專利名稱：利用caps標(biāo)記鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物分子標(biāo)記技術(shù)，確切地說是一種利用CAPS標(biāo)記鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumis sativus L.)是重要的蔬菜作物，其性別表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要有雌雄同株異花(Monoecious)、全雌株(Gynoecious)、全雄株(Androdiecious)、兩性株(Hermaphroditic)、雄花兩性花同株(Andromonoecious)、雄花雌花及兩性花同株(Trimonoecious)等不同的性別表現(xiàn)類型。在生產(chǎn)上黃瓜雌花節(jié)位的多少和高低是影響產(chǎn)量的主要因素，黃瓜的雌性系往往表現(xiàn)出豐產(chǎn)、早熟、瓜密、采瓜期集中等優(yōu)點(diǎn)；此外，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前我國生產(chǎn)上80％以上種植的黃瓜品種為雜種一代，而利用雌性系制備雜種一代，具有無需人工除雄和授粉、節(jié)約勞力、降低制種成本、雜種純度高等特點(diǎn)。但在生產(chǎn)實(shí)踐中，黃瓜的不同性別類型種子外形相像，肉眼難以分辨，通常需要到植株生長的后期——開花期，方能從花的形態(tài)上對不同性別類型的黃瓜品種進(jìn)行區(qū)別和鑒定。而在黃瓜育種過程和種子經(jīng)營銷售過程中，存在機(jī)械性混雜和不法商人的故意摻假。不同性別類型的黃瓜品種，其種性差異很大，適宜種植的時間和地點(diǎn)都有很大差異。錯賣和錯買不同性別類型的黃瓜品種會給農(nóng)民造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。
因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，有必要尋找快速精確鑒定不同性別、尤其是雌性系黃瓜品種的方法。由于黃瓜的遺傳背景十分狹窄，品種間的遺傳多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它作物，一般的分子標(biāo)記，如RFLP、RAPD、SSR、AFLP等在黃瓜的品種間所能揭示的多態(tài)性十分有限(Pan Jun-song，Wang Gang，Li Xiao-zun，He Huan-le，Wu Ai-zhong，Cai Run.Construction of agenetic map with SRAP markers and localization of the gene responsible for thefirst-flower-node trait in cucumber(Cucumis sativus L.).Progress in Natural Science，2005，15(5)407～413)。而SNP(singlenucleotide polymorphism)標(biāo)記以及根據(jù)SNP標(biāo)記發(fā)展出的CAPS標(biāo)記(cleaved amplified polymorphic sequence)技術(shù)能夠獲得其它分子標(biāo)記技術(shù)不能顯示的更加豐富的多態(tài)性(Rafalski A.Applications of single nucleotide polymorphisms in cropgenetics.Curr Opin Plant Biol，2002，5(2)94～100)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能快速、準(zhǔn)確鑒定是否為強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，以及該分子標(biāo)記方法所使用的引物一種人工設(shè)計(jì)合成的核苷酸分子。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的提供一種人工設(shè)計(jì)合成的核苷酸分子，該核苷酸分子是具有下列堿基組成的特定序列正向5′-CACTCGGAACGGTTTACGAT-3′反向5′-AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA-3′。
本發(fā)明還提供了鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟1)、強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705基因組DNA的提取；2)、以權(quán)利要求1所述的核苷酸分子為引物(P-ACS2)，對上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出長度為1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)；3)、對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I酶切后電泳，得到CAPS標(biāo)記；在所述CAPS標(biāo)記中，引物對強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705有335bp和853bp 2條譜帶。
作為本發(fā)明的鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法的一種改進(jìn)，步驟3)中XhoI酶的酶切位點(diǎn)為強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705克隆的基因序列第335bp處。
作為本發(fā)明的鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中a、反應(yīng)液的反應(yīng)體積以100μL為參考，所用物品的組成及含量為10mmol/L的dNTP混合物 0.2μL0.1μmol/L的PCR引物 2μL高保真PCR聚合酶 5U基因組DNA0.2μg10倍的反應(yīng)緩沖液 10μL無離子水 加到100μL；b、PCR擴(kuò)增反應(yīng)在DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min后，然后按照94℃ 45sec、55℃ 45sec、72℃ 90sec的設(shè)置進(jìn)行30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，在72℃下延伸10min，隨后于4℃保存?zhèn)溆茫?
作為本發(fā)明的鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I酶切，酶切后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳1.5h(5V/cm)，溴化乙錠(EtBr)染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。
本發(fā)明選擇我國生產(chǎn)上應(yīng)用的8個不同性別類型(雌雄同株、強(qiáng)雌性和全雌性)品種，依據(jù)ACC合酶基因保守序列設(shè)計(jì)引物，從8個不同性別類型黃瓜品種基因組DNA克隆ACC合酶基因，并進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析，首先獲得了SNP(single nucleotidepolymorphism)標(biāo)記，進(jìn)一步根據(jù)獲得的SNPs多態(tài)性成功地發(fā)展了一個CAPS(cleavedamplified polymorphic sequence)標(biāo)記C-MT700。該標(biāo)記能將從國外引進(jìn)的強(qiáng)雌性優(yōu)良品種滿田705(簡稱為MT705，下同)與其它性別類型品種相區(qū)別，從而實(shí)現(xiàn)在分子水平上快速、精確鑒定黃瓜優(yōu)良品種MT705之目的。


圖1是引物P-ACS2對不同性別類型黃瓜品種PCR擴(kuò)增結(jié)果M-100bp ladderplus DNA分子量標(biāo)記，1-津春4號，2-早豐1號，3-中農(nóng)8號，4-秋雌1號，5-MT705，6-MT700，7-中農(nóng)5號，8-中農(nóng)203號；圖2是不同性別類型黃瓜品種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性克隆質(zhì)粒DNA經(jīng)過EcoR I和SalI雙酶切鑒定圖譜M-1Kb ladder DNA分子量標(biāo)記，1-津春4號，2-早豐1號，3-中農(nóng)8號，4-秋雌1號，5-MT705，6-MT700，7-中農(nóng)5號，8-中農(nóng)203號；圖3是黃瓜強(qiáng)雌性品種中MT705中的CAPS標(biāo)記C-MT705M-1Kb ladderDNA分子量標(biāo)記，1-津春4號，2-早豐1號，3-中農(nóng)8號，4-秋雌1號，5-MT705，6-MT700，7-中農(nóng)5號，8-中農(nóng)203號；圖4是利用CAPS標(biāo)記C-MT705對黃瓜強(qiáng)雌性品種MT705進(jìn)行鑒定結(jié)果M-1Kb ladder DNA分子量標(biāo)記，1-津春4號，2-津春5號，3-MT705，4-津優(yōu)1號，5-中農(nóng)5號，6-津研4號，7-早豐1號，8-中農(nóng)203號，9-中農(nóng)8號10-秋雌1號，11-豫黃瓜2號，12-MT700，13-津優(yōu)4號。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的具體發(fā)明內(nèi)容如下1、材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)所用的黃瓜品種及性別類型見表1。
表1 黃瓜品種及性別類型

1.2DNA的提取黃瓜基因組DNA的提取具體步驟如下①供試種子在26℃的培養(yǎng)室萌發(fā)生長兩周，取黃瓜幼苗剪碎后放入研缽內(nèi)，加液氮研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移到50mL的離心管中，加入事先預(yù)熱至60℃的抽提液20mL(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)。②將50mL的離心管來回顛倒數(shù)次，60℃水浴1h，期間振蕩幾次，隨后在37℃振蕩(60r/min)20min。③加入20mL氯仿∶乙醇∶異戊醇(80∶16∶4，v/v)，輕輕搖勻，4℃、11000r/min離心10min；取上層液相再加入20mL氯仿∶乙醇∶異戊醇(80∶16∶4，v/v)，輕輕搖勻，4℃、11000r/min離心10min。④取上層液相，加入等體積的異丙醇沉淀，4℃、11000r/min離心5min。⑤棄上清液，沉淀用70％的乙醇清洗2次，室溫下干燥后溶于雙蒸餾水中備用。
1.3PCR擴(kuò)增根據(jù)ACC合酶基因家族序列保守序列，設(shè)計(jì)1對引物P-ACS25′-CACTCGGAACGGTTTACGAT-3′和5′-AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA-3′，引物由上海Sangon公司合成。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液體積以100μL為參考，各種物品的用量分別為10mmol/L的dNTP混合物(美國Promega公司產(chǎn)品)0.2μL
0.1μmol/L的PCR引物 2μL高保真PCR聚合酶(美國Stratagene公司產(chǎn)品) 5U基因組DNA 0.2μg10倍的反應(yīng)緩沖液10μL無離子水加到100μL。
上述物品混合、高速離心若干秒種后，制成反應(yīng)液，用美國PE9600型DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5min變性后，按94℃ 45sec、55℃ 45sec、72℃ 90sec的設(shè)置進(jìn)行30個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后在72℃下延伸10min，隨后于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 取上述反應(yīng)液10μL與2μL的6倍的載樣緩沖液混合在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳1.5h(5V/cm)，溴化乙錠(EtBr)染色，用美國Bio/Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。
1.4PCR產(chǎn)物的克隆和測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海Sangon公司產(chǎn)品)提取和純化。純化后的DNA連接到測序載體pMD18-T(日本TaKaRa公司產(chǎn)品)。采用凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液在含50mg/LAmp和X-gal及IPTG的LB篩選平板上篩選陽性克隆。用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含50mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中繁殖，堿裂解法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒用EcoR I和Sal I雙酶切電泳鑒定。陽性克隆用UNIQ-10柱式質(zhì)粒抽提試劑盒(上海Sangon公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒DNA后送交上海華諾生物技術(shù)有限公司，用ABI377型DNA測序儀測定序列。首先利用M13正反向通用引物測定克隆的序列；為了確保測定序列的正確，根據(jù)測定的序列再設(shè)計(jì)引物5′-AGTTTCTAATCCTGGTGATG-3′對克隆的序列進(jìn)行驗(yàn)證測定，最后重疊拼接成完整序列。
1.5SNP分析和CAPS標(biāo)記的獲得與國際核酸數(shù)據(jù)庫聯(lián)網(wǎng)，對測定的序列進(jìn)行Blastn和Blastx分析；利用ORFinder軟件分析測定序列的開放閱讀框(ORF)；利用ClustalW軟件對測定的DNA序列和DNA編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，獲得SNP標(biāo)記；利用DNAStar軟件分析DNA序列含有的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，根據(jù)分析結(jié)果選用相關(guān)的內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切和電泳分析，獲得CAPS標(biāo)記。
2結(jié)果與分析2.1ACC合酶基因的克隆和序列測定引物P-ACS2對8個不同性別類型黃瓜品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出非常清晰的單一條帶，并且8個條帶大小相同，經(jīng)3次重復(fù)，結(jié)果穩(wěn)定一致(見圖1)。
將PCR產(chǎn)物純化并連接到測序載體pMD18-T上，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選獲得了白色單菌落克隆，提取單克隆質(zhì)粒DNA，經(jīng)過EcoR I和Sal I雙酶切鑒定為陽性克隆(見圖2)。
經(jīng)過序列測定，8個PCR產(chǎn)物長度均為1188bp；并且，PCR擴(kuò)增所用的引物全部在兩端被正確測出。其中，黃瓜強(qiáng)雌性品種MT705CS-ACS2基因序列見序列表SEQ ID NO1。
2.2ACC合酶基因序列的SNP標(biāo)記和特性分析對測定的8條序列進(jìn)行Blastn、Blasntx以及ORFinder分析，結(jié)果表明本研究克隆的基因?yàn)镃S-ACS2?？寺〉幕虻?186bp-270bp區(qū)段編碼274個氨基酸，其中第763bp-669bp是95bp的內(nèi)含子，內(nèi)含子的兩端序列符合典型的“GT-AG”規(guī)則。
通過對克隆的DNA序列進(jìn)行ClustalW分析發(fā)現(xiàn)，從3個雌雄同株性別類型品種克隆的序列全部相同；而與雌雄同株性別類型相比，5個強(qiáng)雌性和全雌性品種共存在8個SNPs標(biāo)記(表2)。8個SNPs標(biāo)記為4個A←→G和4個T←→C之間的轉(zhuǎn)換。在8個SNPs中，第719bp處的1個SNP位于內(nèi)含子區(qū)域，其余7個SNPs均在外顯子區(qū)域。在7個位于外顯子區(qū)域的SNPs中，第104bp、147bp和213bp處為3個非編碼區(qū)的SNPs，第329bp、335bp、342bp和532bp處為4個編碼SNPs(coding SNPs，cSNPs)(表2)。
表2 不同性別類型黃瓜品種CS-ACS2基因的SNP標(biāo)記

i內(nèi)含子區(qū)域；c外顯子編碼區(qū)；nc外顯子非編碼區(qū)。
2.3ACC合酶基因的CAPS標(biāo)記利用DNAStar軟件對測定的DNA序列進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的分析，結(jié)果表明從強(qiáng)雌性系品種MT705克隆的基因序列第335bp處有Xho I酶切位點(diǎn)。將引物P-ACS2對上述8個不同性別類型品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過Xho I酶切后電泳。
該酶切反應(yīng)的反應(yīng)液體積以50μL為參考，各種物品的用量分別為上述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物20μLXho I酶 10U10倍的反應(yīng)緩沖液 5μL無離子水 加到50μL。
將上述物品混合、高速離心若干秒種后，制成反應(yīng)液在37℃水浴反應(yīng)1.5h。取反應(yīng)液20μL與4μL的6倍的載樣緩沖液混合，在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳1.5h(5V/cm)，溴化乙錠(EtBr)染色，用美國Bio/Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。其中MT705得到長度為335bp和853bp的2條譜帶，其它品種均為長度為1188bp的1條譜帶，即強(qiáng)雌性系品種MT705具有1個CAPS標(biāo)記(該標(biāo)記命名為C-MT705)(見圖3)。此外，在8條DNA序列中，第701bp和833bp處分別都有EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)，這與EcoR I和Sal I雙酶切鑒定陽性克隆出現(xiàn)4條譜帶相吻合(見圖2)。
由于黃瓜的遺傳背景十分狹窄，品種間的遺傳多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它作物，一般的分子標(biāo)記在黃瓜的品種間所能揭示的多態(tài)性十分有限。SNP標(biāo)記和由SNP標(biāo)記發(fā)展的CAPS技術(shù)能夠獲得其它分子標(biāo)記技術(shù)不能顯示的更加豐富的多態(tài)性。本發(fā)明根據(jù)獲得的SNPs多態(tài)性成功地發(fā)展了一個CAPS標(biāo)記C-MT700。該標(biāo)記能將從國外引進(jìn)的強(qiáng)雌性優(yōu)良品種MT705與其它性別類型品種相區(qū)別，從而實(shí)現(xiàn)在分子水平上快速、精確鑒定黃瓜優(yōu)良品種MT705的目的。
為了證明本發(fā)明的分子標(biāo)記方法能精確鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)從8個種子公司購買13份不同性別類型的黃瓜種子，見表3。事先不知道每份品種的名稱，從每份種子中隨機(jī)取出若干粒種子，水培萌發(fā)提取基因組DNA，利用引物P-ACS2對13份樣品的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Xho I酶切后電泳(見圖4)。根據(jù)電泳結(jié)果，證明編號3的樣品是強(qiáng)雌性品種MT705，與實(shí)際結(jié)果完全一致。
表3 利用CAPS標(biāo)記C-MT705對不同性別類型黃瓜品種樣品的鑒定

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ ID NO11 agccccttaa gtttcccaaa ttattgggaa tcaaaaaagg ccataactct atatagtgaa61 atacacttat ccataaccct aacagtgtca aaacaacaac ctcacgagat gatcactttg121 gaaaaaaccc acgactcaca tttgagggtt tttgcttttt gattagttac gccttaagaa181 cttgttaaaa caaacttttg tcaaacaatg gaaattttca tctgatcagg ttgccagaat241 atgactgatt gacggtcgtc ttgtgtttaa gttgttgcac gaagcatagg ggattgaggc301 aacggtgagt gtggtgacat gatgtcttcg agtcctcgag atgacaatcg aagttcgagg361 ctgctttgac gccagcagaa tttttgtttc ttgaccttag ttgttacctc cttgttttga421 agcacgaagt ttctaatcct ggtgatggaa atgtccattg tattgtcatc catatttgca481 aaacaaaccc taaaccatcc tggttctgag caatggaatg aagaacctgg tgaaacattt541 agtttaactt cattgataat cactttccat aatgccattt ctgcttccaa tgtcttctct601 ttcaaaagat gacgcaaatc catccataaa aataatcctc cacttccttt caaatatcca661 attccaacct gcacatcatg aacaaaaaac ttagcatttt gaattcggta tagtgtaaca721 cctttgcatc taaatataaa tttatcacaa cccattaact aacctgagca agcccttttg781 tgaagtttcg atgacgcgca gcgagttttt cagcactccc agcaagaaag ttgtcgacaa841 acacatcatc caacaacatc gatgcaatca aatattgagt ttgcgaggag acgaggccaa901 agcttgacat cttacgagcg catgcaacaa cagcgtcgtt ataagagtag ataataccga961 cacgaaatcc agggaatccc atgtctttgg ataggctata aacgacatgg acaagatttc1021 tatcgcattc aatgtcactg ttgtcgatca cttcagagat actaatgaaa ccgggctctg1081 caaagacagt ggcagcgtag atttcgtcgc acactaagtg gatattcttt tcgttgataa1141 acgatacagc agtttcaagt gtttgtctat cgtaaaccgt tccgagtg
權(quán)利要求
1.一種人工設(shè)計(jì)合成的核苷酸分子，其特征是具有下列堿基組成的特定序列正向5′-CACTCGGAACGGTTTACGAT-3′反向5′-AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA-3′。
2.一種鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，其特征是包括以下步驟1)、基因組DNA的提??；2)、以權(quán)利要求1所述的核苷酸分子為引物，對上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)、對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I酶切后電泳，得到CAPS標(biāo)記；在所述CAPS標(biāo)記中，引物對強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705有335bp和853bp 2條譜帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，其特征是所述步驟3)中Xho I酶的酶切位點(diǎn)為強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705克隆的基因序列第335bp處。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，其特征是所述步驟2)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中a、反應(yīng)液的反應(yīng)體積以100μL為參考，所用物品的組成及含量為10mmol/L的dNTP混合物0.2μL0.1μmol/L的PCR引物 2μL高保真PCR聚合酶 5U基因組DNA 0.2μg10倍的反應(yīng)緩沖液10μL無離子水加到100μL；b、PCR擴(kuò)增反應(yīng)在DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min后，然后按照94℃45sec、55℃45sec、72℃90sec的設(shè)置進(jìn)行30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，在72℃下延伸10min，隨后于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，其特征是所述步驟3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I酶切，酶切后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳1.5h(5V/cm)，溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工設(shè)計(jì)合成的核苷酸分子，是具有下列堿基組成的特定序列正向5′－CACTCGGAACGGTTTACGAT－3′,反向5′－AGCCCCTTAAGTTTCCCAAA－3′。本發(fā)明還公開了一種鑒定強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟1)基因組DNA的提??；2)以上述核苷酸分子為引物，對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Xho I酶切后電泳，得到CAPS標(biāo)記；在CAPS標(biāo)記中，引物對強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705有335bp和853bp 2條譜帶。使用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法，能快速、準(zhǔn)確鑒定是否為強(qiáng)雌性黃瓜品種滿田705。
文檔編號C12N15/11GK1763226SQ200510060830
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者向太和, 王利琳, 龐基良, 胡江琴 申請人:杭州師范學(xué)院