專利名稱：：切割來自hprt基因的dna靶序列的大范圍核酸酶變體及其用途的制作方法切割來自HPRT基因的DNA把序列的大范圍核酸酶變體及其用途本發(fā)明涉及切割來自HPRT基因的DNA靶序列的大范圍核酸酶(meganuclease)變體、編碼所述變體的載體、經(jīng)所述栽體^f務(wù)飾的細(xì)胞、動物或植物以及所述大范圍核酸酶變體及衍生產(chǎn)物用于基因組工程(genomeengineering)和基因組療法的用途。大范圍核酸酶定義為具有大(>14bp)切割位點的序列特異性內(nèi)切核酸酶，其可向活細(xì)胞的特定基因座中遞送DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak,DSB)(Thierry和Dujon，NucleicAcidsRes.,1992,20，5625-5631)。大范圍核酸酶已經(jīng)用于在培養(yǎng)細(xì)胞和植物中刺激其乾序列附近的同源重組(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994,14，8096-106;Choulika等，Mol.Cell.Biol"1995,15,1968-73;Donoho等，Mol.Cell.Biol,1998，18，4070-8;Elliott等，Mol.Cell.Biol"1998，18,93-101;Sargent等，Mol.Cell.Biol"1997,17,267-77;Puchta等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996，93,5055-60;Chiurazzi等，PlantCell，1996，8，2057-2066)，使得大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組成為用于基因組工程有效并有力的方法。大范圍核酸酶誘導(dǎo)重組的使用長期受到天然大范圍核酸酶種類的限制，當(dāng)前技術(shù)的主要限制是需要事先在目的基因座中引入大范圍核酸酶切割位點。因此，進(jìn)行了大量研究來產(chǎn)生具有定制的特異性的大范圍核酸酶。這些蛋白質(zhì)可以用于切割天然的染色體序列，并展現(xiàn)了將基因組工程用于更廣泛應(yīng)用的新前景。例如，大范圍核酸酶可用于在染色體中敲除內(nèi)源基因或敲入外源基因。其同樣也可以用于基因矯正，并原則上用于矯正與單基因疾病相關(guān)的突變。在自然界中，大范圍核酸酶基本上由歸巢內(nèi)切核酸酶(HomingEndonuclease，HE)代表，其為可動遺傳因子編碼的內(nèi)切核酸酶家族，其功能是在稱作歸巢的過程中啟動DNA雙鏈斷裂(DSB)誘導(dǎo)的重組事件(Chevalier和Stoddard,NucleicAcidsRes.,2001,29，3757-74;Kostriken等，Cell;1983，35，167-74;Jacquier和Dujon,Cell,1985，41，383-94)。在細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌(archea)中已經(jīng)鑒定了數(shù)百種HE(上文引用的Chevalier和Stoddard);然而在選定的基因中發(fā)現(xiàn)HE切割位點的可能性非常低?？紤]到它們的生物功能和就效率和特異性而言特有的切割特性，HE提供了產(chǎn)生用于基因組工程的新內(nèi)切核酸酶的理想骨架。HE屬于四個主要的家族。以涉及催化中心的保守肽基序命名的LAGLIDADG家族是分布最廣和最充分表征的一組(上文引用的Chevalier和Stoddard)。目前能夠獲得七種結(jié)構(gòu)。盡管來自該家族的大部分蛋白質(zhì)是單體的并展示兩種LAGLIDADG基序，但是少數(shù)僅具有一個基序，并發(fā)生二聚化以切割回文或假回文的靶序列。盡管LAGLIDADG肽是該家族成員中唯一的保守區(qū)，但是這些蛋白質(zhì)共有非常類似的結(jié)構(gòu)(圖1A)。催化核心的側(cè)翼是兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，對同二聚體(如I-Crel(Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001，8，312-6)和I-Msol(Chevalier等，J.Mol.Biol"2003,329，253-69))而言具有完全的二重對稱性，對單體(如I-Scel(Moure等，J.Mol.Biol.，2003，334,685-95)、I-Dmol(Silva等，J.Mol.Biol"1999,286，1123-36)或I-Anil(Bolduc等，GenesDev.,2003，17,2875-88))而言具有假對稱性。這兩個單體或兩個結(jié)構(gòu)域(對于單體蛋白質(zhì)而言)組成組織在二價陽離子周圍的催化核心。就在催化核心上方的兩個LAGLIDADG肽也在二聚化界面中起關(guān)鍵作用。DNA結(jié)合依賴于位于DNA大溝上的兩個鞍形ppapp折疊。對與其天然靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel結(jié)構(gòu)進(jìn)行的分析顯示，在i個4體中，八個殘基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68和R70)與±3、4、5、6、7、9和10位的七個堿基建立直接相互作用(Jurica等，Mol.Cell"1998,2，469-76)。另外，一些殘基與若干堿基建立由水介導(dǎo)的接觸；例如S40、K28和N30與+8和-8位的堿基對建立接觸(上文引用的Chevalier等，2003)。其他結(jié)構(gòu)域例如可見于內(nèi)蛋白(如PI-PfuI(Ichiyanagi等，J.Mol.Biol"2000，300,889-卯l)和PI-SceI(Moure等，Nat.Struct.Biol"2002，9，764-70))中，其蛋白質(zhì)剪接結(jié)構(gòu)域也參與DNA結(jié)合。通過將N端I-Dmol結(jié)構(gòu)域與I-Crel單體融合產(chǎn)生功能性嵌合的單鏈人工HE(Epinat等，NucleicAcidsRes.,2003,31,2952-62;Chevalier等，Mol.Cell"2002，10,895陽卯5;Steuer等，Chembiochem.,2004,5，206-13;國際PCT申請WO03/078619和WO2004/031346)已證明了LAGLIDADG蛋白的可塑性不同的單體或核心結(jié)構(gòu)域可融合到單個蛋白質(zhì)中，以獲得切割新的(非回文)靶序列的新大范圍核此外，不同研究組還使用推理性方法來局部改變I-Crel(Seligman等，Genetics,1997，147，1653-64;Sussman等，J.Mol.Biol"2004，342,31-41;Seligman等，NucleicAcidsRes.，2006年9月13日發(fā)表；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458及國際PCT申請WO2006/097853和WO2006/097784)、I-Scel(Doyon等，J.Am.Chem.Soc"2006，128，2477-2484)、PI-SceI(Gimble等，J.Mol.Biol"2003，334,993-1008)和I-Msol(Ashworth等，Nature,2006，441,656-659)的特異性。通過將半推理性方法與高通量篩選(HighThroughputScreening,HTS;Arnould等(上文引用)；國際PCT申請WO2006/097853和WO2006/097784)組合而改造出了具有改變的特異性的數(shù)百種I-Crel衍生物；i秀變了I-Crel的殘基Q44、R68和R70或Q44、R68、D75和177并通過篩選鑒定了在土3到5位(5NNNDNA靶標(biāo))中具有改變的特異性的變體集合。然后，將兩種不同的變體(圖IB;右上和左下)組合并裝配在能切割嵌合靶標(biāo)的功能性異二聚體內(nèi)切核酸酶(圖IB;右下)中，所述嵌合靶標(biāo)得自每個變體DNA靶序列的不同一半的融合物(圖IB;上文引用的Arnould等；國際PCT申請WO2006/097854)。有趣的是，新蛋白保持了正確的折疊和穩(wěn)定性、高活性和窄特異性。因此，可使用兩步策略來定制天然LAGLIDADG大范圍核酸酶的特異性。第一步是局部誘變天然LAGLIDADG大范圍核酸酶如I-Crel，并通過篩選來鑒定具有改變的特異性的變體集合。第二步是依賴于這些蛋白質(zhì)的模塊性，使用組合方法產(chǎn)生切割選定位點的新的大范圍核酸酶(圖IB)。新大范圍核酸酶集合的產(chǎn)生以及通過裝配兩種不同單體/核心結(jié)構(gòu)域來組合它們的能力可觀地豐富了能夠被靶向的DNA序列數(shù)，但是還不能滿足所有可能的序列。為了達(dá)到更大的序列數(shù)，能夠鑒定可以被組合的更小的獨立亞結(jié)構(gòu)域會是非常有價值的(圖IC)。然而，在單個單體或結(jié)構(gòu)域內(nèi)應(yīng)用組合方法比在單體之間難得多，因為結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)非常緊密，并且負(fù)責(zé)基本上所有堿基特異性相互作用的兩個不同PP發(fā)夾不構(gòu)成獨立的亞結(jié)枸域，而是單個折疊的一部分。例如，在I-CreIDNA結(jié)合區(qū)的內(nèi)部部分中，gtc三聯(lián)體與來自第一發(fā)夾的一個殘基(Q44)和來自第二發(fā)夾的兩個殘基(R68和R70;見前文引用的Chevalier等，2003的圖IB)結(jié)合。此外，一系列突變的累積影響最終會破壞正確的折疊。盡管在結(jié)構(gòu)水平上缺乏明顯的模塊性，但是本發(fā)明人已證實，I-Crel的殘基28到40和44到77形成兩個可分離的功能性亞結(jié)構(gòu)域，其能夠結(jié)合歸巢內(nèi)切核酸酶半位點的不同部分。通過將來自不同單體或核心結(jié)構(gòu)域的兩個亞結(jié)構(gòu)域裝配在相同的單體內(nèi)，本發(fā)明人已改造出能夠切割回文嵌合靶標(biāo)的功能性歸巢內(nèi)切核酸酶(同二聚體)變體(圖1C)。另外，通過裝配四個不同的亞結(jié)構(gòu)域形成能夠切割非回文嵌合靶標(biāo)的新異二聚體分子，可以進(jìn)行更大的組合方法(圖1D)。不同的亞結(jié)構(gòu)域可被獨立修飾以改造出新的切割特異性，并組合在能夠切割來自目的基因的靶標(biāo)的一個大范圍核酸酶變體(同二聚體、異二聚體、單鏈分子)中。次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因是位于X染色體上的單拷貝基因，并因此以單拷貝存在(XY細(xì)胞)或僅從一個等位基因表達(dá)(XX細(xì)胞)。例如，可分別在NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NC—000086和NCJ)00023下獲得小鼠和人的HPRT基因。兩個基因均具者9個外顯子(圖2)，其轉(zhuǎn)錄成1289個堿基的mRNA(小鼠；登錄號NM_013556)或1331個堿基的mRNA(人；登錄號NM—000194)，含有;^自88到744位(小鼠)或86到742位(人)的HPRTORF。中國倉鼠(Criteculussp.)mRNA是1301個堿基的序列(登錄號J00060.1),其含有來自91到747位的HPRTORF。次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶是催化5-磷酸核糖-l-焦磷酸酯和次黃嘌呤、鳥噪呤或6-巰基嘌呤轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的5，-單核苷酸和焦磷酸酯的酶。該酶在噤呤生物合成及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中是很重要的。考慮到其生物學(xué)功能，HPRT基因可用作基因靶向?qū)嶒灥倪x擇標(biāo)記。與其他選擇標(biāo)記相比，HPRT具有同時作為陽性及P月性選擇標(biāo)記的優(yōu)勢。此外，HPRT基因中的突變與自毀容貌綜合征相關(guān)。小鼠HPRT的基因乾向首先由Thomas,K.R.和M.R.Cappechi(Cell,1987，51,503-512)在來自胚胎的干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中進(jìn)行。然而，效應(yīng)非常低(約10;的轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。在HPRT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂的能力提供了在該基因座處顯著提高同源重組的手段。使用經(jīng)典的基因乾向，Donoho等(Mol.Cell.Biol"1998,18，4070-4078)向小鼠HPRT基因中引入了I-Scel大范圍核酸酶的切割位點。在第二步中，他們通過用修復(fù)基質(zhì)和I-Scel表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化而可在1%的細(xì)胞中誘導(dǎo)基因靶向。因此，靶向HPRT基因座的人工大范圍核酸酶將允許高效的基因插入(圖3A)。在該基因座處有效插入基因的能力具有允許可再現(xiàn)表達(dá)水平及產(chǎn)生插入的時間線可預(yù)計的優(yōu)勢。此外，如已對小鼠描述的(vanderLugt等Gene,1991,105,263-267;Selfridge等，Somat.Cell.Mol.Genet"1992,18，325-336)，HPRT可用作基因耙向?qū)嶒灥倪x擇標(biāo)記。通過Reid和同事首先提出的雙置換基因靶向操作(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990，87，4299-4303)是基于HPRT選擇標(biāo)記的(Magin等，Gene,1992,122,289-296)，以產(chǎn)生具有微小的基因改變的小鼠。該操作基于次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)小基因在HPRT缺陷型胚胎干細(xì)胞中的使用及對HPRT表達(dá)進(jìn)行正選擇和負(fù)選擇的能力。在第一步中，為使靶標(biāo)失活，用HPRT小基因代替靶基因座的區(qū)域，以HAT(次黃嘌呤/氨基喋呤/胸苷；LittlefieldJ.W.，Science,1964，145,709-)對HPRT標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行選擇。HAT是次黃嘌呤鈉、氨基喋呤和胸苷的混合物。氨基喋呤是有效的葉酸拮抗劑，其抑制二氫葉酸還原酶，阻斷核普從頭合成。細(xì)胞僅在嘌呤和嘧啶補(bǔ)救途徑有活性時才能在HAT中存活。次黃噪呤是嘌呤補(bǔ)救途徑的底物。因此，HPRT突變體不能利用嘌呤補(bǔ)救途徑，并對HAT選擇敏感。在第二個耙向步驟中，所述HPRT小基因本身被靶基因的改變區(qū)域代替，以重建基因座，并使用嘌呤類似物6-硫代鳥嘌呤(6-TG)選擇HPRT標(biāo)記的喪失。然而，這需要細(xì)胞在引入標(biāo)記之前含有失活的HPRT基因。因此，靶向HPRT基因的人工大范圍核酸酶可用于失活所述HPRT基因(圖3A和B)o自毀容貌綜合征是作為伴性性狀傳遞的遺傳病，其由HPRT的缺少引起，特征是高尿酸血、嚴(yán)重的運動性殘疾和自我損害行為。已經(jīng)鑒定了與自毀容貌疾病或者僅具有完整綜合征中一部分的較輕臨床表型相關(guān)的高度異質(zhì)的突變集合。目前的基因治療策略基于回補(bǔ)(complementation)方法，其中隨機(jī)插入但是有功能的額外基因拷貝提供了突變的內(nèi)源拷貝的功能。相反，大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組將允許在原位精確地矯正突變(圖3C)，并因此避免目前基因治療方法遇到的因隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因而引起的風(fēng)險(Hacein-Bey-Abina等Science,2003，302，415-419)。矯正遺傳缺陷的最準(zhǔn)確方法是使用帶有未突變基因拷貝的修復(fù)基質(zhì)(repairmatrix),得到突變的回復(fù)(圖3C)。然而，基因矯正的效率隨著突變與DSB之間距離的延長而降低，200bp的距離降低五倍。因此，僅可使用給定的大范圍核酸酶矯正其DNA乾標(biāo)附近的突變。圖3D中展示了稱為"外顯子敲入，，的替代方案。在該情況下，可以使用在基因5'部分進(jìn)行切割的大范圍核酸酶將功能性外顯子序列敲入有害突變的上游。盡管該方法將轉(zhuǎn)基因置于其常規(guī)位置，但是它也引起外顯子重復(fù)(exonsd叩lication)，其長期影響尚待評價。另外，如將天然順式作用元件置于切割下游的內(nèi)含子中，則其直接環(huán)境將被改變，其正確的功能也有待于探索。然而，該方法具有一個巨大的優(yōu)點單個大范圍核酸酶可用于許多不同的患者。本發(fā)明人已鑒定了HPRT基因中可被I-Crel變體切割的一系列DNA靶標(biāo)(圖2和19)。圖1D中描述的組合方法用于將四組突變裝配到具有完全改造特異性的異二聚體歸巢內(nèi)切核酸酶中，以切割來自HPRT基因的DNA靶標(biāo)。能夠切割來自HPRT基因的基因組DNA乾標(biāo)的這些I-Crel變體可用于在HPRT基因座處進(jìn)行基因組改造(敲除和敲入)，并用于使用HPRT作為選擇標(biāo)記來進(jìn)行任何基因座處的基因組改造(圖3A和3B)。另外，這些大范圍核酸酶可用于修復(fù)與自毀容貌綜合征相關(guān)的HPRT突變(圖3C和3D)。本發(fā)明涉及I-Crel變體或單鏈衍生物用于在HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性修飾的非治療目的用途，其中所述I-CreI變體或單鏈衍生物在位于I-Crel26到40位和44到77位的LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域之一中含有至少一個替換，并能夠切割選自序列SEQIDNO:1到14的DNA靼序列。可通過任何公知的體外或體內(nèi)切割測定法來測量本發(fā)明所定義變體的切割活性，例如在國際PCT申請WO2004/067736、Arnould等(J.Mol.Biol"2006，355,443-458)、Epinat等(NucleicAcidsRes.，2003,31，2952-2962)和Chames等(NucleicAcidsRes.,2005，33，el78)中所述的那些。例如，通過直接重復(fù)重組測定法，使用報告載體在酵母或哺乳動物細(xì)胞中測量本發(fā)明變體的切割活性。所述報告載體在間插序列內(nèi)包含報告基因的兩個截短的非功能性拷貝(直接重復(fù))和基因組DNA靶序列，所述間插序列克隆到酵母或哺乳動物表達(dá)載體中。變體的表達(dá)產(chǎn)生能切割基因組DNA耙序列的功能性內(nèi)切核酸酶。該切割誘導(dǎo)直接重復(fù)之間的同源重組，產(chǎn)生功能性報告基因，其表達(dá)可通過合適的測定法監(jiān)測。定義-多肽序列中的氨基酸殘基在本文中根據(jù)單字母代碼命名，其中例如Q表示Gin或谷氨酰胺殘基，R表示Arg或精氨酸殘基，D表示Asp或天冬氨酸殘基。-核苷酸如下命名使用單字母代碼命名核苷的堿基a為腺嘌呤，t為胸腺嘧啶，c為胞嘧啶，g為鳥嘌呤。對于簡并核苷酸而言，r表示g或a(噪呤核普酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧咬核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c,b表示g、t或c，h表示a、t或c,n表示g、a、t或c。-"大范圍核酸酶，，是指具有14到40pb的雙鏈DNA乾序列的內(nèi)切核酸酶。所述大范圍核酸酶是其中各結(jié)構(gòu)域位于單體上的二聚體酶，或是在單個多肽上包含兩個結(jié)構(gòu)域的單體酶。-"大范圍核酸酶結(jié)構(gòu)域"是指這樣的區(qū)域，其與大范圍核酸酶DNA靶標(biāo)的一半相互作用，并能夠與相同大范圍核酸酶中與所述DNA靼標(biāo)的另一半相互作用的另一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成能夠切割DNA把標(biāo)的功能性大范圍核酸酶。-"大范圍核酸酶變體"或"變體"是指通過將野生型大范圍核酸酶(天然大范圍核酸酶)氨基酸序列中的至少一個殘基替換為不同的氨基酸而獲得的大范圍核酸酶。-"功能性變體"是指能夠切割DNA靶序列的變體，優(yōu)選地所述耙標(biāo)是不被母體大范圍核酸酶切割的新耙標(biāo)。例如，這些變體在接觸DNA靶序列的位置或與所述DNA耙標(biāo)直接或間接相互作用的位置上具有氨基酸改變。-"具有新特異性的大范圍核酸酶變體"是指具有與母體歸巢內(nèi)切核酸酶不同的切割靶標(biāo)模式的變體。等價且無差異地使用的術(shù)語"新特異性"、"經(jīng)修飾的特異性"、"新切割特異性"、"新底物特異性"是指變體針對DNA靶序列中核苷酸的特異性。曙"I醒CreI"是指具有序列SWISSPROTP05725(SEQIDNO:143)或pdb登錄號lg9y(SEQIDNO:144)的野生型I-Crel。-"LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域"或"核心結(jié)構(gòu)域"是指"LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域"，它是LAGLIDADG家族歸巢內(nèi)切核酸酶的特征性a^^2a2l53P4a3折疊，對應(yīng)于約一百個氨基酸殘基的序列。所述結(jié)構(gòu)域包含在折疊成反向平行P-片層的四條P鏈(h、(52、p3、p4)，所述j3-片層與DNA靶標(biāo)的一半相互作用。該結(jié)構(gòu)域能夠與另一LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成能夠切割DNA靶標(biāo)的功能性內(nèi)切核酸酶，所述另一核心結(jié)構(gòu)域與所述DNA乾標(biāo)的另一半相互作用。例如，在二聚體歸巢內(nèi)切核酸酶I-Crel(163個氨基酸)的情況下，LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于6到94位殘基。-"單鏈大范圍核酸酶"、"單鏈嵌合大范圍核酸酶"、"單鏈內(nèi)切核酸酶"、"單鏈大范圍核酸酶衍生物"、"單鏈嵌合大范圍核酸酶衍生物"或"單鏈衍生物"是指包含通過肽間隔區(qū)連接的兩個LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域或核心結(jié)構(gòu)域的大范圍核酸酶。單鏈大范圍核酸酶能夠切割嵌合DNA靶序列，所述靶序列包含各母體大范圍核酸酶耙16序列中不同的一半。-"亞結(jié)構(gòu)域"是指LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域，其與歸巢內(nèi)切核酸酶DNA靶標(biāo)半位點的不同部分相互作用。兩個不同的亞結(jié)構(gòu)域獨立作用，并且一個亞結(jié)構(gòu)域中的突變不改變另一亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)合和切割特性。因此，兩個亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合歸巢內(nèi)切核酸酶DNA靶標(biāo)半位點的不同部分。-"P-發(fā)夾"是指LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域反向平行P-片層的兩條連續(xù)P-鏈(^P2或p3p4)，其通過環(huán)或轉(zhuǎn)角相連。畫"I-CreI位點"是指被I-Crel切割的22到24bp雙鏈DNA序列。I-Crel位點包括野生型(天然)非回文I-CreI歸巢位點和衍生的回文也稱為C1221(SEQIDNO:16;圖10)。-"DNA靶標(biāo)"、"DNA靶序列"、"靶序列"、"靶位點"、"靶標(biāo)"、"位點"；"目的位點"；"識別位點"、"識別序列"、"歸巢識別位點"、"歸巢位點"、"切割位點"是指被LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸斷如I-Crel)或者來自I-Crel的變體或單鏈嵌合大范圍核酸酶識別并切割的20到24bp的雙鏈回文、局部回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。這些術(shù)語是指要通過內(nèi)切核酸酶在其中誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的獨特DNA位置，優(yōu)選地為基因組位置。DNA耙標(biāo)通過雙鏈多核苦酸中一條鏈的5'到3，序列來定義，如上文針對C1221所指出的。DNA靶標(biāo)的切割發(fā)生在有義和反義鏈中分別為+2和-2位的核苷酸處。除非另有說明，否則I-CreI大范圍核酸酶變體對DNA粑標(biāo)進(jìn)行切割的位置對應(yīng)于DNA乾標(biāo)有義鏈上的切割位點。-"DNA靶標(biāo)半位點"、"半切割位點"或"半位點"是指DNA靶標(biāo)中與各個LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合的部分。-"嵌合DNA靶標(biāo)"或"雜合DNA靶標(biāo)"是指兩條母體大范圍核酸酶靶序列中不同的一半的融合物。另外，所述靶標(biāo)的至少一半可包含與至少兩個獨立的亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核苷酸組合(組合DNA粑標(biāo))。-"來自HPRT基因的DNA耙序列，，是指HPRT基因中被大范圍核酸酶變體識別并切割的20到24bp序列。-"HPRT基因"是指脊椎動物的HPRT基因。-"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運與之連接的另一核酸的核酸分子。-"同源"是指一條序列與另一序列具有足夠?qū)е掳l(fā)生序列間同源重組的同一性，更具體地具有至少95%的同一性，優(yōu)選97%的同一性，更優(yōu)選99%的同一性。一"同一性"是指兩條核酸分子或多肽之間的序列同一性?？赏ㄟ^比較各序列中可為比較目的而排列的位置來測定同一性。當(dāng)所比較序列中的一個位置被相同的堿基占據(jù)時，則這些分子在該位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之間的相似性或同一性程度是核酸序列間共有的位置上相同或匹配的核苷酸數(shù)量的函數(shù)?？墒褂枚喾N比對算法和/或程序計算兩條序列之間的同一性，包括FASTA或BLAST，它們可作為GCG序列分析包(UniversityofWisconsin,Madison，Wis.)的一部分獲得，并可以例如默認(rèn)設(shè)定使用。-"個體"包括哺乳動物以及其他脊推動物(例如鳥類、魚和爬行動物)。本文使用的術(shù)語"哺乳動物"是指任何這樣的脊推動物，包括單孔類、有袋類和有胎盤的動物，它們對其幼仔哺乳，并且分娩活的幼仔(真哺乳亞綱(eutharian)或胎盤哺乳動物)或者產(chǎn)卵(后獸亞綱(metatharian)或無胎盤(nonplacental)哺乳動物)。哺乳動物物種的實例包括人和其他靈長類(例如猴、猩猩)、嚙齒動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和其他，例如牛、豬和馬。-突變是指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中替換、缺失、添加一個或多個核苷酸/氨基酸。所述突變可影響基因的編碼序列或其調(diào)節(jié)序列。其還可影響基因組序列的結(jié)構(gòu)或所編碼mRNA的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性。-"遺傳性疾病"指部分或完全地由于一個或若干基因中的異常而直接或間接導(dǎo)致的任何疾病。所述異?？梢允峭蛔?。所述遺傳性疾病可以是隱性的或顯性的。在本發(fā)明用途的一個優(yōu)選實施方案中，位于I-Crel44到77位的亞結(jié)構(gòu)域中的所述替換位于44、68、70、75和/或77位中。在本發(fā)明用途的另一優(yōu)選實施方案中，位于I-CreI26到40位的亞結(jié)構(gòu)域中的所述替換位于26、28、30、32、33、38和/或40中。在本發(fā)明用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述I-Crel變體或單鏈衍生物包含接觸DNA靶序列或與DNA主鏈或核苷酸堿基直接或經(jīng)水分子進(jìn)行相互作用的其他氨基酸殘基的替換；這些I-Crel相互作用殘基為本領(lǐng)域所公知。在根據(jù)本發(fā)明的用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述I-CreI變體或單鏈衍生物包含一個或更多額外的替換，所述替換改善所述變體對上文所定義HPRT基因的DNA靶標(biāo)的結(jié)合和/或切割活性；這些替換位于整個I-Crel序列上或僅位于I-Crel的C端的一半中(80到163位)。優(yōu)選地，所述額外的替換位于選自以下位置的I-Crel的位置中2、9、19、42、43、54、66、69、72、81、82、86、卯、92、96、100、103、104、105、107、108、109、110、113、120、125、129、130、131、132、135、136、137、140、143、151、154、155、157、158、159、161和162位。更優(yōu)選地，所述替換是G19S或G19A突變，其提高I-Crel變體/單鏈衍生物的切割活性。更優(yōu)選地，所述突變是G19S突變，其進(jìn)一步破壞功能性同二聚體的形成。G19S突變被有利地引入異二聚體I-Crel變體的兩個單體之一，以獲得具有提高的切割活性和增強(qiáng)的切割特異性的大范圍核酸酶。在本發(fā)明用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述替換是用選自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L、W、M和I的例如-28位的賴氨酸(K)可以突變?yōu)镽，-30位的天冬酰胺(N)可以突變?yōu)镾、C、R、Y、Q、D和T，-32位的絲氨酸(S)可以突變?yōu)镈、T、R、G和W,-33位的酪氨酸(Y)可以突變?yōu)镠、T、G、R、C、Q、D和S，-38位的谷氨酰胺(Q)可以突變?yōu)閃、S、T、G、E、A、Y、C、D和H，-40位的絲氨酸(S)可以突變?yōu)镼、A、T和R，-44位的谷氨酰胺(Q)可以突變?yōu)镹、T、R、K、D、Y和A，-68位的精氨酸(R)可以突變?yōu)镵、Q、E、A、Y、N、H和T，國70位的精氨酸(R)可以突變?yōu)镾、H、N和K,-75位的天冬氨酸(D)可以突變?yōu)镽、S、N、Y、E、H和Q,且國77位的異亮氨酸(I)可以突變?yōu)門、W、Y、K、N、R、H、D、F、E、Q和L。另外，如本發(fā)明中定義的I-Crel變體可包括在I-Crel序列的NH2端和/或COOH端插入的一個或多個殘基。例如，將標(biāo)簽(表位或多聚組氨酸序列)引入NH2端和/或COOH端；所述標(biāo)簽可用于所述變體的檢測和/或純化。如在本發(fā)明中定義的I-Crel變體可以是同二聚體或異二聚體，其得自在I-CreI26到40位或44到77位中含有至少一個突變的第一單體與第二單體(I-Crel或I-Crel變體)的結(jié)合。在根據(jù)本發(fā)明的用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述I-CreI變體是異二聚體，其得自在I-Crel中26到40位和/或44到77位含有不同突變的第一單體和第二單體的結(jié)合。在更優(yōu)選的一個實施方案中，至少一個單體具有至少兩個替換，位于I-Crel中26到40及44到77位的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域中各有一個。更優(yōu)選地，所述異二聚體由選自以下序列對的第一和第二單體組成SEQIDNO:83與97,SEQIDNO:84與98，SEQIDNO:85與99，SEQIDNO:32與52,SEQIDNO:32和53，SEQIDNO:32與54，SEQIDNO:32與55，SEQIDNO:32與56，SEQIDNO:32與57,SEQIDNO:32與58，SEQIDNO:32與60，SEQIDNO32與65，SEQIDNO:32與66，SEQIDNO:32與67，SEQIDNO:32與68，SEQIDNO:32與69，SEQIDNO:32與與71，SEQIDNO:32與72，SEQIDNO:32與與74,SEQIDNO:75與56，SEQIDNO:76與與56，SEQIDNO:78與56，SEQIDNO:79與與56,SEQIDNO:81與56，SEQIDNO:82與與96,SEQIDNO:87與100，SEQIDNO:88與與102，SEQIDNO:90與103，SEQIDNO:9192與105，SEQIDNO:93與106，SEQIDNO:9495與108，SEQIDNO:147與148。70，SEQIDNO:3273，SEQIDNO:3256，SEQIDNO:7756,SEQIDNO:8056，SEQIDNO:86101，SEQIDNO:89與104，SEQIDNO:與107，SEQIDNO:如在本發(fā)明中定義的I-Crel變體的單鏈衍生物是包含LAGLIDADG大范圍核酸酶的兩個單體或兩個核心結(jié)構(gòu)域或二者之組合的融合蛋白，其中至少一個單體或核心結(jié)構(gòu)域具有I-Crel變體的序列，所述I-Crel變體在I-Crel的26到40位和/或44到77位中含有至少一個替換，如上文所述。被I-Crel變體或單鏈衍生物切割的DNA耙序列位于HPRTORF中，并且這些序列覆蓋所有的HPRTORF(表I和圖2)。表I:哺乳動物中的靶標(biāo)位置和同一性SEQIDNO:在眼T基因中的位置在外顯子'中的位置在中國倉鼠HPRTm陽(SEQIDNO:15)中的位置在小鼠HPRT'm陽《SEQIDNO:145)中的位置在人HPRTm隨(SEQIDNO:1站)中的位置與中國倉鼠序列的同一性與小鼠序列的同一性與人序列的同一性1外顯子l-19至+272-9369-9067-9822/2219/2217/222外顯子242-63159"18015W77154-17522/2219/2218/223外顯子281-102198-219195-216193-21422/2221/2220/224外顯子317-38244-262241-259239<25722/2221/2220/225外顯子357-78281-302278-299276-29722/2221/2221/226外顯子389-110313-334310-331308-32922/2222/2222/22外顯子394-115318-33931W36313-33422/2222/2221/228外顯子3138-159372-393369-390367-38822/2221/22221/2229外顯子69-30501-522498-547496"54522/2222/2220/22210外顯子637-58529-550526^547524-54522/2221/22218/2211外顯子638-59530-551527-548525>54622/222輕18/2212外顯子84-25626-647623-644621-64222/2222/2222/2213外顯子99-30708-729705>726703-72422/2221/2221/2214外顯子946-67745-766742-763740-76122/2219/22321/2221:該位置相對于對應(yīng)外顯子的起點，只有靶標(biāo)SEQIDNO:l例外，其位置相對應(yīng)于21ATG起始密碼子。2:在±3到5位和8到10位處100%同一性，沒有缺口3:在士3到5位和8到10位處100%同一性，在中間有缺口所述DNA耙序列在至少一種哺乳動物(人或動物)的HPRT基因中存在。例如，靶序列SEQIDNO:6和12至少在人、小鼠和中國倉鼠(Criteculussp.)HPRT基因中存在。靶序列SEQIDNO:7和9至少在小鼠和中國倉鼠HPRT基因中存在。乾序列SEQIDNO:1到5、8、10、11、13和14至少在中國倉鼠HPRT基因中存在。另外，與序列SEQIDNO:8和14的±3到5位及±8到IO位中的核苷酸具有序列同一性的靶序列至少在人和小鼠HPRT基因中存在。與序列SEQIDNO:10和11中±3到5位及士8到10位的核苷酸具有序列同一性的靶序列至少在小鼠HPRT基因中存在(沒有發(fā)現(xiàn)與人HPRT基因具有序列同一性)。與序列SEQIDNO:9中±3到5位及±8到10位的核苷酸具有序列同一性的靶序列至少在人HPRT基因中存在。因此，切割SEQIDNO:6和12中一個DNA靼序列的I-Crel變體能夠至少在人、小鼠和中國倉鼠HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性的修飾。另外，切割DNA靶序列SEQIDNO:9的I-Crel變體能夠在中國倉鼠和小鼠HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性的修飾，并且對它們中的一些而言，也能夠在人HPRT基因中進(jìn)行誘導(dǎo)。切割DNA耙序列SEQIDNO:8的I-Crel變體能夠在中國倉鼠HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性修飾，并且對它們中的一些而言，也能夠在人和/或小鼠HPRT基因中進(jìn)行誘導(dǎo)；HPRT基因中修飾的位置對應(yīng)于基因組DNA切割位點的位置(基因組DNA耙標(biāo)有義鏈上的+2位(即，對序列SEQIDNO:6、12、9和8而言分別為以下位置101(外顯子3)、16(外顯子8)、21(外顯子6)、150(外顯子3))。切割DNA靶序列SEQIDNO:7的I-Crel變體能夠至少在小鼠和中國倉鼠HPRT基因中(但不在人HPRT基因中的相應(yīng)位置)誘導(dǎo)位點特異性的修飾。另外，切割DNA靶序列SEQIDNO:10和11的I-Crel變體能夠在中國倉鼠HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性修飾，并且對它們中的一些而言，也能夠在小鼠HPRT基因中(但不是在人HPRT基因中的相應(yīng)位置)進(jìn)行誘導(dǎo)；HPRT基因中的修飾位置分別對應(yīng)于106(外顯子3)、51(外顯子6)和52(外顯子6)位。切割DNA把序列SEQIDNO:14的I-Crel變體能夠在中國倉鼠HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性修飾，并且對它們中的一些而言，也能夠在人HPRT基因中(但不是在小鼠HPRT基因中的相應(yīng)位置)進(jìn)行誘導(dǎo)；HPRT基因中的修飾位置對應(yīng)于68位(外顯子9)。切割DNA靶序列SEQIDNO:1到5和13的I-Crel變體能夠至少在中國倉鼠HPRT基因(但不是在人或小鼠HPRT基因中的相應(yīng)位置)中誘導(dǎo)位點特異性修飾；HPRT基因中的修飾位置分別對應(yīng)于從ATG(外顯子1)開始的-7、54(外顯子2)、93(外顯子2)、29(外顯子3)、69(外顯子3)、93(外顯子9)和21位(外顯子9)。切割各個DNA靶標(biāo)的異二聚體變體的實例示于表II及圖19中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表II續(xù)第一I-CreI單體(SEQIDNO:83,84,85,32,75到82,86到95)第二I-Crel單體(SEQIDNO:97到99,52到58,60，65到74,56,96和100到108^靶標(biāo)28K30N32T33Y38W40S44N68R70S75Y77I28K30R32S33Y38E40S44Q68H70H75N77I528K30N32S33T38Q40A44N68K70S75R77T28K30N32S33H38T40S44N68R70N75N77I628K30N32S33H38S40S44R68R70S75N77D28K30N32S33G38Q40O44Q68A70K75N77I728K30N32S33G38T40S44N68K70S75H77F28K30C32S33T38Q40S44Q68Y70S75R77Q828K30K32S33R38Q40S44D68Y70S75S77R28K30N32S33T38Q40Q44N68K70S75H77F928K30N32S33T38Q40T44R68Y70S75E77Y28K30N32S33R38T40S44R68T70S75N77N1028K30N32T33T38O40S44Y68R70S75Y77V28K30N32G33T38Q40S44N68Y70S75R77Y1128K30Y32T33C38Q40S44Q68R70S75D77K28K30N32W33T38O40S44Q68R70R75N77I1228K30N32S33H38G40S44N68R70S75Y77N28K30N32S33T38A40S44Q68R70S75N77L1328K30N32S33Y38O40S44A68R70S75Q77E28K30N32S33C38Y40S44R68Y70S75D77I14各變體的序列通過指定位置處的氨基酸殘基來定義。例如，表II的第一個異二聚體變體由第一單體和第二單體組成，所述第一單體在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別具有K、Q、D、Y、Q、S、N、K、S、R和T，所述第二單體在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別具有K、N、S、G、C、S、Q、R、R、N和I。所述位置通過參考I-Crel序列SWISSPROTP05725或pdb登錄號lg9y來指定；I-Crel在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別具有K、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D和I。未指出的位置未發(fā)生突變，并因此與野生型I-Crel序列一致。在本發(fā)明用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述I-CreI變體或單鏈衍生物與包含待引入序列的靶向DNA構(gòu)建體組合，所述待引入序列的側(cè)翼是與所述I-Crel變體或單鏈衍生物基因組DNA切割位點周圍的HPRT基因區(qū)域共有同源性的序列，如上所述。優(yōu)選使用至少50bp,優(yōu)選多于100bp，并最優(yōu)選多于200bp的同源序列。事實上，共有的DNA同源性位于斷裂位點上游和下游的側(cè)翼區(qū)域中，且待引入的DNA序列應(yīng)位于兩臂之間。待引入的序列包含外源目的基因或序列或者用于失活或缺失HPRT基因或其部分的序列。這種染色體DNA改變可用于產(chǎn)生HPRT敲除及敲入動物，其中佳_25HPRT基因失活(敲除)并最終替換為外源目的基因(敲入)。因此，這種染色體DNA改變還可用于產(chǎn)生遺傳修飾的脊推動物(哺乳動物，包括人)細(xì)胞系，其中內(nèi)源HPRT基因是失活的，并且轉(zhuǎn)基因最終插入到HPRT基因座處。另外，內(nèi)源HPRT基因失活之后，HPRT在對HPRT缺陷型細(xì)胞/動物染色體中任何基因座進(jìn)行的進(jìn)一步基因靶向操作中可用作陽性選擇標(biāo)記(用HAT選擇HPRT標(biāo)記表達(dá))。本發(fā)明的主題還包括用于產(chǎn)生HPRT敲入或敲除動物的方法，所述方法至少包括以下步驟(a)如上述，將I-Crel變體或單鏈衍生物引入動物的多能前體細(xì)胞或胚胎中，以在包含所述I-Crel變體或單鏈衍生物的DNA識別和切割位點的HPRT基因目的位點處同時或連續(xù)誘導(dǎo)雙鏈斷裂，(b)將靶向DNA引入步驟(a)的動物前體細(xì)胞或胚胎中，以產(chǎn)生基因組被修飾的動物前體細(xì)胞或胚胎(其通過同源重組而修復(fù)了目的位點)，其中所述靶向DNA包含(l)與切割位點周圍區(qū)域共有同源性的DNA和(2)在該乾向DNA與染色體DNA之間發(fā)生重組后修復(fù)該目的位點的DNA，(c)使步驟(b)中基因組被修飾的動物前體細(xì)胞或胚胎發(fā)育成嵌合動物，和(d)從步驟(c)中的嵌合動物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。優(yōu)選地，步驟(c)包括將步驟(b)中產(chǎn)生的基因組被修飾的前體細(xì)胞引入胚泡中，以產(chǎn)生嵌合動物。本發(fā)明的主題還包括用于產(chǎn)生HPRT敲入或敲除細(xì)胞的方法，所述方法至少包括以下步驟(a)如上述，將I-Crel變體或單鏈衍生物引入細(xì)胞中，以在包含所述I-Crel變體或單鏈衍生物的DNA識別和切割位點的HPRT基因目的位點處同時或連續(xù)誘導(dǎo)雙鏈斷裂，飾的細(xì)胞(其通過同源重組而修復(fù)了目的位點)，其中所述靶向DNA包含(l)與切割位點周圍的區(qū)域共有同源性的DNA和(2)在該靶向DNA與染色體DNA之間發(fā)生重組后修復(fù)該目的位點的DNA,(c)通過任何適當(dāng)手段分離步驟(b)的重組細(xì)胞。在適合于將靶向DNA引入目的位點的條件下將靶向DNA引入細(xì)胞中。在一個優(yōu)選實施方案中，將所述把向DNA構(gòu)建體插入載體中。或者，通過非同源末端接合來修復(fù)雙鏈斷裂，以使HPRT基因失活(圖3B)。本發(fā)明的主題還包括用于產(chǎn)生HPRT敲除動物的方法，所述方法至少包括以下步驟(a)如上述，將I-Crel變體或單鏈衍生物引入動物的多能前體細(xì)胞或胚胎中，以在包含所述I-Crel變體或單鏈衍生物的DNA識別和切割位點的HPRT基因目的位點處誘導(dǎo)雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生基因組被修飾的前體細(xì)胞或胚胎，所述前體細(xì)胞或胚胎具有通過非同源末端接合修復(fù)的雙鏈斷裂，(b)使步驟(a)中的基因組被修飾的動物前體細(xì)胞或胚胎發(fā)育成嵌合動物，和(c)從步驟(b)中的嵌合動物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。優(yōu)選地，步驟(b)包括將步驟(a)中獲得的基因組被修飾的前體細(xì)胞引入胚泡中，以產(chǎn)生嵌合動物。本發(fā)明的主題還包括用于產(chǎn)生HPRT缺陷型細(xì)胞的方法，所述方法至少包括以下步驟(a)如上述，將I-Crel變體或單鏈衍生物引入細(xì)胞中，以在包含所述I-Crel變體或單鏈衍生物的DNA識別和切割位點的HPRT基因目的位點處誘導(dǎo)雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生基因組被修飾的HPRT缺陷型細(xì)胞，所述細(xì)胞具有通過非同源末端接合被修復(fù)的雙鏈斷裂，和(b)通過任何適當(dāng)手段分離步驟(a)中基因組被修飾的HPRT缺陷型細(xì)胞。被修飾的細(xì)胞可以是任何目的細(xì)胞。對產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因/敲除動物而言，所述細(xì)胞是多能前體細(xì)胞，如本領(lǐng)域所公知的胚胎衍生干細(xì)胞(ES細(xì)胞)。所述I-Crel變體/單鏈衍生物可直接提供給細(xì)胞，或通過包含達(dá)栽體提供給細(xì)胞。動物優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選實驗室嗜齒類(小鼠、大鼠、豚鼠)，或牛、豬、馬或山羊。另外，可通過使用嘌呤類似物6-硫代鳥嘌呤(6-TG)來選擇被修飾細(xì)胞中內(nèi)源HPRT基因的丟失。在本發(fā)明用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述I-Crel變體或單鏈衍生物由多核苷酸片段編碼。所述多核苷酸可編碼同二聚體或異二聚體變體中的一個單體，或編碼單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶的兩個結(jié)構(gòu)域/單體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將所述多核苷酸片段插入適于在所用細(xì)胞中表達(dá)的栽體中。所述載體有利地包含如上述的靶向DNA構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述栽體包含兩個不同的多核苷酸片段，每個片段各編碼如上述的異二聚體I-CreI變體的一個單體?？稍诒景l(fā)明中使用的載體包括但不限于病毒載體、質(zhì)粒、RNA載體，或者可由染色體、非染色體、半合成或合成的核酸所組成的線性或環(huán)形DNA或RNA分子。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制與之連接的核酸的載體(附加型載體)和/或表達(dá)與之連接的核酸的載體(表達(dá)載體)。大量的合適載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可以商品獲得。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(parvovirus)(例如腺相關(guān)病毒)、冠形病毒、負(fù)鏈RNA病毒如正粘病毒(orthomyxovims)(例如流感病毒)、桿狀病毒(例如狂犬病毒和皰滲性口腔炎病毒(vesicularstomatitisvirus))、富，J粘病毒(paramyxovirus)(例如麻滲病毒和仙臺病毒(Sendai))、正鏈RNA病毒如小RNA病毒(picornavirus)和a病毒，以及雙鏈DNA病毒，其包括腺病毒、皰滲病毒(例如1和2型單純皰滲病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒和金絲雀痘病毒)。其他病毒包括例如諾瓦克病毒、披膜病毒(togavirus)、黃病毒(flavivirus)、呼腸病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、肝DNA病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括禽白血病-肉瘤、哺乳動物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV組、慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin,J.M.，Retroviridae:Thevirusesandtheirreplication,InFundamentalVirology,第三版,B.N.Fields，等編輯,Lippincott陽RavenPublishers,Philadelphia,1996)。優(yōu)選的載體包括慢病毒載體，尤其是自失活(selfinactivacting)的慢病毒載體。載體可包含選擇標(biāo)記，例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰滲病毒胸苷激酶、腺苷脫氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黃噪呤-鳥噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；用于釀酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1;大腸桿菌(E.coli)中的四環(huán)素、利福平或氨千青霉素抗性。優(yōu)選地，所述載體是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明變體/單鏈衍生物的序列置于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制下，以允許產(chǎn)生或合成所述變體。因此，所述多核苷酸包含在表達(dá)盒中。更具體地，載體包含復(fù)制起點、與所述編碼多核苷酸有效連接的啟動子、核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點(使用基因組DNA時)、多腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止位點。其還可包含增強(qiáng)子。啟動子的選擇將取決于多肽在其中表達(dá)的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述變體是異二聚體，編碼各個單體的兩多核苷酸包含在一個載體中，所述載體能夠驅(qū)動兩多核苷酸同時表達(dá)。合適的啟動子包括組織特異性和/或誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子的例子是由提高的重金屬水平誘導(dǎo)的真核金屬硫堇(metallothionine)啟動子，應(yīng)答于異丙基-P-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的原核lacZ啟動子，和由提高的溫度誘導(dǎo)的真核熱休克啟動子。組織特異性啟動子的實例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特異性抗原(PSA)、a-抗胰蛋白酶、人表面活性劑(SP)A和B蛋白、p-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。在適合乾向DNA引入目的位點的條件下將把向DNA引入細(xì)胞。對產(chǎn)生敲入動物/細(xì)胞而言，修復(fù)目的位點的DNA包含外源目的基因的序列以及最終的選擇標(biāo)記，如HPRT基因。對于產(chǎn)生敲除動物/細(xì)胞而言，修復(fù)目的位點的DNA包含使內(nèi)源目的基因失活的序列。本發(fā)明的主題還包括如上述的I-Crel變體或單鏈衍生物用于制備藥物中的用途，所述藥物用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療與HPRT基因中突變相關(guān)的遺傳性疾病，所述藥物通過任何手段施用給所述個體。在該情況下，如上述I-CreI變體或單鏈衍生物的使用至少包括以下步驟(a)在個體的軀體組織中，在包含所述變體的至少一個識別和切割位點的HPRT基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈切割，和(b)向該個體中引入靶向DNA，其中所述耙向DNA包含(l)與切割位點周圍的區(qū)域共有同源性的DNA，和(2)在該乾向DNA與染色體DNA之間發(fā)生重組后修復(fù)目的位點的DNA。在適于將靶向DNA引入目的位點的條件下將靶向DNA引入所述個體。根據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈切割通過對個體施用所述大范圍核酸酶而整體(intoto)誘導(dǎo)，或者通過將所述大范圍核酸酶？1入從個體中取出的體細(xì)胞內(nèi)并在修飾后放回個體內(nèi)而進(jìn)行離體誘導(dǎo)。在所述用途的一個優(yōu)選實施方案中，I-Crel變體或單鏈衍生物與靶向DNA構(gòu)建體組合，所述靼向DNA構(gòu)建體包含修復(fù)HPRT基因中突變的序列，其側(cè)翼是與所述I-CreI變體或單鏈衍生物的基因組DNA切割位點周圍的HPRT基因區(qū)域共有同源性的序列，如上述。就矯正HPRT基因而言，基因的切割發(fā)生在突變附近，優(yōu)選在突變的500bp范圍內(nèi)(圖3C)。靶向構(gòu)建體包含HPRT基因片段，其具有基因組DNA切割位點側(cè)翼至少200bp的同源序列(最小修復(fù)基質(zhì))用于修復(fù)切割，并含有HPRT基因的正確序列用于修復(fù)突變(圖3C)。因此，用于基因矯正的靶向構(gòu)建體包含最小修復(fù)基質(zhì)或由其組成；其優(yōu)選地為200pb到6000pb,更優(yōu)選地為1000pb到2000pb。為了恢復(fù)功能基因(圖3D)，基因的切割發(fā)生在突變的上游。優(yōu)選所述突變是基因序列中第一個已知的突變，從而該基因中所有下游突變可同時被矯正。靶向構(gòu)建體包含基因組DNA切割位點下游的外顯子，它們框內(nèi)融合(像在cDNA中一樣)，并在3'具有多聚腺苷酸化位點以終止轉(zhuǎn)錄。待引入的序列(外顯子敲入構(gòu)建體)的側(cè)翼是切割位點周圍的內(nèi)含子或外顯子序列，從而允許改造基因(外顯子敲入基因)轉(zhuǎn)錄成為能編碼功能性蛋白質(zhì)的mRNA(圖3D)。例如，外顯子敲入構(gòu)建體的側(cè)翼是上游和下游的序列。在所述用途的另一優(yōu)選實施方案中，I-Crel變體或單鏈衍生物由載體編碼。優(yōu)選地，所述載體包含如上述的靶向DNA構(gòu)建體。在所述用途的另一優(yōu)選實施方案中，所述遺傳性疾病是自毀容貌綜合征。本發(fā)明的主題還包括組合物，其特征在于包含上述至少一種I-Crel變體或單鏈衍生物和/或編碼所述變體/單鏈分子的至少一種表達(dá)載體，及可藥用賦形劑。在所述組合物的一個優(yōu)選的實施方案中，其包含靶向DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含修復(fù)HPRT基因中突變的序列，其側(cè)翼是與所述變體的基因組DNA切割位點共有同源性的序列，如上所述。所述修復(fù)突變的序列是具有正確序列的基因片段或者是外顯子敲入構(gòu)建體，如上所述。優(yōu)選所述乾向DNA構(gòu)建體包含在重組栽體中，或包含在表達(dá)載體中，所述栽體包含編碼本發(fā)明所述變體/單鏈衍生物的多核苷酸。本發(fā)明的主題還包括產(chǎn)品，其含有上述至少一種I-Crel變體/單鏈衍生物或編碼所述大范圍核酸酶的一種表達(dá)載體，及上述包含靶向構(gòu)建體的載體，所述產(chǎn)品作為組合制劑用于在與HPRT基因中突變相關(guān)的遺傳性疾病的預(yù)防或治療中同時、分別或依次使用。本發(fā)明的主題還包括用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療與HPRT基因中突變相關(guān)的遺傳性疾病的方法，所述方法至少包括通過任何手段對所述個體施用上文所述組合物的步驟。對治療的目的而言，以治療有效量施用I-Crel變體/單鏈衍生物和可藥用賦形劑。如果施用量是有生理意義的，則這樣的組合被稱作以"治療有效量，，施用。如果一種藥劑的存在導(dǎo)致接受者生理狀況可檢測的改變，則它是有生理意義的。在本文中，如果藥劑的存在導(dǎo)致目標(biāo)疾病的一個或多個癥狀的嚴(yán)重程度減輕以及對損傷或異常的基因組矯正，則它是有生理意義的。在本發(fā)明用途的一個實施方案中，I-Crel變體/單鏈衍生物基本上是非免疫原性的，即不引發(fā)或幾乎不引發(fā)不利的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明可使用大量改善或消除這類有害免疫反應(yīng)的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，I-Crel變體/單鏈衍生物基本不含N-甲?；琢虬彼?。避免不想要的免疫反應(yīng)的另一種方式是將大范圍核酸酶與聚乙二醇("PEG")或聚丙二醇("PPG")(優(yōu)選500到20,000道爾頓的平均分子量(MW))綴合。與PEG或PPG綴合(例如Davis等(US4,179,337)所述)例如能夠提供具有抗病毒活性的非免疫原性的生理活性水溶性內(nèi)切核酸酶綴合物。Saifer等(US5,006，333)中還描述了使用聚乙-聚丙二醇共聚物的類似方法。I-Crel變體或單鏈衍生物可作為多肽使用或作為編碼所述多肽的多核苷酸構(gòu)建體/栽體使用。其通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何適用于特定細(xì)胞種類的便利手段而(單獨地或與至少一種合適的運載體或運載體和/或與靶向DNA組合)在體外、離體或在體內(nèi)將其引入細(xì)胞中。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大范圍核酸酶和包含耙向DNA和/或編碼大范圍核酸酶的核酸的載體(如果存在的話)被細(xì)胞從胞質(zhì)輸入或易位至核內(nèi)的作用位點。I-Crel變體或單鏈衍生物(多肽)可有利地與以下結(jié)合脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)、和/或膜易位肽(Bonetta，TheScientist,2002，16,38;Ford等,GeneTher"2001，8，1-4;Wadia和Dowdy,Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13,52-56);在后一種情況下，I-Crel變體/單鏈衍生物的序列與膜易位肽的序列融合(融合蛋白)?？赏ㄟ^大量方法(例如注射、直接攝入、射彈轟擊、脂質(zhì)體、電穿孔)將包含靶向DNA和/或編碼大范圍核酸酶的核酸的載體引入細(xì)胞中?？墒褂帽磉_(dá)載體在細(xì)胞中穩(wěn)定或瞬時地表達(dá)大范圍核酸酶。在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見CurrentProtocolsinHumanGenetics:第12章"VectorsForGeneTherapy"&第13章"DeliverySystemsforGeneTherapy")。任選地，可優(yōu)選在重組蛋白中摻入核定位信號以確保其在核內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明的主題還包括I-Crel變體或單鏈衍生物、編碼所述變體或單鏈衍生物的多核苷酸片段、包含所述多核苷酸片段和/或DNA靶向構(gòu)建體的載體、經(jīng)上述多核苷酸或載體(優(yōu)選表達(dá)載體)〗奮飾的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的主題還包括非人轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物，其中其全部或部分細(xì)胞通過上述多核苷酸或栽體進(jìn)行了修飾。本文使用的"細(xì)胞"是指原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞，或真核細(xì)胞如動物、植物或酵母細(xì)胞?？赏ㄟ^改造能夠切割目的基因組DNA靶序列(其來自脊推動物基因)的I-Crel變體的方法獲得本發(fā)明中所述的I-Crel變體，所述方法至少包括以下步驟(a)構(gòu)建第一系列I-Crel變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域中含有至少一個替換，所述第一功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-Crel的26到40位，(b)構(gòu)建第二系列I-Crel變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個替換，所述第二功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-Crel的44到77位，(c)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已4皮替換為選自cag、att、cct、ttg、gac、atg、ttt、ttc、tgg、gtc、aag、gag的核苷酸三聯(lián)體，且(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點-10到-8位替換的所述核苷酸三聯(lián)體的反向互才卜序歹ij(即分另'J為ctg、aat、agg、caa、gtc、cat、aaa、gaa、cca、gac、ctt和etc)，(d)從來自步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為選自gac、taa、tca、gtg、gct、tgt、tgg、ctg、ttg、tag和gag的核苷酸三聯(lián)體，且(ii)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點-5到-3位替換的所述核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序歹'J(茛卩分另'J為gtc、tta、tga、cac、agc、aca、cca、cag、caa、cta和etc)，(e)從來自步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點+8到+10位的核香酸三聯(lián)體已被替換為選自cat、cga、tat、ggg、tac、taa、cag、gca、aca、gaa、tga、atg的核苷酸三聯(lián)體，且(ii)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點+8到+10位替換的所述核香酸三聯(lián)體的反向互4卜序列(即分別為atg、tcg、ata、ccc、gta、tta、ctg、tgc、tgt、ttc、tea和cat)，(f)從來自步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點+3到+5位的核香酸三聯(lián)體已被替換為選自tcc、tat、gtg、gaa、tgg、tac、ttt、aca、agc、gcg、tcc、act、caa和aag的核苷酸三聯(lián)體，且(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點+3到+5位替換的反向互補(bǔ)序歹'J(^卩分另'J是gga、ata、cac、ttc、cca、gta、aaa、tgt、gct、cgc、gga、agt、ttg和ctt)，(gi)從步驟(c)到(f)中選擇和/或篩選能夠切割序列SEQIDNO:1到14的DNA乾標(biāo)的變體。根據(jù)本發(fā)明第一個實施方案，其中所述I-Crel變體可通過至少包括上述步驟(a)到(f)及以下其他步驟的方法獲得(g2)將在步驟(c)到(f)中任何一步中獲得的不同變體組彼此組合或與I-Crel組合，以形成異二聚體，和(h2)選擇和/或篩選來自步驟(g2)的能夠切割序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靶標(biāo)的異二聚體。根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方案，其中所述I-Crel變體可通過至少包括上述步驟(a)到(f)及以下其他步驟的方法獲得(g3)將來自步驟(c)和步驟(d)的兩個變體中26到40位及44到77位中的突變在單個變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-Crel變體，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靶標(biāo)中-10到-8位的核香酸三聯(lián)體相34同，(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA耙標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靶標(biāo)中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體相同，(iv)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA乾標(biāo)中-5到-3位的核普酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，和/或，(h3)將來自步驟(e)和步驟(f)的兩個變體中26到40位及44到77位中的突變在單個變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-Crel變體，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA耙標(biāo)中+3到+5位的核普酸三聯(lián)體相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靶標(biāo)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)該I-Crel位點中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靼標(biāo)中+8到+10位的核普酸三聯(lián)體，和(iv)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA乾標(biāo)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，和(i3)選擇和/或篩選來自步驟(g3)或(h3)的能夠切割序列SEQIDNO:1到14的DNA乾標(biāo)的變體。根據(jù)本發(fā)明的第三個實施方案，其中所述I-CreI變體可通過至少包括步驟(a)到(f)、步驟(g3)和/或步驟(h3)及以下其他步驟的方法獲得(")將步驟(g3)中獲得的變體與步驟(hs)中獲得的變體、I-Crel或者步驟(e)或步驟(f)中獲得的變體相組合，以形成異二聚體，或(i，4)將步驟(h3)中獲得的變體與I-Crel或者步驟(c)或步驟(d)中獲得的變體相組合，以形成異二聚體，和(J4)選擇和/或篩選來自步驟(14)或(1，4)的能夠切割序列SEQIDNO:1到14的DNA靶標(biāo)的異二聚體。可如國際PCT申請WO2004/067736、Epinat等(NucleicAcidsRes.，2003，31，2952-2962)、Chames等(NucleicAcidsRes.，2005,33，el78)和Arnould等(J.Mol.Biol.，2006,355，443-458)中所述，通過使用體外或體內(nèi)切割測定來進(jìn)行步驟(c)、(d)、(e)、(f)、(gO、(h2)、(i3)和(j4)中的選擇和/或篩選。優(yōu)選地，如在國際PCT申請WO2004/067736、Epinat等(NuclekAcidsRes.,2003，31,2952-2962)、Chames等(NucleicAcidsRes"2005，33，el78)和Arnould等(J.Mol.Biol"2006，355，443-458)中所述，通過重組介導(dǎo)的所述DNA雙鏈斷裂的修復(fù)在下述條件下在體內(nèi)進(jìn)行步驟(c)、(d)、(e)、(f)、(gl)、(h2)、(i3)和/或(J4),在所述條件下，由所述變體產(chǎn)生的突變DNA靶序列中的雙鏈斷裂導(dǎo)致陽性選擇標(biāo)記或報告基因的激活或者陰性選擇標(biāo)記或報告基因的失活。步驟(a)和(b)可包括引入額外的突變，以改善突變體的結(jié)合和/或切割特性，尤其是在其他位置接觸DNA靶序列或者直接或間接與所述DNA耙標(biāo)相互作用。可如國際PCT申請WO2004/067736和Arnould等(J.Mol.Biol.，2006,355,443-458)中所述，通過產(chǎn)生組合文庫來進(jìn)行這些步驟。通過共表達(dá)來自步驟(c)和(d)、(e)和(f)、(g3)和(h3)、(g3)和(e)、(g3)和(f)、(h3)和(c)、(h3)和(d)的兩種不同變體或者共表達(dá)(c)到(f)、(g3)或(h3)中任何步驟的一種變體與I-Crel來進(jìn)行步驟(g2)、(U)和(i，4)中的(分子間)變體組合，以允許異二聚體的形成。例如，可通過一種或兩種編碼所述變體的重組表達(dá)載體來修飾宿主細(xì)胞。如先前在國際PCT申請WO2006/097854和Arnould等(J.Mol.Biol"2006，355，443-458)中所述，然后在允許變體表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)所述細(xì)胞，從而在宿主細(xì)胞中形成異二聚體?？筛鶕?jù)公知的重疊PCR技術(shù)，通過擴(kuò)增包含兩個亞結(jié)構(gòu)域中每一個的重疊片段來進(jìn)行步驟(g3)和(h3)中的(分子內(nèi))突變組合。另外，步驟(g3)和/或(h3)可進(jìn)一步包括在整個變體或部分變體(特別是在變體的C端一半(80到163位))上引入隨機(jī)突變。可根據(jù)本領(lǐng)域公知的并可以商品獲得的標(biāo)準(zhǔn)誘變方法，通過對變體池(pool)產(chǎn)生隨機(jī)誘變文庫來進(jìn)行誘變。本發(fā)明的主題還包括在I-Crel的26到40位和/或44到77位含有突變的I-Crel變體，所述變體可用于根據(jù)本發(fā)明改造出能夠切割來自HPRT基因的DNA乾標(biāo)的變體。具體地，本發(fā)明包括如上述改造I-Crel變體的方法的步驟(c)到(f)中定義的I-Crel變體，包括序列SEQIDNO:24到47和129到142的變體。本發(fā)明還包括如上述改造I-Crel變體的方法的步驟(g3)和(h3)中定義的I-Crel變體，包括序列SEQIDNO:52到60的變體。能夠切割來自目的基因的DNA靶標(biāo)的單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶根據(jù)本領(lǐng)域7>知的方法衍生自本發(fā)明的變體(Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31，2952-62;Chevalier等，Mol.Cell.,2002,10,895-905;Steuer等，Chembiochem.，2004,5,206-13;國際PCT申請WO03/078619和WO2004/031346)。任何這些方法都可用于構(gòu)建衍生自本發(fā)明所述變體的單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知任何方法制備多核苷酸片段，其含有靶向DNA構(gòu)建體的序列或編碼本發(fā)明所述I-Crel變體或單鏈矛汙生物的序列。例如，通過使用特定引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從DNA模板擴(kuò)增它們。優(yōu)選將編碼I-Crel變體或單鏈衍生物的cDNA的密碼子選擇成有助于所述蛋白質(zhì)在期望的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)?？赏ㄟ^公知的重組DNA和遺傳工程技術(shù)獲得包含所述多核苦酸的重組栽體并將其引入宿主細(xì)胞中。通過表達(dá)如上所述的多肽來產(chǎn)生本發(fā)明所述的I-Crel變體或單鏈衍生物；優(yōu)選在適合多肽表達(dá)或共表達(dá)的條件下在經(jīng)一種或兩種表達(dá)載體(僅在變體的情況下)修飾的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物/植物中表達(dá)或共表達(dá)(僅在變體的情況下)所述多肽，并從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或從轉(zhuǎn)基因動物/植物中回收變體或單鏈衍生物。除非另有說明，否則本發(fā)明的實施將使用本領(lǐng)域內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡解釋。參閱，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.AUSUBEL,2000,Wiley和sonInc，LibraryofCongress,USA);MolecularCloning:實驗室操作手冊，第三版，(Sambrook等，2001，ColdSpringHarbor,NewYork:冷泉港實驗室出版)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編輯，1984);Mullis等美國專利號4,683,195;NucleicAcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins編輯1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins編輯1984);CultureOfAnimalCells(R,I，F(xiàn)reshney,AlanR.Liss,Inc.,1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);theseries,MethodsInENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，編輯-in畫chief，AcademicPress,Inc.,NewYork),尤其是，第154和155巻(Wu等編輯)和第185巻，"GeneExpressionTechnology"(D.Goeddel,編輯)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987,ColdSpringHarborLaboratory);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker,編輯，AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,第I國IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編輯,1986);和ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1986)。除了上述特征以外，本發(fā)明還包括在以下涉及說明本發(fā)明I-Crel大范圍核酸酶變體及其用途的實施例及附圖中顯現(xiàn)的其他特征，在附圖中-圖1顯示了歸巢內(nèi)切核酸酶的模塊結(jié)構(gòu)和用于設(shè)計定制大范圍核酸酶的組合方法。A.與其DNA耙標(biāo)結(jié)合的I-Crel歸巢內(nèi)切核酸酶的三維結(jié)構(gòu)。催化核心;故兩個aP(5a(5pa4斤疊包圍，所述4斤疊在DNA大溝上形成鞍形相互作用界面。B.可以將與衍生自I-Crel靶序列的不同結(jié)合序列(右上和左下)相組合，以獲得切割非回文嵌合靶標(biāo)的異二聚體或單鏈融合分子(右下)。C.鑒定更小的獨立亞基(即在單個單體或a即appa折疊內(nèi)的亞基(右上和左下))會允許通過將突變在同一單體內(nèi)組合來設(shè)計新的嵌合分子(右下)。這樣的分子會切割回文嵌合靶標(biāo)(右下)。D.之前兩個步驟的組合會允許進(jìn)行涉及四個不同亞結(jié)構(gòu)域的更大的組合方法。在第一步驟中，可將幾個新的大范圍核酸酶組合成新的分子("半-大范圍核酸酶，，)，該分子切割來自想要切割之靶標(biāo)的回文靶標(biāo)。然后，這樣的"半-大范圍核酸酶"的組合可產(chǎn)生切割目的靶標(biāo)的異二聚體種類。因此，針對各亞結(jié)構(gòu)域鑒定少量新的切割酶(cleaver)會允許設(shè)計非常大量的具有定制特異性的新內(nèi)切核酸酵o-圖2顯示了次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因及相應(yīng)的mRNA。外顯子以框顯示，并標(biāo)出了小鼠基因(登錄號NC—000086)中各外顯子的大??；也標(biāo)出了與人基因(NC—000023)的大小差異。在外顯子上標(biāo)出了I-Crel變體的切割位點(SEQIDNO:1到14)?；蛳路斤@示中國倉鼠HPRTmRNA(登錄號J00060.1;SEQIDNO:15)。ORF用灰色框表示。標(biāo)出了HprCH3靶位點及其序列(SEQIDNO:4)和位置。-圖3顯示了使用切割次黃嘌呤-鳥噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因的大范圍核酸酶的四種不同策略。A.基因插入和/或基因失活。用大范圍核酸酶切割并與含有目的基因(基因插入)或失活盒(基因失活)的修復(fù)基質(zhì)重組后，會發(fā)生基因插入或基因失活，所述目的基因或失活表達(dá)盒側(cè)翼是與切割位點周圍的序列共有同源性的序列。B.通過非同源末端接合產(chǎn)生的基因失活。用大范圍核酸酶切割后，DNA末端發(fā)生降解并通過非同源末端接合(Non-Homologous-End-Joining,NHEJ)重新連接，然后發(fā)生基因失活。C.基因矯正。突變發(fā)生在HPRT基因內(nèi)。用大范圍核酸酶切割并與修復(fù)基質(zhì)重組后，有害突變被矯正。D.外顯子序列敲入。突變發(fā)生在HPRT基因內(nèi)。突變的mRNA轉(zhuǎn)錄本示于基因下方。在修復(fù)基質(zhì)中，位于切割位點下游的外顯子與多聚腺苷酸化位點框內(nèi)融合(像cDNA中那樣)，以在3'終止轉(zhuǎn)錄?？墒褂脙?nèi)含子和外顯子序列作為同源區(qū)。外顯子序列敲入產(chǎn)生被改造的基因，其轉(zhuǎn)錄為能夠編碼功能性蛋白質(zhì)的mRNA。畫圖4顯示了編碼I畫CreIN75骨架蛋白的核苷酸序列和用于Ulib4和Ulib5文庫構(gòu)建的簡并引物。A.骨架(SEQIDNO:lll)是I-CrelORF，其包含D75N密碼子替換、在ATG起始密碼子后插入丙氨酸(A)密碼子和3'端三個額外的密碼子(AAD)。B.引物(SEQIDNO:112、113、114)。-圖5顯示了模式的實例和切割各靶標(biāo)的突變體數(shù)。A.模式分析(profiling)的實例。在酵母中以一系列64種回文靼標(biāo)對每個新內(nèi)切核酸酶進(jìn)行模式分析，所述靶標(biāo)如圖5B排列中，并在±8、±9和±10位與序列C1221(SEQIDNO:16;圖8B)不同。各耙序列以-10、-9、-8三聯(lián)體(10NNN)命名。例如，GGG對應(yīng)于tegggacgtc歐acgacgtcccga乾標(biāo)(SEQIDNO:122;圖8B)。針對64種靶標(biāo)對大范圍核酸酶測試4次。被I-Crel(D75)、I-CrelN75或10種衍生變體切割的耙標(biāo)以黑色或灰色點顯示。B.切割各靶標(biāo)的突變體數(shù)以及切割的平均強(qiáng)度。各序列以-10、-9、-8三聯(lián)體(10NNN)命名。切割各靶標(biāo)的蛋白質(zhì)數(shù)在下方顯示，并且灰色程度與在酵母中用這些切割酶獲得的平均信號強(qiáng)度成正比。-圖6顯示了I-Crel變體在28、30、33、38和/或40位的切割模式。對于在篩選后獲得并由28、30、33、38、40、70和75位殘基定義的141種I-Crel變體中的每一種而言，用64種耙標(biāo)在酵母中監(jiān)測切割，所述靼標(biāo)從^LI-Crel切割的C1221回文耙標(biāo)通過替換土8到10位的核香酸衍生而來。乾標(biāo)用對應(yīng)于-10、-9和-8位核苷酸的三個字母來命名。例如，GGG對應(yīng)于tegggacg^皮acgacgtcccga把標(biāo)(SEQIDNO:122)。數(shù)值(框內(nèi)的)對應(yīng)于切割強(qiáng)度，所述強(qiáng)度在掃描濾紙后通過適當(dāng)?shù)能浖u價，而(0)表示沒有切割。-圖7顯示了與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel同二聚體上蛋白質(zhì)和DNA靶標(biāo)中突變的定位。兩組突變(殘基44、68和70;殘基30、33和38)在左側(cè)的單體上用黑色顯示。這兩組突變明顯在空間上是分離的。然而，并沒有不同亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)證據(jù)。DNA靶位點中的對應(yīng)區(qū)(-5到-3區(qū)；-10到-8區(qū))在一個半位點上以灰色顯示。-圖8:I-Crel衍生耙標(biāo)的定義(A和B)及模式分析(C和D)。所有耙標(biāo)均衍生自被I-CreI野生型切割的回文把標(biāo)C1221,并示于A和B的上部。A.第一系列的64種靶標(biāo)衍生自±5到±3位(灰色框中)的誘變。少數(shù)實例示于下文中。顯示了與I-Crel殘基44、68和70之間的相互作用。B.第二系列的64種靶標(biāo)衍生自±10到±8位(灰色框中)的誘變。少數(shù)實例示于下文中?！?、±9和±10位不與44、68和70位殘基接觸。C.如圖8D中組織耙標(biāo)。對左圖而言，表中的三字母表示-5、-4、-3位的堿基(例如，GGG指^aa^cggggtaccccgttttga(SEQIDNO:115))。對右圖而言，三字母表示-10、-9、-8位的堿基(例如，GGG指tcgggac舒cg加gacg^ccga(SEQIDNO:122))。D.模式分析。將切割C1221把標(biāo)的10種I-Crel變體(包括I-CrelN75(QRR))針對兩組64種乾標(biāo)(左側(cè)的士5到±3，和右側(cè)的±10到±8)進(jìn)行模式分析。靶標(biāo)如圖8C排列。在兩組中均存在C1221靶標(biāo)(正方形內(nèi))。通過對應(yīng)于在44、68和70位所存在殘基的三字母(例如QRR是Q44、R68、R70)來標(biāo)識突變體，并且其全部具有額外的D75N突變。-圖9顯示了與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel同二聚體上蛋白質(zhì)和DNA乾標(biāo)中突變的定位。兩組突變(殘基44、68和70;殘基28、30、33、38和40)在左側(cè)的單體上用黑色顯示。這兩組突變明顯在空間上是分離的。然而，并沒有不同亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)證據(jù)。DNA靶位點中的對應(yīng)區(qū)(-5到-3區(qū)；-10到-8區(qū))在一個半位點上以灰色顯示。畫圖10顯示了HprCH3系列靼標(biāo)和近緣衍生物。IOGAG一P、10CAT—P和5CTT—P(SEQIDNO:17到19)是發(fā)現(xiàn)被I-Crel突變體切割的近^衍生物。它們與C1221(SEQIDNO:16)的區(qū)別在于加框的基序。C1221、10GAG—P、10CAT—P和5CTT—P是最早被描述為24bp的序列，但是結(jié)構(gòu)數(shù)^提示，只有22bp與蛋缶質(zhì)/DNA相互作用相關(guān)。然而，在括號中標(biāo)出了士12位。在HprCH3.2耙標(biāo)(SEQIDNO:20)中，靶標(biāo)中間的atga序列被替換為可見于C1221中的堿基gtac。HprCH3.3(SEQIDNO:21)是矛汙生自HprCH3.2左側(cè)部分的回文序歹'J，HprCH3.4(SEQIDNO:22)是衍生自HprCH3.2右側(cè)部分的回文序列。如圖中所示，來自10GAG—P、10CAT_P和5CTT—P的加框的基序可見于HprCH3系列靶標(biāo)+。畫圖11顯示了10NNN—P突變體對HprCH3.3的切割。該圖展示了用HprCH3.3乾標(biāo)初步篩選I—Crel的實例。加框的是陽性克隆。Gl、H6和H7位置處的陽性突變體"序列分別是KNDTQS/QRRDI(SEQIDNO:24)、KNTPQS/QRRDI(seqID脆44)和KNTTQS/QRRDI(seqidNO:45)(與表III的命名法相同)。-圖12顯示了組合突變體對HprCH3.4的切割。該圖展示了用HprCH3.4耙標(biāo)初步篩選I-Crel組合突變體的實例。A9和Bl位置處的陽性突變體的序列分別是KNTHQS/RYSDN(SEQIDNO:54)和KNSYQS/RYSNI(SEQIDNO:60)(與表IV的命名法相同)。國圖13顯示了異二聚體組合突變體對HprCH3.2和HprCH3的切割。A.用HprCH3.2耙標(biāo)再次篩選I-Crel突變體的組合。B.用HprCH3耙標(biāo)再次篩選I-Crel突變體的相同組合。-圖14展示了HprCH3靶標(biāo)的切割。將切割HprCH3.4的一系列I-Crel突變體優(yōu)化并與切割HprCH3.3的突變體共表達(dá)。用HprCH3靶標(biāo)測試切割。圓圏中AJL示HprCH3切割提高的突變體。在所示濾紙中，C9對應(yīng)于異二聚體28R,32S,33S，38Y,40Q，44R,68,70S,75N，77N(SEQIDNO:65)+33H(SEQIDNO:32),E6對應(yīng)于28R，32S33S,38Y,40Q,44R,68A，70S,75H,77Y(SEQIDNO:66)+33H(SEQIDNO:32)，F(xiàn)3對應(yīng)于28K，32T，33H,38Q,40S,44K,68Y,70S,75D，77R，92R,96R，107R,132V，140A，143A(SEQIDNO:74)+33H(SEQIDNO:32)。Hll是原始異二聚體(與切割HprCH3.3的突變體KNSHQS/QRRDI(SEQIDNO:32)共表達(dá)的切割HprCH3.4的突變體KSSQQS/RYSDN(SEQIDNO:53))。H12是陽性對照。-圖15展示了HprCH3乾標(biāo)的切割。將切割HprCH3.3的一系列I-Crel突變體優(yōu)化并與切割HprCH3.4的突變體共表達(dá)。用HprCH3靶標(biāo)測試切割。圓圏中是顯示有效切割HprCH3的突變體。在第一個濾紙上，B10對應(yīng)于異二聚體33H、71R、1031、129A和130G(SEQIDNO:80)+33T、38Y、44K、68Y、70S、75E和77V(SEQIDNO:56)。在第二個濾紙上，H3對應(yīng)于異二聚體21、33H、81V、861、110G、131R、135Q、151A和157V(SEQIDNO:79)+33T、38Y、44K、68Y、70S、75E和77V(SEQIDNO:56)。H12是陽性對照。-圖16顯示了pCLS1055載體圖。國圖17顯示了pCLS0542載體圖。-圖18顯示了pCLS1107栽體圖。國圖19顯示了在中國倉鼠(Criteculusgriseus)HPRT基因中存在的DNA靼序列及能夠切割所述DNA耙標(biāo)的相應(yīng)I-Crel變體。DNA靶標(biāo)(第3列)通過其第一個核普酸(起點，第1列)和最后一個核苷酸(終點，第2列)顯示；位置相對于HPRTmRNA序列(登錄號J00060.1)而標(biāo)出。各異二聚體變體的序列通過第一單體(第4列)和第二單體(第5列)中指定位置處的氨基酸殘基來定義。例如，圖19的第一個異二聚體變體由在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別具有K、Q、D、Y、Q、S、N、K、S、R和T的第一單體和在28、30、32、38、40、44、68、70、75和77位分別具有K、N、S、G、C、S、Q、R、R、N和I的第二單體組成。上述位置參考I-Crel序列SWISSPROTP05725或pdb登錄號lg9y標(biāo)出；I-Crel在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別具有K、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D、I。未標(biāo)出的位置未突變，并因此對應(yīng)于野生型I-Crel序列。-圖20展示了哺乳動物細(xì)胞中報告系統(tǒng)的設(shè)計。在起始密碼子下游132bp處被I-Scel切割位點中斷的嘌呤霉素抗性基因處于EFI(i啟動子的控制下(l)。該轉(zhuǎn)基因已在CHO-K1細(xì)胞中以單拷貝穩(wěn)定表達(dá)。為了在同一染色體環(huán)境中引入大范圍核酸酶靶位點，修復(fù)基質(zhì)包含i)無啟動子的潮霉素抗性基因、(ii)完整的lacZ表達(dá)盒和iii)兩條同源序列臂(1.1kb和2.3kb)。已構(gòu)建了若干修復(fù)基質(zhì)，其區(qū)別僅在于中斷l(xiāng)acZ基因的識別位點(2)。因此，已生產(chǎn)了非常類似的細(xì)胞系A(chǔ)l細(xì)胞系、I-SceI細(xì)胞系和I-CreI細(xì)胞系。當(dāng)lacZ修復(fù)基質(zhì)(長度2kb)與表達(dá)切割該識別位點的大范圍核酸酶的栽體一起共轉(zhuǎn)染時，恢復(fù)了功能性lacZ基因(3)。大范圍核酸酶誘導(dǎo)的重組水平可根據(jù)轉(zhuǎn)染后藍(lán)色集落或灶點(foci)的數(shù)量來推斷。國圖21顯示了用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)I-CrelN75的質(zhì)粒pCLS1088的圖鐠。-圖22顯示了切割HprCH3DNA乾序列的大范圍核酸酶的切割效率。在轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后檢測LacZ基因的修復(fù)頻率，所述細(xì)胞含有HprCH3染色體報告系統(tǒng)、修復(fù)基質(zhì)和不同量的大范圍核酸酶表達(dá)載體(其編碼原始經(jīng)改造的異二聚體(HprCH3.3/HprCH3.4)或其G19S衍生物(HprCH3.3/HprCh3.4G19S或HprCH3.3G19S/HprCh3.4))。實施例1:對±8到±10位核苷酸(10NNN)具有新特異性的功能性內(nèi)切核酸酶國際PCT申請WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes"2003,31，2952-2962;Chames等，NucleicAcidsRes"2005，33，e178和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355，443-458中描述了產(chǎn)生大范圍核酸酶的方法和哺乳動物或酵母細(xì)胞中基于切割所誘導(dǎo)重組的測定，其用于篩選具有改變的特異性的變體。這些測定產(chǎn)生可通過標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測的功能性LacZ報告基因。A)材料和方法a)構(gòu)建突變體文庫如先前所述(Epinat等，N.A.R.，2003，31，2952-2962)，合成I-Crelwt(I-CrelD75)、I畫CreID75N(I-CrelN75)和I-CrelS70N75開放讀碼框。通過用不同的殘基組合(Q26、K28、N30、S32、Y33、Q38和S40)進(jìn)行替換而從I-CrelN75、I-CrelD75和I-CrelS70N75骨架產(chǎn)生組合文庫，所述殘基組合可能參與與一個DNA靶標(biāo)半位點中士8到IO位堿基的相互作用。通過使用簡并引物的PCR來產(chǎn)生大范圍核酸酶文庫的多樣性，所述引物在各個選定位置上具有獨特的簡并密碼子。通過用aac替換密碼子75來引入突變D75N。然后，N30、Y33和Q38位(Ulib4文庫)或K28、N30和Q38位(Ulib5文庫)的三個密碼子被替換為編碼12種不同氨基酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)的簡并密碼子VVK(18種密碼子)。因此，這些蛋白質(zhì)文庫的最大(理論)多樣性為123或1728。然而，對核酸而言，多樣性為183或5832。在定購自BIOMETHODES的Lib4中，I-CrelN75中70位的精氨酸首先被替換為絲氨酸(R70S)。然后將28、33、38和40位隨機(jī)化。常規(guī)氨基酸(K28、Y33、Q38和S40)被替換為10種氨基酸(A、D、E、K、N、Q、R、S、T、Y)之一。得到的文庫就蛋白質(zhì)而言具有10000的理論復(fù)雜度。另外，使用NVK簡并密碼子(24種密碼子，氨基酸ACDEGHKNPQRSTWY)在I-CrelN75或I-CrelD75骨架中構(gòu)建由僅在兩個位置隨機(jī)化而得到的復(fù)雜度225(152)的小文庫。通過PCR獲得帶有期望的突變組合的片段，所述PCR使用編碼10、12或15種不同氨基酸的簡并引物對和作為DNA模板的I-CrelN75(圖4A)、I-CrelD75或I-CrelS70N75開放讀碼框(ORF)。例如，圖4B展示了分別用于產(chǎn)生Ulib4和Ulib5文庫的兩對引物(Ulib456for和Ulib4rev;Ulib456for和Ulib5rev)。將相應(yīng)的PCR產(chǎn)物克隆回酵母復(fù)制型表達(dá)載體pCLS0542中的I-CrelN75、I-CrelD75或I-CrelS70N75ORF中(前述Epinat等；圖17)，所述載體帶有LEU2營養(yǎng)缺陷標(biāo)記基因。在基于2micron的該復(fù)制型載體中，I-Crel變體處于半乳糖誘導(dǎo)型啟動子的控制下。b)構(gòu)建靶標(biāo)克隆如下構(gòu)建來自C1221的64種回文耙標(biāo)從Sigma定購64對寡核苦酸(ggcatacaagtttc咖acgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca(SEQIDNO:109)和反向互補(bǔ)序列)，將其退火并以相同方向克隆進(jìn)pGEM-TEasy(PROMEGA)中。接著，切下400bpPvuII片段并克隆進(jìn)前文已描述(前述Epinat等)的酵母載體pFL39-ADH-LACURAZ(也稱作pCLS0042)中，得到64種酵母報告載體(耙標(biāo)質(zhì)粒)。c)酵母菌株將大范圍核酸酶表達(dá)變體的三個文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)leu2突變單倍體酵母菌抹FYC2-6A:M/4:Ta、"/^A63、/^/2Z\i、/、3中。轉(zhuǎn)化中使用經(jīng)典的化學(xué)/熱激方案，所述方案通常給出每jigDNA106個獨立的轉(zhuǎn)化體(Gietz和Woods,MethodsEnzymol.，2002，350,87-96)。將個體轉(zhuǎn)化體(Leu+)克隆單個挑取到96孔微孔板中。使用相同的方案將64個靶標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)單倍體酵母菌株FYBL2-7B:A^ira，wm3AS5J，^pJA63，/ew2AJ，/j^2A2M中，得到64種測試菌抹。d)接合表達(dá)大范圍核酸酶的克隆并在酵母中篩選將表達(dá)大范圍核酸酶的克隆與64種靶菌林中的每一種進(jìn)行接合，并通過4吏用先前在國際PCT申請WO2004/067736;Epinat等，NucleicAcidsRes.，2003，31,2952-2962;Chames等，NucleicAcidsRes.,2005，33,e178和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355,443-458中描述的篩選實驗來測試二倍體的p-半乳糖苷酶活性。將I-Crel變體克隆以及酵母報告菌抹儲存在甘油(20。/。)中并在新的微孔板中復(fù)制。使用菌落網(wǎng)格(gridder)(QpixII,GENETIX)進(jìn)行接合。使用高密度(約20個點/cm2)將突變體在覆蓋YPD平板的尼龍濾膜上劃網(wǎng)格。在同一濾膜上進(jìn)行第二次劃網(wǎng)格的過程從而印上第二層，所述第二層對每個變體而言由64種含有不同報告子的酵母菌林組成。將膜置于富含固體瓊脂YEPD的培養(yǎng)基上，并在30。C孵育一夜，以進(jìn)行接合。接著，將濾膜轉(zhuǎn)移至合成培養(yǎng)基上并在37。C孵育五天，以選擇帶有表達(dá)載體和靶標(biāo)載體的二倍體，所述合成培養(yǎng)基缺乏亮氨酸和色氨酸，并含有半乳糖(1%)作為碳源(對共表達(dá)實驗而言還含有G418)。5天后，將濾膜置于固體培養(yǎng)基上并在37。C孵育，以監(jiān)測p-半乳糖普酶活性，所述固體培養(yǎng)基在0.5M磷酸鈉緩沖液pH7.0中含有0.02%X-Gal、0.1%SDS、6%二甲基甲酰胺(DMF)、7mMp-巰基乙醇、1%瓊脂糖。孵育兩天后，通過掃描鑒定陽性克隆，并使用適當(dāng)?shù)能浖吭摽寺〉膒-半乳糖苷酶活性。分離對至少一種靶標(biāo)顯示活性的克隆(首次篩選)，并將每個陽性克隆一式四份對64種報告菌林進(jìn)行測試，從而創(chuàng)建完整圖譜(二次篩選)。c)序列使用來自PROLIGO的引物PCR-GallO-F(gcaactttagtgctgacacatacagg,SEQIDNO:48)和PCR-GallO-R(.ac幼ccttgattgcagacttgacc,SEQIDNO:49)，在酵母菌落上通過PCR來擴(kuò)增酵母中首次和/或二次篩選期間鑒定的陽性克隆的開放讀碼框(ORF)。簡言之，挑取酵母菌落，重懸于lOOjULGlu液體培養(yǎng)基中并過夜培養(yǎng)。離心后，將酵母沉淀物重懸于10pl無菌水中，并在含有1.5pl每種特異性引物(100pmol/pl)的50|nl終體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件是94°C變性10分鐘的一個循環(huán)，94。C變性30s、55。C退火1分鐘、72。C延伸1.5分鐘的35個循環(huán)，和最終延伸5分鐘。通過MILLEGEN直接對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。d)結(jié)構(gòu)分析使用Pymol實現(xiàn)所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。I-Crel結(jié)構(gòu)對應(yīng)于pdb登錄號lg9y。本文中的殘基編號均指這些結(jié)構(gòu)，只有同二聚體中第二個I-CreI蛋白結(jié)構(gòu)域的殘基例外，其中殘基編號如第一個結(jié)構(gòu)域中所述。B)結(jié)果I-Crel是切割22bp假回文靶標(biāo)的二聚體歸巢內(nèi)切核酸酶。與其天然靶標(biāo)結(jié)合的I-CreI的結(jié)構(gòu)分析顯示，在每個單體中，八個殘基與七個堿基建立直接相互作用(前述Jurica等，1998)。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，±8到10位核苷酸的堿基與I-Crel氨基酸N30、Y33、Q38建立直接接觸，并與I-Crel氨基酸K28和S40建立間接接觸。因此，在30、33和38位具有突變的新蛋白質(zhì)能夠展示新的切割模式，其中含有通過替換I-Crel所切割回文耙標(biāo)的士8、±9和±10位而產(chǎn)生的64種乾標(biāo)(IONNN乾標(biāo))。另外，突變可改變參與與DNA堿基直接接觸的殘基數(shù)和位置。更特別地，除30、33、38以外但是在折疊后的蛋白質(zhì)上位于其附近的位置也可涉及與同一堿基對的相互作用。采取窮舉性蛋白質(zhì)文庫和靶標(biāo)文庫方法來局部改造這部分DNA結(jié)合界面。5個氨基酸位置的隨機(jī)化將產(chǎn)生205=3.2xl(^的理論多樣性。然而，通過每次使2、3或4個殘基隨機(jī)化而產(chǎn)生了具有更低多樣性的文庫，導(dǎo)致225(152)、1728(123)或10，000(104)的多樣性。該策略允許使用前述基于酵母的測定，將這些文庫中的每一個針對64種回文10NNNDNA乾標(biāo)進(jìn)行大規(guī)模篩選(前述Epinat等，2003，和國際PCT申請WO2004/067736)。首先，將I-Crel骨架從D75突變?yōu)镹。D75N突變不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但是降低了I-Crel在過表達(dá)實驗中的毒性。接著構(gòu)建Ulib4文庫將殘基30、33和38隨機(jī)化，并將常規(guī)氨基酸(N30、Y33和Q38)替換為12種氨基酸(A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T)之一。得到的文庫就蛋白質(zhì)而言具有1728(對核酸而言為5832)的復(fù)雜度。然后構(gòu)建兩個其他文庫Ulib5和Lib4。在Ulib5中，將殘基28、30和38隨機(jī)化，并將常規(guī)氨基酸(K28、N30和Q38)替換為12種氨基酸(ADEGHKNPQRST)之一。得到的文庫就蛋白質(zhì)而言具有1728(對核酸而言為5832)的復(fù)雜度。在Lib4中，首先用絲氨酸替換70位的精氨酸。然后將殘基28、33、38和40隨機(jī)化，將常規(guī)氨基酸(K28、Y33、Q38和S40)替換為10種氨基酸(A、D、E、K、N、Q、R、S、T、Y)之一。得到的文庫就蛋白質(zhì)而言具有10000的復(fù)雜度。在初步篩選實驗中，將來自Ulib4的20000個克隆、來自Ulib5的10000個克隆和來自Lib4的20000個克隆與64種測試菌林中的每一種進(jìn)行接合，并測試二倍體的(5-半乳糖苷酶活性。在第二輪篩選中，將對64種乾標(biāo)中至少一種顯示切割活性的所有克隆一式四份地對64種靶標(biāo)進(jìn)行測試，并如圖5顯示建立各個切割模式。然后通過PCR從各個菌林中擴(kuò)增大范圍核酸酶ORF并測序。在第二次篩選并在整個編碼區(qū)范圍內(nèi)對陽性克隆進(jìn)行測序后，分離到對至少一種靶標(biāo)顯示切割活性的共1484種獨特的突變體?？捎^察到不同的模式。圖6展示了被141種變體的集合切割的37種新靶標(biāo)，包括不被I-Crel切割的34種把標(biāo)和被I-Crel切割的3種耙標(biāo)(aag、aat和aac)。包括I-CrelN75和I-CrelD75的12種模式實例示于圖5A。這些新模式中的一些與野生型骨架共有一定的相似性，而許多其他的則完全不同。歸巢內(nèi)切核酸酶一般能夠在其靶序列中接受一定的筒并性，I-Crel和I-CreIN75蛋白本身分別切割一系列16種和3種靶標(biāo)。發(fā)現(xiàn)許多新的內(nèi)切核酸酶具有切割簡并性，每個突變體平均有9.9種切割靶標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)差11)。然而，在鑒定出的1484種突變體中，發(fā)現(xiàn)219種(15%)僅切割一種DNA耙標(biāo)，179種(12%)切割兩種，169種(ll%)和120種(8%)分別能夠切割3種和4種靶標(biāo)。因此，不考慮它們的優(yōu)選靶標(biāo)，大量的I-Crel衍生物顯示與I-CreIN75突變體(切割三種10NNN耙序列)，或I-Crel(切割16種10NNN耙序列)相似(如果不更高的話)的特異性水平。同時，所分離的對10NNN序列具有改變的特異性的大多數(shù)突變體不再切割原始C1221靶序列(分別為61%和59%)?？偠灾撏蛔凅w的大集合允許靶向±10、±9和±8位不同的所有64種可能的DNA序列(圖5B)。然而，切割每種靶標(biāo)的突變體數(shù)有巨大差異(圖5B)，這些數(shù)目為3到936不等，平均為228.5(標(biāo)準(zhǔn)差201.5)。在±8位為鳥噪呤或±9位為腺噤呤的靶標(biāo)中經(jīng)常觀察到切割，而±10或±8位的胞嘧啶與低切割數(shù)相關(guān)。另外，所有耙標(biāo)不以相同效率切割。既然觀察到相同靶標(biāo)中信號的顯著變異，就根據(jù)突變體(例如，對圖5B中的野生型10AAA靶標(biāo)而言比較切割效率)，如前才艮道對各個乾標(biāo)測量平均切割效率(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006,355,443-458)。這些平均效率通過圖5B上的灰度水平來表示。對結(jié)果的分析顯示，在該平均效率和切割酶數(shù)量之間具有明顯的相關(guān)性，最頻繁切割的靶標(biāo)也是最有效的切點(例如，將圖5B中具有IOGAN、10AAN和10TAN的把標(biāo)與IOTCN、10CTN和10CCN進(jìn)行比較)。因此，獲得了數(shù)百種新的變體，所述變體包括具有新的底物特異性的突變體；這些變體能保持高水平的活性，并且新蛋白質(zhì)的特異性比野生型蛋白質(zhì)對其靶標(biāo)的特異性甚至可以更窄。實施例2:就DNA結(jié)合而言，兩個I-CreI功能性亞結(jié)構(gòu)域可獨立作用本實施例顯示，I-Crel靶標(biāo)可分成與不同亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合并獨立作用的兩部分。在I-CreIDNA耙標(biāo)中，±5、±4和±3位結(jié)合44、68和70位殘基。如實施例1中描述獲得的在44、68、70和75位突變的若干I-Crel變體顯示對C1221(被I-Crel野生型切割的回文靶標(biāo)(Chevalier，等，2003))有可檢測的活性，但以不同效率切割其他耙標(biāo)。在該結(jié)合位點的外部，±9和±8位與30、33和38位殘基接觸。如圖7所示，這兩組殘基位于蛋白質(zhì)的不同部分中。士8位殘基沒有直接相互作用。如果士5到±3位和±10到±8位結(jié)合兩個不同的獨立的功能性亞結(jié)構(gòu)域，那么改造一個亞結(jié)構(gòu)域應(yīng)該不影響另一結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性。為了確定士5到±3位和±9到±8位是否結(jié)合兩個不同的獨立的功能性亞結(jié)構(gòu)域，對在±5到±3區(qū)域中具有改變的特異性但仍然結(jié)合C1221的突變體測定其在士IO到±8區(qū)域中的切割特性。A)材料和方法a)結(jié)構(gòu)分析實驗操作如實施例1。b)表達(dá)I-Crel變體的酵母菌株如實施例l所述，通過將44、68、70和75位突變并篩選能夠切割C1221衍生靶標(biāo)的克隆來產(chǎn)生突變體。將表達(dá)突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母(S.cerevisiae)菌林FYC2國6A(M/47Vz、^2A63、^w2AJ、歸A，)中。c)構(gòu)建靶標(biāo)克隆如實施例1中所述，通過使用64對寡核苷酸(ggcatacaagtttcaaaac咖gtacnnngttttgacaatcgtctgtca(SEQIDNO:110)及反向互補(bǔ)序列)，通過突變士5到±3來構(gòu)建中衍生自C1221的64種回文靶標(biāo)質(zhì)粒。使用實施例1中所述方案將這64種耙標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)單倍體酵母菌林FYBL2-7B:AWT，"n^AS57，fr/LA63，/e"2AJ，/"2AM2中，得到64種測試菌林。d)接合表達(dá)大范圍核酸酶的克隆并在酵母中篩選如實施例1中所述，使用低網(wǎng)格密度(約4個點/cm"進(jìn)行接合。B)結(jié)果如圖8B顯示，通過誘變士IO到±8位堿基來構(gòu)建對應(yīng)于衍生自C1221的所有可能回文靶標(biāo)的64種靶標(biāo)。建立了I-CreIN75的切割模式，其對aaa及aat耙標(biāo)顯示強(qiáng)信號，對aag耙標(biāo)顯示較弱的信號。如圖8C所示，在士5到士3中具有截然不同的切割模式的蛋白質(zhì)(如QAR、QNR、TRR、NRR、ERR和DRR)在±10到±8中具有相似的才莫式?！?0到±8中的aaa序列對應(yīng)于C1221靶標(biāo)，必然4皮所有切割C1221的變體切割。aat也在大多數(shù)突變體(90%)中被切割，而經(jīng)常觀察不到aag被切割，這可能是因為信號降到微弱切割酶的檢測水平之下的緣故。沒有其他靶標(biāo)被切割。這些結(jié)果顯示，±5到±3與±10到±8區(qū)域與兩個不同的非常獨立的結(jié)合單元結(jié)合。實施例3:用于改造出切割來自HPRT基因的新大范圍核酸酶的策略A)用于設(shè)計具有定制特異性的新大范圍核酸酶的組合方法的原理此處的目的是確定是否可能將可分離的功能性亞結(jié)構(gòu)域組合在I-CrelDNA結(jié)合界面中，以切割新的DNA靶標(biāo)。對I-Crel編碼序列中不同突變組的鑒定提高了這樣的可能性可以將這些兩組突變體在分子內(nèi)進(jìn)行組合，以產(chǎn)生能夠同時切割在IONNN和5NNN位發(fā)生改變之靶序列的組合突變體(圖1C),所述突變組改變針對C1221靶序列的兩個不同區(qū)域(IONNN(-IO到-8位和+8到+10位±8到IO或士IO到85實施例1)和5NNN(畫5到-3和+3到+5:±3到5或±5到3;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355，443-458，國際申請WO2006/097784和WO2006/097853))的切割特異性。另一方面，28、30、33、38和40位與44、68和70位位于同一DNA結(jié)合折疊上，并且沒有結(jié)構(gòu)證據(jù)顯示它們會獨立作用。然而，這兩組突變明顯地處于該折疊中位于DNA耙標(biāo)的不同區(qū)域附近的空間上分離的區(qū)域中(圖7和9)。另外，一系列突變的累積影響可最終破壞折疊。為了檢查它們是否是兩個獨立功能性亞基的一部分，將來自這兩組突變體的突變組合，并測定所得變體切割組合乾序列的能力(圖ID)。因此，鑒定了將四種被切割的5NNN和10NNN把標(biāo)混雜物(patchwork)的非回文耙序列。另外，設(shè)計了代表回文形式的左半側(cè)和右半側(cè)的兩個衍生乾序列。為了產(chǎn)生能夠乾向回文耙標(biāo)的合適I-Crel組合突變體，選擇有效切割每個回文序列的10NNN和5NNN部分的突變體，并通過在酵母中體內(nèi)克隆將其特征性突變整合到同一編碼序列中。在本文及附圖中，組合突變體序列以28、30、32、33、38、40、44、68和70、75和77位的11字母^R碼命名。例如，KNSTYS/KYSEV表示I畫CrelK28、謂、S32、T33、Y38、S40、K44、Y68、S70、E75和V77(I-Crel28K、30N、32S、33T、38Y、40S、44K、68Y、70S、75E和77V)。母體對照以28、30、32、33、38和40位的6字母代碼或44、68、70、75和77位的5字母代碼命名。例如，KNSTYS表示I畫Crel28K、30N、32S、33T、38Y和40S,KYSEV表示-CreI44K、68Y、70S、75E和77V。描述于這些實施例中的所有靶序列都是22或24bp回文序列。因此，僅以前11或12個核苷酸描述它們，隨后是后綴_;例如，I-Crel蛋白質(zhì)切割的靶標(biāo)5，tca^gtc踟cg",ga3，(SEQIDNO:16)將稱為tcaaaacgtcgtJP。B)設(shè)計切割來自中國倉鼠HPRT基因的靶標(biāo)的新大范圍核酸酶使用該組合方法來改造I-Crel大范圍核酸酶的DNA結(jié)合域，并切割中國倉鼠HPRT基因。HprCH3是位于CW化cm/msg"&ws(中國倉鼠)HPRT基因外顯子3(17到38位)中的22bp(非回文)靶標(biāo)(圖2);所述靶序列對應(yīng)于mRNA(登錄號J00060;SEQIDNO:15;圖2)的241到262位。切割HprCH3的大范圍核酸酶可用于在HPRT基因座處插入異源目的基因以在脊推動物重組細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動物中實現(xiàn)可重現(xiàn)的基因表達(dá)水平，或者用于失活所述HPRT基因以允許選擇脊堆動物重組細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動物(圖3A和3B)。HprCH3序列一部分是被如國際PCT申請WO2006/097784和WO2006/097853;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355,443-458;實施例1中所述獲得的先前鑒定的大范圍核酸酶所切割的IOGAG一P、10CAT—P和5CTT—P靼標(biāo)的混雜物(圖10)。因此，HprCH3可被得自這些A前鑒定的l范圍核酸酶的組合突變體切割。10GAG—P、10CAT—P和5CTT—P靼序列是I-Crel所切割的回文序列C1221的24bp衍i物(前述的Arnould等)。然而，與其DNA靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel的結(jié)構(gòu)表明，這些靶標(biāo)中的兩個外側(cè)堿基對(-12和12位)對結(jié)合和切割沒有影響(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001,8，312-316;Chevalier和Stoddard,NucleicAcidsRes.，2001,29,3757-3774;Chevalier等，J.Mol,Biol"2003，329，253-269)，在本研究中，只考慮-11到11位。因此，HprCH3系列乾標(biāo)以22bp序列而不是24bp來定義。HprCH3與C1221差異在于4bp中央?yún)^(qū)。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，4個中央堿基對(-2到2位)不與I國CreI蛋白接觸(Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001,8，312-316;Chevalier和Stoddard,NucleicAcidsRes.，2001，29，3757-3774;Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，這些位置上的堿基不應(yīng)影響結(jié)合效率。然而，它們能夠影響由該區(qū)域邊緣處的兩個切口所引起的切割。因此，首先用來自C1221的gtac序列替換-2到2位的atga序列，得到耙標(biāo)HprCH3.2(圖10)。然后從HprCH3.2衍生兩個回文乾標(biāo)HprCH3.3和HprCH3.4(圖10)。因為HprCH3.3和HprCH3.4是回文的，所以它們應(yīng)當(dāng)被同二聚體蛋白質(zhì)切割。因此，首先"^殳計了能夠作為同二聚體切割HprCH3.3和HprCH3.4序列的蛋白質(zhì)(實施例4和5),隨后將它們共表達(dá)以獲得切割HprCH3的異二聚體(實施例6)?？梢澡b定到切割HprCH3.2和HprCH3靶標(biāo)的異二聚體。為了提高對HprCH3靶標(biāo)的切割活性，選擇并然后精制一系列切割HprCH3.3和HprCH3.4的突變體。將選擇的突變體隨機(jī)誘變，并用于形成新的異二聚體，針對HprCH3靶標(biāo)篩選所述異二聚體(實施例7和8)?？设b定到對HprCH3靶標(biāo)具有改善的切割活性的異二聚體。實施例4:鑒定切割HprCH3.3的大范圍核酸酶該實施例顯示，I-Crel突變體能切割衍生自HprCH3.2耙標(biāo)左側(cè)部分的回文形式HprCH3.3DNA靶序列(圖10)。本實施例中描述的靶序列是22bp回文序列。因此，僅以前11個核苷酸描述它們，隨后是后綴—P(例如，靶標(biāo)HprCH3.3記為cgagatgtcgt—P(sEQIDNO:21)。HprCH3.3在除士6外的所有位置均與10GAG—P相似。推測±6位應(yīng)該對結(jié)合及切割活性幾乎沒有影響。如實施例1+所述，通過在28、30、32、33、38、40位誘變I-Crel或I-CrelS70N75來獲得能夠切割I(lǐng)OGAG一P靶標(biāo)的突變體。篩選這些突變體會允許鑒定切割HprCH3.3耙標(biāo)的;范圍核酸酶。A)材料和方法a)構(gòu)建乾標(biāo)栽體如下克隆乾標(biāo)從PROLIGO定購側(cè)翼是gateway克隆序列的對應(yīng)于耙序列的寡核普酸5,tggca加aagtttcgagatgtcgtacgacatetegacaatogtctgtca3，(SEQIDNO:23)。使用Gateway方案(INVITROGEN)，將通過PCR擴(kuò)增單鏈寡核苷酸而產(chǎn)生的雙鏈靶DNA克隆進(jìn)酵母報告載體(pCLS1055,圖16)中。將酵母報告載體轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母菌林FYBL2-7B(AWra，"m3AS52，^p7A63，/e"2AJ，/"2AM2)中，得到報告菌林。b)接合表達(dá)大范圍核酸酶的克隆并在酵母中篩選先前鑒定了切割10GAG—P的I-Crel突變體，如實施例1中所述。這些突變體存在于釀酒酵母菌林FYC2-6A(3^ra、"/^Z\63、/ew2ZL、/f/WA2M)中的酵母表達(dá)質(zhì)粒(pCLS0542，圖17)上。將表達(dá)大范圍核酸酶的克隆與報告菌林接合，并使用如實施例1中所述篩選測定，通過使用低網(wǎng)格密度(約4個點/cm2)來測試二倍體的p-半乳糖苷酶活性。c)突變體測序?qū)嶒灢襟E如實施例1中所描述。B)結(jié)果在能夠切割10GAG—P的I-Crel突變體中篩選對HprCH3.3DNA靶標(biāo)(cgagatgtcgt_P;(SEQIDNO:21)的切割。發(fā)現(xiàn)了38個陽性克隆，在測序并通過二次篩選驗證后，鑒定出了列于表III中的24種突變體。陽性的實例示于圖ll中。表III:能夠切割HprCH3.3DNA把標(biāo)的I-Crel突變體I-Crel突變體中28,30,32,33,38,40/44,68,70,75位及77位的氨基酸(例如KNDTQS/QRRDI表示K28,N30,D32,T33,Q38,S柳Q44,R68,R70,D75和177)SEQIDNO:<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>實施例5:產(chǎn)生切割HprCH3.4的大范圍核酸酶該實施例顯示，I-Crel突變體能夠切割衍生自HprCH3.2靶標(biāo)右側(cè)部分的回文形式HprCH3.4DNA靶序列(圖10)。該實施例中描述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，僅用前l(fā)l個核苷酸描述它們，隨后是后綴—P(例如，HprCH3.4可稱作ccatctcttgt—P;SEQIDNO:22)。HprCH3.4在士l、±2、±3、±4、±5和±11位與5CTT_P相似，在±1、±2、±8、±9、±10和±11位與10CAT—P相似。推領(lǐng)'J士6和士7位對結(jié)合和切割活性幾乎沒有影響。如前述(國際PCT申請WO2006/097784和WO2006/097853;Arnould等，J.Mol.Biol"2006,355，443-458),通過在44、68和70位誘變I-CrelN75或在44、68、75和77位誘變I-CrelS70而獲得了能夠切割5CTT_P(caa幼c戰(zhàn)織一P;SEQIDNO:19)的突變體。如實施例l中所述，通過^30、32、33和38位誘變I-Crel(D75)獲得了能夠切割10CAT—Ptarget(ccatacgtcgt_P;SEQIDNO:18)耙標(biāo)的突變體。這樣，組合這些i變體對會允許切割HprCH3.4靶標(biāo)。因此，為了檢查組合突變體是否可以切割HprCH3.4靶標(biāo)，將來自切割5CTT_P的蛋白質(zhì)中44、68、70、75和77位的氨基酸與來自切割10CAT—P的蛋白質(zhì)中30、32、33和38位的氨基酸相組合。A)材料和方法a)構(gòu)建靶標(biāo)載體實驗步驟如實施例4中所描述。b)構(gòu)建組合突變體如國際PCT申請WO2006/097784和WO2006/097853;Arnould等，J.Mol.Biol"2006，355,443-458和實施例1中所述，先前鑒定了切割10CAT—P或5CTT一P的I-Crel突變體。為了產(chǎn)生含有來自兩個系列的突變"I-Crel衍i編碼序列，進(jìn)行擴(kuò)增I-Crel編碼序列5，端(1-43位氨基酸)或3，端(39-167位)的獨立的重疊PCR反應(yīng)。對5，和3'端二者而言，都使用對栽體(pCLS0542，圖11)具有特異性的引物(GallOF5，-ge幼c她gtgctgacacatacagg-3，(SEQIDNO:48)或Gall0R5，一acaaccttgattggagacttgaco_3，(SEQIDNO:49))和引物(assF5，-ctannnttgaccttt-3，(SEQIDNO:50)或assR5，-咖ggtcaan^tag-3，(SEQIDNO:51))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中nnn編碼40位殘基。將得自使用相同引物進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)并具有相同的40位殘基編碼序列的PCR片段合并。然后，將得自使用引物GallOF與assR或者assF與Gall0R的反應(yīng)的各個PCR片段庫以等摩爾比混合。最后，使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz和Woods,MethodsEnzymol，2002,350，87-96)，使用最終的兩種重疊PCR片段池各約25ng以及75ng經(jīng)DraIII和NgoMIV消化而線性化的栽體DNA(pCLS1107，圖18)轉(zhuǎn)化酵母釀酒酵母菌林FYC2-6A(M^ra，^p7AW，/ew2A/，A/WA2^)。通過在酵母中的體內(nèi)同源重組來產(chǎn)生同時含有兩組突變的完整編碼序列。c)接合表達(dá)大范圍核酸酶的克隆并在酵母中篩選實驗步驟如實施例4中所描述。d)突變體測序?qū)嶒灢襟E如實施例4中所描述。B)結(jié)果用于本實施例中的切割10CAT—P靼標(biāo)或5CTT—P靼標(biāo)的I-Crel突變體列于表IV中。通過將I-CreI骨架中來自切割5CTT一P靶標(biāo)的突變體的44、68、70、75和77位氨基酸與來自切割10CAT—P耙標(biāo)的突變體的30、32、33和38位氨基酸組合來構(gòu)建I-Crel組;突變體(表IV)，產(chǎn)生有480復(fù)雜度的文庫。將該文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，并對1728個克隆(多樣性的3.6倍)篩選針對HprCH3.4DNA乾標(biāo)(:ccatetcttgt_P;SEQIDNO:22)的切割。發(fā)現(xiàn)了10個陽性克隆，并在測序和二次篩選驗證后鑒定出9種組合突變體(表IV)。通過對應(yīng)于28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位氨基酸殘基的11字母代碼來標(biāo)識突變體。例如，KNSTYS/KYSEV表示I-CreIK28、N30、S32、T33、Y38、S40、K44、Y68、S70、E75和V77(SEQIDNO:56)。在這9個突變體中，4種突變體對應(yīng)于2種母體分子的真正組裝(表IV;SEQIDNO:52到55),而其他5種突變體在28、30、32、33、38、40或44、68、70、75、77位顯示了非親本組合。這5種突變體是-KNSTYS/KYSEV(SEQIDNO:56)-KNRDQS/KYSDR(SEQIDNO:57)-KNSSDS/KYSDR(SEQIDNO:58)-KNTHQS/KYSNR(SEQIDNO:59)-KNSYQS/RYSNI(SEQIDNO:60)這些突變體可能得自轉(zhuǎn)化過程中相似PCR片段的重組。P曰性的實例示于圖12中。表IV:理論上存在于組合文庫中的突變體對HprCH3.4靶標(biāo)的切割<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>a)突變體共表達(dá)實驗步驟如國際PCT申請WO2006/097854及Arnould等J.Mol.Biol.,2006，355，443-458中所描述。簡言之，使用標(biāo)準(zhǔn)方案從切割HprCH3.4靶標(biāo)的突變體中提取酵母DNA,并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)。然后使用所得質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)切割HprCH3.3靼標(biāo)之突變體的酵母菌林。在-LGlu+G418培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。b)接合共表達(dá)大范圍核酸酶的克隆并在酵母中篩選實驗操作如實施例4中所描述，只是使用低網(wǎng)樹約4個點/cm2)。B)結(jié)果共表達(dá)切割HprCH3.3和HprCH3.4的突變體在大部分情況下導(dǎo)致對HprCH3.2靶標(biāo)的有效切割(圖13A)。另外，這些組合中的一些能夠切割在-1、-2、1和2位與HprCH3.2序列有4bp不同的HprCH3天然靶標(biāo)。(圖13B)。功能性組合總結(jié)于表V和表VI中。表V:異二聚體突變體對HprCH3.2靶標(biāo)的切割<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>十表示功能性組合。粗體的突變體是實施例5中具有替代性突變的突變體。表VI:異二聚體突變體對HprCH3靶標(biāo)的切割<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>+表示功能性組合。*粗體的突變體是實施例5中具有替代性突變的突變體。實施例7:通過對切割HprCH3.4的蛋白質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)i秀變并與切割HprCH3.3的蛋白質(zhì)進(jìn)行裝配來改進(jìn)切割HprCH3的大范圍核酸酶先前在實施例4中已經(jīng)鑒定了通過裝配切割回文HprCH3.3和HprCH3.4靶標(biāo)的突變體而能夠切割HprCH3.2和HprCH3靶標(biāo)的I-Crel突變體。然而，這些突變體對HprCH3.2乾標(biāo)比HprCH3乾標(biāo)展示出更強(qiáng)的活性。因此，對切割HprCH3的組合突變體進(jìn)行了誘變，并篩選了對該靶標(biāo)展示更強(qiáng)切割的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-Crel蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，4個中央堿基對(-2到2位)不與I-Crel蛋白質(zhì)接觸(Chevalier等，Nat.Struct.Biol"2001，8,312-316;Chevalier和Stoddard,NucleicAcidsRes.,2001，29,3757-3774;Chevalier等,J.Mol.Biol"2003，329，253-269)。因此難以推理性地選擇一組位置來誘變，在整個蛋白質(zhì)上進(jìn)行了隨機(jī)誘變。隨機(jī)誘變產(chǎn)生高復(fù)雜度的文庫。因此，為了限制待測試變體文庫的復(fù)雜度，僅對切割HprCH3的異二聚體的兩個組件之一進(jìn)行誘變。因此，在第一步中，誘變切割HprCH3.4的蛋白質(zhì)，在第二步中評價它們在與切割HprCH3.3的蛋白質(zhì)共表達(dá)時是否能夠切割HprCH3。A)材料和方法a)通過隨機(jī)誘變構(gòu)建文庫如JBSdNTP-誘變試劑盒中JenaBioscienceGmbH的方案所述，通過使用PCR(其使用Mn2+)或兩步式PCR方法(其使用dNTP衍生物8-氧代-dGTP和dPTP)，對所選突變體池進(jìn)行隨機(jī)誘變。所用的引物是preATGCreFor(.5，-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3，SEQIDNO:61)和ICrelpostRev(5，-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctegagttotoagtcggccgc-3，SEQIDNO:62)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz和Woods,MethodsEnzymol.，2002,350，87-96)，將大約25ng的PCR產(chǎn)物及75ng經(jīng)DraIII和NgoMIV消化而線性化的載體DNA(pCLS1107,圖18)轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母釀酒酵母菌株FYC2-6A(M^4T^,./eM2ZL./wWZ2M)中。通過在酵母中的體內(nèi)同源重組來產(chǎn)生含有I-Crel突變體完整編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒。b)突變體-靶標(biāo)酵母菌林、篩選和測序使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，用亮氨酸載體(pCLS0542)中切割HprCH3.3靶標(biāo)的突變體來轉(zhuǎn)化在酵母報告載體(pCLS1055,圖16)中含有HprCH3乾標(biāo)的酵母菌株FYBL2-7B(M^r，wm3AS57，&/^A63，/ew2AJ，/"2A2M)。使用突變體-靶標(biāo)酵母作為用于實施例4所述接合測定的靶標(biāo)菌林。通過如實施例4所述的測序(MILLEGEN)來驗證所得陽性克隆。B)結(jié)果將切割HprCH3.4序列的4個突變體(I-CreI32T、33H、44K、68Y、70S、75N、77R，I-Crel30S、33Q、44R、68Y、70S、77N,I國CreI32T、33H、70S、75H、77Y和I國Crel32T、33H、68N、70S、75Q、77R，根據(jù)表IV的命名法也稱作KNTHQS/KYSNR、KSSQQS/RYSDN、KNTHQS/QRSHY和KNTHQS/QNSQR;SEQIDNO:59，53，63和64)合并，隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中。然后將1140個轉(zhuǎn)化克隆與酵母菌林接合，所述酵母菌林含有(i)報告質(zhì)粒中的HprCH3耙標(biāo)，(ii)表達(dá)質(zhì)粒，其含有切割HprCH3.3耙標(biāo)的突變體(I-Crel33H或KNSHQS/QRRDI;SEQIDNO:32)。與該酵母菌抹接合后，發(fā)現(xiàn)23個克隆比原始突變體更有效地切割HprCH3靶標(biāo)。因此，23個陽性克隆含有能與KNSHQS/QRRDI形成對HprCH3乾標(biāo)有強(qiáng)切割活性的異二聚體的蛋白質(zhì)。陽性的實例示于圖14中。對這23個陽性克隆測序表明，鑒定到了列于表VII中的IO個不同突變體。表VII:對HprCH3展示強(qiáng)切割活性的功能性突變體組合優(yōu)化突變體HprCH3.4(SEQIDNO:65到74)l-Crel28R.30N.32S.33S.38Y.40Q.44R.68A.70S.75N.77NI-Crel28R.30N.32S.33S.38Y.40Q.44R.68A.70S.75H.77Yl-Crel28R.30N.32T.33S.38Y.40Q.44R.68Y.70S.75N.77N.140MI-Crel28K.30N.32T.33H.38H.40S.44Q.68Y.70S.75D.77RI-Crel28K,30W.327;33H.38Q.40S."K.68y.70S.75D.77Rl-Crel28K.30W.327;33H.38Q.40S."Q.6柳.70S.75H.77Rl-Crel28K,30W,327",33H,38Q,40S,44Q,68R70S,75W77Rl-Crel28K,30W,32r.33/i38Q,40S.44Q朋H.70S.75H.77Hl-Crel28K.30W.32r.33H.38Q.40S.44Q.68H.70S.75H.77H.92Rl-Crel28K,30W,327",33〃,38Q,40S,"K,68V70S,75D,77R，92R,96R,107R,132V,140A,143A實施例8:通過對切割HprCH3.3的蛋白質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)誘變并與切割HprCH3.4的蛋白質(zhì)進(jìn)行裝配來改進(jìn)切割HprCH3的大范圍核酸酶作為實施例6的補(bǔ)充，還決定對切割HprCH3.3的突變體進(jìn)行隨機(jī)誘變。僅有一個HprCh3.3突變體能夠切割HprCH3，所以將該突變體和強(qiáng)烈切割HprCH3.3但不切割HprCH3的3個其他突變體用于隨機(jī)i秀變。然后測試切割HprCH3.3的誘變蛋白質(zhì)，以確定它們在與切割HprCH3.4的蛋白質(zhì)共表達(dá)時是否能有效切割HprCH3。A)材料和方法a)通過隨機(jī)i秀變構(gòu)建文庫如JBSdNTP-i秀變試劑盒中JenaBioscienceGmbH的方案所述，通過使用PCR(其使用Mn2+)或兩步式PCR方法(其使用dNTP衍一卜zosz舌z芝903s導(dǎo)OSCHCCSZCNOSSZIgu.1生物8-氧代-dGTP和dPTP)，對所選突變體池進(jìn)行隨機(jī)誘變。所用的引物是preATGCreFor('5，-gcataaattactatacttetatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacO"3，SEQIDNO:61)和ICrelpostRev(5'-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctogag加tcagteggccgc-3，SEQIDNO:62)。使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz和Woods,MethodsEnzymol.，2002,350，87-96)，將大約25ng的PCR產(chǎn)物及75ng經(jīng)Ncol和Eagl消化而線性化的載體DNA(pCLS0542，圖17)轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母釀酒酵母菌林FYC2-6A(M^7Vz、^/^Z(B、/ew2ZL,Zi/s^l2W)中。通過在酵母中的體內(nèi)同源重組來產(chǎn)生含有I-Crel突變體的完整編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒。b)突變體-靶標(biāo)酵母菌林、篩選和測序使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，用卡那霉素抗性載體(pCLS1107)中切割HprCH3.4靶標(biāo)的突變體來轉(zhuǎn)化在酵母報告載體(pCLS1055，圖16)中含有HprCH3靶標(biāo)的酵母菌林FYBL2-7B(MATa，ura3A851，trplA63，leu2Al，lys2A202)。使用突變體-耙標(biāo)酵母作為用于如實施例6所述接合測定的靶標(biāo)菌林。通過如實施例4所述的測序(MILLEGEN)來驗證陽性所得克隆。B)結(jié)果將切割HprCH3.3序列的4個突變體(I-CreI32D、33T，I-Crel32T、33T,I-Crel33H和I-Crel33Q，根據(jù)表IV的命名法也稱作KNDTQS/QRRDI、KNTTQS/QRRDI、KNSHQS/QRRDI和KNSQQS/QRRDI;SEQIDNO:24,45，32和35)合并，隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中。然后將1140個轉(zhuǎn)化克隆與酵母菌抹接合，所述酵母菌株含有(i)報告質(zhì)粒中的HprCH3靶標(biāo)，(ii)表達(dá)質(zhì)粒，其含有切割HprCH3.4靶標(biāo)的突變體(I-Crel33T、38Y、44K、68Y、70S、75E、77V或KNSTYS/KYSEV;SEQIDNO:56)。與該酵母菌林接合后，發(fā)現(xiàn)18個克隆有效地切割HprCH3靶標(biāo)。因此，18個陽性克隆中含有能與KNSTYS/KYSEV形成對HprCH3耙標(biāo)有強(qiáng)切割活性的異二聚體的蛋白質(zhì)。陽性的實例示于圖15中。這些異二聚體突變體的實例列于表VIII中。63表VIII:對HprCH3展示切割活性的功能性突變體組合實施例9:通過導(dǎo)致甘氨酸-19替換絲氨酸(G19S)的定點^l"變對切割HprCH3靶標(biāo)的大范圍核酸酶的精制為了驗證G19S替換提高I-Crel衍生大范圍核酸酶切割活性的能力，將該突變整合進(jìn)異二聚體HprCH3.3(KNSHQS/QRRDI/42A43L,SEQIDNO:147)/HprCH3.4(KNTHQS/RYS麗72T，SEQIDNO:148)的兩種蛋白質(zhì)的4一種中。如實施例7和8中所述，切割HprCH3靶標(biāo)的該異二聚體通過隨機(jī)誘變獲得。為了評價原始及G19S衍生突變體的切割活性，使用CHO細(xì)胞中的染色體報告系統(tǒng)(圖20)。在該系統(tǒng)中，由CMV啟動子驅(qū)動的單拷貝LacZ基因被HprCH3位點中斷，因此是非功能性的。用HprCH3.3/HprCH3.4的CHO表達(dá)質(zhì)粒和LacZ修復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系允許通過同源重組恢復(fù)功能性LacZ基因。先前已經(jīng)顯示雙鏈斷裂可誘導(dǎo)同源重組；因此修復(fù)LacZ基因的頻率指示了基因組HprCH3耙位點的切割效率。1)材料和方法a)定點i秀變?yōu)榱讼騂prCH3.3和HprCH3.4編碼序列中引入G19S替換，進(jìn)行擴(kuò)增I-Crel編碼序列5，末端(殘基1-24)或3'末端(殘基14-167)的兩次獨立重疊PCR反應(yīng)。對5，末端和3，末端而言，PCR擴(kuò)增都4吏用與栽體具有同源性的引物(CCM2For64優(yōu)化突變體HprCH3.3(SEQIDNO:75到82)I-Crel33H66C137V155R162PI-Crel9L33H1001108V154G155P161PI-Crel2Y33H麗125Al(rel33H113S136SI-Crel2133H81V861110G131R135Q151A157VI-Crel33H71R103M29A130GI-Crel33H69V82R90R120V139R158MI-Crel33H54L86D100R104M105A136S159RAZ卜3s/sou99奪SOUBS:lES:szeNOO-szls3.15'-aagcagagctototggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaalaccaaatataacaaagagttcc-3*(SEQIDNO:149)或CCMRev5,一tctgatcgattcaagtcagtgtctctctagatagcgagtcggccgccggggaggatttcttcttctogc-3，SEQIDNO:150))和對含有替換突變G19S的14-24位氨基酸的I-Crel編碼序列具有特異性的引物(G19SF5，-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3，(SEQIDNO:151)或G19SR5，-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3，(SEQIDNO:152))進(jìn)行。所得PCR產(chǎn)物彼此間具有33bp的同源性。接著使用兩個片段中每一個的等分試樣和CCM2For或CCMRev引物通過PCR來裝配片段。b)在CHO表達(dá)載體中克隆突變體將經(jīng)SacI-XbaI消化的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)質(zhì)粒pCLS1088中相應(yīng)的Sacl-Xbal位點中(圖21)，所述質(zhì)粒是含有I-CrelN75編碼序列的CHOgateway表達(dá)載體pCDNA6.2(INVITROGEN)。通過測序(MILLEGEN)來驗證HprCH3.3-G19S或HprCH3.4-G19S編碼序列對I-CrelN75編碼序列的替換。c)哺乳動物細(xì)胞中的染色體測定將帶有才艮告系統(tǒng)的CHO細(xì)胞系以每個10cm平皿2xl()S個細(xì)胞的密度接種在完全培養(yǎng)基(Kaighn，s改良F-12培養(yǎng)基(F12-K)，補(bǔ)充有2mML-谷氨酰胺、青霉素(100UI/ml)、鏈霉素(100fig/ml)、兩性霉素B(Fongizone)(0.25pg/ml)(INVITROGEN誦LIFESCIENCE)和10%FBS(SIGMA國ALDRICHCHIMIE))中。第二天，用Polyfect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。簡言之，將2pglacz修復(fù)基質(zhì)載體與多種量的大范圍核酸酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。在37°C孵育72小時后，在0.5%戊二醛中于4。C下將細(xì)胞固定10分鐘，在含0.020/。NP40的100mM磷酸鹽緩沖液中洗滌兩次，并用以下染色緩沖液染色(lOmM磷酸鹽緩沖液、1mMMgCl2、33mM鐵氰化鉀(Khexacyanoferrate(III))、33mM亞鐵氰化鉀(Khexacyanoferrate(II))、0.1%(v/v)X-Gal)。在37'C孵育過夜后，在光學(xué)顯微鏡下檢查平板，并計數(shù)LacZ陽性細(xì)胞克隆的數(shù)目。LacZ修復(fù)的頻率表述為LacZ+灶點數(shù)除以轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)(5xl05)，并通過轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行修正。2)結(jié)果在含有HprCH3靶標(biāo)的CHO細(xì)胞系中使用染色體測定來測試異二聚體的活性，所述異二聚體含有兩種原始突變體(HprCH3.3/HprCH3.4)或者與相應(yīng)原始突變體組合的兩種G19S衍生突變體之一(HprCH3.3/HprCh3.4G19S或HprCH3.3G19S/HprCh3.4)。該染色體測定已經(jīng)廣泛描述于最近的出版物中(Ar謂ld等,J.Mol.Biol.EpubMay10，2007)。簡言之，首先建立攜帶單拷貝轉(zhuǎn)基因的CHO細(xì)胞系。所述轉(zhuǎn)基因在I-Scel切割位點上游含有人EFla啟動子(圖20，步驟l)。接著，使用I-Scel大范圍核酸酶在該基因座處引發(fā)DSB誘導(dǎo)的同源重組，并插入帶有新大范圍核酸酶切割位點的5.5kb盒(圖20，步驟2)。該盒含有由CMV啟動子驅(qū)動的非功能性LacZ開放讀碼框，以及無啟動子的潮霉素標(biāo)記基因。LacZ基因本身被含有待測試大范圍核酸酶切割位點(此處為HprCH3切割位點)的50bp插入所失活。該細(xì)胞系繼而可用于使用切割HprCH3靶標(biāo)的改造I-Crel衍生物來評價DSB誘導(dǎo)的基因靶向效率(LacZ修復(fù))(圖20,步驟3)。用修復(fù)基質(zhì)和多種量的表達(dá)大范圍核酸酶的載體共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。LacZ基因修復(fù)的頻率從使用最初改造的異二聚體(HprCH3.3/HprCH3.4)時2.0xl(T3的最大值提高至使用HprCH3,3-G19S衍生突變體時1.15xl(T2的最大值和和使用HprCH3.4-G19S衍生突變體時1.2乂10-2的最大值(圖22)。這些發(fā)現(xiàn)證實，當(dāng)僅在其單體之一中存在時，G19S突變本身就能夠提高異二聚體的活性。單個G19S替換顯示可以提高完全不同的異二聚體切割其他靶標(biāo)的活性。因此，所述G19S突變的作用類似于"便攜式"基序，其自身或與其他突變組合能夠提高不同I-Crel衍生物的活性。然而，當(dāng)HprCH3.3G19S/HprCH3.4G19S異二聚體與修復(fù)基質(zhì)一起轉(zhuǎn)化時，沒有檢測到LacZ+灶點，顯示了低于6.0><10-6的重組頻率。這些發(fā)現(xiàn)表明單個G19S替換提高了活性，而異二聚體的每個單體中均有G19S替換則導(dǎo)致活性非常強(qiáng)的降低。權(quán)利要求1.I-CreI變體或單鏈衍生物用于在HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性修飾的非治療目的用途，其中所述I-CreI變體或單鏈衍生物在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的位于I-CreI中26到40位以及44到77位的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域之一中含有至少一個替換，并且能夠切割選自序列SEQIDNO1到14的DNA靶序列。2.根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述HPRT基因是非人哺乳動物HPRT基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述HPRT基因是倉鼠(CW&cm/ms平)HPRT基因。4.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述HPRT基因是小鼠(AfMs附w,/ws)HPRT基因。5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述I-CreI變體切割序列6、7、8、9、10、11、12或14的DNA乾標(biāo)。6.根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述HPRT基因是人(^挑oHPRT基因。7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述I-CreI變體切割序列6、8、9、12或14的DNA乾標(biāo)。8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項的用途，其中所述I-CreI變體或單鏈衍生物與包含待引入序列的靶向DNA構(gòu)建體相組合，所述待引入序列的側(cè)翼是與所述I-Crel變體或單鏈衍生物的基因組DNA切割位點周圍的HPRT基因區(qū)共有同源性的序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述待引入序列包含目的基因。10.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述待引入序列包含HPRT基因的失活盒。11.根據(jù)權(quán)利要求8到10中任一項的用途，其中所述耙向DNA構(gòu)建體被插入載體中。12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項的用途，其中所述I-CreI變體或單鏈衍生物由多核苷酸片段編碼。13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述片段被插入表達(dá)載體中。14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述載體包含兩個不同的多核苷酸片段，每個片段編碼異二聚體I-CreI變體的單體之一。15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的用途，其中所述栽體包括如權(quán)利要求8到10中任一項中所定義的靶向DNA構(gòu)建體。16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一項的用途，其中HPRT基因的所述位點特異性修飾是通過以所述I-CreI變體切割HPRT基因并與如權(quán)利要求9中所定義的靶向DNA構(gòu)建體進(jìn)行同源重組而插入目的基因。17.根據(jù)權(quán)利要求l到15中任一項的用途，其中HPRT基因的所述位點特異性修飾是通過以所述I-CreI變體切割HPRT基因并與如權(quán)利要求10中所定義的靶向DNA構(gòu)建體進(jìn)行同源重組而插入失活盒。18.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項的用途，其中HPRT基因的所述位點特異性修飾是通過以所述I-CreI變體切割HPRT基因并通過非同源末端接合修復(fù)雙鏈斷裂而失活所述HPRT基因。19.根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一項的用途，其用于產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物或重《且細(xì)胞系。20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其用于產(chǎn)生重組人細(xì)胞系。21.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任一項的用途，其中所述I-CreI變體可通過至少包^"下述步驟的方法獲得(a)構(gòu)建第一系列I-Crel變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域中含有至少一個替換，所述第一功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-CreI的26到40位，(b)構(gòu)建第二系列I-Crel變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個替換，所述第二功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-Crel的44到77位，(c)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為選自cag、att、cct、ttg、gac、atg、ttt、ttc、tgg、gtc、aag、gag的核苷酸三聯(lián)體，且(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點-10到-8位4換的所述核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列(即分另'J為ctg、aat、agg、caa、gtc、cat、aaa、gaa、cca、gac、ctt和etc)，(d)從來自步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已,皮替換為選自gac、taa、tca、gtg、gct、tgt、tgg、ctg、ttg、tag和gag的核苷酸三聯(lián)體，且(ii)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點-5到-3位替換的所述核苦酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列(^卩分另'J為gtc、tta、tga、cac、agc、aca、cca、cag、caa、cta和etc)，(e)從來自步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為選自cat、cga、tat、ggg、tac、taa、cag、gca、aca、gaa、tga、atg的核香酸三聯(lián)體，且(ii)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-Crel位點+8到+10位替換的所述核苷酸三聯(lián)體的反向互4卜序列(即分別為atg、tcg、ata、ccc、gta、tta、ctg、tgc、tgt、ttc、tea和cat)，(f)從來自步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變體I-Crel位點的變體，所述突變體位點中(i)I-Crel位點+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為選自tcc、tat、gtg、gaa、tgg、tac、ttt、aca、agc、gcg、tcc、act、caa和aag的核普酸三聯(lián)體，且(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為所述I-CreI位點+3到+5位替換的反向互補(bǔ)序列(即分另'J是gga、ata、cac、ttc、cca、gta、aaa、tgt、gct、cgc、gga、agt、ttg和ctt),(gi)從步驟(c)到(f)中選擇和/或篩選能夠切割序列SEQIDNO:1到14的DNA耙標(biāo)的變體。22.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任一項的用途，其中所述I-CreI變體可通過至少包括權(quán)利要求13所定義的步驟(a)到(f)及以下其他步驟的方法獲得(g2)將在(c)到(f)的任何步驟中獲得的不同變體彼此組合或與I-Crel組合，以形成異二聚體，和(h2)選擇和/或篩選來自步驟(g2)的能夠切割序列SEQIDNO:1到14的所述DNA耙標(biāo)的異二聚體。23.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任一項的用途，其中所述I-Crel變體可通過至少包括權(quán)利要求21所定義的步驟(a)到(f)及以下其他步驟的方法獲得(g3)將來自步驟(c)和步驟(d)的兩個變體中26到40位及44到77位中的突變在單個變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-Crel變體，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靼標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA乾標(biāo)中-10到-8位的核普酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靶標(biāo)中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體相同，(iv)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA靶標(biāo)中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，和/或，(h3)將來自步驟(e)和步驟(f)的兩個變體中26到40位及44到77位中的突變在單個變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-Crel變體，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA把標(biāo)中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)-5到-3位的核香酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA耙標(biāo)中+3到+5位的核普酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)該I-Crel位點中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被替換為存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA乾標(biāo)中+8到+10位的核普酸三聯(lián)體，和(iv)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于序列SEQIDNO:1到14的所述DNA耙標(biāo)中+8到+10位的核普酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，和(13)選擇和/或篩選來自步驟(g3)或(h3)的能夠切割序列SEQIDNO:1到14的DNA乾標(biāo)的變體。24.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任一項的用途，其中所述I-CreI變體可通過至少包括權(quán)利要求20中所定義的步驟(a)到(f)、如權(quán)利要求23中所定義的步驟(g3)和/或步驟(h3)及以下其他步驟的方法獲得(14)將步驟(g3)中獲得的變體與步驟(h3)中獲得的變體、I-Crel或者步驟(e)或步驟(f)中獲得的變體相組合，以形成異二聚體，或(i，4)將步驟(h3)中獲得的變體與I-Crel或者步驟(c)或步驟(d)中獲得的變體相組合，以形成異二聚體，和(J4)選擇和/或篩選來自步驟O0或(i，4)的能夠切割序列SEQIDNO:1到14的DNA乾標(biāo)的異二聚體。25.根據(jù)權(quán)利要求1、21到24中任一項的用途，其中位于I-CreI44到77位的亞結(jié)構(gòu)域中的所述替換位于44、68、70、75和/或77位。26.根據(jù)權(quán)利要求1、21到24中任一項的用途，其中位于I-CreI26到40位的亞結(jié)構(gòu)域中的所述替換位于26、28、30、32、33、38和/或40位。27.根據(jù)權(quán)利要求l、21到26中任一項的用途，其中所述I-CreI變體包含I-Crel中的一個或更多個額外替換。28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述替換位于I-CreI的以下位置處2、9、19、42、43、54、66、69、72、81、82、86、90、92、96、100、103、104、105、107、108、109、110、113、120、125、129、130、131、132、135、136、137、140、143、151、154、155、157、158、159、161或162位。29.根據(jù)權(quán)利要求1、21到28中任一項的用途，其中所述替換是用選自A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、W、L、V、M和I的氨基酸替換原始氨基酸。30.才艮據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29的用途，其中所述替換是G19S或G19A突變。31.根據(jù)權(quán)利要求1到30中任一項的用途，其中所述I-CreI變體是異二聚體，所述異二聚體由在I-Crel26到40位和/或44到77位含有不同突變的第一單體和第二單體組合而成。32.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中至少一個單體含有至少兩個替換，位于I-Crel26到40位和44到77位的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域中各有一個。33.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述異二聚體由選自以下序列對的第一單體和第二單體組成SEQIDNO:83與97，SEQIDNO:84與98,SEQIDNO:85與99,SEQIDNO:32與52，SEQIDNO:32與53，SEQIDNO:32與54,SEQIDNO:32與55,SEQIDNO:32與56,SEQIDNO:32與57,SEQIDNO:32與58,SEQIDNO:32與60，SEQIDNO:32與65,SEQIDNO:32與66,SEQIDNO:32與67，SEQIDNO:32與68，SEQIDNO:32與69，SEQIDNO:32與70,SEQIDNO:32與71，SEQIDNO:32與72,SEQIDNO:32與73，SEQIDNO:32與74,SEQIDNO:75與56，SEQIDNO:76與56，SEQIDNO:77與56，SEQIDNO:78與56，SEQIDNO:79與56，SEQIDNO:80與56，SEQIDNO:81與56，SEQIDNO:82與56，SEQIDNO:86與96，SEQIDNO:87與100，SEQIDNO:88與101,SEQIDNO:89與102，SEQIDNO:90與103，SEQIDNO:91與104,SEQIDNO:92與105，SEQIDNO:93與106，SEQIDNO:94與107，SEQIDNO:95與108，SEQIDNO:147與148。34.根據(jù)權(quán)利要求31到33中任一項的用途，其中所述異二聚體的單體之一包含G19S突變。35.如權(quán)利要求1、21到34中任一項中所述的I-Crel變體或單鏈衍生物用于制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防、改善或治療與HPRT基因中的突變相關(guān)的遺傳性疾病。36.根據(jù)權(quán)利要求35的用途，其中所述I-CreI變體或單鏈衍生物與靶向DNA構(gòu)建體結(jié)合，該耙向DNA構(gòu)建體包含修復(fù)HPRT基因中突變的序列以及位于其側(cè)翼的與所述I-Crel變體或單鏈衍生物的基因組DNA靶標(biāo)周圍的HPRT基因區(qū)共有同源性的序列，如權(quán)利要求8或11中所述。37.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中修復(fù)所述突變的所述序列是HPRT基因的正確序列。38.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中修復(fù)所述突變的所述序列包含框內(nèi)融合的基因組切割位點下游的HPRT外顯子及在3，終止轉(zhuǎn)錄的多腺苷酸化位點。39.根據(jù)權(quán)利要求36到38中任一項的用途，其中所述I-CreI變體或單鏈衍生物由包含該靶向DNA構(gòu)建體的載體編碼。40.根據(jù)權(quán)利要求35到39中任一項的用途，其中所述遺傳性疾病是自毀容貌綜合征。41.權(quán)利要求1以及21到34中任一項定義的I-Crel變體。42.衍生自權(quán)利要求41所述I-CreI變體的單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶。43.多核苷酸片段，其編碼根據(jù)權(quán)利要求41的變體或根據(jù)權(quán)利要求42的單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶。44.表達(dá)載體，其包含至少一個根據(jù)權(quán)利要求43的多核苷酸片段。45.根據(jù)權(quán)利要求44的表達(dá)載體，其包含兩個不同的多核苷酸片段，其中每個多核苷酸片段編碼權(quán)利要求14以及30到34中任一項所定義的異二聚體變體的單體之一。46.根據(jù)權(quán)利要求44或權(quán)利要求45的表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求8到10以及36到38中任一項所定義的耙向DNA構(gòu)建體。47.栽體，其包含權(quán)利要求8到10以及36到38中任一項所定義的耙向DNA構(gòu)建體。48.以根據(jù)權(quán)利要求41的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求44到47中任一項的載體進(jìn)行了修飾的宿主細(xì)胞。49.包含權(quán)利要求41到43中任一項中所定義的一種或兩種多核苷酸片段的非人轉(zhuǎn)基因動物。50.包含權(quán)利要求41到43中任一項中所定義的一種或兩種多核苷酸片段的轉(zhuǎn)基因植物。51.組合物，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1以及21到32中任一項所定義的I-Crel變體或根據(jù)權(quán)利要求39的單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶，和/或至少一種根據(jù)權(quán)利要求42到44中任一項的表達(dá)載體。52.含有根據(jù)權(quán)利要求1以及21到32中任一項所定義的至少一種I-Crel變體、至少一種根據(jù)權(quán)利要求39的單鏈嵌合內(nèi)切核酸酶或至少一種根據(jù)權(quán)利要求42到44中任一項的表達(dá)載體和權(quán)利要求34到36中任一項所定義的至少一種載體的產(chǎn)品，其作為組合制劑用于在與HPRT基因突變相關(guān)的遺傳性疾病的預(yù)防或治療中同時、分別或依次使用。全文摘要本發(fā)明涉及一種I-CreI變體或單鏈衍生物，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的位于I-CreI中26到40位以及44到77位的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域之一中含有至少一個替換，并且所述I-CreI變體或單鏈衍生物能夠切割來自HPRT基因的具有核苷酸序列SEQIDNO1到14的DNA靶序列。本發(fā)明還涉及所述變體為治療目的(自毀容貌綜合征的基因治療)或非治療目的(改造轉(zhuǎn)基因動物和重組細(xì)胞系)用于在HPRT基因中誘導(dǎo)位點特異性修飾的用途。文檔編號C12N9/22GK101583711SQ200780045983公開日2009年11月18日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日發(fā)明者朱莉安娜·史密斯,艾格尼絲·古布勒,西爾韋斯特·格里佐申請人:賽萊克蒂斯公司