專利名稱：一種使重組桿狀病毒獲得多角體包被的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及重組桿狀病毒的包裝及添食昆蟲幼蟲等的用途，特指在 家蠶桿狀病毒表達(dá)外源基因等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
桿狀病毒(baculovinjs)是主要以鱗翅目昆蟲為宿主的雙鏈DNA病毒。目前已記載有600
余株桿狀病毒。病毒的命名主要根據(jù)分離到桿狀病毒的宿主命名，如家蠶桿狀病毒(BmNPV)，
柞蠶桿狀病毒，茶尺蠖桿狀病毒，舞毒蛾桿狀病毒，美國白蛾桿狀病毒等。桿狀病毒的結(jié)構(gòu)
特征為病毒粒子呈桿狀，外面包被著一層蛋白質(zhì)膜，外觀有一定規(guī)則，稱為多角體
(polyhedrin)。桿狀病毒的感染過程是這樣實(shí)現(xiàn)的病毒多角體散布在環(huán)境中，粘附在植物
表面的病毒多角體通過昆蟲進(jìn)食植物進(jìn)入到蟲體的中腸部位，病毒外膜被腸液溶解，釋放出
病毒粒子，病毒粒子進(jìn)入中腸細(xì)胞進(jìn)行繁殖并形成病毒粒子進(jìn)入其他組織感染，此時的病毒
稱為出芽病毒，至感染后期，病毒粒子包被到多角體中，隨昆蟲死亡崩解釋放到環(huán)境中。研
究表明，桿狀病毒的多角體基因可以被其他基因取代，而不影響病毒粒子在細(xì)胞中的增殖。
因此，在1984年，日本前田進(jìn)等人利用家蠶桿狀病毒(又稱為家蠶核型多角體病毒)表達(dá)了
干擾素。近年來，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因已成為常見的表達(dá)方式。但目前普遍
采用的取代多角體基因的表達(dá)方法，由于病毒不能表達(dá)多角體基因，不能產(chǎn)生多角體顆粒。
因此，目前利用家蠶幼蟲作為生物反應(yīng)器，只能通過注射的方法，將病毒粒子注入家蠶幼蟲
體內(nèi)，通過病毒的感染獲得表達(dá)產(chǎn)物。但這種方式存在兩個缺點(diǎn)， 一是每頭注射需要大量的
人力，二是家蠶幼蟲體壁由于針刺被破壞后，容易造成細(xì)菌感染，影響家蠶幼蟲的生存率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組桿狀病毒的包裝方法，可以通過添食的方法接種家蠶幼蟲， 提高家蠶生物反應(yīng)器的利用效率。
本發(fā)明所述的使重組桿狀病毒獲得多角體包被的方法，其特征在于，將家蠶桿狀病毒的 多角體基因轉(zhuǎn)座到家蠶細(xì)胞的染色體上，再用重組的家蠶桿狀病毒感染這種轉(zhuǎn)座后的家蠶細(xì) 胞，隨病毒基因表達(dá)的刺激，位于家蠶細(xì)胞染色體上的多角體基因也表達(dá)，從而使重組桿狀
病毒可以被包埋到多角體中，從而使重組桿狀病毒被包埋到多角體中。
上述所說的方法，具體的操作可以是以家蠶桿狀病毒DNA為模板，通過PCR方法擴(kuò)增 家蠶多角體其因片段，序列如SEQ No. 1，將擴(kuò)增得到的多角體片段連接到昆蟲轉(zhuǎn)座質(zhì)粒 piggyBac中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座多角體基因質(zhì)粒piggyBac-poly，用重組質(zhì)粒piggyBac-poly轉(zhuǎn) 化家蠶細(xì)胞，篩選出轉(zhuǎn)座了多角體基因的家蠶細(xì)胞；再用已構(gòu)建好的重組家蠶桿狀病毒感染 上述轉(zhuǎn)座的家蠶細(xì)胞，培養(yǎng)4-5天。
上述重組桿狀病毒包裝的方法在家蠶生物反應(yīng)器中的應(yīng)用，具體是將通過上述方法獲 得的重組桿狀病毒的多角體純化后，噴灑于桑葉面，接種家蠶幼蟲，完成外源基因的表達(dá)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于使重組的家蠶桿狀病毒可以重新獲得多角體外膜，改變目前釆用針刺 接種家蠶幼蟲的方法，提高勞動效率。


圖1是經(jīng)轉(zhuǎn)座后的家蠶細(xì)胞
圖2是重組桿狀病毒在發(fā)生多角體轉(zhuǎn)座的家蠶細(xì)胞中獲得多角體外膜。在細(xì)胞中可見多 角體顆粒。
圖3是Bmpak6病毒及BmNPV-GFP病毒通過包裝后的感染率比較。
其中1表示包裝后的Bmpak6病毒，2表示Bmpak6病毒感染轉(zhuǎn)化的BmN細(xì)胞的培養(yǎng)液，3 表示B即ak6病毒感染普通BmN細(xì)胞的培養(yǎng)液；4表示包裝后的BmNPV-GFP病毒，5表示 BmNPV-GFP病毒感染轉(zhuǎn)化的BmN細(xì)胞的培養(yǎng)液，6表示BmNPV-GFP病毒感染普通BmN細(xì)胞的培 養(yǎng)液。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 常理解的含義。
下面結(jié)合具體的應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解， 這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方 法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo) 明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。 實(shí)施例一
(1)擴(kuò)增家蠶多角體基因的片段以家蠶桿狀病毒的DNA為模板，以PI:
actgaattcaccgcgcggcggtatgtaca和P2: tgcggtaccagatacaaagacgctgaaa為引物，通過PCR方法擴(kuò)土曾
多角體基因片段，序列如SEQ No. 1所示，其中啟動子為400bp,編碼區(qū)為738bp, 3端調(diào)控 區(qū)為162bp。反應(yīng)條件為94 °C 45秒，55 。C 45秒，72 。C 100秒，30個循環(huán)。
(2) 將上述方法擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)EcoR I和Kpn I酶切后，連接到相同酶切的昆蟲轉(zhuǎn) 座質(zhì)粒piggyBac中，構(gòu)成重組轉(zhuǎn)座多角體基因的質(zhì)粒piggyBac-poly。該質(zhì)?？蓞⒄瘴墨I(xiàn)(吳 雪鋒，徐漢福，劉春，夏慶友，家蠶轉(zhuǎn)基因載體pBacA3EG在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)，蠶學(xué)通 訊，2007， 27 (2) : l一4;曹廣力，薛仁宇，何澤，鄭小堅，沈下.德，貢成良.基于piggyBac 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)hGM-CSF基因家蠶的研究.蠶業(yè)科學(xué)，2006， 32 (3) : 324 — 328)
(3) 由于piggyBac-poly質(zhì)粒中含gfp基因，可以通過觀察炎光的方法判斷細(xì)胞中是否 轉(zhuǎn)入了該質(zhì)粒。
(4) 將上述構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒piggyBac-poly (DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到家蠶細(xì)胞 BmN中，通過綠色熒光篩選發(fā)生轉(zhuǎn)座的家蠶細(xì)胞(如圖1)。家蠶細(xì)胞BmN可根據(jù)參考文獻(xiàn)(吳 雪鋒，徐漢福，劉春，夏慶友，家蠶轉(zhuǎn)基因載體pBacA3EG在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá).蠶學(xué)通 訊，2007， 27 (2) : l—4;曹廣力，薛仁宇，何澤，鄭小堅，沈衛(wèi)德，貢成良.基于piggyBac 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)hGM-CSF基因家蠶的研究.蠶業(yè)科學(xué)，2006， 32 (3) :324—328)
(5) 將構(gòu)建好的重組家蠶桿狀病毒感染上述家蠶細(xì)胞，4至5天后，即可見細(xì)胞中出現(xiàn)多 角體(如圖2)。
(6) 將感染的家蠶細(xì)胞在離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心IO分鐘，收集沉淀，沉淀中含有 大量多角體。
(7) 將上述獲得的多角體以滅菌水稀釋后噴灑到桑葉表面，以之喂蠶，家蠶幼蟲即可被 感染，3至5天后收集蠶體，獲得表達(dá)產(chǎn)物。
實(shí)施例二
與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于，將Bmpak6及BmNPV-GFP病毒粒子分別按上述實(shí)施方式 中的(5)感染上述的經(jīng)轉(zhuǎn)化的BmN細(xì)胞，4天后按上述實(shí)施方式中的(6)收集病毒多角體及 作為對照的細(xì)胞培養(yǎng)液，再按上述實(shí)施方式中的(7)添食家蠶幼蟲，計算家蠶感染的百分率 (Bmpak6病毒參考文獻(xiàn)王文兵，姚斌，肖慶利，季平，汪生鵬，何家祿,吳祥甫.植酸酶基因在家 蠶一桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其酶學(xué)特性，生物工程學(xué)報，2003， 19(1) :112-115; BmNPV-GFP病毒參考文獻(xiàn)Motohashi T， Shimojima T， Fukagawa T, Maenaka K, Park FY.Efficient large—scale protein production of larvae and pupae of silkworm by So/ffib/x 恥"'nuclear polyhedrosis virus bacmid system. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 326: 564 - 569)。鑒定的結(jié)果表明，通過檢測包裝后的重組病毒BmPAK6 和BmNPV-GFP能經(jīng)口感染家蠶(圖3中的1和4)，感染率分別為40 %和30 %,而陰性對照組的止 常BmPAK6， BmNPV-GFP病毒對家蠶幾乎沒有感染能力(圖3中的3和6)。同時，BmPAK6， BmNPV-GFP 病毒感染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后的上清液也能較少量的感染家蠶(圖3中的2和5)。 SEQUENCE LISTING
〈U0〉江蘇大學(xué)
〈120〉一種使重組桿狀病毒獲得多角體包被的方法
<160>1
<210>1
<211>1300
<212>DNA
<213>家蠶核型多角體病毒 (Bom—附o". nucleopolyhedrovirus)
<400>1
accgcgcggcggtatgtscatatacta犯ctgttacattgcaaacgtggt60
ttcgtgtaccaaatgtgeiaa3CCg3tgtttgatc犯ggctctgacacatttttacaatta120
cgactccaagtgtgtgggtgaagtcatgcatcttttaatcaaatccc肌gatgtgtat犯180
cgac3兆ctctgtccgtttgctggcaactg240
caagggcctcaatcctattttgtcaaattt300
gttttttatttaaccatctc360
ctgttttcgtaacagttttgtaataaa肌aacctataaat3tgccgaattattcatacac420
CCCC3CC6ttCgggcgtactt6LCgtgt3Cg3tacaaaaacttgggctgtct480
tatca肌犯cgccaagcgcaagtcg犯catg肌ca卿ggagaagcaatg540
ggatcttct3gacaactscatggttgccgaagatcccttttt鄉(xiāng)8CCgg600
ctttttaaag犯attcgc恥tgtgaaacccagttaatcgt660
caactggagcggc肌卿gtttttgcgtgaaacttggacccgttttgttgaggacagctt720
ccccattgta肌cgaccaagaggtgat卿cgtgtacctcgtcgccaacctC犯8CCC8C780
8CgCCCC83Caggtgctacaagttcctcgctcaacacgctcttaggtggg840
cgtgccccacg犯gt^tcag肌ttgtggagccatcctacgtgggcatga900
cag犯ttagtctggctaaaa鄉(xiāng)gcggcggctgcccaatcatgaacatccacagcgagta960
caccaactcgttcgagtcgtttgtgaaccgcgtcatatgggagaacttct1020
cgtttacatcggcacagactctgccgaagaagaggai肌tcctaattgaggtttctctcgt1080
鄉(xiāng)getgtttgceiccagacgcgcctctgttcactggtccggcgtattaaaa1140
cactatacattgttattagtagcgtt卿ttctgtgcgttgttgstttac1200
agac犯ttgttgtacgtattggtggtatgt1260
t8g3gcgsa^atcaaatgattttcagcgtctttgtatctg讓
權(quán)利要求
1、一種使重組桿狀病毒獲得多角體包被的方法，其特征在于，將家蠶桿狀病毒的多角體基因轉(zhuǎn)座到家蠶細(xì)胞的染色體上，再用重組的家蠶桿狀病毒感染這種轉(zhuǎn)座后的家蠶細(xì)胞，隨病毒基因表達(dá)的刺激，位于家蠶細(xì)胞染色體上的多角體基因也表達(dá)，從而使重組桿狀病毒可以被包埋到多角體中，從而使重組桿狀病毒被包埋到多角體中。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的方法，具體的操作是以家蠶桿狀病毒DNA為模板，通過PCR 方法擴(kuò)增家蠶多角體其因片段，序列如SEQ No. 1,將擴(kuò)增得到的多角體片段連接到昆蟲轉(zhuǎn)座 質(zhì)粒piggyBac中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座多角體基因質(zhì)粒piggyBac-poly，用重組質(zhì)粒piggyBac-poly 轉(zhuǎn)化家蠶細(xì)胞，篩選出轉(zhuǎn)座了多角體基因的家蠶細(xì)胞；再用已構(gòu)建好的重組家蠶桿狀病毒感 染上述轉(zhuǎn)座的家蠶細(xì)胞，培養(yǎng)4-5天。
3、 權(quán)利耍求1重組桿狀病毒包裝的方法，在家蠶桿狀病毒表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所說的應(yīng)用，具體是將通過權(quán)利要求1方法獲得的重組桿狀病毒的 多角體純化后，噴灑T桑葉面，接種家蠶幼蟲，完成外源基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒獲得多角體，以及利用獲得的多角體添食的方法。通過將家蠶桿狀病毒的多角體基因轉(zhuǎn)座到家蠶細(xì)胞的染色體上，重組的家蠶桿狀病毒通過感染這種修飾后的家蠶細(xì)胞，隨病毒基因表達(dá)的刺激，位于家蠶細(xì)胞染色體上的多角體基因也表達(dá)，從而使重組桿狀病毒可以被包埋到多角體中，再將這種多角體噴施到桑葉上，家蠶幼蟲食下后即可感染，大大提高了工作效率。
文檔編號C12N15/09GK101205535SQ200710190910
公開日2008年6月25日 申請日期2007年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者烏慧玲, 言 吳, 王文兵, 璐 陳 申請人:江蘇大學(xué)