專利名稱：一種戊二酰－7－氨基頭孢烷酸?；傅墓潭ɑ椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物酶工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅墓潭ɑ椒?，采用酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)用的關(guān)鍵酶之一——戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶的一種固定化載體和方法。
背景技術(shù)：
7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成頭孢菌素的重要原料，主要由頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通過化學(xué)法或酶法裂解脫去7-位上的D-α-氨基己二酰側(cè)鏈得到。
酶法替代傳統(tǒng)的化學(xué)法裂解頭孢菌素C生產(chǎn)7-ACA，具有工藝簡單、效率高、成本低、安全、無污染及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，在經(jīng)濟和環(huán)保上都具有很大的競爭力。近些年來，人們已對酶法生產(chǎn)半合成抗生素的研究和開發(fā)投入了大量資金和力量。用酶法裂解生產(chǎn)7-ACA，首先，CPC在D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase，DAAO)的作用下，產(chǎn)生一個具酮基的中間體，這個中間體較不穩(wěn)定，很容易被同時生產(chǎn)的H2O2化學(xué)氧化脫羧，轉(zhuǎn)變成戊二?；?7-氨基頭孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic acid，GL-7-ACA)；然后在戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?Glutaryl-7-amidocephalosporanic acid acylase，GL-7-ACA?；?的作用下脫去其側(cè)鏈，生成7-ACA。
目前，利用兩步酶法催化裂解CPC制造7-ACA的技術(shù)在國外已經(jīng)工業(yè)化，國內(nèi)也已經(jīng)引進國外技術(shù)進行7-ACA試生產(chǎn)，但是所用固定化酶均需進口。另外這種方法具有一定的缺點，例如在制備固定化酶之前需要對酶進行多步分離純化，會造成酶的大量損失；固定化酶和固定化細胞都會增加底物和產(chǎn)物的擴散阻力，使催化反應(yīng)速率下降；固定化酶和固定化細胞的酶活收率都較低，一般低于50％。在7-ACA生產(chǎn)領(lǐng)域，盡管已有多家企業(yè)從國外引進了酶法生產(chǎn)線和生產(chǎn)技術(shù)，但由于不能自主生產(chǎn)固定化酶，而進口的固定化酶價格昂貴，采用酶法生產(chǎn)的7-ACA成本甚至高于化學(xué)法的成本。因此，尋找價格低、能耗低、對酶活性損失小的新型載體和新的固定化方法以降低固定化的成本，對在國內(nèi)實現(xiàn)酶法生產(chǎn)代替化學(xué)法生產(chǎn)7-ACA尤為重要。
在現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域中，膜分離技術(shù)得到越來越多的關(guān)注。應(yīng)用膜分離設(shè)備，可以將大分子物質(zhì)(或細胞)和小分子物質(zhì)進行很好的分離，而且作為催化劑的大分子物質(zhì)(酶分子)和細胞的活性損失較小，可以進行反復(fù)使用。膜分離技術(shù)操作簡單，成本較低，容易實現(xiàn)連續(xù)化操作。游離態(tài)的菌催化結(jié)合膜分離的方法進行7-ACA的制備已被證明是可行的(中國專利，申請?zhí)?00410039573.1)。但是直接用未經(jīng)處理的游離態(tài)的菌進行催化，通常只催化幾個批次酶即失去活性，如何提高游離態(tài)菌的酶催化穩(wěn)定性是關(guān)鍵(現(xiàn)代化工，2005，25卷增刊，138～141)。
隨著中國加入WTO，國外先進技術(shù)生產(chǎn)的頭孢菌素將大量涌入中國，國內(nèi)抗生素工業(yè)將面臨嚴峻的形勢。因此，加緊開發(fā)具有先進水平的酶法生產(chǎn)7-ACA的技術(shù)，滿足國內(nèi)需求和增強國際市場競爭力已迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；傅墓潭ɑ椒ǎ杂坞x態(tài)菌為載體的固定化GL-7-ACA?；傅姆椒ǎ员阌诮Y(jié)合膜分離技術(shù)，在簡化生產(chǎn)工藝的同時降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明通過下述方法實現(xiàn)的1、培養(yǎng)并收集具有GL-7-ACA?；富钚缘挠坞x細胞，2、將步驟1中收集得到的游離細胞重懸于pH6～9緩沖溶液中，然后加入終濃度為5～100mmol/l的交聯(lián)劑；0～45℃下，交聯(lián)1～4小時，離心，所得固體用緩沖液沖洗，得到以游離態(tài)菌為載體的固定化戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶。4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、在生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用；所述的固定化酶與催化產(chǎn)物的分離以及固定化酶的重復(fù)使用，采用的是離心或膜分離的方法，進行重復(fù)使用；或者采用中空纖維超濾膜分離的方法將固定化酶與催化產(chǎn)物分離，使固定化酶得到重復(fù)使用。
本發(fā)明所述具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；富钚缘挠坞x細胞為GL-7-ACA?；傅闹亟M大腸桿菌。所述的緩沖溶液為三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖液，濃度為0～1mol/L，pH為6～9；所述緩沖溶液優(yōu)選為pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液。所述的交聯(lián)劑為戊二醛。
本發(fā)明的優(yōu)點在于通過以游離態(tài)菌為載體對GL-7-ACA酰化酶進行交聯(lián)固定化，固定化后，酶活提高了20～40％，催化穩(wěn)定性增加了10～20倍。
具體實施例方式
實施例1GL-7-ACA?；傅墓潭ɑ^程為首先將GL-7-ACA?；钢亟M大腸桿菌pET-ACY的發(fā)酵液離心收集菌體，再用濃度為100mM/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖溶液重懸，最后加入事先配好的戊二醛溶液，使其終濃度為40mmol/l，放4℃交聯(lián)4小時后離心，棄上清液，所得固體用Tris-HCl緩沖液沖洗，即得到以游離態(tài)菌為載體的固定化GL-7-ACA?；?。固定化后測得GL-7-ACA?；该富钍枪潭ɑ暗?.38倍。
實施例2
GL-7-ACA?；傅墓潭ɑ^程為首先將GL-7-ACA?；钢亟M大腸桿菌pET-ACY的發(fā)酵液離心收集菌體，再用濃度為100mM/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖溶液重懸，最后加入事先配好的戊二醛溶液，使其終濃度為70mmol/l，放25℃交聯(lián)2小時后離心，棄上清液，所得固體用Tris-HCl緩沖液沖洗，即得以游離態(tài)菌為載體的固定化GL-7-ACA?；?。固定化后測得GL-7-ACA?；该富钍枪潭ɑ暗?.36倍。
實施例3利用實施例1制備的以游離態(tài)菌為載體的固定化GL-7-ACA酰化酶，進行GL-7-ACA催化生成7-ACA的實驗。在裝有固定化酶的試管中，加入用濃度為100mM/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖溶液配制的GL-7-ACA溶液(5g/L)，37℃下進行催化反應(yīng)，催化30min為一批次，離心收集固定化酶進行反復(fù)催化。經(jīng)檢測，催化30批次后，固定化酶的活性還保留了62％。
實施例4先將GL-7-ACA酰化酶重組大腸桿菌pET-ACY的發(fā)酵液離心收集菌體，再用濃度為100mM/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖溶液重懸。利用未經(jīng)交聯(lián)處理的游離態(tài)的菌體進行GL-7-ACA催化生成7-ACA的實驗。在裝有游離態(tài)菌體的試管中，加入用濃度為100mM/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖溶液配制的GL-7-ACA溶液(5g/L)，37℃下進行催化反應(yīng)，催化30min為一批次，離心收集菌體進行反復(fù)催化。經(jīng)檢測，催化3批次后，固定化酶的活性還保留了36％。
實施例5利用實施例1制備的以游離態(tài)菌為載體的固定化GL-7-ACA?；?，進行GL-7-ACA催化生成7-ACA的實驗。在裝有固定化酶的試管中，加入用濃度為100mM/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖溶液配制的GL-7-ACA溶液(10g/L)，37℃下進行催化反應(yīng)，反應(yīng)120min，GL-7-ACA基本都轉(zhuǎn)化生成7-ACA，轉(zhuǎn)化率約為90.3％。得到的催化反應(yīng)液，采用膜過濾法進行固定化GL-7-ACA酶與產(chǎn)物的分離。選擇中空纖維超濾膜(截留分子量30,000)。采用膜過濾法分離的反應(yīng)液，采用6N HCl調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至3.5，使7-ACA進行等電結(jié)晶。經(jīng)過減壓過濾和真空干燥，得到白色的7-ACA晶體，產(chǎn)物純度為92.5％。
實施例6將實施例5中經(jīng)膜分離得到的固定化GL-7-ACA?；?，按實施例5的條件再次催化GL-7-ACA溶液(5g/L)。經(jīng)過120min的催化反應(yīng)，GL-7-ACA基本都轉(zhuǎn)化生成7-ACA，轉(zhuǎn)化率約為91.2％。這說明，經(jīng)過催化反應(yīng)及膜分離的固定化GL-7-ACA?；溉跃哂泻芎玫拇呋钚?，可以進行多次循環(huán)使用。
權(quán)利要求
1.一種戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶的固定化方法，其特征在于a、培養(yǎng)并收集具有戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富钚缘挠坞x細胞；b、將步驟a中收集得到的游離細胞重懸于pH6.0～9.0緩沖溶液中，然后加入終濃度為5～100mmol/L的交聯(lián)劑；0～45℃下，交聯(lián)1～4小時，離心，所得固體用緩沖液沖洗，得到以游離態(tài)菌為載體的固定化GL-7-ACA?；福籧、在生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用；所述的固定化酶與催化產(chǎn)物的分離以及固定化酶的重復(fù)使用，采用的是高速離心的方法收集固定化酶；或者采用中空纖維超濾膜分離的方法將固定化酶與催化產(chǎn)物分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；富钚缘挠坞x細胞為戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶的重組大腸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液，濃度為0～1mol/L，pH為6～9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的緩沖溶液選擇pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種戊二酰－7－氨基頭孢烷酸酰化酶的固定化方法，屬于生物酶工程技術(shù)領(lǐng)域。工藝步驟為培養(yǎng)并收集具有戊二酰－7－氨基頭孢烷酸酰化酶活性的游離細胞；收集得到的游離細胞重懸于Ph 6～9緩沖溶液中，然后加入終濃度為5～100mmol/L的交聯(lián)劑；0～45℃下，交聯(lián)1～4小時，離心，所得固體用緩沖液沖洗，得到以游離態(tài)菌為載體的固定化戊二酰－7－氨基頭孢烷酸?；浮１景l(fā)明的優(yōu)點在于與傳統(tǒng)的固定化酶、固定化細胞方法相比，具有明顯的優(yōu)勢，結(jié)合膜分離工藝，展現(xiàn)了強有力的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12P35/02GK1844383SQ20061001174
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者羅暉, 史芫芫, 于慧敏, 李強, 沈忠耀 申請人:北京科技大學(xué), 清華大學(xué)