專利名稱：以串連表達(dá)方式制備天然人胸腺素α1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物多肽的制備方法，特別涉及以基因串連表達(dá)方式制備天然人胸腺素α1的方法。
背景技術(shù)：
胸腺素α1(Thymosin-α1，Tα1)是由28個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，等電點(diǎn)為4.2，無二級(jí)結(jié)構(gòu)無二硫鍵，唯一的修飾是N-末端乙酰化。其氨基酸序列為N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C，是一種針對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫增強(qiáng)劑。它可以使T細(xì)胞成熟和分化，可促使成熟的T細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌各種淋巴因子如白介素-2、γ-干擾素，也可以同時(shí)促進(jìn)白介素-2受體的生成，促使高親和力的白介素-2受體(IL-2)的生成。
Tα1作為一種免疫增強(qiáng)劑，主要用于免疫缺陷和免疫抑制類疾病。當(dāng)病人感染某些病毒如HIV、HBV或者癌癥以及經(jīng)過放療或者化療后，其免疫系統(tǒng)往往會(huì)被逐漸抑制甚至破壞，而不能發(fā)揮對(duì)病毒或癌細(xì)胞的正常殺傷作用。Tα1可以恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)成熟T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞在病原組織及癌細(xì)胞周圍的聚集，促進(jìn)淋巴因子及淋巴因子受體的產(chǎn)生，這樣就大大增強(qiáng)了免疫細(xì)胞的作用，提高了對(duì)病毒和癌癥的抵抗能力。
Tα1在醫(yī)療上的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面(1)癌癥的治療，已證實(shí)對(duì)惡性黑色素瘤、肺癌、白血病、鱗狀上皮細(xì)胞癌、直結(jié)腸癌有效。(2)病毒性肝炎HBV的治療。(3)艾滋病病毒(HIV)的治療。Tα1也應(yīng)用于放療和化療病人的免疫系統(tǒng)恢復(fù)。
Tα1不僅對(duì)多種惡性腫瘤、病毒性肝炎、HIV等常見、多發(fā)、高死亡率性的疾病有良好的治療和緩解作用，還在新生兒免疫、老年人的醫(yī)療保健等方面的應(yīng)用具有很大的潛力。
目前，國內(nèi)制備胸腺α1常用的方法是從動(dòng)物的胸腺中提取，這種方法的缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，提取Tα1的純度不高，且來源受物數(shù)量限制。國外制備胸腺素α1常用的方法是化學(xué)合成法，該方法的缺點(diǎn)是成本較高且容易造成環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，利用基因工程技術(shù)，根據(jù)Tα1的氨基酸序列，推導(dǎo)并合成其編碼核苷酸序列，以串連的方式在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)包涵體分離純化后，利用羥胺裂解，得到高純度的天然人胸腺素α1。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種以串連表達(dá)方式制備天然人胸腺素α1的方法，包括以下步驟(1)將天然人胸腺素α1所包含的28個(gè)氨基酸按照大腸桿菌的慣用密碼子，翻譯成如下序列TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACAGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCTTCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性內(nèi)切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性內(nèi)切酶Bgl II、終止子、核酸限制性內(nèi)切酶Xho I所對(duì)應(yīng)的核苷酸；(3)兩片斷經(jīng)退火、延伸得到如下一段基因片斷GTC GACATGGGA TCCAAT GGG--84bp—GGCAGA TCTTGACTC GAGVal Asp Met Gly Ser Asn Gly Tα1 Gly Arg Ser StopLeu Glu
HindIII BamH I Bgl II Xho I將該片斷克隆入pUCm-T中，測(cè)序鑒定證明無誤后，擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)提取質(zhì)粒分為兩份，BamH I和Xho I雙酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I雙酶切，回收大片段；兩片段用T4 ligase連接為Tα1二串體；(5)將該二串體克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒分為兩份，用BamH I和Xho I雙酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I雙酶切，回收大片段；兩片段用T4ligase連接為Tα1四串體；(6)提取二串體質(zhì)粒，用BamH I和Xho I雙酶切，回收小片段；提取四串體質(zhì)粒，用Bgl II和Xho I雙酶切，回收大片段；兩片斷用T4 ligase連接為Tα1六串體；(7)將天然胸腺素α1六串體克隆在質(zhì)粒pET22-b(+)的核酸限制性內(nèi)切酶Hind III、Xho I位點(diǎn)之間，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定無誤，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)；(8)分離純化包涵體得到Tα1六串體蛋白，于37℃、pH4.5條件下，經(jīng)0.2M的羥胺裂解48h，得到天然人胸腺素α1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明應(yīng)用人工合成的方法，按照大腸桿菌慣用密碼子合成Tα1的基因序列，并采用六串體的方法表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于菌內(nèi)，從而大量表達(dá)目的蛋白；(2)本發(fā)明采用包涵體的形式表達(dá)，只需破碎菌體后使用離心沉淀的方法就可以分離、純化目的蛋白，工藝簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本低廉。
(3)在Tα1六串體的各單體之間設(shè)計(jì)有甘氨酸，可以通過羥胺有效的切割分離，并且使單體的N-末端帶上乙酰基，恢復(fù)Tα1的天然組成，不影響其生物活性。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施例1進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。
具體實(shí)施例1中以串連表達(dá)方式制備天然人胸腺素α1的方法前面的準(zhǔn)備工作首先包括以下步驟(1)將天然人胸腺素α1所包含的28個(gè)氨基酸按照大腸桿菌的慣用密碼子，翻譯成如下序列TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACAGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCTTCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性內(nèi)切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性內(nèi)切酶Bgl II、終止子、核酸限制性內(nèi)切酶Xho I所對(duì)應(yīng)的核苷酸；(3)兩片斷經(jīng)退火、延伸得到如下一段基因片斷GTC GACATGGGA TCCAAT GGG--84bp—GGCAGA TCTTGACTC GAGVal Asp Met Gly Ser Asn Gly Tα1 Gly Arg Ser StopLeu GluHindIII BamH I Bgl II Xho I將該片斷克隆入pUCm-T中，測(cè)序鑒定證明無誤后，擴(kuò)大培養(yǎng)；前述步驟即對(duì)應(yīng)以下操作步驟(1)合成兩條多聚核苷酸片斷Th1GTCGACATGGGATCCAACGGTTCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAATh2CTCGAGTCAAGATCTCCCGTTCTCAGCCTCTTCGACAACTTCCTTCTTCTCCTTTAGGTCTTTAGTAGTA其中帶有下劃線的部分為相互配對(duì)的堿基。
(2)合成片斷的連接、擴(kuò)增按如下條件進(jìn)行PCR，以連接、擴(kuò)增Tα1基因PCR各試劑用量 PCR反應(yīng)條件Th15ul 94℃ 5minTh25ul 94℃ 30sdNTP 16ul 60℃ 30sbuffer 10ul 72℃ 30sMgcl2 10ul 重復(fù)上三步30次H2O53ul 72℃ 5minTaq plus 1ul(3)合成片斷的檢測(cè)與克隆將步驟2中的連接片斷電泳檢測(cè)，回收后克隆在pUMc-T載體內(nèi)并測(cè)序檢測(cè)。
之后的步驟還包括(4)質(zhì)粒的雙酶切步驟2中測(cè)序鑒定證明無誤的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒分為兩份，BamHI和Xho I雙酶切，電泳回收小片段(約120個(gè)核苷酸殘基)；Bgl II和Xho I雙酶切，電泳回收大片段(約2800個(gè)核苷酸殘基)。
(5)Tα1基因的第一次串連步驟4中的小片斷取3ul，大片斷取5ul，加入1ul連接buffer和1ul連接酶，于4℃保溫16h；連接產(chǎn)物為Tα1基因兩串體。
(6)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選將步驟5中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過鋪板、培養(yǎng)、擴(kuò)增、酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測(cè)序確定正確的陽性克隆。
(7)Tα1基因的第二次串連步驟6中測(cè)序鑒定證明無誤的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒分為兩份，BamHI和Xho I雙酶切，電泳回收小片段(約240個(gè)核苷酸殘基)；Bgl II和Xho I雙酶切，電泳回收大片段(約3000個(gè)核苷酸殘基)；取小片斷3ul，取大片斷5ul，加入1ul連接buffer和1ul連接酶。于4℃保溫16h，連接產(chǎn)物為Tα1基因四串體。該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過鋪板、培養(yǎng)、擴(kuò)增、酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測(cè)序確定正確的陽性克隆。
(8)Tα1基因的第三次串連提取步驟6中正確克隆的質(zhì)粒，BamH I和Xho I雙酶切，電泳回收小片段(約240個(gè)核苷酸殘基)；提取步驟7中正確克隆的質(zhì)粒，Bgl II和Xho I雙酶切，電泳回收大片段(約3200個(gè)核苷酸殘基)；取小片斷3ul，取大片斷5ul，加入1ul連接buffer和1ul連接酶。于4℃保溫16h，連接產(chǎn)物為Tα1基因六串體。該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過鋪板、培養(yǎng)、擴(kuò)增、酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測(cè)序確定正確的陽性克隆。
(9)高效表達(dá)重組子的構(gòu)建提取步驟8中正確克隆的質(zhì)粒，Hind III和Xho I雙酶切，電泳回收后插入pET22-b(+)質(zhì)粒的Hind III和Xho I位點(diǎn)之間。
(10)工程菌的構(gòu)建將步驟9中構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過鋪板、培養(yǎng)、擴(kuò)增、酶切的方法篩選出陽性克隆，最后測(cè)序確定正確的陽性克隆為pET22-b(+)-Tα1/BL21。
(11)Tα1多肽六串體在工程菌中的表達(dá)將步驟10中篩選出的工程菌pET22-b(+)-Tα1/BL21，37℃培養(yǎng)2h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，于3mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下37℃培養(yǎng)3小時(shí)，離心沉淀菌體，加入2xSDS-PAGE上樣buffer95℃處理5min，進(jìn)行SDS-PAGE，染色、脫色后掃面分析，在23kD出有明顯的誘導(dǎo)條帶，約占菌體總蛋白的10％。
(12)Tα1多肽六串體的純化工程菌pET22-b(+)-Tα1/BL21經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，離心沉淀；將沉淀懸浮于細(xì)胞裂解緩沖液中，在200w的功率下超生破碎15min；破碎后溶液離心回收沉淀；用包涵體洗滌緩沖液洗滌兩次；加入包涵體溶解緩沖液置于搖床于200rpm作用過夜，得到Tα1多肽六串體。
(13)Tα1多肽六串體的裂解在Tα1多肽六串體溶液(濃度為1mg/ml)中加入羥胺使終濃度至0.2M，調(diào)pH至4.5，于25℃反應(yīng)48h，經(jīng)色普檢測(cè)并分離得到Tα1多肽。
產(chǎn)品多肽的序列與天然Tα1一致為N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C具體實(shí)施例2除第(13)步裂解條件為加入羥胺使終濃度至1.0M，調(diào)pH至6.0，于37℃反應(yīng)60h外，其它與具體實(shí)施例1相同。
具體實(shí)施例3除第(13)步裂解條件為加入羥胺使終濃度至2.0M，調(diào)pH至7.0，于45℃反應(yīng)72h外，其它與具體實(shí)施例1相同。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種以串連表達(dá)方式制備天然人胸腺素α1的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將天然人胸腺素α1所包含的28個(gè)氨基酸按照大腸桿菌的慣用密碼子，翻譯成如下序列TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACAGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCTTCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性內(nèi)切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性內(nèi)切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性內(nèi)切酶Bgl II、終止子、核酸限制性內(nèi)切酶Xho I所對(duì)應(yīng)的核苷酸；(3)兩片斷經(jīng)退火、延伸得到如下一段基因片斷GTC GACATGGGA TCCAAT GGG --84bp-GGCAGA TCTTGACTC GAGVal AspMet Gly Ser AsnGly Tα1Gly Arg SerStop Leu GluHind III BamH I Bgl IIXho I將該片斷克隆入pUCm-T中，測(cè)序鑒定證明無誤后，擴(kuò)大培養(yǎng)；(4)提取質(zhì)粒分為兩份，BamH I和Xho I雙酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I雙酶切，回收大片段；兩片段用T4 ligase連接為Tα1二串體；(5)將該二串體克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒分為兩份，用BamH I和Xho I雙酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I雙酶切，回收大片段；兩片段用T4 ligase連接為Tα1四串體；(6)提取二串體質(zhì)粒，用BamH I和Xho I雙酶切，回收小片段；提取四串體質(zhì)粒，用Bgl II和Xho I雙酶切，回收大片段；兩片斷用T4 ligase連接為Tα1六串體；(7)將天然胸腺素α1六串體克隆在質(zhì)粒pET22-b(+)的核酸限制性內(nèi)切酶Hind III、Xho I位點(diǎn)之間，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定無誤，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式表達(dá)；(8)分離純化包涵體得到Tα1六串體蛋白，于25～45℃、pH4.5～7.0條件下，經(jīng)0.2～2.0M的羥胺裂解48～72h，得到天然人胸腺素α。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物多肽的制備方法，特別涉及以基因串連表達(dá)方式制備天然人胸腺素α1的方法。包括合成兩條多聚核苷酸片斷、合成片斷的連接、擴(kuò)增、質(zhì)粒的雙酶切、Tα1基因的三次串連、高效表達(dá)重組子的構(gòu)建、工程菌的構(gòu)建、Tα1多肽六串體在工程菌中的表達(dá)、Tα1多肽六串體的純化和裂解等步驟。本發(fā)明應(yīng)用人工合成的方法，按照大腸桿菌慣用密碼子合成Tα1的基因序列，并采用六串體的方法表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于菌內(nèi)，從而大量表達(dá)目的蛋白；工藝簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本低廉，還能恢復(fù)Tα1的天然組成，不影響其生物活性。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1724663SQ200510050069
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者龔興國, 周亮, 曾冬云, 謝毅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)