專利名稱：：地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用。技術(shù)背景纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等植物纖維類物質(zhì)，普遍存在于植物當(dāng)中，由于它們本身的特性，如果作為飼料，其被吸收利用的比率非常低，因此常被當(dāng)作垃圾而遭廢棄。僅拿一年生禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩诪槔?，該作物的生命力非常頑強，除極端沙土和黏土外，均可栽培。調(diào)査表明，每生產(chǎn)100公斤的玉米，會產(chǎn)生17.5公斤的玉米耳(玉米包皮)及玉米須，100公斤的玉米稈和41公斤的玉米芯。計算可知，玉米稈和玉米芯等副產(chǎn)品的總量為主產(chǎn)量的158.5%，是相當(dāng)驚人的一個數(shù)字。但一般情況下，由于玉米稈和玉米芯的成分很難被利用，因此它們往往被當(dāng)作了廢棄物，其價值僅為主產(chǎn)物的3.4%。目前，由于玉米與黃豆等糧食產(chǎn)品的價格不斷提高，有人提出，將一些富含纖維素的植物加工副產(chǎn)品添加到動物飼料當(dāng)中。但是，其效果并不理想。因為，在飼料中直接添加富含纖維素的植物加工副產(chǎn)品，雖然詞料的成本可以得到降低，但由于動物對這些植物加工副產(chǎn)品的消化利用率較低，致使詞養(yǎng)成本并沒有得到相應(yīng)的同步降低，其直接導(dǎo)致的后果就是幼小動物育成率下降，肥育期禽畜的增肥效果較差，因此使用量受到了很大限制。當(dāng)前僅少部分用于與苜?；旌显谝黄?，制成塊，供給牛、羊、馬等牲畜食用。世界能源短缺使應(yīng)用酵母菌或其它特殊微生物將高淀粉谷物轉(zhuǎn)化成酒精等來提供能源的技術(shù)方案應(yīng)運而生，相應(yīng)的，其帶來的副產(chǎn)品怎樣加以利用也成為了刻不容緩需要解決的問題。對于盛產(chǎn)玉米、高粱、水稻、小麥、大麥、樹薯的國家來說，富含植物纖維的副產(chǎn)品非常繁多，如稻稈、玉米稈、高粱秸稈、麥稈及林業(yè)加工廠的木屑等廢棄物，其原料成本較低，且不受糧食供應(yīng)及價格影響，具有非常大的開發(fā)價值。如何提高高纖維谷物一玉米秸稈等廢棄物的利用價值將是未來的一大商機，而提高植物纖維的消化率，首先要將其轉(zhuǎn)化成寡糖或單糖。微生物是自然界分解植物纖維素的酶最大的來源，目前工業(yè)用酶生產(chǎn)所用的材料一般均來自微生物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是一株地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bac/Z/^/ZcAem/wTm's)BL54CGMCCJV2.2276。所述地衣芽包桿菌(5ac/〃ws//c/zem/wm&)BL54CGMCCW.2276為會產(chǎn)生芽胞之革蘭氏陽性桿菌。菌落大小6-8mm，菌落形狀不規(guī)則，白色。最適合生長之條件:溫度為45。C、pH6.5。該菌株為環(huán)境微生物。所述地衣芽孢桿菌(Bac/^j/Zc/zem/wm^)BL54CGMCCW2.2276,已于2007年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏號為CGMCC熗.2276。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(5flc///z//c/zem/onm;s)BL54可發(fā)酵產(chǎn)生高效力之纖維素水解酶、蛋白酶、淀粉酶，在小型的發(fā)酵試驗中已收取良好成效。該菌株產(chǎn)生的纖維素水解酶具有在高溫下穩(wěn)定的特性，符合目前工業(yè)生產(chǎn)的使用條件。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(5a"7/MW/c/2em/w7m;s)BL54可利用含纖維素的工農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，如植物秸稈、葉片、其它農(nóng)業(yè)廢棄組織、酒糟等，將這些原料其中的纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖，可大大提高廢棄物的利用價值。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(50"7/^/^/^"^0^^)BL54由于可產(chǎn)生纖維素水解酶、蛋白酶、淀粉酶，因此也可以利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)纖維素水解酶、蛋白酶、淀粉酶，在工業(yè)生產(chǎn)上具有很高的價值。圖1為地衣芽孢桿菌(SacZ/Zz^/Zc/ze^/wTm;)BL54各個溫度培養(yǎng)18小時后的OD590值圖2為地衣芽孢桿菌(5ac/〃w//c/^m/wm^)BL54各個pH值培養(yǎng)18小時后的OD590值圖3為地衣芽孢桿菌(Sac/〃w/Zc/2em/om^)BL54發(fā)酵液的不同pH值的羧甲基纖維素酶活性圖4為地衣芽孢桿菌(5a"7/wW/c/em:/^m&)BL54的纖維素分解酶活性菌落檢測結(jié)果照片圖5為地衣芽孢桿菌(Sflc/Z/^/fc/^m/om^)BL54的蛋白酶活性菌落檢測法照片圖6為地衣芽孢桿菌(Bac///^//cAem/onm'j)BL54淀粉分解酶活性菌落的培養(yǎng)基檢測結(jié)果照片具體實施方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例l、地衣芽孢桿菌(SacW/^/Zc/zem/om^)BL54CGMCCW.2276的獲得及其培養(yǎng)條件檢測1、地衣芽孢桿菌(5flc/〃^"c/zem/onm;s)BL54CGMCC的篩選與鑒定1)地衣芽孢桿菌(5ac/〃w//c/^m/wm&)BL54CGMCCJV2.2276的獲得自臺灣省臺中縣土壤樣本三處不同位置各取一克土壤，分別加入10mlTrypticaseSoyBroth(TSB培養(yǎng)液)(每升含有胰蛋白胨(Tryptose)20.0g，葡萄糖(Dextrose)1.0g，磷酸氫二鈉(DisodiumPhosphate)2.0g，硝酸鉀(PotassiumNitrate)1.0g)中震蕩混合均勻后，分別用Mandels-Reese培養(yǎng)基(每升含有蛋白胨(Peptone)1.0g，羧甲基纖維素(CMC,Carboxymethylcellulose)10.0g，(NH4)2S041.4g，Urea0.3g，K2HP042.0g，CaCl2.H200.4g，MgS04.7H200.3g，F(xiàn)eS04.7H205.0mg，MnS04.H201.6mg，ZnS04.7H201.4mg,CoCl2.7H202.0mg，將pH調(diào)至7.0，固態(tài)培養(yǎng)基則加入1.5%Agar)進(jìn)行10倍梯度稀釋至10—1()分別分裝入4支稀釋管中，將每個梯度稀釋液分別培養(yǎng)于3(TC、40°C、5(TC不同溫度培養(yǎng)24小時，進(jìn)行具有纖維酶活性菌的初步增菌篩選。再自各稀釋管取100pl至TSA(Trypticsoyagar,Difco，Sparks,U.S.A.)平板上，并以L型玻棒涂抹均勻，同樣分別置回3(TC、40°C、5(TC培養(yǎng)24小時后，再以隨機選取方式挑取單一菌落至一新的TSA上，并以三步法劃開，重復(fù)純化繼代三次以后，于4(TC平板上獲得一株具有纖維酶活性和蛋白酶活性的菌株，將其命名為BL54。2)菌種生化鑒定觀察BL54純化的菌落外觀型態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，確認(rèn)細(xì)菌染色形態(tài)。結(jié)果表明，BL54菌落外觀型態(tài)，革蘭氏染色，確認(rèn)細(xì)菌染色形態(tài)的結(jié)果如表1所示。將步驟1)篩選并純化得到的BL54菌接種于BUGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1824小時，裝1820ml滅菌的生理食鹽水至透明玻璃管，放入濁度計(Turbidimeter,Biolog,Hayward，California,U.S.A.)內(nèi)，將O.D.值調(diào)到100%,放入濁度標(biāo)準(zhǔn)管(turbiditystandardshighandlowlimits,Biolog,Hayward，California,U.S.A.),革蘭氏陽性菌范圍在35%~42%，菌量約為4.5xl0Vml。接著使用滅菌棉花棒自培養(yǎng)基上釣取菌落，再涂于玻璃管壁上，務(wù)必使O.D.值介于高值至低值(35%~42%)之間，完成后倒入干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，利用八管吸取器(8ChannelPipetman,Biolog,Hayward,California,U.S.A.)吸取菌液，注意必須將第一次吸取量放回培養(yǎng)皿，定量(150pl)放入BiologMicroPlate(Biolog，Hayward,California,U.S.A.)內(nèi)，以上之動作必須在IO分鐘內(nèi)完成，將完成之BiologMicroPlate放入培養(yǎng)箱內(nèi)，作用4、6、1624小時后，透過對95種三碳糖、胺基酸或脂肪酸的代謝性，放入BiologMicroStation機器自動判讀代謝結(jié)果，其結(jié)果如表1所示。表1、BL54與地衣芽孢桿菌(5"c/〃iw//c/ze"z/om/力MTCC429的生化性狀比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表l中，-:陰性；+:陽性；(+):弱陽性；ND:未鑒定;*資料來源ShivajiS,ChaturvediP，SureshK,ReddyGS，DuttCB,WainwrightM,NarlikarJV,BhargavaPM.Bacillusaeriussp.nov.,Bacillusaerophilussp.nov.,Bacillusstratosphericussp.nov.andBacillusaltitudinissp.nov.,isolatedfromcryogenictubesusedforcollectingairsamplesfromhighaltitudes.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(2006)，56,1465—1473。3)菌種基因型分析鑒定一依據(jù)已知細(xì)菌的16SrDNA序列保留性區(qū)域設(shè)計四個引物，正向引物27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，、53OF:5'-GTGCCAGCAGCCGCGG-3,;反向引物907R:5，國CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'、1492R:5，-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，。并分別標(biāo)定700及800nm紅外線吸收波長之染劑(IRD7oo標(biāo)定引物27F、530F，IRD,標(biāo)定907R、1492R)。PCR擴增以27F及1492R引物，測序以530F及907R引物，反應(yīng)采用Sequ汀hermExcelIIDNAsequencingKit(EpicentreTechnologies,Madison,Wisconsin,U.S.A.)及Perkin-ElmerkGeneAmp9600PCRsystem。測序條件為先92°C2分鐘后，然后92°C30秒、55°C15秒、70°C15秒共30個循環(huán)，最后4。C保存；反應(yīng)結(jié)束后于各微量離心管分別加入3|ilStopsolution,置于92。C加熱3分鐘，測序產(chǎn)物以5.5%KBplusgel(LI-COR，Inc.,Lincoln,Nebraska,U.S.A.)及LI-COR測序系統(tǒng)(LI-COR,Inc.，Lincoln,Nebraska,U.S.A.)進(jìn)行分析。利用BaseImageIR(LI-COR,Inc.,Lincoln,Nebraska,U.S.A.)軟件擷取電泳之序列，將數(shù)據(jù)送入GeneBase(AppliedMaths,Bdgium)進(jìn)行排列，構(gòu)筑得到BL54菌株16SrDNA序列，該16SrDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，將BL54菌株完整16SrDNA序列與GenBank進(jìn)行菌種比對，比對結(jié)果與地衣芽孢桿菌(5flcz'〃wW/c/7em/onm:)ATCC14580(GENBANK號為CP000002.3)有99.8%相似性，將序列比對的結(jié)果結(jié)合上述形態(tài)和生理生化特征，表明BL54菌株屬于地衣芽包桿菌(5ac/〃z^/Zc/zemybnmj)，艮卩土也衣芽包桿菌(5"c/〃ms//c/zem》rm^)BL54。地衣芽孢桿菌(5ac/〃^//c/^"i/bm^)BL54，已于2007年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏號為CGMCCW.2276。2、地衣芽包桿菌(5^/〃^//(:/^"^^^)BL54CGMCCW2.2276的最適生長溫aaaaccgcatecgtcaaggacateateaaagagageggcggaaaaLysThrAlaSerValLysLysAsplielieLysGluSerGlyGlyLys-55-50-45192gtggacValAsp-40aagLyscagGintttagaPheArg-35atelieatelieaacgcgAsnAlagcaAla-30LysgcgAlaaagLysetaLeugacAsp-25240aaagaaLysGlugcgAlacttLeuaaglys-20gaaGlugtcValLysaatgatAsnAsp-15ccgProgatAspgtcValgetAlatatTyr-10gtgVal288gaagagGluGluAspcatHisgtgValgccAlacatHisgccAla-1ttgLeu1gcgAlacaaGinaccThrgttValcctProt3CTyrggcGly336gttcctValPro10etcLeuattlieaaaLysgcgAlagacAsp15aaaLysgtgValcagGingetAlaGin20ggcGlytttPheaagLysggaGly384gcgaatAlaAsn25gtaValaaaLysgtaValgccAla30gtcValctgLeugatAspacaThrggaGly35ateliecaaGingetAlatctSercatHis40432CCgg3CProAspttgLeuaacAsngtaVal45gtcValggcGlyggaGlygcaAlaageSer50tttPhegtgValgetAlaggcGlygaaGlu55getAla480tataacTyrAsnaccThrgacAsp60ggcGlyaacAsnggaGlycacHisggcGly65acaThrC￡ltHisgttValgccAlaggtGly70acaThrgtaVal528getgcgAlaAlacttgacLeuAsp75aatAsnacaThracgThrggtGly80gtaValttaLeuggcGlygttValgcgAla85ccaProageSergtaVal576tecttgSerLeu90tacgcgTyrAlagttValaaaLysgtaVal95ctgLeuaatAsnteaSerageSerggaGly100ageSerggaGlyteaSertacTyr624ageggcSerGly105attgtalieValageSerggaGly110ateliegagGlutggTrpgcgAlaacaThr115acaThraacAsnggcGly3tgMetgatAsp120672原糖測定法測定糖生成量，并以葡萄糖制備標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對。纖維素酶相對活性計算，以最高活性pH6.5之活性量為100%進(jìn)行換算比較。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌(5ac/〃wW/c/^剛/om^)BL54的發(fā)酵液在pH6-8均有良好的羧甲基纖維素酶活性，但以pH6.5為最佳。2、地衣芽孢桿菌(Sac/〃wW/c/zem/om^)BL54CGMCC的纖維素分解酶活性檢測將地衣芽孢桿菌(5ac/〃w//c/zem/om^)BL54CGMCCW2.2276菌分別以穿刺針接種TSA平板中間，分別在培養(yǎng)基表面平鋪3.5ml含質(zhì)量百分含量為1%的羧甲基纖維素(CMC)和質(zhì)量百分含量為0.7%的瓊脂糖的培養(yǎng)基(用于檢測葡聚糖內(nèi)切酶活性)，將培養(yǎng)皿放在45"C隔夜(約18-24小時)培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的培養(yǎng)基表面分別加10~15ml的質(zhì)量百分濃度為0.1%剛果紅溶液。作用約1015分鐘后，倒去多余的溶液，以1015ml之lMNaCl沖洗兩次。在紅色背景中，有葡聚糖內(nèi)切酶活性(即培養(yǎng)基中的纖維素被降解)的菌落周圍會呈現(xiàn)白色或粉紅色。上述實驗重復(fù)三次。結(jié)果表明在含有鋪入含質(zhì)量百分含量為1%的羧甲基纖維素和質(zhì)量百分含量為0.7%的瓊脂糖的培養(yǎng)基的平板的菌落周圍呈現(xiàn)淡粉紅(結(jié)果如圖4所示)，結(jié)果表明地衣芽孢桿菌(Sa"'//z//c/zem/w7m's)BL54對羧甲基纖維素具有水解作用，即具有內(nèi)切型纖維素分解酶。3、地衣芽孢桿菌(Sflc/〃wW/cAem/w7M/s)BL54CGMCC的蛋白水解酶活性檢測蛋白水解酶活性檢測采用蛋白水解的菌落檢測法，以含脫脂乳(skinmilk)基質(zhì)的培養(yǎng)基，檢測菌種蛋白酶(proteinase)活性，具體方法如下所述配置含質(zhì)量百分含量為1.5%脫脂乳(基質(zhì))和質(zhì)量百分含量為1%的瓊脂粉的培養(yǎng)基，倒在培養(yǎng)皿中，制成平板。將20nl地衣芽孢桿菌(5ac/〃w//c/zem/w7m;s)BL54CGMCC菌液接種在上述制備的平板中間，并將培養(yǎng)皿放在45。C做隔夜(約18-24小時)培養(yǎng)。在平板乳白色背景中，有酶活性的菌落周圍會呈現(xiàn)透明的水解圈，透過比對透明水解圈的大小，可知其活性差異。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，在上述菌落檢測法中則可發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌(Jflc/〃w//c/zem/om^)BL54CGMCC蛋白酶活性很強，隔夜培養(yǎng)即可水解1/2以上含脫脂乳基質(zhì)的培養(yǎng)基(圖5)。圖5中，透明處為酶水解圈。4、地衣芽孢桿菌(5acz7/wW/c/zem/om^)BL54CGMCCWs.2276的淀粉酶活性檢測將地衣芽孢桿菌(5ac/〃w//c/zem/onm's)BL54CGMCCW2.2276接種到含有質(zhì)量百分含量為1%的淀粉和質(zhì)量百分含量為1%的瓊脂粉的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)隔夜后，用質(zhì)量百分濃度為1%的碘溶液進(jìn)行染色后，淀粉被染成棕黑色，如果菌落產(chǎn)生淀粉酶，菌落周圍的淀粉即被降解，而不能被染色。結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明地衣芽孢桿菌(Sac/〃w//c/^m/wm&)BL54CGMCCW.2276接種到含有淀粉基質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)隔夜(約18-24小時)后，以碘溶液進(jìn)行染色后，在淀粉未分解的棕黑色背景中，可見一個淡黃透明之酶水解圈(黃色)，表明地衣芽孢桿菌(5ac/〃w//c/^m/om^)BL54CGMCCW2.2276有很強的淀粉酶活性。實施例3、地衣芽孢桿菌(5a"'〃^//c/zem/onm;s)BL54CGMCCW2.2276在利用含植物纖維的原料生產(chǎn)飼料中的應(yīng)用本實施例用地衣芽孢桿菌(Bac/〃w//c/zem/om^)BL54CGMCCJVf2.2276葵花盤粉、麥桿、綠豆桿粉、谷子桿粉、向日葵桿粉、玉米芯粉、玉米桿或酒糟為原料，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)飼料，具體方法如下所述用500ml燒杯裝原料，分別秤10g葵花盤粉、麥桿、綠豆桿粉、谷子桿粉、向日葵桿粉、玉米芯粉、玉米桿或酒糟為原料，分別向各個燒杯中加入10、fu/g原料的地衣芽孢桿菌(5ac/〃ws//c/^m/wvw;s)BL54CGMCC并加入50ml去離子水，調(diào)節(jié)pH值為6.5，混合均勻后，靜置于45t:恒溫箱，發(fā)酵24小時。將發(fā)酵后的葵花盤粉、麥桿、綠豆桿粉、谷子桿粉、向日葵桿粉、玉米芯粉、玉米桿或酒糟平鋪在不銹鋼盤上，厚度愈薄愈好，置6(TC烘箱吹風(fēng)烘干，至水分含量為8%以下。用電動粉碎機粉碎即為飼料的原料，可用于豬雞牛羊全價料中取代玉米粉(玉米淀粉)原料。發(fā)酵前后，分別按照下述方法測定原料發(fā)酵前后成分(1)粗蛋白含量的分析將樣品粉末精稱0.5克，放入分解管中，并加入15ml濃硫酸(8mol/L)及1顆催化劑(Kjeltabcatalyst)，以粗蛋白測定儀(B-435,Biichi,Switzerland)加熱消化分解2小時，至溶液澄清為止。冷卻后，加入50ml蒸餾水，以粗蛋白蒸餾裝置(B-316,Biichi,Switzerland)蒸餾消化液，并以50ml的質(zhì)量百分濃度為4%硼酸溶液加入2滴混合指示劑(methylred:methylblue=3:2)做為接收液，蒸餾時間為5分鐘，再以0.1mol/LHC1溶液滴定接收液，當(dāng)顏色由翠綠色變?yōu)榈奂t色時即為滴定終點。紀(jì)錄HC1溶液滴定量，并以下面公式計算粗蛋白含量(％)。實驗重復(fù)性每個試樣取兩平行樣進(jìn)行測定，以其算術(shù)平均值為結(jié)果；當(dāng)粗蛋白質(zhì)質(zhì)量含量在25%以上，允許相對偏差為1%;當(dāng)粗蛋白質(zhì)質(zhì)量含量在10-25%，允許相對偏差為2%;當(dāng)粗蛋白質(zhì)質(zhì)量含量在10%以下，允許相對偏差為3%。(a—b)x6.25x0.0014x(HC1標(biāo)定濃度/0.1)粗蛋白含量(％)=-x100(式I)樣品重式I中，a:以0.1mol/LHCl溶液滴定樣品所用的毫升數(shù)；b:以0.1mol/LHCl滴定空白所用的毫升數(shù)；6.25:含氮系數(shù)；0.0014:lml0.1mol/LHCl溶液相當(dāng)于0.0014g的氮量；HC1標(biāo)定濃度/0.1:0.1mol/LHCl溶液的力價。(2)粗脂肪含量的分析將樣品粉末精稱l克，包裹入已恒重的濾紙(WhatmanNo.l)，再放入Soxhlet裝置的回流冷凝管中，以無水乙醚以回流萃取8小時后，取出濾紙，置于抽氣柜中使乙醚揮發(fā)，再以紅外線水分測定儀(IR-200,DernerInstrumentCompany,USA)快速將濾紙干燥至恒重并記錄重量，最后以下面公式計算粗脂肪含量(％)。(樣品原重一去除脂肪后樣品重)粗脂肪含量(％)=-x100樣品原重(3)水分含量測定秤取試樣約5公克置于秤量瓶內(nèi)，在105"C至11(TC干燥箱內(nèi)烘干，至恒量后秤量，其減量即為水分。水分(。/。)二(A/B)x100A二烘干減量(g)，B^試樣重量(g)或以紅外線水分測定儀(IR-200,DenverInstrumentCompany,USA)測定其水分含量，并將24小時的數(shù)據(jù)平均后，得到糞便的水分含量(％)。(4)粗纖維含量測定秤取試樣2g，以乙醚抽取后與石棉0.5g同置一燒瓶中，加200ml硫酸液(燒瓶與冷卻器直接)隨即加熱，須1分鐘內(nèi)使瓶中溶液沸騰，每隔5分鐘轉(zhuǎn)動燒瓶一次，俾瓶內(nèi)溶液能夠充分混合，并須注意瓶內(nèi)液面上，不可粘有試樣。吹入空氣以除泡沫，煮沸30分鐘后以置石棉薄層的古氏坩堝濾之，用沸水沖洗，至不含酸性為止，次用氫氧化鈉溶液200ml，將沉淀物及石棉洗回?zé)恐?，與冷卻器連接后煮沸30分鐘移開燒瓶，再用原來之古氏坩堝過濾，用沸水沖洗至不含酸性為止，再用95%酒精15ml，然后用乙醚10ml洗滌之。置古氏坩堝及其內(nèi)容于烘箱中以溫度110±2"C烘干，待冷卻后秤之。再移于燒灰爐上燒約至紅燒約20分鐘以除去碳，冷卻后再秤之，計算所損失之重量，即為粗纖維量。粗纖維(％)=(A/B)xlOOA二灰分減量(g)，B二試樣重量(g)(5)粗灰分測定秤量試樣5至10g于瓷坩堝中，于600°C溫度灼熱至恒重，所殘留之量即為粗灰分。粗灰分(％)=(A/B)xlOOA二殘留物重量(g)，B二試樣重量(g)(6)發(fā)酵后糖類生成分析測定方法以Miller,1959所開發(fā)之DNS還原糖測定法測定，并以葡萄糖制備標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對。檢測的總還原糖量為l克原料所含還原糖量，經(jīng)公式換算求得酶作用釋放的還原糖量(釋放還原糖量=實驗組(發(fā)酵后原料)還原糖量一對照組(未發(fā)酵原料)還原糖量)，并以各原料原始還原糖量作為對照，以計算其利用率和作用效力?？ūP粉、麥桿、綠豆桿粉、谷子桿粉、向日葵桿粉、玉米芯粉、玉米桿或酒糟原料主要成份，纖維含量分析結(jié)果如下表2所示表2.原料發(fā)酵前成分<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>利用步驟(6)檢測的不同原料處理后還原糖產(chǎn)生量如表3所示，表3中的還原糖增長率計算公式為(發(fā)酵后的總還原糖含量一發(fā)酵前的總還原糖含量)還原糖增長率(％)=-x100發(fā)酵前的總還原糖含量表3.不同原料經(jīng)發(fā)酵處理后得到的飼料的還原糖產(chǎn)生量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*作用效力以玉米粉原始還原糖量為100%，將原料發(fā)酵作用后總還原糖量除以玉米粉還原糖量(123mg)即得。序列表<160>1<210>1<211>412<212><213>土也衣芽f包桿菌(5ac/〃ws//c/zem》rm&)〈400〉1gtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtgcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagccccattgga認(rèn)tgggg獄ttgagtgc卿ag3gg卿gtggaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgagctgaggcgcga肌gcgtggggagcg認(rèn)aggatt卿taaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttag'gc6ictccgcctgggg3gtscggcgc肪gsctgaasctcagiccggaattattgggCgt33360cggctcaaccggggagggtc120aattccacgtgtagcggtga180ctctctggtctgtaactgac240ccctggtagtccacgccgta300tgctgcagca3603ggaattgglCgg41權(quán)利要求1、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BL54CGMCC№.2276。2、地衣芽孢桿菌(Sac/〃wW/c/zem/om^)BL54CGMCCWs.2276在降解含植物纖維素的物質(zhì)中的應(yīng)用。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述含植物纖維素的物質(zhì)為農(nóng)業(yè)廢棄植物組織和/或工業(yè)生產(chǎn)廢棄物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解含植物纖維素的物質(zhì)的方法是在含植物纖維素的物質(zhì)中接種地衣芽孢桿菌(i5ac/〃us//c/zem/om^)BL54CGMCCJVf2.2276，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度條件為30一5(TC;所述發(fā)酵培養(yǎng)的pH值為6—8。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度條件為45°C;所述發(fā)酵培養(yǎng)的pH值為6.5。7、地衣芽孢桿菌(Bac/〃^fe/zem/om&)BL54CGMCCJY2.2276在制備纖維素酶中的應(yīng)用。8、地衣芽孢桿菌(^acW/M/Zc/zem/onT^)BL54CGMCCWs.2276在制備蛋白酶中的應(yīng)用。9、地衣芽孢桿菌(5a"7/^//cte"^ww;y)BL54CGMCCWs.2276在制備淀粉酶中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一株地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用。該地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BL54CGMCC№.2276。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)BL54可利用含纖維素的工農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，如植物秸稈、葉片、其它農(nóng)業(yè)廢棄組織、酒糟等，將這些原料其中的纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖，大大提高了廢棄物的利用價值。文檔編號C12N1/20GK101215537SQ20071030853公開日2008年7月9日申請日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者干小英,萍張,徐慶霖,汪志陽,王昭閔,程景章,邱云棕申請人:北京欣博陽科技有限公司