專利名稱：使用islet1作為標(biāo)志分離或產(chǎn)生干細(xì)胞的制作方法
本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2004年2月2日、申請(qǐng)?zhí)枮?00480008937.8(PCT/US2004/002978)、發(fā)明名稱為“使用ISLET1作為標(biāo)志分離或產(chǎn)生干細(xì)胞”。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般性地涉及體外擴(kuò)增和增殖未分化的祖細(xì)胞，更具體地，涉及含有Islet1的未分化祖細(xì)胞(undifferentiated progenitor cellscontaining Islet1)。
背景信息
先天性心臟病(Congenital heart disease)在所有出生缺陷中是最常見的(Hoffman and Kaplan，2002)。為了成功地預(yù)防先天性心臟病，或?qū)ο忍煨孕呐K病進(jìn)行治療干預(yù)，對(duì)其病原學(xué)的了解是極其重要的。為了達(dá)到這個(gè)目的，對(duì)具體的心臟細(xì)胞譜系的起源和它們之間的相互關(guān)系的理解是至關(guān)重要的。理解心臟祖先細(xì)胞(cardiac progenitors)的起源和性質(zhì)，對(duì)于開發(fā)針對(duì)先天性心臟病和成人心臟病的心臟干細(xì)胞治療來說也具有重要意義。

最近的研究工作已經(jīng)定義了心臟祖先細(xì)胞的兩個(gè)區(qū)(fields)，被稱為初級(jí)區(qū)，和次級(jí)區(qū)，或前心區(qū)(Kelly and Buckingham，2002)。據(jù)認(rèn)為，初級(jí)心區(qū)(primary heart field)形成心臟的心房和心室，而認(rèn)為次級(jí)區(qū)或前區(qū)(secondary or anterior field)形成流出道(outflow tract)。認(rèn)為次級(jí)區(qū)在早期線性心管階段(early linear heart tube stage)位于心臟的前部和背部。有關(guān)心流出道不存在于線性心管中的最初的證據(jù)，來自在小雞胚胎中所進(jìn)行的一系列體內(nèi)譜系研究，這些研究由de laCruz和同事從1977起向前推進(jìn)(de la Cruz，2000)。這些研究表明，在線性心管階段不存在流出道，但是沒有指出在后面的階段中，流出道來自何處。

最近，由三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室所作的研究指出了流出道的起源，其中，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在小雞胚胎中進(jìn)行研究，一個(gè)在小鼠胚胎中進(jìn)行研究(Kelly et al.，2001；Miaatvedt et al.，2001；Waldo et al.，2001)。這些研究結(jié)果表明，流出道中的一些細(xì)胞起源于靠近咽內(nèi)胚層(pharyngealendoderm)的臟壁中胚層(splanchnic mesoderm)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能最終評(píng)階“次級(jí)”或“前”心區(qū)的貢獻(xiàn)大小和界線。

已經(jīng)用許多不同的方式對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行了定義。然而，主要原則包括(1)自我更新，或能產(chǎn)生具有與原始的母細(xì)胞類似的特征的子細(xì)胞(daughter cells)的能力；(2)單個(gè)細(xì)胞的多譜系分化(multi-lineagedifferentiation)；和(3)受損組織的體內(nèi)功能重構(gòu)。

胚胎干(ES)細(xì)胞——最初從小鼠獲得(Evans andKaufmann，1981)，最近從非人靈長(zhǎng)類和人類胚泡獲得(Thomson，et al.，1998)——展示出所有三種特征。ES細(xì)胞是多能細(xì)胞，源自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，它可以在未分化的狀態(tài)下無限繁殖。小鼠和人ES細(xì)胞系都在培養(yǎng)中被連續(xù)保持，細(xì)胞倍增多于300次。在體外，當(dāng)ES細(xì)胞被注射入胚泡時(shí)，ES細(xì)胞分化為所有的體細(xì)胞類型，并形成具有全部三胚層的成熟子代細(xì)胞(mature progeny cells)。最終，ES細(xì)胞的所有分化的子代細(xì)胞部是功能細(xì)胞，因?yàn)橛伤谋扼w胚胎互補(bǔ)作用(tetraploid embryocomplementation)產(chǎn)生的小鼠是活的。盡管ES細(xì)胞已經(jīng)被從人類分離得到，但是它們?cè)谘芯恐械膽?yīng)用以及它們的治療潛力受到倫理考慮因素的阻礙。

盡管成體干細(xì)胞的自我更新和分化的程度低于ES中所看到的自我更新和分化的程度，多數(shù)成體干細(xì)胞也能達(dá)到上面提到的干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。研究得最透徹的成體干細(xì)胞——造血干細(xì)胞(HSC)(Weissman，2000)——進(jìn)行著體內(nèi)自我更新的細(xì)胞分裂，在單細(xì)胞水平分化成所有成熟血成分，并在機(jī)能上使得重度骨髓抑制的動(dòng)物和人的骨髓予以恢復(fù)。其他成體干細(xì)胞在更近時(shí)期才被定義，并因此，研究得不夠透徹。然而，神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)(Gage，2000)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)(Jiang，et al.，2002)和表皮干細(xì)胞(Toma，et al.，(200 1)都達(dá)到這些基本標(biāo)準(zhǔn)。其他也被稱為于細(xì)胞的細(xì)胞，如成血管細(xì)胞或內(nèi)皮干細(xì)胞(Rafii，et al.，1994)，除了它們僅分化成一種單一類型的細(xì)胞外，展示出所有必要的特點(diǎn)。

過去幾年中，發(fā)表了許多文獻(xiàn)，它們指出來自一個(gè)給定組織的細(xì)胞可以有能力分化成一個(gè)不同組織的細(xì)胞?！案杉?xì)胞可塑性(Stemcell plasticity)”是一個(gè)新的術(shù)語，其已被用來描述最近觀察資料，即在出生后的成體干細(xì)胞中，存在著比原先所期望的更大潛力。利用骨髓(BM)的大多數(shù)研究，或利用富集HSC的外周血的大多數(shù)研究，是基于性別錯(cuò)配細(xì)胞(sex-mismatched cells)或者遺傳標(biāo)記細(xì)胞的體內(nèi)移植，供體細(xì)胞(donor cells)的檢測(cè)是基于Y-染色體或標(biāo)記基因的存在。已經(jīng)有了關(guān)于使用任一標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行的、在供體細(xì)胞檢測(cè)中所涉及的陷阱的綜述(Tisdale and Dunbar，2002)。已經(jīng)描述了下述分化作用，不但分化成造血細(xì)胞，而且分化成具有骨骼肌細(xì)胞(Gussoni，et al.，1999)、心肌細(xì)胞(Orlic，et al.，2001)、內(nèi)皮細(xì)胞(Jackson，et al.，2001)、神經(jīng)外胚層細(xì)胞(Brazelton，et al.，2000)特征的細(xì)胞，和內(nèi)胚層細(xì)胞(Krause，etal.，2001)，包括肝細(xì)胞。

在這些研究的80％中，新鮮的BM細(xì)胞未經(jīng)預(yù)前體外培養(yǎng)而被移植，這樣不能確定具有可塑性的細(xì)胞是否能夠進(jìn)行自我更新的可能性。在大多數(shù)的這些研究中，未純化的細(xì)胞群或純化得到的部分同質(zhì)性的細(xì)胞被移植，因此，使得無法研究分化細(xì)胞的無性繁殖起源或具有次級(jí)組織(second tissue)特性的細(xì)胞的起源組織。最后，這些研究，依賴于表型性狀，來確定分化為與起源組織不同的細(xì)胞的分化作用，但仍不得不證明次級(jí)組織的細(xì)胞具有那個(gè)譜系的功能性狀。

因此，本領(lǐng)域需要新的且更好的方法，來體外擴(kuò)增和增殖未分化的心臟祖細(xì)胞(undifferentiated cardiac progenitor cells)。該方法包括在足以使祖細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)分離的未分化祖細(xì)胞，其中這些細(xì)胞表達(dá)Islet1。研究。
發(fā)明概述
對(duì)缺少Islet1——一種LIM同源轉(zhuǎn)換域轉(zhuǎn)錄因子——的小鼠的分析已經(jīng)顯示出心臟發(fā)育的一個(gè)新模式。Islet1敲除小鼠的心臟完全缺失流出道、右心室和大部分的心房。Islet1的表達(dá)和表達(dá)Islet1的祖先細(xì)胞的譜系追蹤表明，Islet1是未分化的心臟祖細(xì)胞群特有的標(biāo)志，其產(chǎn)生在isl 1突變體中發(fā)現(xiàn)為缺失的心臟節(jié)段。Islet1的功能是這些祖細(xì)胞形成心臟所必須的。在islet1突變體中，表達(dá)islet1的祖細(xì)胞在數(shù)量上逐漸減少，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)被下調(diào)。本文中描述的研究定義了兩個(gè)生心區(qū)(cardiogenic fields)，在它們中，一個(gè)表達(dá)并需要Islet，另一個(gè)則不是如此。這些研究的結(jié)果對(duì)于特定心臟譜系發(fā)育、心臟成環(huán)(cardiac looping)、左右不對(duì)稱性(leftright asymmetry)、心臟演變(cardiac evolution)和心臟干細(xì)胞具有啟示意義。

因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)干細(xì)胞的方法，包括測(cè)定細(xì)胞中Islet1核酸的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物。

在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離或富集干細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與對(duì)Islet1有反應(yīng)性的試劑相接觸，并將反應(yīng)陰性細(xì)胞和反應(yīng)陽性細(xì)胞分離，從而分離或富集干細(xì)胞。

在又一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生干細(xì)胞的方法，包括將表達(dá)Islet 1的未分化祖細(xì)胞與激活或增強(qiáng)該細(xì)胞中Islet1表達(dá)的試劑相接觸，以便激活和增強(qiáng)Islet 1在該細(xì)胞中的表達(dá)。

在再一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了擴(kuò)增和增殖未分化的心臟祖細(xì)胞的體外方法。該方法包括在足以使祖細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)分離得到的未分化的祖細(xì)胞，該祖細(xì)胞表達(dá)Islet1。在該方法中，祖細(xì)胞足以生長(zhǎng)的條件包括在物種特異性的心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上培養(yǎng)細(xì)胞，或者在來自心臟的纖維原細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其是Islet1陽性干細(xì)胞的富集群，相比起其他細(xì)胞類型，包括大于90％的Islet1陽性干細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是Islet 1的一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的mRNA序列(SEQID NO1)。

圖2是Islet 1(小鼠)的DNA序列，可以從GenBank獲得，編號(hào)NM_021459 XM_354773(SEQ ID NO2)。
發(fā)明詳述
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Islet1(SEQ ID NO2)是轉(zhuǎn)錄因子，是增殖著的心臟干細(xì)胞所特有的一個(gè)標(biāo)志(FIG 2)。它是至今為止唯一已知的特異性表達(dá)在生心于細(xì)胞(cardiogenic stem cells)中，而不表達(dá)在分化的心臟細(xì)胞中的基因。Islet1是生心干細(xì)胞狀態(tài)的主調(diào)節(jié)子(master regulator)。該發(fā)現(xiàn)使得能夠使用islet1表達(dá)作為手段來分離內(nèi)源性生心干細(xì)胞，或產(chǎn)生生心干細(xì)胞。Islet1也在其他祖細(xì)胞或“干細(xì)胞”群中被表達(dá)，包括胰腺、神經(jīng)嵴、主動(dòng)脈-生殖腺-中腎區(qū)域(造血祖細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞)和其他細(xì)胞類型的祖細(xì)胞或“干細(xì)胞”群。該表達(dá)——與本文中描述的關(guān)于生心干細(xì)胞的數(shù)據(jù)相一致，顯示了islet不但能標(biāo)記生心干細(xì)胞，而且也能標(biāo)記其他多能干細(xì)胞。

還不知道有其他基因，它們?cè)谧钤珉A段特異性地表達(dá)在未分化的生心性前體細(xì)胞(undifferentiated cardiogenic precursors)中。Islet1是這一細(xì)胞群的獨(dú)特鑒定者。Islet1也是這些前體細(xì)胞(precursors)幫助心臟發(fā)育所必需的。在islet1突變體中，通常源自表達(dá)islet1的祖細(xì)胞的生心譜系是不存在的。因此，Islet的獨(dú)特性在于，它在許多胚胎期不同的多能祖細(xì)胞中被表達(dá)。Islet是驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子。

利用islet1作為標(biāo)志，細(xì)胞可以從早期胚胎中被分離得到，與熒光標(biāo)記的islet1抗體雜交，并通過FACS(熒光激活細(xì)胞分選術(shù))對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分選?？商娲?，基因(例如lacZ、GFP、cre)可以被插入到內(nèi)源性islet1位點(diǎn)，并用作細(xì)胞鑒定或分選的基礎(chǔ)。生心干細(xì)胞系可以通過單獨(dú)表達(dá)islet1而建立，或通過聯(lián)合表達(dá)islet1與Nkx2.5而建立，Nkx2.5是另一種轉(zhuǎn)錄因子，其在心臟祖細(xì)胞中被表達(dá)，也在分化的心臟細(xì)胞中表達(dá)。為了使這些生心性前體進(jìn)行分化，通過遺傳學(xué)手段，或通過應(yīng)用生長(zhǎng)因子下調(diào)islet1的表達(dá)。其他干細(xì)胞系能以類似的方式被創(chuàng)作，或者單獨(dú)表達(dá)islet1，或者islet1與對(duì)不同的譜系具有特異性的其他因子一起被表達(dá)，來創(chuàng)制多能細(xì)胞，其能分化成多個(gè)譜系，或特殊的譜系，這取決于遺傳或物理環(huán)境。

大量的數(shù)據(jù)證實(shí)了這樣的結(jié)論，即islet1是分化之前的生心干細(xì)胞的標(biāo)志。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致形成這樣的想法，利用islet1作為工具，在胚胎、新生或成體階段，從各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物和從人中，分離生心干細(xì)胞?？梢垣@得islet1抗體，以檢測(cè)這些細(xì)胞群；和使用已知的技術(shù)，可以創(chuàng)作在islet1位置插入有GFP的小鼠系。也已經(jīng)確定，islet在主動(dòng)脈-生殖腺-中腎區(qū)域被表達(dá)，該區(qū)域?qū)τ诋a(chǎn)生多能造血前體和內(nèi)皮前體是至關(guān)重要的。

由本文中描述的研究，若干利用這些干細(xì)胞的治療用途由然而生。例如，本發(fā)明提供了方法，用于將不同的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化為生心干細(xì)胞，用于治療用途，例如從心臟患者分離皮膚纖維原細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為生心干細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞注射入患者。該方法可以被用于治療心臟病，包括心梗后疾病(post-infarct)、心力衰竭、缺血性心臟病。其他的應(yīng)用包括，刺激在分化心臟內(nèi)的常住生心干細(xì)胞的增殖和/或分化，以修復(fù)心臟或改善心臟功能。分離的生心干細(xì)胞可以用于治療藥物篩選，用于毒理學(xué)研究，和用于組織工程。在所有這些程序中，來自islet陽性干細(xì)胞的其他不同的細(xì)胞譜系也可以被使用，具有對(duì)相關(guān)人類疾病的用途。

本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，兩種生心區(qū)的界線與之前期望的不同。一種祖先群表達(dá)islet1并將產(chǎn)生流出道、右心室、左心室細(xì)胞亞群和大部分的心房細(xì)胞。另一祖先群則不表達(dá)islet1，且將產(chǎn)生左心室的大部分和一些心房細(xì)胞。Islet1在未分化的前體中的特異性表達(dá)，也第一次使得能夠準(zhǔn)確地觀察到islet1表達(dá)祖先群，并給予我們一個(gè)重要的手段，用于分離和表征心臟干細(xì)胞群。Islet1不但定義該干細(xì)胞群，而且也是這些細(xì)胞幫助形成心臟所必須的，這為不同的心臟區(qū)域提供了第一個(gè)的遺傳證據(jù)。

[slet1(Isl 1)敲除小鼠已被用來檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和胰腺發(fā)育的缺陷(Ahlgren et al.，1997；Pfaffet al.，1996)。isl 1純合無效的小鼠在大約ED9.5時(shí)，顯示出生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象，并在大約ED10.5時(shí)死亡。而雜合突變體存活下來，且無明顯的表型。盡管懷疑是血管畸形(Pfaff et al.，1996)，但純合突變體死亡的原因在這之前還未被陳述過。因此，查明了isl1-/-小鼠死亡的原因。

當(dāng)對(duì)ED9.0至ED9.5之間的純合無效(homozygous null)胚胎進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重異常的心臟。在總體形態(tài)學(xué)水平上，突變體心臟看上去由單個(gè)的、畸形的、未分裂的腔室組成。組織學(xué)分析確認(rèn)了該印象。作為第一次嘗試去表征突變體心臟內(nèi)的細(xì)胞之腔室同一性，使用心腔室標(biāo)記物來進(jìn)行整體原位雜交分析(whole mount in situhybridization analysis)。心室肌球蛋白輕鏈2(MLC2v)mRNA特異性地標(biāo)記心室細(xì)胞，和A/V連接細(xì)胞(Franco et al.，1999)。在這些階段，心房肌球蛋白輕鏈2(MLC2a)mRNA標(biāo)記所有心肌細(xì)胞(Kubalak et al.，1994)。與針對(duì)MLC2v和MLC2a mRNAs的探針進(jìn)行的雜交表明，單個(gè)腔室的前面部分內(nèi)的細(xì)胞具有心室同一性，而單個(gè)腔室的后面部分中的細(xì)胞則不具有心室同一性，并因此可能具有心房同一性。

許多轉(zhuǎn)錄因子區(qū)域性地表達(dá)于心臟中，一組這些轉(zhuǎn)錄因子被用于進(jìn)一步研究isl 1突變心臟內(nèi)的細(xì)胞同一性。在所研究的階段中，tbx5特異性地表達(dá)于心臟的后極中，在心房和左心室中(Bruneau et al.，1999)。在islet1突變體中，心臟的心房和心室部分都表達(dá)tbx5，這表示突變心臟的心室部分具有左心室同一性。EHand在左心室中被表達(dá)，但不在右心室中表達(dá)(Cross et al.，1995；Cserjesi et al.，1995；Thomas etal.，1998)。在isl1-/-胚胎中，EHand在整個(gè)心室組織中都被表達(dá)，這表示它具有左心室同一性，不具有右心室同一性，這與用tbx5探針獲得結(jié)果相一致。Tbx20在流出道和A/V通道中被高度表達(dá)(Carson et al.，2000；Kraus et al.，2001)。來自islet 1突變體的心臟在心室和心房的連接處表達(dá)tbx20，在它們的前端不表達(dá)tbx20，這表示無流出道。用msx2的探針獲得了與該結(jié)果一致的結(jié)果，msx2標(biāo)記在ED8.5的心臟流出道。Islet1突變心臟的前部無msx2染色。這些數(shù)據(jù)，同從先前與MLC2a和MLC2v的探針?biāo)M(jìn)行雜交獲得的結(jié)果一起，提示盡管存在左心室、AN通道和心房同一性的細(xì)胞，islet1突變體缺少流出道和右心室。

從該分析推斷出，islet1突變體缺失完整的心臟分隔。此外，突變的心臟不能成環(huán)。該結(jié)論得到掃描電子顯微鏡分析的支持。令人感興趣的是，在ED 9.0(12體節(jié)對(duì)(somite pairs))時(shí)，isl 1突變體中的心臟原基類似于在ED 8.25(5體節(jié)對(duì))時(shí)、在較早階段野生型胚胎中所見的心臟原基(Kaufman，1999)，這表示出心臟發(fā)育的中斷。在ED 9.5(22體節(jié)對(duì))，野生型同胎仔(littermates)與它們的突變對(duì)等物的比較顯示，在突變子中不存在流出道和右心室，這與標(biāo)記物分析一致。

isl 1-/-小鼠嚴(yán)重的心臟表型使得人們?nèi)パ芯啃∈笮呐K發(fā)育的早期的isl1表達(dá)。利用isl1和MLC2a mRNAs的探針對(duì)ED7.25至ED8.75的胚胎進(jìn)行單和雙整體原位雜交。后者是分化的生心性前體最早的標(biāo)志物之一。該整體原位雜交及隨后的切片分析(section analysis)表明，islet1決不與MLC2a共表達(dá)，相反，在緊靠的細(xì)胞群處被表達(dá)。在早期生心新月階段(cardiogenic crescent stages)，islet1表達(dá)細(xì)胞是在MLC2a表達(dá)細(xì)胞的中部和背部。隨著心管形成時(shí)，內(nèi)臟間質(zhì)中的islet1陽性細(xì)胞在它們的整個(gè)延伸范圍內(nèi)，包括前面區(qū)域和后面區(qū)域，與MLC2a陽性細(xì)胞相鄰，其中內(nèi)臟間質(zhì)包括心系膜并靠近前腸內(nèi)胚層。Islet1不但在臟壁中胚層中被表達(dá)，也在腹前腸內(nèi)胚層中被表達(dá)。

盡管islet1不在分化的MLC2a陽性心肌前體中被表達(dá)，但是它在最近鑒定的心臟次級(jí)或前心區(qū)(secondary or anterior heart field)區(qū)域中，也就是咽區(qū)域的臟壁中胚層細(xì)胞中表達(dá)。最近的證據(jù)指出，小鼠心前區(qū)幫助形成流出道(Kelly and Buckingham，2002)。該發(fā)現(xiàn)——與islet1突變體中的心臟表型相一致——顯示出islet1表達(dá)細(xì)胞可能幫助形成心臟的流出道。

為了研究該問題，進(jìn)行isl 1表達(dá)細(xì)胞的譜系分析，這通過將islet-1-cre小鼠(Srinivas et al.，200 1)和Rosa26-lacZ指示小鼠(Soriano，1999)雜交來進(jìn)行。在該雜交的子代中，Cre-介導(dǎo)的切除使得lacZ基因處于普遍表達(dá)的Rosa26基因座的控制之下，使得通過針對(duì)β-半乳糖苷酶活性的染色方法從而對(duì)表達(dá)isl 1的細(xì)胞的命運(yùn)進(jìn)行跟蹤成為可能，既便是從內(nèi)源性isl 1基因座而來的轉(zhuǎn)錄已被抑制。這一分析的結(jié)果是令人吃驚的，并且表明先前表達(dá)islet1的細(xì)胞對(duì)胚胎心臟具有實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)，包括位于流出道、右心室和心房中的大部分細(xì)胞，也有助于形成左心室的特殊區(qū)域。β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞也在心內(nèi)膜內(nèi)被觀察到，和在襯里于主動(dòng)脈弓動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞中被觀察到，內(nèi)皮細(xì)胞襯著主動(dòng)脈弓動(dòng)脈(aortic arch arteries)。多數(shù)的β-半乳糖苷酶陰性心肌細(xì)胞在左心室的腹側(cè)面和左心房的前腹區(qū)域被觀察到。

觀察到，islet1-表達(dá)細(xì)胞貢獻(xiàn)了發(fā)育成為心臟的大部分細(xì)胞，該觀察結(jié)果與我們先前在isl 1純合突變體小鼠中對(duì)心臟表型所作的分析相一致，在該突變體小鼠中，整個(gè)心臟分割都缺失。缺失的結(jié)構(gòu)表明，Islet1可能對(duì)于表達(dá)islet1的生心前體的增殖、存活和/或遷移是所必需的。為了致力于解決該問題，人們嘗試去檢測(cè)isl 1突變體和同胎幼崽對(duì)照中的isl 1表達(dá)細(xì)胞。盡管isl 1基因的靶向結(jié)構(gòu)被刪除了第三外顯子，——第三外顯子包含第二LIM區(qū)域——isl 1 mRNA的5′端依然在突變體中被表達(dá)，這使得可以檢測(cè)突變體細(xì)胞中的islet1信使。然而，Islet蛋白是不能被檢測(cè)到的(Pfaff et al.，1996)。

為了追蹤突變體和野生型胚胎中的isl 1表達(dá)細(xì)胞，用isl 1mRNA的探針，對(duì)ED8.5-ED10的胚胎進(jìn)行整體原位雜交分析。這些分析的結(jié)果證明，盡管一些細(xì)胞仍然存在，但是在突變體中islet-表達(dá)細(xì)胞卻日漸減少。結(jié)合isl 1突變體的心臟表型，這些結(jié)果表明，Islet是細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞存活所必需的。

這些研究結(jié)果顯示，Islet1是生心前體增殖和存活所必需的細(xì)胞，也顯示，Islet1的下游靶物質(zhì)(downstream targets)調(diào)控該效應(yīng)。兩個(gè)生長(zhǎng)因子通道是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)，它們涉及脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育中的生心前體的生長(zhǎng)和存活(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)。許多BMPs和FGFs已被描述為表達(dá)在胚胎區(qū)域，其與islet1-表達(dá)細(xì)胞相重疊，和/或臨近islet1-表達(dá)細(xì)胞，包括BMPs 2、4、6和7，和FGFs 4、8和10(Crossley andMartin，1995；Dudley and Robertson，1997；Kelly et al.，2001；Lyons et al.，1995；Niswander and Martin，1992)。為了測(cè)定是否這些BMPs和FGFs中的任何一個(gè)是Islet1作用的靶(目標(biāo)，targets)，用這些生長(zhǎng)因子基因的探針進(jìn)行整體原位雜交。該分析的結(jié)果表明，在isl無效小鼠中，這些基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平下降。在與islet1表達(dá)重疊的區(qū)域，這些生長(zhǎng)因子中一些表達(dá)急劇下調(diào)或未被檢測(cè)到，包括BMP4、BMP7和FGF10的表達(dá)。這些基因可能是Islet的直接或間接目標(biāo)。其他BMP和FGF基因的表達(dá)依然存在，但是在與islet1表達(dá)重疊的區(qū)域，表達(dá)區(qū)域減少，這與在islet1突變體中對(duì)islet1 mRNA的觀察結(jié)果相類似。該減少能反映出表達(dá)這些生長(zhǎng)因子的細(xì)胞數(shù)量的減少。

本文中描述的數(shù)據(jù)顯示，產(chǎn)生流出道的祖先也產(chǎn)生右心室和心房中的大部分細(xì)胞，和左心室內(nèi)的細(xì)胞亞群。因此，之前描述的二級(jí)(secondary)或前心區(qū)是這些祖先群(progenitor population)的亞群，其以islet1表達(dá)為特征。Islet1功能是這些細(xì)胞成為心臟所必需的。在缺乏Islet1時(shí)，其形成的心臟缺失正常情況下由islet1表達(dá)祖先所貢獻(xiàn)的分割(segments)。區(qū)別是，將產(chǎn)生大部分的左心室細(xì)胞和心房細(xì)胞亞群的祖先不表達(dá)islet1，并且能夠產(chǎn)生心臟細(xì)胞，其具有在缺失Islet1功能下的這些標(biāo)識(shí)特征。

在islet1突變體中心臟的外觀和表征，和islet1表達(dá)的分析和islet1祖先的原基分布作圖，已經(jīng)導(dǎo)致產(chǎn)生新的心臟發(fā)育工作模式。在該模型中，在正中線的生心性中胚層的第一突出分隔(protruding segments)首先分化，不表達(dá)islet1，并將產(chǎn)生左心室和一些相鄰心房?jī)?nèi)的大部分的細(xì)胞。當(dāng)Islet1表達(dá)祖先加入“初級(jí)”心臟分割時(shí)，它們遷入進(jìn)來，同時(shí)日益增多地進(jìn)行分化并下調(diào)islet1表達(dá)，以形成右心室、流出道和心房剩余部分的大部分細(xì)胞。應(yīng)該注意到，islet1表達(dá)祖先的很大數(shù)量的子代在左心室內(nèi)、在與右心室的連接區(qū)域、在小梁內(nèi)，和沿著向內(nèi)彎曲的壁處被發(fā)現(xiàn)，微微向下延伸至左心室的背壁。

在心臟發(fā)育的最早階段，當(dāng)相鄰的間質(zhì)與正分化的心肌相鄰時(shí)，islet細(xì)胞細(xì)胞遷入貫穿心肌的整個(gè)前部-后部區(qū)域中。在后面的階段中，islet祖先通過兩個(gè)區(qū)域遷移入心臟，這兩個(gè)區(qū)域保持與背體壁(dorsalbody wall)的內(nèi)臟間質(zhì)的連接。在前部，這是主動(dòng)脈囊的區(qū)域；在后部，是心背系膜(dorsal mesocardium)。

前面利用分子標(biāo)記對(duì)人心臟發(fā)育進(jìn)行解剖學(xué)分析，表明心臟外間質(zhì)——其通過心背系膜遷移進(jìn)來，形成心房和心房-心室分隔(Lamers and Moonnan，2002)。對(duì)于初級(jí)心房七分隔(primary atrialseptem)前沿上的間質(zhì)帽(mesenchymal cap)是否起源于該心臟外中胚層，或是否從墊狀內(nèi)皮(cushion endothelium)衍生而來有爭(zhēng)論。利用islet1譜系分析，該問題現(xiàn)在可以最終解決了。此外，研究islet-衍生心肌細(xì)胞在心臟分隔中的作用將引起人們的注意。

有趣的是，注意到islet-表達(dá)祖先的子代明顯分布于與發(fā)育傳導(dǎo)系統(tǒng)的標(biāo)記相符的區(qū)域中，這表明該分布群在傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮主要作用(Rentschler et al，2002；Kondo et al，2003)。

本文中描述的數(shù)據(jù)證明，Islet1不存在時(shí)，表達(dá)islet1的生心祖先未充分地幫助形成心臟，并且數(shù)量減少，這證明Islet1是這些祖先增殖和/或存活所必需的。Islet1祖先的大部分子代不存在于isl 1-/-突變體心臟中的觀察現(xiàn)象表明，Islet1也是遷移所必需的。

當(dāng)前體分化時(shí)，Islet1表達(dá)被下調(diào)，這表明在生心前體中，Islet的功能可能是維持未分化狀態(tài)所必需的，和/或可能與分化的狀態(tài)不相容。Islet1也是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中細(xì)胞存活中所必需的，但是在分化的細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮作用(Pfaff et al.，1996)。在胰腺發(fā)育中，Islet1的功能在胰腺間質(zhì)中和在分化的islet細(xì)胞中是所必需的(Ahlgren et al.，1997)。

肌細(xì)胞分化之后的心臟生長(zhǎng)導(dǎo)致人們認(rèn)為，分化的肌細(xì)胞廣泛地增殖，導(dǎo)致心肌生長(zhǎng)。表達(dá)islet1的前體遷移入心臟，表明該遷移也能導(dǎo)致心臟的某些生長(zhǎng)。然而，在islet1突變體中，非-islet表達(dá)祖先發(fā)生分化，并進(jìn)行擴(kuò)張，這表明分化的前體的遷移和增殖在生心性生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。

islet1突變體的心臟似乎沒有經(jīng)歷成環(huán)形態(tài)形成(Loopingmorphogenesis)，是因?yàn)樾氖夜?jié)段保持在心房節(jié)段之前。該觀察資料表明，islet1表達(dá)祖先遷移入心臟與成環(huán)形成發(fā)生過程密切相關(guān)。環(huán)形成發(fā)生過程(Looping morphogenesis)可能不但是心肌生長(zhǎng)、而且是islet1-表達(dá)細(xì)胞遷入到心臟中的結(jié)果。

除了在生心中胚層被表達(dá)外，islet1也在咽內(nèi)胚層中表達(dá)，咽內(nèi)胚層是已經(jīng)被證明在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用的組織(Lough et al，)。這產(chǎn)生這樣的可能性，在生心祖先中對(duì)islet的需求可能不是細(xì)胞自主的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)將直指該問題。

本文中描述的研究證明，Islet1界定了生心區(qū)(cardiogenic fields)中的一個(gè)，并且是該一個(gè)生心區(qū)所必需的。也引起人們的興趣去了解可能類似地為其他的非islet表達(dá)區(qū)所必需的其他基因。在本文上下文中，應(yīng)該注意到Nkx2.5敲除小鼠具有突變的心臟，該突變心臟具有流出道、右心室細(xì)胞和心房細(xì)胞(Harvey et al，1999；Tanaka et al，1999)。許多左心室同一性標(biāo)記不存在，這表明不具有左心室同一性。這些觀察現(xiàn)象產(chǎn)生這樣的可能性，即Nkx2.5是由非islet表達(dá)祖先形成心臟組織所必需的。倘若islet1和kx2.5無效小鼠的表型形成鮮明對(duì)比，盡管Nkx2.5在Islet方式中明顯不是必需的，Nkx2.5也可能在islet-表達(dá)心臟區(qū)中發(fā)揮作用。產(chǎn)生islet1和Nkx2.5雙重突變的小鼠，可以用于評(píng)價(jià)這些可能性。已經(jīng)顯示，在Nkx2.5敲除的小鼠中，islet1 mRNA表達(dá)被保留(未公布觀察結(jié)果)。

如上所討論，Islet1陽性祖先(Islet1 positive progenitors)可以影響心臟成環(huán)形態(tài)形成(cardiac looping morphogenesis)。心臟成環(huán)作用的發(fā)生以左-右方向?yàn)樘卣鳎鞒龅篮陀倚氖蚁蛴页森h(huán)。左-右軸信息的微擾(Perturbation)導(dǎo)致心臟的內(nèi)臟逆位，流出道和右心室向左成環(huán)。心房異構(gòu)(Atrial isomerism)也可以產(chǎn)生。本文中描述的數(shù)據(jù)證明，流出道、右心室和大部分心房細(xì)胞衍生于islet-表達(dá)祖先細(xì)胞，這表明賦予這些前體的左-右信息將是左右心臟不對(duì)稱的關(guān)鍵的決定因素。遺傳標(biāo)記的先前研究已經(jīng)表明最初的左右軸信息保持于心房的排列中，但是在心室中被旋轉(zhuǎn)。也就是，“左”和“右”心室不是嚴(yán)格地與左和右體軸(body axis)相對(duì)應(yīng)(Campione et al.，2001；Franco et al.，2000)。我們的發(fā)現(xiàn)，即左和右心室源于不同的生心區(qū)，給予這一個(gè)觀察資料更深層次的理解。有價(jià)值的是，依據(jù)islet祖先細(xì)胞群來重新檢測(cè)心臟的左右結(jié)構(gòu)模式，以便研究涉及在細(xì)胞進(jìn)入心臟之前將左右信息賦予這些細(xì)胞的基因，以及它們相對(duì)于其原始左-右方向定位、在心臟內(nèi)的隨后定位。類似地，檢測(cè)賦予非-islet表達(dá)祖源的左右同一性，和在發(fā)育的心臟內(nèi)的左右分隔的最終定位是有價(jià)值的。

同源轉(zhuǎn)換區(qū)轉(zhuǎn)錄因子(homeodomain transcription factor)，pitx2，在左-右通道的下游，在左外側(cè)中胚層中被特異性表達(dá)，并在后期發(fā)育中保持區(qū)域劃分狀態(tài)(Capdevila et al，2000)。最近分析證明，pitx2在生心新月體(cardiogenic crescent)的區(qū)域中被不對(duì)稱地表達(dá)，并且隨后在左心房而不是在右心房中被表達(dá)，也表達(dá)在流出道、右和左心室的不同部分中(Campione et al，2001)。非常感興趣的是，去研究pitx2在islet-表達(dá)祖先中的潛在的不對(duì)稱表達(dá)，并可能使用pitx2表達(dá)作為標(biāo)志去研究islet1-表達(dá)祖先所采用的遷移途徑。在這點(diǎn)上，在ED9.5，pitx2c不對(duì)稱性地表達(dá)在鰓弓和臟壁中胚層中，其與主動(dòng)脈囊相鄰(Liu et al，2002)。Pitx2被敲除的小鼠無法存活下來，并展示出許多心臟表型，盡管心臟依然明顯向右成環(huán)(Capdevila et al，2000)。在islet1范例的上下文中，重新檢測(cè)pitx2無效表型，和左右心臟不對(duì)稱的其他組織是引人矚目的。

缺少Islet導(dǎo)致表達(dá)islet的生心前體細(xì)胞數(shù)量減少，這表明可以擾亂生長(zhǎng)因子信號(hào)(growth factor signaling)。因?yàn)镕GF和BMP信號(hào)是心臟發(fā)生所必需的(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)，我們檢測(cè)了許多BMP或FGF生長(zhǎng)因子的表達(dá)，這些生長(zhǎng)因子在表達(dá)islet1的生心祖先中或與表達(dá)islet1的生心祖先相鄰的地方被表達(dá)。本文中描述的數(shù)據(jù)證明，每一檢測(cè)的生長(zhǎng)因子選擇性地在與表達(dá)islet1的生心前體的相重疊的區(qū)域顯著被下調(diào)或減少。

[slet1突變體顯示出，在fgf8表達(dá)區(qū)域中的總體減少，但它們的表型比起具有fgf8亞效等位基因所看到的表型更嚴(yán)重。敲除fgf4或fgf8的小鼠是早期胚胎致死型的。但是fgf8是亞效等位基因的小鼠在出生時(shí)死亡，這是由于心血管缺陷的緣故，包括流出道畸形(Abu-Issa et al.，2002；Feldman et al.，1995；Frank et al.，2002；Sun et al.，1999)。在islet1突變體中，fgf8表達(dá)實(shí)質(zhì)上在islet1-表達(dá)生心前體中是不存在的。敲除fgf8的小鼠在出生時(shí)死亡，這歸因于它們的肺表型(Sekine et al.，1999)。然而，盡管明顯不如islet心臟表型嚴(yán)重，可能有未被描述過的心臟表型。

BMP4和BMP7，以高度重疊的方式，被表達(dá)islet的生心前體共表達(dá)。BMP2和BMP6以與BMP4、BMP7不同方式表達(dá)，或以彼此不相同的方式被表達(dá)，但是它們的表達(dá)也與islet1的表達(dá)相重疊。在islet1突變體中，這些生長(zhǎng)因子中的每一個(gè)的表達(dá)在與islet表達(dá)相一致的區(qū)域被大大減少或表現(xiàn)缺乏。對(duì)這些BMPs中的每個(gè)進(jìn)行了敲除，對(duì)BMP6/7進(jìn)行了雙敲除(Kim et al.，2001；Winnier et al.，1995；Zhang andBradley，1996)。這些突變體中的任何突變體都沒有重演islet突變體的心臟表型，這是由于在植入或原腸胚形成中的早期缺陷的緣故，或者，如果它們經(jīng)受得住較早缺陷而存活下來，可能是功能性豐余(functionalredundancy)的緣故。

我們的結(jié)果表明，在islet突變體中的心臟表型可能全部或部分是或者FGF或者BMP或兩者信號(hào)缺陷的緣故。要將這些可能性辨別開來，將需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，來將islet表達(dá)祖先中的這些信號(hào)通路去除。此外，islet突變體中的其他生長(zhǎng)因子通路可能受到影響。

考慮到許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明脊椎動(dòng)物心臟從咽或腸中胚層演化而來(Haun et al.，1998；Park et al.，1998；Ranganayakulu et al.，1998)，islet1在咽和前腸區(qū)域的臟壁中胚層中的表達(dá)引人矚目。先前的數(shù)據(jù)已經(jīng)證明，islet在小雞生心前體中被表達(dá)(Yuan and Schoenwolf，2000)。對(duì)于小鼠islet，存在islet的果蠅同系物，其在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育中具有作用；并且吸引人的是，它在背脈管(dorsal vessel)中被表達(dá)(Thor and Thomas，1997)。非常令人感興趣的是去檢測(cè)islet在其他物種心臟發(fā)生中的作用，來獲得對(duì)心臟進(jìn)化的更深的認(rèn)識(shí)。結(jié)果可以表明，islet-表達(dá)祖先，用進(jìn)化術(shù)語來說，是“初級(jí)的”。如果是這樣的話，它可能表明左心室是較晚的進(jìn)化發(fā)育。令人感興趣的是，在斑馬魚中——其具有單個(gè)心室——，Dhand是存在的，Dhand是高等脊椎動(dòng)物中的右心室的標(biāo)志物，然而未發(fā)現(xiàn)它的左心室中的對(duì)等物EHand的同源物ngelo，Lohr，Lee，Ticho，Breitbart，Yost，2000)。

也許，在我們對(duì)islet在心臟發(fā)生中的作用的發(fā)現(xiàn)中，最令人興奮的方面之一是利用Islet1作為生心干細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)志來進(jìn)行預(yù)測(cè)。干細(xì)胞可以定義為祖細(xì)胞，其增殖并產(chǎn)生許多不同的譜系。Islet1-表達(dá)細(xì)胞符合該定義，產(chǎn)生許多不同的心臟譜系。Islet1在分化之前的細(xì)胞中表達(dá)的獨(dú)特特性，將使得能依據(jù)islet1表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞分選。此外，Islet1在指令這些細(xì)胞增殖和/或存活中的作用表明，Islet1，與其他因子一起，可以被用于驅(qū)動(dòng)生心干細(xì)胞的狀態(tài)。

基于上面描述的這些深思熟慮以及在證據(jù)A(Exhibit A)中所闡述的——其通過參考并入本文，我們成功地鑒定到了小鼠、鼠類和人類非-肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的稀有細(xì)胞群(rare cell population)，其能夠在體外被擴(kuò)增和繁殖。這些細(xì)胞不但分化成中胚層譜系，而且分化成神經(jīng)外胚層。我們能夠顯示，能夠體外分化成至少兩個(gè)胚層的細(xì)胞能夠從嚙齒類動(dòng)物和人心臟選擇出來。Islet-1(isl 1)，是一種LIM-同源轉(zhuǎn)換區(qū)轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)識(shí)了這些未分化的祖細(xì)胞，并使該生心前體群在成體心臟中是現(xiàn)顯的。因此，這些細(xì)胞被命名為i-細(xì)胞(i-cells)。

未分化的i-細(xì)胞的培養(yǎng)，如在下面實(shí)施例1中闡述的，揭示了生心前體群只能在無分化作用下進(jìn)行培養(yǎng)，并且在種屬-特異性的心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上衰老。類似的滋養(yǎng)細(xì)胞-依賴型(feeder-dependent)培養(yǎng)條件被用于分離小鼠和人ES細(xì)胞，且此類滋養(yǎng)層被證明對(duì)于將它們維持在未分化的狀態(tài)下是至關(guān)重要的(Donovanand Gearhart，2001)。

對(duì)從心臟纖維原細(xì)胞獲得的飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基(conditioned medium)的需求表明它們提供抑制多能祖細(xì)胞的分化或促進(jìn)多能祖細(xì)胞自我更新的因子。具有這些特性的活性稱為i-細(xì)胞的分化-抑制活性(differentiation-inihibiting activity of i-cells)(DIAI)。對(duì)于鼠類ES細(xì)胞，白血病抑制因子(LIF)，其為有關(guān)白細(xì)胞介素-6的細(xì)胞因子家族的成員，可以替代對(duì)飼養(yǎng)細(xì)胞的需求(Nichols，et al.，1990)。為了抑制LIF受體信號(hào)組分的鼠類ES細(xì)胞分化激活作用，糖蛋白130(gp 130)是必要和充分的。然而，人ES細(xì)胞和心臟i-細(xì)胞似乎不需要LIF，以便用于阻斷分化作用和刺激自我更新(Thomson，et al.，1998)。

直到現(xiàn)在，還沒有建立起這樣的體外培養(yǎng)條件，其允許多能的成體干細(xì)胞擴(kuò)增和繁殖。成體HSCs或NSCs(dult HSCs or NSCs)，在體內(nèi)定義為長(zhǎng)期再生細(xì)胞(long-term repopulating cells)，不能在培養(yǎng)物中被擴(kuò)增，而不失去發(fā)育潛力(Weissman，2000)。但是最近的一個(gè)研究顯示，從骨髓得到的間質(zhì)干細(xì)胞，能夠在特定的條件下，在培養(yǎng)基中無限生長(zhǎng)(Jiang，et al.，2002)。

本發(fā)明也提供了細(xì)胞的組合物，包括富集的isl 1陽性干細(xì)胞群。相比起其他細(xì)胞類型，該組合物優(yōu)選含有大部分的或至少約90％isl 1陽性干細(xì)胞。isl 1陽性干細(xì)胞由任何心臟組織衍生而來，諸如從大鼠、小鼠或人的心臟組織。

因?yàn)槲捶只癄顟B(tài)的表型特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)i-細(xì)胞在細(xì)胞核中表達(dá)高水平的isl 1，和在胞質(zhì)中表達(dá)高水平的巢蛋白(nestin)，巢蛋白是標(biāo)志未分化NSCs的中間絲。此外，細(xì)胞顯示出低水平地表達(dá)Nkx2.5和ES細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子oct-4，Nkx2.5是果蠅鐵匠基因(tinman)的同源框脊椎動(dòng)物同系物。因此，這些標(biāo)志物可以被用于鑒定i-細(xì)胞。

Isl 1對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和胰腺發(fā)育是至關(guān)重要的(Pfafff，et al.，1996)。敲除isl1的純合胚胎在大約ED 10.5死亡，這是由單心室的未分開的心臟-腔室以及流出道血管畸形所造成的(Cai，et al.，2003)。isl 1表達(dá)細(xì)胞的譜系分析揭示這些細(xì)胞在實(shí)質(zhì)上有助于形成(substantiallycontribute)胚胎心臟，包括在流出道中的大部分細(xì)胞、右心室和兩心房(Cai，et al.，2003)。在新生兒和成體心臟中，isl 1表達(dá)的下調(diào)允許在心肌層看到生心前體。

免疫組織化學(xué)顯示，在成體心臟中的isl 1表達(dá)細(xì)胞主要位于右心室、隔膜和心房中。在未分化的前體細(xì)胞中，isl 1在核中被高水平的表達(dá)，并在i-細(xì)胞分化期間被下調(diào)。Islet表達(dá)在體外和體內(nèi)成為生心干細(xì)胞群的標(biāo)志，并看上去是這些干細(xì)胞分化和存活所必需的。

在未分化狀態(tài)下，Nkx2.5也在i-細(xì)胞中被表達(dá)。該轉(zhuǎn)錄因子是脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育最早的標(biāo)記物之一，并且對(duì)于心臟-限制性基因活性的調(diào)節(jié)是重要的。POU-域轉(zhuǎn)錄因子oct-4是多能ES細(xì)胞的分子標(biāo)記物。Oct-4在原腸形成前期胚胎、早期卵裂-期胚胎(early cleavage-stageembryo)、胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)的細(xì)胞、和胚胎癌細(xì)胞中被表達(dá)。在成體動(dòng)物中，oct-4僅在生殖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)(Rosner，et al.，1990)。

在本發(fā)明中，新型心臟祖細(xì)胞群(progenitor population)已被發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定。Isl 1表達(dá)標(biāo)記這些生心干細(xì)胞，并似乎是這些細(xì)胞分化狀態(tài)和存活所必需的。這些細(xì)胞對(duì)研究和理解心臟干細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的信號(hào)通路，為先天性和成體心臟病的未來治療應(yīng)用鋪平了道路。

神經(jīng)細(xì)胞或肌細(xì)胞中具有進(jìn)一步分化作用的i-細(xì)胞中的基因靶向(gene targeting)，使得進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究，而避免了與耗費(fèi)時(shí)間的動(dòng)物模型的復(fù)雜性相關(guān)的斗爭(zhēng)。細(xì)胞培養(yǎng)的目標(biāo)是開發(fā)明確的、并容易操作的實(shí)驗(yàn)體系，其賦予克隆均勻性的優(yōu)點(diǎn)和操縱外部環(huán)境的能力。而且，由于倫理上不能接受通過實(shí)驗(yàn)的方式改變?nèi)朔N系，ES細(xì)胞轉(zhuǎn)基因路線對(duì)于涉及人基因操作的實(shí)驗(yàn)是不可行的。在人i-細(xì)胞中進(jìn)行基因靶向，使得在嚙齒類動(dòng)物模型系統(tǒng)不能充分重演(recapitulate)人生物學(xué)或疾病過程的領(lǐng)域的重要應(yīng)用成為可能。

此外，I-細(xì)胞可以作為心臟和神經(jīng)元細(xì)胞治療的供體組織的來源予以應(yīng)用。早期的胚胎干細(xì)胞對(duì)于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療具有不利之處(i)轉(zhuǎn)化的數(shù)量和(ii)獲得特異性分化表型所需要的信號(hào)的復(fù)雜性。相反，發(fā)育中的i-細(xì)胞和來源于成體的心臟祖先細(xì)胞的表型分化避開了倫理上和免疫學(xué)上的約束。

i-細(xì)胞的交叉-譜系轉(zhuǎn)化(Cross-lineage transformation)，為獲得更為靈活的組織來源提供了一個(gè)新的途徑，特別是從病人本身獲得自體移植物。i-細(xì)胞相比起ES細(xì)胞還有一個(gè)先進(jìn)之處，在于這些前體細(xì)胞，在異種移植物中，比起初級(jí)胚胎肌細(xì)胞，具有較少的免疫原性，這就為克服來自非-人供體移植中的主要困難之一開辟了道路。

本發(fā)明方法利用分離的單克隆抗體，該抗體特征為特異性地結(jié)合Islet 1多肽并免疫沉淀Islet 1多肽。

本領(lǐng)域已知的和本文中描述的任何合適的免疫測(cè)定形式，都可以被用于檢測(cè)Islet 1-表達(dá)細(xì)胞在不同的細(xì)胞群中的存在和/或?qū)υ诓煌募?xì)胞群中的Islet 1-表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行定量。盡管可以使用任何類型的抗-Islet 1多肽抗體，如本文中描述的，其特異性結(jié)合Islet 1多肽，但是優(yōu)選的是單克隆抗體。

本發(fā)明對(duì)Islet 1多肽的免疫學(xué)測(cè)試，可以通過使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)、以高通量形式被使用，諸如FASC篩選，下面將對(duì)其進(jìn)行更加詳細(xì)地描述。

適合于結(jié)合到本發(fā)明方法所使用的抗體上的可檢測(cè)標(biāo)記物——包括高通量篩選形式方法，包括通過使用各種化學(xué)連接基團(tuán)或雙功能肽接頭連接到抗體上的放射性標(biāo)記物。末端羥基可以用無機(jī)酸進(jìn)行酯化，例如32p磷酸或14C有機(jī)酸，或者以另外方式酯化，以便為標(biāo)記物(label)提供連接基團(tuán)(linking groups)。有意用作可檢測(cè)標(biāo)記物的酶將首先是水解酶，特別地是酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素和它的衍生物，若丹明和其衍生物、丹磺酰(dansyl)、傘形酮、和諸如此類物質(zhì)。化學(xué)發(fā)光劑(Chemiluminescers)包括熒光素和2，3-二羥酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)(例如鄰苯二甲基肼)和類似物。

抗體也可以被附著到固體支持物上，其特別用于Islet 1多肽的免疫測(cè)定或免疫沉淀反應(yīng)。此種固體支持物包括，但是不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯，例如蛋白G覆蓋的微量板或珠的孔。

針對(duì)特異性表位或表位組合的抗體，這樣與Islet 1多肽特異性結(jié)合，將使得能篩選本文中描述的細(xì)胞群。通過使用此類單克隆抗體，可以利用各種篩選技術(shù)，并包括使用抗體-涂覆的磁珠的磁分離，用附著到固體基質(zhì)(即板子)上的抗體“淘洗(panning)”和流式細(xì)胞分析術(shù)(參見例如美國(guó)專利5,985,660；和Morrison et al.，Cell，96737-49(1999))。

在本發(fā)明方法中有用的抗體可以用任何本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定其免疫特異性結(jié)合特性?？梢允褂玫拿庖邷y(cè)定包括，但不限于競(jìng)爭(zhēng)性和非-競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)，使用技術(shù)諸如蛋白質(zhì)印跡、放射性免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾層”免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)(gel diffusion precipitin reactions)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定(agglutination assays)、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定(complement-fixation assays)、免疫放射量測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、蛋白A免疫測(cè)定諸如此類。此類測(cè)定是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域熟知的(參見例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，其通過參考整體并入本文)。示范性的免疫測(cè)定方法在下面被簡(jiǎn)要描述(但決不為了限制的目的)。

免疫沉淀反應(yīng)的方案一般包括在裂解緩沖液中裂解細(xì)胞群，裂解緩沖液諸如RIPA緩沖液(1％NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01 M磷酸鈉，pH 7.2，1％Trasylol)，補(bǔ)充以蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、釩酸鈉)，將感興趣的抗體加入到細(xì)胞裂解物中，在4℃下，溫育一段時(shí)間(例如1-4小時(shí))，將蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G瓊脂糖珠加入到細(xì)胞裂解物中，在4℃下溫育約1小時(shí)或更多時(shí)間，在裂解緩沖液中洗滌珠子，和將珠子重新懸浮于SDS/樣品緩沖液。例如通過蛋白質(zhì)印跡分析可以測(cè)定感興趣的抗體免疫沉淀特定抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，關(guān)于這些參數(shù)可以被修改以增加抗體與抗原的結(jié)合作用和減少背景(例如，用瓊脂糖珠預(yù)先洗滌細(xì)胞裂解物)。對(duì)于涉及免疫沉淀反應(yīng)方案的進(jìn)一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York at 10.16.1。

蛋白質(zhì)印跡分析一般包括制備蛋白質(zhì)樣品；蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠中電泳(例如，8％-20％SDS-PAGE，這取決于抗原的分子量)；將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，諸如硝酸纖維素、PVDF或尼龍；在封閉溶液(例如，含3％BSA或脫脂奶粉的PBS)中封閉膜；在洗滌緩沖液(PBS-Tween 20)中洗滌膜；用在封閉緩沖液中稀釋的初級(jí)抗體(感興趣的抗體)對(duì)膜進(jìn)行封閉；在洗滌緩沖液中洗滌膜；用在封閉緩沖液中稀釋的二級(jí)抗體(其識(shí)別初級(jí)抗體，例如抗-人抗體)對(duì)膜進(jìn)行封閉，二級(jí)抗體偶聯(lián)到酶解基質(zhì)(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或偶聯(lián)到放射活性分子(例如32P或125I)上；在洗滌緩沖液中洗滌膜；并檢測(cè)抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將對(duì)這些參數(shù)是可以知曉的，它們被修改以增加被檢測(cè)到的信號(hào)和減少背景噪音(backgroundnoise)。對(duì)于關(guān)于蛋白質(zhì)印跡分析方案的進(jìn)一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York at 10.8.1。

ELISAs包括制備抗原，用抗原包被96孔微量板的孔，將偶聯(lián)有可檢測(cè)化合物諸如酶促基質(zhì)(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)的感興趣的抗體加入到孔中，并溫育一段時(shí)間，并檢測(cè)抗原的存在。在ELISAs中，感興趣的抗體不必結(jié)合到可檢測(cè)的化合物上；相反，結(jié)合到可檢測(cè)化合物上的二級(jí)抗體(其識(shí)別感興趣的抗體)可以被加入到孔中。還有，代替用抗原包被孔，抗體可以被用來包被孔。在該情況下，在將感興趣的抗原加入到包被的孔中之后，結(jié)合到可檢測(cè)化合物上的二級(jí)抗體可以被加入。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，參數(shù)可以被修改以增加被檢測(cè)到的信號(hào)，以及也知道本領(lǐng)域已知的其他變化。對(duì)于關(guān)于ELISAs的進(jìn)一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York at 11.2.1。

通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定方法，可以測(cè)定抗體對(duì)抗原的結(jié)合親和力，以及抗體-抗原相互作用的解離率(off-rate)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的一個(gè)例子是放射性免疫測(cè)定，包括用感興趣的抗體，在增加數(shù)量的未標(biāo)記抗原的存在下，溫育標(biāo)記的抗原(例如，3H或125I)；并檢測(cè)結(jié)合到標(biāo)記的抗原上的抗體。由用斯卡查德圖分析獲得的數(shù)據(jù)，能夠測(cè)定感興趣的抗體對(duì)特異抗原的親和力，和結(jié)合解離率。與二級(jí)抗體的競(jìng)爭(zhēng)也能使用放射性免疫測(cè)定來確定。在這種情況下，在增加數(shù)量的未標(biāo)記的二級(jí)抗體的存在下，用結(jié)合到標(biāo)記的化合物(例如3H或125I)上的感興趣的抗體溫育抗原。

用于本發(fā)明測(cè)定中的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體或它們的功能活性片段。針對(duì)islet 1多肽的單-或多-克隆抗體在合適的宿主動(dòng)物中產(chǎn)生，這是通過使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)、用免疫源性偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生。

單克隆抗體的制備方法已被如Kohler and Milstein，Nature 256495-7，1975；和Harlow et al.，inAntibodiesa Laboratory Manual，page726(Cold Spring Harbor Pub.，1988)所公開，這些公開資料通過參考并入本文。簡(jiǎn)言之，單克隆抗體可以通過下述方法獲得用包含本發(fā)明免疫原性偶聯(lián)物——上面已公開了它的制備——的組合物注射小鼠或其他小型哺乳動(dòng)物，諸如兔，通過取出血清樣品確認(rèn)抗體產(chǎn)物的存在，取出脾以獲得B淋巴細(xì)胞，將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆該雜交瘤，篩選針對(duì)抗原產(chǎn)生抗體的陽性克隆，和從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。通過各種業(yè)已建立的技術(shù)，單克隆抗體可以從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化得到。此種分離技術(shù)包括利用蛋白A-瓊脂糖的親合層析，大小排阻層析和離子交換層析。參見，例如Barnes etal.，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，inMethods in Mol.Biol.，1079-104，1992)。本發(fā)明的抗體也可以來自亞人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(subhumanprimate)抗體。在狒狒中產(chǎn)生抗體的通用技術(shù)可以參見例如Goldenberget al.，國(guó)際專利公布WO91/11465(1991)和Losman et al.，Int.J.Cancer，46310-314，1990。

也能使用抗-獨(dú)特型技術(shù)(anti-idiotype technology)產(chǎn)生單克隆抗體，其模擬一個(gè)表位。例如，為第一單克隆抗體制備的抗-獨(dú)特型單克隆抗體，將在高變區(qū)具有結(jié)合區(qū)域，這是被第一單克隆抗體結(jié)合的該表位的“像(image)”。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“抗體(antibody)”包括完整的分子以及其功能片段，諸如Fab、F(ab′)2和Fv，它們能夠結(jié)合islet 1多肽，這些功能性抗體片段定義如下 (1)Fab，是包含抗體分子的單價(jià)抗原-結(jié)合片段的片段，能夠通過用酶——木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體，產(chǎn)生一個(gè)完整的輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分而制備得到； (2)Fab′，是抗體分子的片段，其通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，然后還原，產(chǎn)生完整輕鏈和部分重鏈而制備得到；每個(gè)抗體分子得到兩個(gè)Fab′片段； (3)(Fab′)2，是抗體片段，其通過用酶——胃蛋白酶處理整個(gè)抗體而制備得到，無需隨后的還原作用；F(ab′)2是兩個(gè)Fab′的二聚物，通過兩個(gè)二硫鍵固定在一起； (4)Fv，定義為遺傳工程片段，包含表達(dá)為兩條鏈的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)；和 (5)單鏈抗體(Single chain antibody，″SCA″)，是遺傳工程分子，包含輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)，通過合適的多肽接頭連接，作為遺傳融合單鏈分子。

制備這些片段的方法是本領(lǐng)域已知的。(參見如Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1988，通過參考，并入本文)。如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“表位(epitope)”指抗原上的任何抗原決定簇，抗體的互補(bǔ)位與其結(jié)合?？乖瓫Q定簇通常由分子的化學(xué)活性表面定群(grouping)諸如氨基酸或碳水化合物側(cè)鏈組成，通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異性電荷特征。

本發(fā)明的抗體片段可以通過對(duì)抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)水解作用制備，或通過在大腸桿菌中表達(dá)編碼該片段的DNA而制備得到?？贵w片段可以通過常規(guī)的方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體而獲得。例如，抗體片段可以通過用木瓜蛋白酶酶切抗體，給出稱為F(ab′)2的5S片段而生產(chǎn)得到。該片段可以進(jìn)一步使用硫醇還原劑進(jìn)行切割，和任選地，使用針對(duì)由二硫鍵切割產(chǎn)生的巰基基團(tuán)的任意封閉劑，從而產(chǎn)生3.5S Fab′單價(jià)片段。可選擇地，使用木瓜蛋白酶的酶切，直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab′片段和一個(gè)Fc片段。這些方法例如被Goldenberg，美國(guó)專利4,036,945和4,331,647，以及該專利包含的參考文獻(xiàn)所描述，這些專利通過參考整體并入本文。也參見Porter，R.R.，Biochem.J.，73119-126，1959。切割抗體的其他方法，諸如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段，對(duì)片段的進(jìn)一步切割，或其他酶促的，化學(xué)的，或遺傳技術(shù)也可以被使用，只要片段能夠結(jié)合被完整抗體所識(shí)別的抗原就可以。

Fv片段包括VH和VL鏈的締合體。該締合可以是非共價(jià)的，如Inbar et al.，Proc.Nat′lilcad.Sci.USA 692659-62，1972中所述?？蛇x擇地，該可變鏈可以通過分子間二硫鍵連接或通過化學(xué)試劑諸如戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。優(yōu)選地，這些Fv片段含有通過肽接頭連接的VH和VL鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過構(gòu)建包括編碼VH和VL區(qū)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因制各而得，其中VH和VL區(qū)域通過寡核苷酸連接起來。結(jié)構(gòu)基因被插入到表達(dá)載體，其隨后被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌。該重組宿主細(xì)胞合成單個(gè)多肽鏈，以連接肽連接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域。產(chǎn)生sFvs的方法，由下述文獻(xiàn)描述，例如Whitlow and Filpula，Methods，297-105，1991；Bird et al.，Science 242423-426，1988；Pack etal.，Bio/Technology 111271-77，1993；和Ladner等美國(guó)專利4,946,778，其通過參考整體并入本文。

抗體片段的另一種形式是編碼單個(gè)互補(bǔ)-決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽(“最小識(shí)別單位(minimal recognition units)”)可以通過構(gòu)建編碼感興趣的CDR的基因而獲得。此類基因，例如通過使用聚合酶鏈反應(yīng)，從抗體-產(chǎn)生細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)而制備得到。參見例如Larrickand Fry，Methods，2106-10，1991。

本發(fā)明方法使用單克隆抗體，該抗體以特異性結(jié)合islet 1多肽為特征，其中，Islet 1多肽保留功能活性。

產(chǎn)生單克隆抗體——其用于本發(fā)明方法來免疫捕捉Islet 1多肽——的雜交瘤細(xì)胞系可以從商業(yè)渠道獲得。

下面的實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)程序 小鼠突變體
產(chǎn)生islet無效突變體的方法已經(jīng)在前面描述(Pfaff et al，1996)。敲除構(gòu)建物剔除了編碼Islet 1第二個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域的外顯子。Islet1-cre小鼠通常由Thomas M.Jessell提供，且在之前已經(jīng)被描述過(Srinivas etal，2001)。IRES-cre盒(cassette)被插入到編碼Islet1第二個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域的外顯子中，破壞islet基因的表達(dá)。
整體RNA原位雜交分析(Whole Mount in situ Hybridization)
整體RNA原位雜交分析按照之前描述的方法進(jìn)行(Wilkinson，1999)。有關(guān)所被使用的特異性RNA探針的參考文獻(xiàn)如下MLC2a(Kubalak et al.，1994)；MLC2v(O′Brien et al.，1993)；tbx5(Bruneau et al.，1999)；tbx20(未公開的結(jié)果)；BMP2、BMP6、BMP7、BMP4、BMP5(Kim et al.，2001；Lyons et al.，1995)；FGF4、FGF8和FGF10(Feldman etal.，1995；Sun et al.，1999)；EHand(Cross et al.，1995)；islet1(EST，GenBank編號(hào)AA198791)(SEQ ID NO2)；msx2(Liu et al.，1994)。

利用異羥洋地黃毒苷配基和熒光素-標(biāo)記探針進(jìn)行雙RNA原位雜交，這些探針偶聯(lián)有堿性磷酸酶(Roche Cat.#1277073，1685619)。染色反應(yīng)采用如下物質(zhì)進(jìn)行采用CIP/鐵氰化物/氰亞鐵酸鹽，依據(jù)萬維網(wǎng)上的Janet Rossant’s實(shí)驗(yàn)室方案網(wǎng)址(mshri.on.ca/rossant/protocols/doubleINsitu)和MagentaPhos-tet Red，依據(jù)萬維網(wǎng)上的Claudio Stem′s實(shí)驗(yàn)室方案網(wǎng)址(sternlab.anat.ucl.ac.uk/INSITU)；或者，采用Fast Red(Roche Cat.No.1496549)和BCIP(堿性磷酸酶的生色底物)；單獨(dú)地。溫育和染色以檢測(cè)第一抗體(抗-熒光素-AP，Roche Cat.No.1426338)之后，胚胎在65℃溫育1小時(shí)，以使得堿性磷酸酶活性發(fā)生失活，并在溫育之前洗滌，與第二抗體溫育和染色以檢測(cè)第二抗體(抗-異羥洋地黃毒苷配基-AP，Roche Cat.No.1093274)。對(duì)于用Fast Red染色的胚胎，其中FastRed可溶于乙醇，制備冷凍切片。對(duì)于用BCIP/鐵氰化物/氰亞鐵酸鹽和MagentaPhos-tet Red染色的胚胎，制備石蠟切片，在乙醇中快速洗滌以最小化信號(hào)損失。
掃描電子顯微術(shù)
可以利用心臟掃描電子顯微術(shù)(SEM)的標(biāo)準(zhǔn)程序(Pexieder，1986)。簡(jiǎn)要地，將胚胎進(jìn)行乙醇脫水作用，和由氟利昂113至氟利昂23的臨界點(diǎn)干燥。干燥的標(biāo)本置于SEM管上，用300nm金進(jìn)行離子噴濺，并在掃描電子顯微鏡中檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)取向(orientations)和放大倍數(shù)，拍攝SEM顯微照片。
實(shí)施例2 未分化的I-細(xì)胞的培養(yǎng)
要從鼠類心臟分離心臟祖先，所使用的方法類似于那些用于從成年器官分離心肌細(xì)胞的方法。在胰蛋白酶-消化狀態(tài)，i-細(xì)胞和心臟纖維原細(xì)胞具有類似的約35μm的細(xì)胞直徑，和在Percoll梯度上以同樣的組分(fiactions)共純化。通過測(cè)試多個(gè)條件，開發(fā)得到I-細(xì)胞培養(yǎng)物，包括在纖連蛋白、膠原蛋白-型-IV或?qū)诱尺B蛋白上的培養(yǎng)物。測(cè)試的培養(yǎng)基條件包括幾個(gè)濃度的胎牛血清(FCS)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2+4、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)1、sonic hedgehoc(Shh)和地塞米松，如下所闡述。

種植有10個(gè)isl1陽性細(xì)胞的96孔板中的約5-10％產(chǎn)生持續(xù)的生長(zhǎng)培養(yǎng)物，這就表明100個(gè)i-細(xì)胞中只有約5-10個(gè)能夠引發(fā)i-細(xì)胞培養(yǎng)。幾個(gè)i-細(xì)胞群現(xiàn)在已經(jīng)培養(yǎng)超過12倍的群體倍增。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上或在由從心臟新鮮分離的纖維原細(xì)胞制成的條件培養(yǎng)基中，生心性前體群只能以無分化的或沒有細(xì)胞死亡的狀態(tài)培養(yǎng)。通過對(duì)心臟纖維原細(xì)胞去除條件培養(yǎng)基或從滋養(yǎng)層分離I-細(xì)胞，可以誘導(dǎo)I-細(xì)胞分化為肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。經(jīng)過5至10倍以上的群體倍增之后，形態(tài)和表型類似。I-細(xì)胞直徑約35μm，具有巨大的細(xì)胞核，無細(xì)胞質(zhì)，以三維球體形式生長(zhǎng)，總是附著到纖維原細(xì)胞滋養(yǎng)層。當(dāng)分離和培養(yǎng)人組織心房的i-細(xì)胞時(shí)，獲得類似的結(jié)果。
實(shí)施例3 單個(gè)I-細(xì)胞的體外公化
接下來，通過加入細(xì)胞因子，測(cè)試從小鼠和大鼠心臟獲得的i-細(xì)胞的體外分化能力，其中，細(xì)胞因子依據(jù)對(duì)ES細(xì)胞分化成神經(jīng)外胚層和中胚層已經(jīng)作出的報(bào)道而選擇。分化作用要求，i-細(xì)胞必須被重新鋪板，無滋養(yǎng)層，i-細(xì)胞以約1-2×104細(xì)胞/cm2的濃度，處于不含血清但含有譜系-特異性細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中。神經(jīng)祖先細(xì)胞(Neuroprogenitors)可以用PDGF-BB擴(kuò)增，并通過加入bFGF進(jìn)行誘導(dǎo)分化(Palmer，et al.，1999)。

在bFGF處理下，約45％的i-細(xì)胞獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和表型特征，對(duì)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元具有免疫組織化學(xué)陽性，其中神經(jīng)元被染色成對(duì)神經(jīng)絲200為陽性(NF-200)。肌細(xì)胞分化作用獲得這樣的細(xì)胞，該細(xì)胞在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(sarcomeric actin)和α-輔肌動(dòng)蛋白顯示出陽性信號(hào)。
實(shí)施例4 從小鼠心臟分離出生后心臟祖細(xì)胞的分離方案
將30至50個(gè)1天大的小鼠幼崽的心臟從胸部解剖出來，切成四片，在4℃下，不含Ca2+的HBSS(Hank′s balanced salt)溶液中洗滌3次。將心臟轉(zhuǎn)移入0.5mg/ml胰蛋白酶-HBSS溶液中，并在4℃下，在定軌搖床上預(yù)先消化過夜(～17小時(shí))。將一半的胰蛋白酶溶液從預(yù)先消化的組織去除，剩余部分用溫DMEM/M199細(xì)胞培養(yǎng)基(4∶1比率)以1∶1稀釋，所述培養(yǎng)基含有青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100mg/ml)/HEPES(25 mm)/谷氨酰胺(2mM)。

將組織在37℃下?lián)u動(dòng)3-4分鐘之后，將稀釋的胰蛋白酶從組織去除，將20ml的24 U/mlII型膠原酶的HBSS溶液加入到組織溶液中。在37℃下，振蕩水浴中溫育2分鐘之后，棄去最初的膠原酶II型消化液，因?yàn)樗饕醒t細(xì)胞和死亡的組織細(xì)胞。將該組織重新懸浮于12ml的新鮮II型膠原酶溶液中，并在37℃水浴中振蕩10分鐘。通過加入同樣體積的冷的DMEM/M199培養(yǎng)基，使得上清液失活，該DMEM/M199培養(yǎng)基含有10％的馬血清和5％的胎牛血清，將失活的上清液保存在冰上。組織重新懸浮和上清液失活作用再反復(fù)進(jìn)行3次，直到組織切片完全被消化。將來自消化液的上清液收集在一起，并以800rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。上清液含有大部分的心臟間充質(zhì)細(xì)胞，而沉淀含有大部分的心臟肌細(xì)胞。

第二次離心1500rpm，3分鐘之后，繼而將DMEM中的間充質(zhì)細(xì)胞鋪板在塑料上20分鐘，DMEM含有青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分鐘之后，通過用PBS進(jìn)行兩步嚴(yán)格的洗滌步驟，將未-附著的細(xì)胞從平板去除。

將附著的心臟間充質(zhì)細(xì)胞在37℃下，用5％CO2培養(yǎng)14-21天。在培養(yǎng)的第二天，當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)，將培養(yǎng)基改換為DMEM/F12，DMEM/F12含有B27補(bǔ)體、2％胎牛血清、10ng/ml EGF。10天后，心臟祖群開始在心臟間充質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)層頂部開始擴(kuò)增。
實(shí)施例5 從大鼠心臟分離出生后心臟祖細(xì)胞的分離方案
將50個(gè)出生1-5天的大鼠幼崽心臟從胸部解剖出來，切成四片，在ADS緩沖液中洗滌2次，ADS緩沖液含有6.8g/l NaCl、4.7g/l HEPES、0.12g/lNaH2PO4、0.14 g/l NaH2PO4H2O、1g/l葡萄糖、0.4g/l KCl、0.2g/lMgSO47H2O(pH調(diào)整為7.35)。將心臟切片在37℃下，攪拌瓶(stirflask)中，于ADS緩沖液中溫育15分鐘，ADS緩沖液含有膠原酶II型(115單位/ml)和胰酶(0.8mg/ml)。棄去第一消化物。將18ml的新鮮酶溶液加入到組織中，并37℃攪拌20分鐘。

消化20分鐘之后，去除酶溶液，用6ml的新生小牛血清使之失活，將新鮮酶溶液加入到攪拌瓶中的組織切片中，并在37℃下再溫育20分鐘。將由第一個(gè)20分鐘消化得到消化物在1000rpm轉(zhuǎn)速下離心6分鐘，將沉淀重新懸浮于5ml的新生小牛血清，并在37℃下置于10％CO2。上面的步驟，從酶溶液的去除至沉淀重新懸浮，重復(fù)進(jìn)行4次。

將每次離心所得到的細(xì)胞懸浮液收集起來，并將收集液在1000rpm離心6分鐘。將沉淀重新懸浮于12ml的ADS緩沖液中。將細(xì)胞懸浮液層鋪在Percoll梯度(每一梯度2ml細(xì)胞)的頂部。每一Percoll梯度由頂部的4ml Percoll(1.06g/ml)和底部的3ml Percoll(1.08g/ml)組成。

在緩慢加速和減速下，3000rpm離心30分鐘之后，上部的帶由心臟間充質(zhì)細(xì)胞組成，界面處的中間帶由心臟肌細(xì)胞組成。用巴氏吸管收集間充質(zhì)細(xì)胞。

第二次離心(1500rpm，3分鐘)之后，繼而將DMEM中的間充質(zhì)細(xì)胞涂布于塑料上20分鐘，DMEM包含青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分鐘后，通過用PBS進(jìn)行兩步嚴(yán)格的洗滌步驟，將未-附著細(xì)胞從平板去除。

將心臟間充質(zhì)細(xì)胞在37℃下，用5％CO2培養(yǎng)14-21天。在培養(yǎng)的第二天，當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)，將培養(yǎng)基改換為DMEM/F12，DMEM/F12含有B27補(bǔ)體、2％胎牛血清、10ng/mlEGF。10天后，心臟祖群開始在心臟間充質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)層頂部開始擴(kuò)增。
實(shí)施例6 心臟祖細(xì)胞群表型細(xì)胞標(biāo)記的FACS分析
在上述實(shí)施例4和實(shí)施例5中，從出生后的小鼠和大鼠心肌膜分離得到的細(xì)胞的表型細(xì)胞標(biāo)記物，分別用FACS分析鑒定。FAGS分析顯示90％的細(xì)胞表達(dá)LIM同源轉(zhuǎn)換區(qū)轉(zhuǎn)錄因子islet1；～90％的細(xì)胞表達(dá)果蠅tinman同源物Nkx2.5；和30-40％的細(xì)胞共表達(dá)中間絲巢蛋白。
實(shí)施例7 分化方案
對(duì)于祖群的分化作用，細(xì)胞被重新鋪板(replated)，無間充質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層，密度大約為2×104細(xì)胞/cm2，位于含有2％的胎牛血清和譜系-特異性分化試劑的培養(yǎng)基中。

體外肌細(xì)胞分化用條件培養(yǎng)基實(shí)施，條件培養(yǎng)基富集逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的NIH3T3細(xì)胞系的wntl 1，細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)和分泌wntl 1。在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，用wntl 1條件培養(yǎng)基，隨后用2.5ng/ml濃度的BMP2，以連續(xù)分化實(shí)驗(yàn)方案處理細(xì)胞4.4天。然后，將分化的細(xì)胞在單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行分析，以分析電生理情形下的通道電流(channelcurrents)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變。

在層粘連蛋白和多溶素包被的培養(yǎng)皿中，用0.2uM全反式視黃酸(all-trans retinoic acid)和5μM毛喉素實(shí)施神經(jīng)元細(xì)胞類型的體外分化，時(shí)間10-15天。

脂肪細(xì)胞的體外分化是在塑料培養(yǎng)皿中，用10％的新生小牛血清和5％的胎牛血清實(shí)施。

盡管本發(fā)明參考上述實(shí)施例而進(jìn)行描述，應(yīng)該理解的是，修飾和變化包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由下述權(quán)利要求的限定。
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序列表
<110>加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)
S.M.埃文斯
J.陳
C.蔡
A.莫雷蒂
K.R.近
K-L.勞格維茨
<120>使用ISLET 1作為標(biāo)志分離或產(chǎn)生干細(xì)胞
<130>UCSD1490-1CN
<150>PCT/US 2004/002978
<151> 2004-02-02
<150>US 60/484,809
<151>2003-07-02
<150>US 60/444,247
<151>2003-01-31
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>700
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(700)
<223>n是任何核苷酸
<400>1
ggtcccgagc cgtgcaggtc cgccgctgct gctgcgcctc cgctctgcca actccgccgg60
cttaaatcgg actcccagat ctgcgagggc gcggcgcagc cagncgtgtt tcccccagtt 120
ttggcaaccc cgggggccac tatttgccac ctagccacag caccagcatc ctctctgtgg 180
gctattcacc aattgtccaa ccaccatttc actgtggaea ttactccctc ttacagatat 240
gggagacatg ggcgatccac caaaaaaaaa acgtctgatt tccctgtgtg ttggttgcgg 300
caatcaaatt cacgaccagt atattctgag ggtttctccg gatttggagt ggcatgcagc 360
atgtttgaaa tgtgcggagt gtaatcagta tttggacgaa agctgtacgt gctttgttag 420
ggatgggaaa acctactgta aaagagatta tatcaggttg tacgggatca aatgcgccaa 480
gtgcagcata ggcttcagca agaacgactt cgtgatgcgt gcccgctcta aggtgtacca 540
catcgagtgt ttccgctgtg tagcctgcag ccgacagctc atcccgggag acgaattcgc 600
cctggcggag gatgggcttt tctgccgtgc ganccacgat gtgtnggaga gagccaggct 660
gggagctgga gaccctctca gtcccttgca tccagcgcgc 700
<210>2
<211>349
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Ile Ser Leu
1 5 10 15
Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His Asp Gln Tyr Ile Leu Arg Val
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys
35 40 45
Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr Cys Leu Val Arg Asp Gly Lys
50 55 60
Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Cys Ala
65 70 75 80
Lys Cys Ser lle Gly Phe Ser Lys Asn Asp Phe Val Met Arg Ala Arg
85 90 95
Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys Val Ala Cys Ser Arg
100 105 110
Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala Leu Arg Glu Asp Gly Leu Phe
115 120 125
Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu Arg Ala Ser Leu Gly Ala Gly
130 135 140
Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala Arg Pro Leu Gln Met Ala Ala
145 150 155 160
Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val His Lys
165 170 175
Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln
180 185 190
Leu His Thr Leu Arg Thr Trp Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala
195 200 205
Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val
210 215 220
Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys Arg Ser
225 230 235 240
Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asn Asp Lys Thr Asn
245 250 255
Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met Val Ala Ala Ser Pro Glu Arg
260 265 270
His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro Val Glu Val Gln Ser Tyr Gln
275 280 285
Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe Ala Leu Gln Ser Asp Ile Asp
290 295 300
Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Glu Gly Gly Pro Gly
305 310 315 320
Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Met Ser Ser Gln Leu Pro
325 330 335
Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser Pro Ile Glu Ala
340 34權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)干細(xì)胞的方法，包括測(cè)定細(xì)胞中的Islet1核酸或表達(dá)產(chǎn)物的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述測(cè)定是免疫組織化學(xué)的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述測(cè)定是包括測(cè)定Islet1mRNA的存在。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是生心干細(xì)胞。
5.一種用于分離或富集干細(xì)胞的方法，包括將一群細(xì)胞與對(duì)Islet1具有反應(yīng)性的試劑相接觸，和將所述反應(yīng)陽性細(xì)胞和反應(yīng)陰性細(xì)胞分離開來，從而分離或富集干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是生心干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述試劑是被可檢測(cè)地標(biāo)記的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述標(biāo)記物是熒光標(biāo)志。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述試劑是抗-islet1抗體。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述分離或富集是通過熒光激活細(xì)胞分選分析法進(jìn)行的。
11.一種用于產(chǎn)生干細(xì)胞的方法，包括將表達(dá)Islet1的未分化祖細(xì)胞與試劑接觸，以便激活或增強(qiáng)Islet1在所述細(xì)胞中的表達(dá)，其中，所述試劑激活或增強(qiáng)Islet1在細(xì)胞中的表達(dá)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，Islet1表達(dá)的所述激活或增強(qiáng)導(dǎo)致所述細(xì)胞分化為中胚層或神經(jīng)外胚層譜系。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述譜系是中胚層譜系。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述譜系是神經(jīng)外胚層譜系。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述未分化祖細(xì)胞是嚙齒類動(dòng)物的。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是非-肌細(xì)胞的心臟細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述未分化祖細(xì)胞是人的。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述人細(xì)胞是非-肌細(xì)胞的心臟細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是生心干細(xì)胞。
20.一種擴(kuò)增未分化生心祖細(xì)胞的細(xì)胞群、而不發(fā)生分化的體外方法，包括
培養(yǎng)分離得到的末分化祖細(xì)胞，所述祖細(xì)胞在祖細(xì)胞足以生長(zhǎng)的條件下表達(dá)Islet1，其中所述祖細(xì)胞足以生長(zhǎng)的條件包括將該細(xì)胞培養(yǎng)在種-特異性心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上或培養(yǎng)在來自心臟的纖維原細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述未分化祖細(xì)胞是非-肌細(xì)胞的細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述非-肌細(xì)胞是大鼠的、小鼠的或人的細(xì)胞。
23.一種組合物，包括Islet1陽性干細(xì)胞的富集群，其包括大于90％的Islet1陽性干細(xì)胞。
24.用于鑒定位于干細(xì)胞中或者干細(xì)胞上的至少一種標(biāo)記物的方法，所述干細(xì)胞包括Islet1核酸或者Islet1的表達(dá)產(chǎn)物，所述方法包括
用試劑接觸干細(xì)胞群，所述干細(xì)胞群帶有Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物，所述試劑與至少一種標(biāo)志物有反應(yīng)性，所述標(biāo)志物與Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物共定位在所述干細(xì)胞上；和
將反應(yīng)陽性細(xì)胞和反應(yīng)陰性細(xì)胞分離開來，從而鑒定出干細(xì)胞，所述干細(xì)胞具有Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物和至少一種標(biāo)志物，所述標(biāo)志物與Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物共定位。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物得到的。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是從心臟得到的。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是從胚胎組織中得到的。
28.分離哺乳動(dòng)物生心干細(xì)胞的方法，所述干細(xì)胞具有至少一種標(biāo)志物和Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物，所述方法包括
從所述哺乳動(dòng)物得到細(xì)胞樣品；
用試劑接觸所述細(xì)胞樣品，所述試劑和至少一種標(biāo)志物有反應(yīng)性，所述標(biāo)志物對(duì)具有Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物的干細(xì)胞有選擇性；
從反應(yīng)陰性細(xì)胞分選出反應(yīng)陽性細(xì)胞，所述反應(yīng)陽性細(xì)胞具有所述標(biāo)志物和Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物，所述反應(yīng)陰性細(xì)胞不具有所述標(biāo)志物和Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物；和
選出具有所述標(biāo)志物和Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)陽性細(xì)胞，從而從哺乳動(dòng)物分離出生心干細(xì)胞，所述生心干細(xì)胞具有至少一種標(biāo)志物和Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述分選步驟包括通過熒光激活細(xì)胞分選分析法進(jìn)行分選。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述分選步驟包括通過磁珠分選進(jìn)行分選。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述細(xì)胞樣品是從成年哺乳動(dòng)物中得到的。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述細(xì)胞樣品是從心臟得到的。
33.一種鑒定試劑的方法，所述試劑調(diào)節(jié)干細(xì)胞中的細(xì)胞反應(yīng)，所述干細(xì)胞包括Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物，所述方法包括
將所述干細(xì)胞和試劑接觸，所述試劑調(diào)節(jié)Islet1的表達(dá)；
將所述干細(xì)胞和檢測(cè)試劑接觸；和
分析所述檢測(cè)試劑存在及不存在時(shí)干細(xì)胞反應(yīng)的變化，其中所述干細(xì)胞反應(yīng)的變化將所述檢測(cè)試劑鑒定為，在所述干細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的試劑，所述干細(xì)胞包括Islet1核酸或者其表達(dá)產(chǎn)物。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)所述干細(xì)胞反應(yīng)的試劑影響所述干細(xì)胞的增殖。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)所述干細(xì)胞反應(yīng)的試劑影響所述干細(xì)胞的存活。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)所述干細(xì)胞反應(yīng)的試劑影響所述干細(xì)胞的遷移。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述調(diào)節(jié)所述干細(xì)胞反應(yīng)的試劑影響所述干細(xì)胞的分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了體外擴(kuò)增和增殖未分化的祖細(xì)胞的方法，更具體地，提供了體外擴(kuò)增和增殖含有Isletl的未分化祖細(xì)胞的方法，Isletl是增殖中的心臟干細(xì)胞顯然特有的一個(gè)標(biāo)志，本發(fā)明描述了用于分離干細(xì)胞群的方法，以及用于刺激未分化的祖細(xì)胞擴(kuò)增和增殖而不發(fā)生分化的方法，例如，以提供心臟修復(fù)或改善心臟功能。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101117643SQ200710112600
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者S·M·埃文斯, J·陳, C·蔡, A·莫雷蒂, K·R·近, K-L·勞格維茨 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)