，每管加不同濃度的抗體2(^1，對照管加入PBS20W;加入濃度為5X1(T的KGla，THP-1細胞100u1，混勻后共孵育20分鐘，加2mlPBS，1000rpm，離心5分鐘，棄上清，加入FITC標記的羊抗鼠二抗100P1，避光孵育20分鐘，加2mlPBS洗一次，棄上清，加入200^1PBS重懸細胞，，流式細胞儀檢測，GraphPadPrism5軟件分析。結(jié)果顯示基于KGla檢測的結(jié)果為1.34nM，基于THP-1檢測的結(jié)果為1.2nM，結(jié)果一致并遠遠小于10nM，證明HI313具有很高的親和力。見圖2。實施例4抗人CD44單克隆抗體可以在體外有效抑制白血病細胞系的生長取生長良好的CD44陽性白血病細胞系，用含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至4X10Vml，按每孔200W加入96孔培養(yǎng)板。將細胞分為4組，均做4個平行孔。對照組l:不添加任何抗體；對照組2:加入50pg/ml小鼠IgGl亞類抗體；實驗組l:加入10^ig/mlffl313;實驗組2:加入20pg/mlHB13;實驗組3:加入5(Hig/mlffl313。置37。C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-144小時。MTS法檢測細胞生長。ffll86可抑制急性髓系白血病細胞系的增殖。見圖3(抑增殖最大達50%)。實施例5抗人CD44單克隆抗體可以阻斷白血病細胞系的細胞周期取生長狀態(tài)良好的白血病細胞系，離心后，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至細胞濃度為8xloVml，種于24孔板，每孔500nl，分為3組。實驗組對照組1:加入500^1正常RPMI1640培養(yǎng)基；對照組2:加入濃度為100pg/ml的小鼠IgGl同型對照7D1150(Hil;實驗組加入濃度為100嗎/ml的HI313抗體500pl。置37。C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72-120小時，BectonDickinson公司的TheCycleTESEPLUSDNAReagentKit檢測細胞周期，方法依說明書進行。結(jié)果顯示HI313抗體可以阻滯細胞周期于Go/Gp實驗組中處于Go/G,期的細胞較對照組明顯增多。見圖4，圖5，HI313處理后，細胞S期的百分比降低，Gl期增加，說明細胞增殖通過Glarrest被抑制。實施例6HB13誘導(dǎo)急性髓系白血病原始細胞的分化Ficoll液分離急性髓系白血病病人原始細胞，用用含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至lxl06/ml，種于24孔板，2ml/孔。分為3組，實驗組加入HI313抗體，終濃度為2(^ig/ml;對照組l:不加入任何抗體或小鼠同型對照；對照組2:加入終濃度為20ng/ml的小鼠IgGl同型對照7D11。置37'C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第3、5、7天，流式細胞儀檢測細胞表面CDllb、CD14、CD15和CD34的表達情況。見表1，圖6。(請將下表的線條劃上實線)表l檢測培養(yǎng)后病人原代細胞表面CDs表達情況，白血病細胞群<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例7抗CD52抗體的輕重鏈可變區(qū)基因克隆應(yīng)用RT-PCR方法從抗人CD44抗體雜交瘤細胞(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCNO.2176，保藏日2007-9-18)中克隆抗人CD52抗體的輕重鏈可變區(qū)基因(1)RNA提取采用Trizol—步法，1)取雜交瘤細胞約10fi，加入lmlTrizol，吹打混勻，室溫靜置5分鐘。2)加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。3)12000rpm，4。C，離心15分鐘。4)取上清，加入0.5ml異丙醇室溫靜置15分鐘。5)12000rpm，4°C，離心15分鐘。6)棄上清，加入lml75%的乙醇洗，7500rpm，4°C，離心5分鐘。7)棄上清，沉淀晾干，加入30iliLDEPC水溶解。(2)逆轉(zhuǎn)錄為CDNA(，):取2.5mMdNTP4^1，5xfirststrandbuffer8|il，DTT,l，01igodT2nl，水16.6^1，混勻后加入RNA約2嗎，65。C水浴5分鐘，快速冰浴2-3分鐘。加入50U/plRNasin0.4pl，SuperscriptII(200u/pl)1^1混勻后37°C水浴>1小時。取出后70°C水浴10分鐘。一2(TC保存。(3)PCR擴增抗CD44抗體的輕重鏈可變區(qū)基因輕、重鏈可變區(qū)基因PCR擴增反應(yīng)體系(50pl):引物MouseIgprimers購自Novagen公司。以cDNA為模板，高保真PyrobestDNA聚合酶擴增。PCR循環(huán)程序為94°C5分鐘;94。C30秒，55。C30秒，72。C30秒，共30個循環(huán)；最后72。C延伸IO分鐘。(4)測序載體的構(gòu)建Si卿le-T載體購自大連寶生物公司。將輕重鏈可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物回收，與Si即le-T載體連接后，按常規(guī)方法氯化鈣轉(zhuǎn)化，以10(Vg/ml氨芐濃度篩選陽性克隆，送測序，該基因完全符合蛋白數(shù)據(jù)庫中抗體所具有的若干保守的框架氨基酸的特點，該序列為抗體基因序列。分別命名為T-VH及T-VL，見圖7。實施例8單鏈抗體基因表達載體PET22b(+)ScFv的構(gòu)建根據(jù)輕、重鏈可變區(qū)的酶切圖譜及構(gòu)建載體PET22b(+)的酶切位點，設(shè)計并合成了用于VH，VL基因擴增和拼接的引物。VH上游引物5'—ggcgatggccatggatgaggtgcaactgcagcagtctgga—3';VH下游引物^—gacccactggatccgcttcctgaacttccagatcctgaggagactgtgagagtggtgcc—3，。VL上游引物5'—ggaagcggatccagtgggtctggaagctcagatgttgttgtgactcaaactcctctctc—3，；VL下游引物5，—gtggtgctcgagcttatcgtcatcgtccttgtaatcccgtttgatttccagcttggtgc—3'。引入克隆用的NcoI/XhoI限制性酶切位點及單鏈抗體的linker序列(采用最廣泛的(GGGGS)3為linker)。從所構(gòu)建的T-VH及T-VL載體中PCR擴增VH，VL片段，回收后，經(jīng)重疊延伸拼接法(S0E)通過PCR直接合成ScFv基因，見圖8、圖9。將PET22b(+)載體及回收的ScFv基因分別用NcoI/XhoI雙酶切，回收后按常規(guī)方法進行連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建抗人CD52ScFv表達載體PET22b(+)ScFv。陽性克隆用NcoI/XhoI雙酶切鑒定后測序確定。正確的克隆用于表達。測序結(jié)果表明正確，按氨基酸序列推測738bp，ScFv約為26.8KD的蛋白，見圖10。實施例9抗人CD44ScFv抗體片段的表達、純化(1)抗人CD44單鏈抗體(ScFv)在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE分析在3ml含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中接種一陽性單菌落，37'C震蕩培養(yǎng)過夜后，全部接種于1L含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)約4小時后，加IPTG至終濃度為0.lmmol/L，16'C繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)12-20小時后6000g收獲菌液，加入細菌滲透性釋放液(Tris-HC130mM，EDTAlmM，PMSF0.lmM，蔗糖(20%，w/v)，NaCl200mM)100ml，室溫輕搖10分鐘。12000g收集菌體，加入100ml5mM預(yù)冷的MgS04，4。C輕搖10分鐘。12000g再次離心，分別收集上清和菌體。各取適量，加入20yl2XSDS上樣buffer,100。C煮沸5min。取5ul上樣，10%SDS-PAGE檢測表達蛋白，考馬斯亮藍染色。實驗證明實現(xiàn)了重組質(zhì)粒pET22b(+)ScFv在大腸桿菌中的表達，738bp片段表達出約28Kd的帶(His)6的蛋白，見圖10。(2)抗人CD44單鏈抗體(ScFv)純化將按上步收集的菌體沉淀重懸于1/10培養(yǎng)體積的冰預(yù)冷20mmol/LTris-HC1(PH7.2)，超聲破碎細胞，13000rpm，4"離心30min，取上清用于純化。上步收集的上清直接用于純化。蛋白采用Pharmacia公司的ChelatingS印haroseFastFlow進行純化，按操作手冊平衡鎳柱，掛鎳，清洗。將粗分離的樣品加入鎳離子親合層析柱，使目的蛋白結(jié)合到柱子上，洗滌后，用6倍柱床體積的含500rnM咪唑的Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫液用PBS緩沖液透析48小時。實施例10抗人CD44ScFv抗體與CD44陽性細胞系結(jié)合實驗測定活性取CD44表達陽性細胞系，制成1乂106細胞懸液；加入HI313-ScFv，室溫避光孵育30分鐘，加入約2mlPBS洗一次，1000rpm離心10分鐘棄上清；再加入FITC標記的anti-Flag抗體，室溫避光孵育30分鐘，加入約2mlPBS洗一次，1000rpm離心10分鐘棄上清；加入300^1PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示HI313-ScFv可與CD44表達陽性的白血病細胞系結(jié)合。見圖11。SEQUENCELISTING〈110>協(xié)和干細胞基因工程有限公司〈120>抗人CD44單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途<130>〈薩4〈170>Patentlnversion3.3〈210>〈211><212>〈213>1357DNA(Musmusculus)<220>〈221>〈222>CDS(1).(357)<400>gaggtgGluVal11c朋GinctgLeuc灘Gin5cagGintctggacctSerGlyProg朋Glu10ctgLeugtgValLyscctProgggGly15gccAla48tcggtgSerValLysattlie20tecSertgcCysaaagattctLysAspSer25gacAspgacAspgcaAlattcPheagtSer30aggArgtctSer96tggatgTrpMetAsn35tggTrpgtgValaggArgcagaggcctGinArgPro40ggaGlycagGinggtGlycttLeu45gagGlutggTrpattlie144ggaeggGlyArg503ttlietatTyrcctProggaGlygatggagatAspGlyAsp55attlieaaaLystatTyr60AsngggGlyaa_gLysttcPhe192acgggcaaggccacactgactgcagacaagtectecageacagcctac240ThrGlyLysAlaThr65atgcaaetcageageMetGinLeuSerSer85gcaagagggtttaatAlaArgGlyPheAsn100accactetcacagtcThrThrLeuThrVal115〈210〉2〈211>119<212>PRT<213〉小鼠(Musmusculus)<400〉2GluValGinLeuGinGinSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLyslieSerCysLysAspSerAspAspAlaPheSerArgSer202530TrpMetAsnTrpValArgGinArgProGlyGinGlyLeuGluTrplie354045LeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr707580ctgacctctgtggactctgcggtctatttctgtLeuThrSerValAspSerAlaValTyrPheCys9095288tactacggctactttggctectggggccaaggcTyrTyrGlyTyrPheGlySerTrpGlyGinGly105110336tecteaSerSer357GlyArglieTyrProGlyAspGlyAsplieLysTyrAsnGlyLysPhe505560ThrGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGinLeuSerSerLeuThrSerValAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaArgGlyPheAsnTyrTyrGlyTyrPheGlySerTrpGlyGinGly100105110ThrThrLeuThrValSerSer115〈210><211><212><213>〈220〉<221><222〉3339DNA小鼠(Musmusculus)CDS(l)..(339)〈400〉3gatgttgttgtgactcaaactcctetctecctgcctgtcagetttggaAspValValValThrGinThrProLeuSerLeuProValSerPheGly15101548gatcagAspGingttValtctSer20atelietctSertgcCysaggtecArgSer25agtSerceiaGinagtSercttLeugtaVal30AsnactThr96tatgggTyrGly3CCThr35accThrtatTyrttgLeutctSertggtacTrpTyr40etcLeuC3CHis犯gLyscctPro45ggcGlycagGintctSer144CC3C8gProGin50etcLeuetcl>euatelietatTyrgggGly55attteclieSerC3CHis卿ArgtttPhe60tctSergggGlygtgValCC3Pro192gacaggAspArg65ttcPheactThrggcGlyaatAsn70ggtGlyteagggSerGlyThrgatAsp75ttcPheThretcLeu卿Lysatelie802403gC8CCSerThrattlieLyscctPro85gagGlugacAspttgggaLeuGlyatgMet90t￡ltTyrtacTyrtgcCysttaLeuGin95getAla288acaestThrHiscagGincctPro100ccgProThrttcPheggtggaGlyGly105ggcGly3CCThreiagLysctgLeug朋Glu110atelieaaaLys336eggArg339<210>〈211〉<212〉〈213>4113PRT小鼠(Musmusculus)〈400〉4AspValValValThrGinThrProLeuSerLeuProValSerPheGly151015AspGinValSerlieSerCysArgSerSerGinSerLeuValAsnThr202530TyrGlyThrThrTyrLeuSerTrpTyrLeuHisLysProGlyGinSer354045ProGinLeuLeulieTyrGlylieSerHisArgPheSerGlyValPro505560AspArgPheThrGlyAsnGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerThrlieLysProGluAspLeuGlyMetTyrTyrCysLeuGinAla859095ThrHisGinProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieLys100105110Arg權(quán)利要求1.一種抗人CD44單克隆抗體雜交瘤細胞系，其特征是所述細胞系的保藏號為CGMCCNO.2176。2、一種抗人CD44單克隆抗體，其特征是由保藏號為CGMCCNO.2176雜交瘤分泌。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人CD44單克隆抗體，其特征是所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgGl亞型。4、權(quán)利要求2的抗人CD44的工程抗體，其特征是由保藏號為CGMCCNO.2176雜交瘤細胞系經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式合成反應(yīng)制備產(chǎn)生。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗人CD44的工程抗體，其特征是由SEQIDNO.2重鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQIDN0.4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列組成。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗人CD44的工程抗體，其特征是編碼所述SEQIDNO.2重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼所述SEQIDNO.4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。7、含有權(quán)利要求4所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，其特征是分別含有SEQIDNO.1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQIDNO.3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T載體。8、含有權(quán)利要求4所述的工程抗體的核苷酸序列的載體，其特征是含有SEQIDNO.1所述的重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列、SEQIDNO.3所述的輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列和接頭序列的cDNA的PET22b(+)載體。9、權(quán)利要求2-3中任一項所述的抗人CD44單克隆抗體或權(quán)利要求4-5中任一項所述的抗人CD44的工程抗體或7、6中任一項所述的載體在制備白血病診斷試劑或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。10、一種免疫檢測試劑盒，其特征是含有至少一種權(quán)利要求2—3所述的單克隆抗體或權(quán)利要求4一6工程抗體或權(quán)利要求7_8的載體。11、權(quán)利要求IO所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后；或指導(dǎo)惡性腫瘤的治療中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗人CD44單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、工程抗體、載體、試劑盒及其用途，能夠在體內(nèi)外特異性結(jié)合人類CD44抗原，通過多種機制單獨或協(xié)調(diào)作用，有目的清除正常免疫細胞活殺傷白血病細胞。本發(fā)明涉及抗人CD44單克隆抗體HI313重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備用于白血病的診斷和治療藥物中的應(yīng)用。重鏈和輕鏈可變區(qū)基因來自抗人CD44單克隆抗體。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)成功制備單鏈抗人CD44基因工程抗體，為白血病和免疫系統(tǒng)疾病的診斷和治療提供了一種新的有效藥物。文檔編號C12N5/18GK101368173SQ200810052670公開日2009年2月18日申請日期2008年4月9日優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日發(fā)明者何大水,鳴佘,立周,浩屈,廖曉龍,毅張,濤張,張麗艷,張宇光,張金香,朱衛(wèi)彬,王冬梅,郭桂慶,黃麗華申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司