專利名稱：一種溴過氧化物酶的分離提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溴過氧化物酶，具體地說是一種中國大連海域珊瑚藻中溴過氧化物酶的分離純化方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹵素過氧化物酶是一種特殊的過氧化物酶，它不僅可使很多有機物鹵化形成具有生理活性的鹵素有機物，而且還具有催化氧化、硫氧化、環(huán)氧化、吲哚氧化及其它類型反應(yīng)的作用，因此鹵素過氧化物酶在藥物合成和高附加值化合物合成方面越來越引起重視。(文獻1van Deurzen MPJ，vanRantwijk F，Sheldon RA.Tetrahedron，1997，53.(39)13183。文獻2Burton SG.Trends Biotechnol，2003，21(12)543)。
溴過氧化物酶是鹵素過氧化物酶中的一種。海洋中含有豐富的鹵素離子，其中氯離子0.5M、溴離子在毫摩爾級、碘離子在微摩爾級，生活在高鹵素濃度環(huán)境中的海洋生物所產(chǎn)生的鹵素有機物也非常高，因此海洋生物是溴過氧化物酶的主要來源(文獻3Ballschmiter K.Chemosphere，2003，52(2)313)。藻種、海域、氣候等原因都會造成溴過氧化物酶的性質(zhì)、活性的差異，因此篩選新的高活性溴過氧化物酶對于該酶的大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高活性溴過氧化物酶的分離提純方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下一種溴過氧化物酶的分離提取方法，其以珊瑚藻為原料，分離純化得到具有較高活性的溴過氧化物酶；溴過氧化物酶，英文名為bromoperoxidase，簡寫B(tài)rPO；其配基為礬，表觀分子量為64000道爾頓，最適pH為6.0，在pH為5-9范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，溫度在25-70℃的范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。
具體操場作過程如下，1)將新鮮珊瑚藻洗凈，加入珊瑚藻重量5-10倍的1-100mM H2O2的pH4-9磷酸鹽緩沖液在冰水浴下研磨提??；2)于0-10℃、3000～8000rpm離心10～50分鐘，取上清液；3)上清液加入一定量的硫酸銨制成濃度40～80％硫酸銨溶液進行硫酸銨沉淀、離心取沉淀物，用pH4-9 Tris-Cl緩沖液進行透析10～48小時，得到溴過氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量為14000。
所述粗酶液還可以采用陰離子交換樹脂及瓊脂糖樹脂進一步純化，具體為，
1)粗酶液上陰離子交換柱層析分離，用NaCl濃度從0.1～0.8M線性梯度洗脫，得到活性組分；粗酶液與洗脫液的體積比為1∶20～40；收集活組分并測定蛋白含量及酶活。
2)將離子交換層析所得活性組分冷凍干燥濃縮后上凝膠柱，用0.02M～0.08M pH4-9的Tris-HCl緩沖液洗脫分離，得到溴過氧化物酶。
所述陰離子交換樹脂為DE52或DEAE Sepharose，瓊脂糖樹脂為Sephadex G-100或Sephacryl S-200。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果1.從中國海域珊瑚藻中分離得到的溴過氧化物酶。采用本發(fā)明提取分離工藝，首次從珊瑚藻中分離純化得到具有較高活性的溴過氧化物酶。
2.本發(fā)明作為一種具有鹵化功能的過氧化物酶具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明分離得到的溴過氧化物酶可將單氯雙甲酮(monochlorodimedone)鹵化，得到其溴化物溴氯雙甲酮，因此該溴過氧化物酶具有鹵素過氧化物酶的共同特征，可用于鹵化、氧化、環(huán)氧化、硫氧化等反應(yīng)。
具體實施例方式
溴過氧化物酶的分離純化以中國大連海域的野生珊瑚藻為原料，采用硫酸銨沉淀、透析、離子交換柱、凝膠柱分離等多種分離手段相結(jié)合的方法，得到較純的溴過氧化物酶，其表觀分子量為64000道爾頓，金屬配位基團為礬，pH在5-9范圍內(nèi)均表現(xiàn)出很好活性，25-70℃的溫度范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。
實施例1 溴過氧化物酶的分離純化將新鮮采集的珊瑚藻(Corallina pilulifera)500克洗凈，用25mM H2O2的磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH6.0)提取液100ml在冰水浴下研磨提取。于4℃、3000～8000rpm離心10～50分鐘，取上清液。再加入一定量的硫酸銨制備成40～60％的硫酸銨溶液進行沉淀、離心取沉淀物，用Tris-Cl緩沖液(0.05，pH8.3)進行透析10～48小時，得到粗酶液。粗酶液上DEAE-纖維素柱分離，用NaCl濃度從0.1～0.8M線性梯度洗脫500ml，得到活性組分。將離子交換層析所得活性組分冷凍干燥后上Sephadex G-100凝膠柱，用Tris-HCl(0.02M～0.08M，pH8.3)緩沖液洗脫分離，得到溴過氧化物酶。
實施例2將新鮮采集的珊瑚藻(Corallina pilulifera)500克洗凈，用25mM H2O2的磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH6.0)提取液50ml在冰水浴下研磨提取。于4℃、3000～8000rpm離心10～50分鐘，取上清液。再加入一定量的硫酸銨制備成40～80％的硫酸銨溶液進行沉淀、離心取沉淀物，離心取沉淀物沉淀，用Tris-Cl緩沖液(0.05，pH8.3)進行透析10～48小時，得到粗酶液。粗酶液上DE52柱分離，用NaCl濃度從0.1～0.8M線性梯度洗脫500ml，得到活性組分。將離子交換層析所得活性組分冷凍干燥后上Sephacryl S-200凝膠柱，用Tris-HCl(0.01M～0.08M，pH8.3)緩沖液洗脫分離，得到溴過氧化物酶。
實施例3 溴過氧化物酶的分離純化雙水相萃取溴過氧化物酶(文獻4，Almeida M，F(xiàn)ilipe S，Humanes M，等，Phytochemistry，2001，57633-642)。將新鮮采集的珊瑚藻(Corallinapilulifera)500克洗凈，用25mM H2O2的磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH6.0)提取液50ml在冰水浴下研磨提取。將研磨液加到含有22.5％(w/v)的碳酸鉀和15％(w/v)聚乙二醇(PEG)1500的水溶液中，混勻靜止，溴過氧化物酶在上層溶液中。取上層液體加入丙酮，離心得到溴過氧化物酶沉淀，溶于50mM Tris-HCI(pH9.0)中得到溴過氧化物酶粗酶溶液，將粗酶液如實施例2，3分別經(jīng)離子交換柱和凝膠柱分離，得到溴過氧化物酶。
應(yīng)用例 溴過氧化物酶溴化單氯雙甲酮(monochlorodimedone)以單氯雙甲酮(ε290＝19.900M-1·cm-1)為底物，以H2O2為氧化劑，對單氯雙甲酮進行溴化。具體反應(yīng)如下 在3ml，pH6.0的反應(yīng)體系中，單氯雙甲酮、KBr、H2O2的終濃度分別為50μM、100mM、2mM，加入一定量的酶液，于290nm處測定吸光值的變化。在該反應(yīng)中，以每分鐘消耗1μmol單氯雙甲酮所需的酶量定義為一個酶活力單位，經(jīng)純化后的溴過氧化物酶的比酶活單位為60.4U/mg蛋白。
權(quán)利要求
1.一種溴過氧化物酶的分離提取方法，其特征在于以珊瑚藻為原料，分離純化得到具有較高活性的溴過氧化物酶。
2.按照權(quán)利要求1所述溴過氧化物酶的分離提取方法，其特征在于具體操場作過程如下，1)將新鮮珊瑚藻洗凈，加入珊瑚藻重量1/5～1/15的1-100mM H2O2的pH4-9磷酸鹽緩沖液在冰水浴下研磨提??；2)于0-10℃、3000～8000rpm離心10～50分鐘，取上清液；3)上清液中加入硫酸銨制成40～80％硫酸銨溶液沉淀后，離心取沉淀物沉淀，用pH4-9 Tris-Cl緩沖液進行透析10～48小時，得到溴過氧化物酶的粗酶液；透析膜截留分子量為14000。
3.按照權(quán)利要求2所述溴過氧化物酶的分離提取方法，其特征在于所述粗酶液還可以采用陰離子交換樹脂及瓊脂糖樹脂進一步純化，具體為，1)粗酶液上陰離子交換柱層析分離，用NaCl濃度從0.1～0.8M線性梯度洗脫，得到活性組分；粗酶液與洗脫液的體積比為1∶20～40；收集活組分并測定蛋白含量及酶活。2)將離子交換層析所得活性組分冷凍干燥濃縮后上凝膠柱，用0.02M～0.08M pH4-9的Tris-HCl緩沖液洗脫分離，得到溴過氧化物酶。
4.按照權(quán)利要求3所述溴過氧化物酶的分離提取方法，其特征在于所述陰離子交換樹脂為DE52或DEAE Sepharose，瓊脂糖樹脂為SephadexG-100或Sephacryl S-200。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溴過氧化物酶的分離提取方法，其以珊瑚藻為原料，分離純化得到具有較高活性的溴過氧化物酶。該酶的金屬配位基團為礬，表觀分子量接近64000，pH在5－9范圍內(nèi)具有很好活性，25－70℃的溫度范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，該酶可將單氯雙甲酮(monochlorodimedone)溴化，作為一種具有鹵化功能的過氧化物酶具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/02GK101037675SQ20061004605
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者靳艷, 張衛(wèi), 張錦友 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所