專利名稱：體外蛋白質(zhì)合成的改進(jìn)方法
背景技術(shù)：
生物大分子的定向合成是生物化學(xué)的偉大成就之一。隨著重組DNA(rDNA)技術(shù)的進(jìn)展，使得利用細(xì)胞催化手段產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)成為可能。這可使用來自細(xì)胞的提取物在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)或體外實(shí)現(xiàn)。
無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成對于常規(guī)體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)方法具有幾種優(yōu)點(diǎn)。無細(xì)胞系統(tǒng)使得大多數(shù)(如果不是所有)細(xì)胞的代謝來源定向于唯一產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。此外，由于可控制合成環(huán)境，體外缺乏細(xì)胞壁和膜成分是有利的。例如，可改變tRNA水平以反映表達(dá)所基因的密碼子使用。由于我們不關(guān)心細(xì)胞生長或生存力，相比于體內(nèi)，也可以更大的靈活性改變氧化還原電勢、pH或離子強(qiáng)度。另外，易于定向回收純化的、適當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
也認(rèn)識到體外翻譯能摻入非天然和同位素標(biāo)記的氨基酸以及產(chǎn)生體內(nèi)不穩(wěn)定、不溶解或細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。此外，無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成在改革蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)組篩選技術(shù)中有作用。無細(xì)胞方法避免了體內(nèi)表達(dá)新基因產(chǎn)物的克隆和轉(zhuǎn)化細(xì)胞所需的費(fèi)力的方法，并且成為本領(lǐng)域的技術(shù)平臺。
雖然無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成具有所有有希望的特性，它的實(shí)際應(yīng)用和大規(guī)模實(shí)施受到幾種障礙的限制。其中很重要的是反應(yīng)時間短和蛋白質(zhì)生率低從而使得蛋白質(zhì)合成的產(chǎn)量差且試劑成本過大。此外，還需要昂貴的試劑并且常規(guī)方法在使用這些昂貴試劑時效率低下。
特別有用的反應(yīng)結(jié)合了體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而直接聯(lián)系了DNA編碼序列和蛋白質(zhì)產(chǎn)物。然而，需要其它試劑來產(chǎn)生mRNA增加了反應(yīng)的總成本。近來的出版物討論了許多不同的降低體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成本的策略，包括重復(fù)使用DNA模板和利用補(bǔ)料分批方案。例如，參見Kern和Davis(1997)“溶液平衡分析在體外RNA轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用”(Application of Solution Equilibrium Analysis to in-Vitro RNATranscription)Biotechnology Progress 13747-756；Kern和Davis(1999)“補(bǔ)料分批系統(tǒng)在經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)RNA中的應(yīng)用”(Application of a Fed-Batch System toProduce RNA by In-Vitro Transcription)B iotechnology Progress 15174-184。
需要改進(jìn)來優(yōu)化體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。持續(xù)除去抑制性副產(chǎn)物以及持續(xù)提供合成底物可使得連續(xù)或半連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)支持長反應(yīng)時間的合成。然而，這些方法也可導(dǎo)致底物使用效率低從而增加成本。解釋抑制性產(chǎn)物以及防止其合成是開發(fā)體外合成系統(tǒng)最感興趣的。降低試劑成本也重要。在當(dāng)前技術(shù)下，主要的試劑成本包括化學(xué)能源、酶、DNA模板和NTP的來源。降低這些成本而可提高產(chǎn)量的方法是很感興趣的。
相關(guān)文獻(xiàn)Swartz等的美國專利6,337,191B1；Kim和Swartz，(2000)Biotechnol Prog.16385-390；Kim和Swartz，(2000)Biotechnol Lett.221537-1542；Kim和Choi，(2000)J Biotechnol.8427-32；Kim等，(1996)Eur J Biochem.239881-886；Kim和Swartz，(2001)Biotechnol Bioeng74309-316；Davanloo等，Proc.Nat’l Acad Sci USA812035-2039(1984)；Datsenko等，Proc Nat′l Acad Sci USA976640-6645(2000)；Jewett等，(2002)《體外表達(dá)、基因克隆和表達(dá)技術(shù)中的原核系統(tǒng)》(Prokaryoticsystems for in vitro expression，in Gene Cloning and Expression Technologies)(Weiner，M.P.和Lu，Q.編)，Eaton Publishing，Westborough，MA.，391-411頁；Spirin等，Science 2421162-1164(1988)。
Cunningham和Ofengand(1990)Biotechniques9713-714建議加入無機(jī)焦磷酸酶經(jīng)水解積累的焦磷酸鹽導(dǎo)致較大的反應(yīng)產(chǎn)量。由于焦磷酸鹽與游離的鎂離子的復(fù)合物較少為轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用，焦磷酸鹽是抑制性的。
Breckenridge和Davis(2000)Biotechnology Bioengineering69679-867建議可通過從固定于固體支持物，例如瓊脂糖珠的DNA模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，其產(chǎn)量與傳統(tǒng)液相轉(zhuǎn)錄相差不大。固定化DNA的優(yōu)點(diǎn)是可從反應(yīng)中回收模板并重復(fù)使用多輪、消除不需要的配置并顯著降低DNA模板的成本。
美國專利號6,337,191描述了使用糖酵解中間體作為能源的體外蛋白質(zhì)合成；美國專利號6,168,931描述了使用新穎的ATP再生系統(tǒng)增強(qiáng)生物大分子的體外合成。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于體外合成生物分子、改善產(chǎn)率、降低成本并提高利用率的改進(jìn)方法。改進(jìn)的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)利用無磷酸化合物的ATP產(chǎn)生能源，例如葡萄糖、谷氨酸鹽(glutamate)、丙酮酸等。核苷三磷酸任選為核苷單磷酸取代。這些改進(jìn)極大降低了成本并增加了無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的可靠性。通過加入外源性磷酸化合物(phosphate)基本上改進(jìn)了反應(yīng)。
附圖簡述

圖1是比較利用本發(fā)明組分系統(tǒng)(component system)體外合成的蛋白質(zhì)水平的柱狀圖，所述系統(tǒng)使用丙酮酸作為能源和核苷單磷酸加上不同濃度的磷酸化合物。從14C-亮氨酸摻入量確定CAT表達(dá)。誤差棒表示來自兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的范圍。
圖2是比較利用本發(fā)明組分系統(tǒng)體外合成的蛋白質(zhì)水平的柱狀圖，所述系統(tǒng)使用葡萄糖作為能源與核苷三磷酸和不同量的磷酸化合物。從14C-亮氨酸摻入量確定CAT表達(dá)。誤差棒表示來自3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖3是比較利用本發(fā)明組分系統(tǒng)體外合成的蛋白質(zhì)水平的柱狀圖，所述系統(tǒng)使用葡萄糖作為能源和用于成功的無細(xì)胞反應(yīng)的各種成分。從14C-亮氨酸摻入量確定CAT表達(dá)。誤差棒表示來自3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4加入10mM磷酸化合物對使用葡萄糖作為能源和NTP或NMP的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的作用。誤差棒表示來自9個實(shí)驗(yàn)(n＝9)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5使用葡萄糖作為能源和NTP或NMP的無細(xì)胞反應(yīng)的ATP濃度。誤差棒表示來自3個實(shí)驗(yàn)(n＝3)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖6.使用Cytomim系統(tǒng)(加或不加磷酸化合物)表達(dá)CAT。反應(yīng)(15μl)進(jìn)行6小時，通過14C-亮氨酸摻入量確定CAT表達(dá)。誤差棒表示來自7個單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。所有反應(yīng)使用Cytomim系統(tǒng)(不加丙酮酸鈉，加NTP)進(jìn)行。磷酸化合物濃度表示于x軸。
圖7.使用Cytomim系統(tǒng)(w/NTP)(不加丙酮酸，加10mM磷酸化合物)的時間-CAT表達(dá)圖。反應(yīng)于37℃進(jìn)行6小時并通過14C-亮氨酸摻入量和酶活性分析確定CAT表達(dá)。每個時間點(diǎn)在不同的試管中制備15微升反應(yīng)混合物。在每個時間點(diǎn)，使用一支試管檢測表達(dá)蛋白質(zhì)的量。誤差棒表示7個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。(■)通過Cytomim系統(tǒng)中14C-亮氨酸摻入量監(jiān)測的CAT總產(chǎn)量。(●)通過Cytomim系統(tǒng)中14C-亮氨酸摻入量監(jiān)測的CAT的可溶產(chǎn)量。(▲)通過酶測定確定的CAT活性產(chǎn)量。
圖8.在1mL泡罩塔(bubble column)中使用Cytomim系統(tǒng)(不加丙酮酸，加10mM磷酸化合物)的CAT表達(dá)。反應(yīng)(1mL)于37℃進(jìn)行5小時。通過14C-亮氨酸的摻入量確定CAT表達(dá)。誤差棒表示兩個單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的高(high)和低(low)。在約3.5小時，反應(yīng)器開始起泡，接著加入1×10-4(V/V)的Sigma0-30消泡劑控制此問題。
圖10.基于相對總CAT表達(dá)的Cytomim系統(tǒng)的磷酸化合物最優(yōu)化研究。所有實(shí)驗(yàn)使用Cytomim系統(tǒng)(不加丙酮酸鈉，加NMP)的條件進(jìn)行。15微升的反應(yīng)于37℃孵育6小時。使用磷酸鉀(二元，MallinckrodtPhillipsburg，NJ)和用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至7.25。
實(shí)施方案詳述改進(jìn)方法提供生物大分子的體外合成，增加了產(chǎn)量、降低了成本和提高了利用率。結(jié)合反應(yīng)條件提高了產(chǎn)量并降低了成本，所述條件包括，但不限于使用無磷酸化合物的能源、不存在外源性核苷三磷酸、存在核苷單磷酸和外源性有機(jī)磷酸。
無細(xì)胞反應(yīng)需要用于蛋白質(zhì)合成的ATP。出于此目的慣常將具有高能磷酸鍵的化合物，例如烯醇丙酮酸磷酸(PEP)加入反應(yīng)。然而，由于細(xì)胞提取物中也存在糖酵解酶可使用葡萄糖和其它代謝中間物，例如谷氨酸鹽、丙酮酸等以低得多的成本和用于AT產(chǎn)生的較高勢能來驅(qū)動無細(xì)胞反應(yīng)，所述ATP產(chǎn)生利用也激活氧化磷酸化的方法。組合下述因素得到產(chǎn)生更天然環(huán)境的反應(yīng)條件。該系統(tǒng)能在體外分批反應(yīng)中顯著產(chǎn)生蛋白質(zhì)達(dá)6小時。模擬細(xì)胞環(huán)境提高了合成能力。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使用葡萄糖、谷氨酸鹽、丙酮酸等作為能源和用核苷單磷酸替代常規(guī)的外源性核苷三磷酸將本文所述的反應(yīng)混合物用于體外合成生物大分子。
通過加入外源性磷酸化合物，例如有機(jī)磷酸化合物等提高了產(chǎn)量。磷酸化合物一般以至少約1mM、優(yōu)選至少約5mM和不大于約20mM、通常不大于約15mM并且優(yōu)選約10mM的濃度提供。有用的磷酸化合物(PO4)源包括各種與生物反應(yīng)相容的鹽和酸，例如磷酸鉀、磷酸鎂、磷酸銨等。在其它實(shí)施方案中，通過加入合適量的含有磷酸根的化合物來提供磷酸化合物，從而使得在反應(yīng)期間釋放(例如通過酶釋放)少量磷酸根。
反應(yīng)優(yōu)選基本上無聚乙二醇。在基本上無聚乙二醇的情況下進(jìn)行合成可激活氧化磷酸化并改進(jìn)折疊；并且還可結(jié)合如美國專利號6,548,276所述的方法，該專利引作參考。
本發(fā)明方法允許在向合成補(bǔ)加能源的條件下產(chǎn)生蛋白質(zhì)，其中能源是無磷酸化合物的，例如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酸鹽等。能源包括氨基酸，例如谷氨酸，三羧酸循環(huán)(TCA)中的化合物，檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰輔酶A、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、草酰乙酸、乙醛酸、甘油和其它可引入中心代謝的化合物，例如乙酸等。能源可以至少約10mM、至少約20mM、更常見以至少約30mM濃度提供。這些化合物通常以不大于約250mM，更常見以不大于約150mM的濃度加入。例如，能源可是谷氨酸鉀、谷氨酸銨等。在一些實(shí)施方案中，使用混合能源，例如谷氨酸鉀和谷氨酸銨的混合物；或葡萄糖和谷氨酸源的組合。為延長反應(yīng)時間，在蛋白質(zhì)表達(dá)期間可向反應(yīng)混合物中加入額外量的能源?；蛘撸扔幂^低的起始濃度再連續(xù)或間歇地補(bǔ)加。
本文使用的體外合成指在含有生物提取物和/或確定的試劑的反應(yīng)混合物中無細(xì)胞合成生物大分子。反應(yīng)混合物可含有生產(chǎn)大分子的模板，例如DNA、mRNA等；待合成的大分子的單體，例如氨基酸、核苷酸等；和合成所需的輔因子、酶和其它試劑，例如核糖體、tRNA、聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等。這種合成反應(yīng)系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，并且描述于參考文獻(xiàn)中。無細(xì)胞合成反應(yīng)可以本領(lǐng)域已知的分批、連續(xù)流動或半連續(xù)流動方式進(jìn)行。生物大分子的體外合成可包括mRNA翻譯來產(chǎn)生多肽或可包括從DNA模板轉(zhuǎn)錄mRNA。
反應(yīng)優(yōu)選利用來自生長在含有葡萄糖和磷酸化合物的培養(yǎng)基中的細(xì)菌細(xì)胞提取物，其中葡萄糖以至少約0.25％(重量/體積)、更常見以至少約1％；并且通常以不大于約4％、更常見以不大于約2％的濃度存在。這種培養(yǎng)基的例子是2YTPG培養(yǎng)基，然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解的是，由于使用確定和不確定營養(yǎng)源的許多公布的培養(yǎng)基適合于生長細(xì)菌，例如大腸桿菌，出于此目的可使用許多培養(yǎng)基，特別是成分確定培養(yǎng)基(含葡萄糖的培養(yǎng)基的例子參見Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第二版，冷泉港大學(xué)出版社，冷泉港，紐約)。
可優(yōu)化用于開發(fā)此新技術(shù)的特定細(xì)菌菌株，例如大腸桿菌。特別是可遺傳修飾菌株來提高蛋白質(zhì)合成。例如，從染色體刪除用于上述實(shí)驗(yàn)的菌株的speA、tnaA、sdaA、sdaB、tonA和endA基因。前4種突變有助于在反應(yīng)中穩(wěn)定精氨酸、色氨酸和絲氨酸濃度。后兩種突變防御噬菌體感染并穩(wěn)定系統(tǒng)中的DNA?；蛘?，可向反應(yīng)混合物中加入不良酶活性的代謝抑制劑。
常規(guī)反應(yīng)混合物(例如，參見Kim和Swartz，2001)含有約2％聚乙二醇8000，但發(fā)現(xiàn)這降低產(chǎn)量。本方法用亞精胺和腐胺分子替代PEG。精胺和亞精胺的濃度至少約0.5mM、通常至少約1mM、優(yōu)選約1.5mM和不大于約2.5mM。腐胺的濃度是至少約0.5mM、優(yōu)選至少約1mM、優(yōu)選約1.5mM和不大于約2.5mM。這些濃度極其依賴于用于無細(xì)胞反應(yīng)中的總提取物濃度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，改變提取物濃度后，亞精胺和腐胺的濃度也可改變?yōu)槌霰疚乃龅湫头磻?yīng)條件的范圍。
反應(yīng)混合物中鎂的濃度影響總的合成。細(xì)胞提取物中常存在鎂，可通過加入額外的鎂來調(diào)節(jié)以優(yōu)化濃度。這些方法中用的鎂鹽來源是本領(lǐng)域已知的。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，鎂的來源可是谷氨酸鎂。優(yōu)選鎂的濃度是至少約5mM，通常至少約10mM，優(yōu)選至少約12mM并且不大于約20mM，通常不大于約15mM。使用谷氨酸鎂造成谷氨酸鹽濃度的輕微變化不影響產(chǎn)量。
系統(tǒng)可在需氧和厭氧條件下運(yùn)行。為增加合成產(chǎn)量，可對反應(yīng)，特別是對大于15μl的反應(yīng)供氧。反應(yīng)室的頂室可充滿氧；氧可輸入反應(yīng)混合物等。可連續(xù)供氧或?yàn)檠娱L反應(yīng)時間，可在蛋白質(zhì)表達(dá)期間對反應(yīng)室的頂室再次充滿氧。其它電子受體，例如硝酸鹽、硫酸鹽或延胡索酸鹽也可結(jié)合制備細(xì)胞提取物提供，從而使細(xì)胞提取物中的所需酶是活性的。
無需加入外源性輔助因子。諸如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD+或輔酶A的化合物可用于補(bǔ)充蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量，但不是必需的。
無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板優(yōu)選DNA。通常用于大腸桿菌系統(tǒng)的偶連的轉(zhuǎn)錄和翻譯連續(xù)地從具有可識別啟動子的DNA模板產(chǎn)生mRNA?？捎猛庠葱訰NA聚合酶，或者向反應(yīng)混合物直接加入外源性噬菌體RNA聚合酶，通常是T7或SP6?；蛘撸赏ㄟ^將信息插入QB復(fù)制酶(RNA依賴性RNA聚合酶)的模板來連續(xù)擴(kuò)增mRNA?？蓮奶崛∥镏谐ズ嗣竵韼椭€(wěn)定mRNA水平。模板可編碼任何感興趣的特定基因。
也可加入其它鹽，特別是生物相關(guān)的，例如錳。鉀的濃度通常是至少約50mM并且不大于約250mM。銨的濃度通常是不大于200mM，更常見的是不大于約100mM并且優(yōu)選不大于約20mM的濃度。反應(yīng)一般維持于約pH5-10和約20-50℃；更常見的是約pH6-9和約25-40℃。這些范圍可擴(kuò)展至感興趣的特定條件。從宿主機(jī)體純化(參見Muller和Blobel(1984)“細(xì)菌蛋白質(zhì)穿過大腸桿菌質(zhì)膜的體外轉(zhuǎn)運(yùn)”(In vitro translocation of bacteria proteins across the plasma membrane of Escherichiacoli)，PNAS 817421-7425)或合成的囊泡也可加入系統(tǒng)。這些可用于提高蛋白質(zhì)合成和折疊。本文所述的技術(shù)顯示激活利用細(xì)胞質(zhì)膜組分的氧化磷酸化過程。激活氧化磷酸化必須有含呼吸鏈組分和F1F0ATP酶的反向膜囊泡。本方法也可用于無細(xì)胞反應(yīng)以激活其它組的膜蛋白；例如插入或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)運(yùn)其它化合物。
在葡萄糖系統(tǒng)中，緩沖液對穩(wěn)定pH是重要的。例如，葡萄糖反應(yīng)中的bis-tris緩沖液可是約10-150mM，通常約50mM。只要其它緩沖液的Pka適合反應(yīng)(或許在6.8和7.2之間)，也可使用。也可在反應(yīng)期間直接加入堿來穩(wěn)定pH。
用于提高體外合成的方法感興趣的合成系統(tǒng)包括復(fù)制生物聚合物的系統(tǒng)，包括擴(kuò)增DNA、從DNA或RNA模板轉(zhuǎn)錄RNA、將RNA翻譯為多肽與從單糖合成復(fù)合糖。合成的增強(qiáng)包括在系統(tǒng)中合成的多肽的總量或相對量增加；每單位時間合成的多肽的總量或相對量增加；在系統(tǒng)中合成的生物活性多肽的總量或相對量增加；在系統(tǒng)中合成的可溶多肽的總量或相對量增加等。
反應(yīng)可使用大規(guī)模反應(yīng)器，小規(guī)模反應(yīng)器或可多路(multiplexed)以同時進(jìn)行多個合成。連續(xù)反應(yīng)使用加料機(jī)理來引入試劑流，并可分離作為過程一部分的終產(chǎn)物。分批系統(tǒng)也是感興趣的，其中可引入額外試劑來延長活性合成的時間。反應(yīng)器可根據(jù)應(yīng)用目的以任何方式運(yùn)行，例如分批、延長分批、半分批、半連續(xù)、補(bǔ)料-分批和連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)可以是任何體積，可以是小規(guī)模的，通常至少約1μl并且不大于15μl，或是規(guī)模放大的反應(yīng)，其中反應(yīng)體積至少約15μl、通常至少約50μl、更常見至少約100μl，并且可以是500μl、1000μl或更大。雖然可同時進(jìn)行多個反應(yīng)，在大多數(shù)情況中，單個反應(yīng)不大于約10ml。然而，只要供氧(或電子受體)充足，原則上反應(yīng)可以任何規(guī)模進(jìn)行。
翻譯mRNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)是特別感興趣的，其中翻譯可與體外從DNA模板合成mRNA相結(jié)合。這種無細(xì)胞系統(tǒng)含有翻譯mRNA所需的所有因子，例如核糖體、氨基酸、tRNA、氨酰基合成酶、延伸因子、起始因子和核糖體循環(huán)因子。本領(lǐng)域已知的無細(xì)胞系統(tǒng)包括可用合適的核酶處理以去除活性內(nèi)源性mRNA的大腸桿菌提取物等。
除了上述成分，例如無細(xì)胞提取物、遺傳模板和氨基酸以外，蛋白質(zhì)合成特別需要的材料可加入反應(yīng)。這些材料包括鹽、亞葉酸、環(huán)AMP、蛋白質(zhì)或核酸降解酶的抑制劑、蛋白質(zhì)合成的抑制劑或調(diào)節(jié)劑、氧化/還原電位調(diào)節(jié)物、非變性表面活性劑、緩沖成分、精胺、亞精胺、腐胺等。
鹽優(yōu)選包括鉀鹽、鎂鹽和銨鹽(例如，乙酸或硫酸的鹽)。這些鹽的一種或多種可具有氨基酸，例如谷氨酸作為反荷陰離子。最佳濃度的離子種類之間有相互依賴性。通常根據(jù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)優(yōu)化這些離子種類。當(dāng)改變反應(yīng)介質(zhì)的特定成分的濃度時，另一成分的濃度可相應(yīng)變化。例如，可根據(jù)其它成分濃度的變化同時控制幾種成分，如核苷酸和能源化合物的濃度。也可隨時間改變成分的濃度水平。氧化/還原電位調(diào)節(jié)物可以是二硫蘇糖醇、抗壞血酸、谷胱甘肽和/或它們的氧化形式。也可任選含有濃度不大于約500Mm，更常見不大于約250mM的非變性表面活性劑，例如Triton X-100。
當(dāng)以連續(xù)操作模式使用蛋白質(zhì)分離裝置時，來自反應(yīng)器的產(chǎn)物輸出流過膜并進(jìn)入蛋白質(zhì)分離裝置。在半連續(xù)操作方式中，膜的外側(cè)或外表面與以預(yù)定順序循環(huán)變化的預(yù)定溶液接觸。這些溶液含有諸如氨基酸和核苷酸的底物。此時，反應(yīng)器以透析、滲濾分批或補(bǔ)料-分批模式操作。加料溶液可通過同一膜或獨(dú)立的注入單元提供給反應(yīng)器。合成的蛋白質(zhì)在反應(yīng)器中累積，然后在系統(tǒng)操作完成后根據(jù)用于蛋白質(zhì)純化的常規(guī)方法分離和純化。
在有試劑流的地方，液流方向可垂直于膜和/或與膜相切。切向流動可有效地循環(huán)ATP和防止膜堵塞，并且可加到垂直流動上?？赏ㄟ^正壓泵或真空抽吸泵造成或?qū)崿F(xiàn)垂直于膜的流動。與膜的外表面接觸的溶液可循環(huán)變化，并且可以相對于膜的穩(wěn)定切向流動。反應(yīng)器可通過合適的攪拌裝置進(jìn)行內(nèi)部或外部攪拌。
蛋白質(zhì)在反應(yīng)器中的合成期間，選擇性分離所需蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分離裝置可包括用吸附合成的所需蛋白質(zhì)的組件固定的充滿顆粒的單元和具有合適大小的孔的膜，所述顆粒包衣有抗體分子或其它分子。蛋白質(zhì)分離裝置優(yōu)選包括用于交替使用的兩列。翻譯反應(yīng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量可以各種方式檢測。一種方法取決于檢測翻譯的特定蛋白質(zhì)活性的測定的有效性。檢測蛋白質(zhì)活性的測定的例子是熒光素酶測定系統(tǒng)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶測定系統(tǒng)。這些測定檢測翻譯反應(yīng)產(chǎn)生的功能活性蛋白質(zhì)的量?；钚詼y定不檢測由于不恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊或缺乏其它蛋白質(zhì)活性所需翻譯后修飾導(dǎo)致失活的全長蛋白質(zhì)。
檢測在偶聯(lián)的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的量的另一種方法是進(jìn)行以下反應(yīng)，該反應(yīng)使用已知量的放射性標(biāo)記氨基酸，例如35S-甲硫氨酸、3H-亮氨酸或14C-亮氨酸，然后檢測摻入新翻譯蛋白質(zhì)中的放射性標(biāo)記氨基酸的量。摻入測定檢測在體外翻譯反應(yīng)中產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)中(包括截短的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)放射性標(biāo)記氨基酸的量。放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)還可在蛋白質(zhì)凝膠上分離和通過證實(shí)產(chǎn)物大小合適和未產(chǎn)生次級蛋白質(zhì)產(chǎn)物的放射自顯影術(shù)分離。
應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不受所述具體方法、策略、細(xì)胞系、動物種類或?qū)佟?gòu)建物和試劑的限制，因?yàn)檫@些當(dāng)然可變化。也應(yīng)該理解的是，本文使用的術(shù)語僅是出于描述具體實(shí)施方案的目的，并非要限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求的限制。
除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然與本文所述相似或等價的任何方法、裝置和材料可用于實(shí)施或測試本發(fā)明，優(yōu)選的方法、裝置和材料仍是本文所述的。
本文述及的所有出版物出于描述和公開的目的納入本文作為參考，例如出版物中所述可能與本文所述發(fā)明聯(lián)合使用的細(xì)胞系、構(gòu)建物和方法。提供以上和全文中討論的出版物僅是因?yàn)樗鼈兊墓_早于本申請的提交日期。本文沒有什么可認(rèn)為是由于在先發(fā)明而使本發(fā)明人不具先于這些公開的資格。
提供以下實(shí)施例是為向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全公開并描述如何制造和使用本發(fā)明，而非要限制本發(fā)明的范圍。我們努力保證使用數(shù)值(例如，量、溫度、濃度等)的精確性，但應(yīng)該允許有一些實(shí)驗(yàn)失誤和偏差。除非另有指出，部分是以重量計的部分，分子量是平均分子量、溫度是攝氏度、壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1葡萄糖作為能源方法和材料用于合成的標(biāo)準(zhǔn)Cytomim環(huán)境含有以下組分1.2mM ATP、0.85mM的各種GTP、UTP和CTP、1mM DTT、130mM谷氨酸鉀、10mM谷氨酸銨、8mM谷氨酸鎂、34μg/ml亞葉酸、170.6μg/ml大腸桿菌tRNA混合物、13.3μg/ml質(zhì)粒、100μg/ml T7RNA聚合酶、2mM的20種未標(biāo)記的氨基酸、11μM[14C]亮氨酸、1.5mM亞精胺和1mM腐胺、0.33mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.26mM輔酶A、2.7mM草酸鈉和0.24體積的S30提取物。使用大腸桿菌K12(Michel-Reydellet等，(2004)Met Eng(6)197-203中所述的菌株KCl，基因型A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaB met+)的粗S30提取物，用稍作改進(jìn)的Pratt，J.M.1984所述方案(“原核無細(xì)胞系統(tǒng)中偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄-翻譯”(Coupled transcription-translation in prokaryoticcell-free systems)，刊于《轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)際方法》(Transcription and translationapractical approach)，Hanes，B.D.和S.J.Higgins編，179-209頁，IRL Press，New York)進(jìn)行原核無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。用于提取物的細(xì)胞生長于成分確定培養(yǎng)基(Zawada等，(2003)，“用于生產(chǎn)大腸桿菌細(xì)胞提取物的高密度、成分確定培養(yǎng)基”(High-density，defined media culture for the production of Escherichia coli cellextracts)，刊于Saha B編《發(fā)酵生物技術(shù)》(Fermentation Biotechnology)，Washington，DCACS Press，142-156頁)。按照Davanloo等，1984所述方法從大腸桿菌菌株BL21(pAR1219)制備T7 RNA聚合酶(“噬菌體T7 RNA聚合酶的基因克隆和表達(dá)”(Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase)，Proc Nat′lAcad.Sci.USA812035-2039)?？杉尤?3mM丙酮酸鈉來提高該系統(tǒng)，雖然這不是必需的。在每次從細(xì)胞提取物開始的反應(yīng)中有約額外的3.3mM鎂、14.4mM鉀、2.4mM TRIS和23.5mM乙酸。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用于合成的改進(jìn)的Cytomim系統(tǒng)是加入10mM磷酸鉀和50mM Bis-Tris(pH7.0)，使用5μM[14C]亮氨酸而非11μM。此外，加入30mM葡萄糖，1.2mM AMP替代1.2mM ATP，0.85mM的各種GMP、UMP和CMP替代0.85mM的各種GTP、UTP和CTP。另外，省去草酸。
反應(yīng)于37℃孵育3-6小時。從用液體閃爍計數(shù)儀(Beckman LS3801)檢測的TCA-不溶放射性估計合成的蛋白質(zhì)的量。(Kim等，1996)。如上述測定可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量(Kim和Swartz，2000)。
結(jié)果Kim和Swartz(2001)描述了偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中的能源是烯醇丙酮酸磷酸(PEP)。以前用葡萄糖直接取代PEP實(shí)際上導(dǎo)致無蛋白質(zhì)合成。然而，當(dāng)用葡萄糖-6-磷酸(G6P)替代PEP時，觀察到228±13μg/mL的顯著蛋白質(zhì)產(chǎn)量(Kim and Swartz 2001)。葡萄糖-6-磷酸在糖酵解反應(yīng)途徑中離葡萄糖僅一步，這表明最初的磷酸化步驟是限制性的。進(jìn)行了幾個實(shí)驗(yàn)來緩解該限制，包括向反應(yīng)加入己糖激酶或葡萄糖激酶，或者緩慢加入葡萄糖。兩種方法均不成功。
通過改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物繼續(xù)優(yōu)化G6P反應(yīng)直至使用該能源的蛋白質(zhì)平均產(chǎn)量超過700μg/mL。為得到這些蛋白質(zhì)產(chǎn)量，使用新的pH緩沖液并除去草酸。此外，G6P反應(yīng)顯示可用NMP代替NTP得到類似的產(chǎn)量。這種替代顯著降低了反應(yīng)成本。盡管有這些進(jìn)展，當(dāng)用葡萄糖替代GF6P時，優(yōu)化的條件仍未顯著提高蛋白質(zhì)合成。
當(dāng)用天然陽離子腐胺和亞精胺替代聚乙二醇，向優(yōu)化的反應(yīng)中加入額外磷酸化合物并省去草酸鈉時，葡萄糖作為能源并使用NMP獲得成功。磷酸化合物對糖酵解的起始步驟(葡萄糖到G6P)和NMP到NTP的磷酸化均重要。當(dāng)使用葡萄糖作為能源時，無細(xì)胞反應(yīng)是磷酸化合物限制的。該限制在通常使用磷酸化能源，例如PEP、磷酸肌酸或甚至G6P的傳統(tǒng)無細(xì)胞反應(yīng)中不存在。與使用G6P的實(shí)驗(yàn)(產(chǎn)生超過800μg/mL的蛋白質(zhì)產(chǎn)量)相比，發(fā)現(xiàn)使用葡萄糖加磷酸化合物的實(shí)驗(yàn)得到超過400μg/mL的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。由于降低了成本并增加了這些試劑的穩(wěn)定性，葡萄糖和NMP反應(yīng)是有利的。
僅當(dāng)加入額外磷酸化合物時，丙酮酸，另一種非磷酸化的能源和NMP也成功地用于無細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。用丙酮酸替代葡萄糖，NMP替代NTP后，上述混合物進(jìn)行3小時分批反應(yīng)。磷酸優(yōu)化得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)量接近使用NTP的，但成本僅是使用NTP的幾分之一(圖1)。無任何額外的磷酸化合物，蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量基本上較低。
為進(jìn)一步確定該新反應(yīng)的要求，分別研究反應(yīng)組分。使用NTP和葡萄糖作為能源的反應(yīng)也確定從額外的磷酸化合物獲益(圖2)，獲得類似于NMP反應(yīng)的產(chǎn)量。也進(jìn)行了其它實(shí)驗(yàn)來確定對成功反應(yīng)重要的其它步驟。發(fā)現(xiàn)除去PEG和草酸以及用合適的緩沖液仔細(xì)地控制pH對蛋白質(zhì)產(chǎn)量有顯著影響(圖3)。
無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)以前限于使用磷酸化的能源和核苷酸三磷酸。這些化合物在無細(xì)胞反應(yīng)中是較貴的試劑。此外，磷酸化的分子更易于降解并產(chǎn)生與無機(jī)磷酸化合物濃度有關(guān)的易變反應(yīng)環(huán)境。使用葡萄糖和核苷一磷酸增加反應(yīng)的可靠性和穩(wěn)態(tài)同時也顯著降低了成本。事實(shí)上，當(dāng)比較能源和核苷酸成本時，葡萄糖和NMP比PEP和NTP便宜將近兩個數(shù)量級(表1，第1行)。
使用葡萄糖作為能源和NMP的體外合成反應(yīng)的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量是傳統(tǒng)反應(yīng)的約60％。然而，使用葡萄糖和NMP的巨大成本優(yōu)勢抵消了產(chǎn)量的稍微降低，從而使得相對產(chǎn)物產(chǎn)量在成本基礎(chǔ)上幾乎好90倍(表1，行3)。
表1比較使用各種能源和核苷酸的無細(xì)胞反應(yīng)
使用大腸桿菌KC1作為提取物來源按照上述進(jìn)行了關(guān)于反應(yīng)條件的其它無細(xì)胞反應(yīng)(Michel-Reydell等所述，(2004)Metab Eng 6(3)197-203)。在無細(xì)胞反應(yīng)期間各種時間取樣獲得ATP濃度的數(shù)據(jù)。樣品用等體積(1∶1)的5％三氯乙酸(TCA)沉淀并以14000g離心10分鐘。收集上清液并通過螢火蟲熒光素酶測定分析確定ATP濃度(Kim和Swartz，(2001)，同上)。
圖4比較了有或沒有磷酸化合物的上述葡萄糖系統(tǒng)和NMP與NTP。圖4的數(shù)據(jù)證實(shí)10mM磷酸化合物對葡萄糖系統(tǒng)有利。此外，這些數(shù)據(jù)顯示NMP可替代NTP而對蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量無影響。
圖5的數(shù)據(jù)顯示使用NMP的無細(xì)胞系統(tǒng)可再生轉(zhuǎn)錄/翻譯所需的ATP。事實(shí)上，使用NMP的ATP濃度快速達(dá)到在葡萄糖/NTP反應(yīng)中觀察到的相同水平。
實(shí)施例2谷氨酸鹽作為能源下述轉(zhuǎn)錄-翻譯聯(lián)合反應(yīng)的反應(yīng)混合物含有以下組分1.2mM ATP、0.85mM各種GTP、UTP和CTP、130mM谷氨酸鉀、10mM谷氨酸銨、10mM谷氨酸鎂、1.5mM亞精胺、1mM腐胺、34μg/ml亞葉酸、170.6μg/ml大腸桿菌tRNA混合物、13.3μg/ml質(zhì)粒、100μg/ml T7RNA聚合酶、2mM20種未標(biāo)記的氨基酸、5μML-[U-14C]亮氨酸、0.33mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.26mM輔酶A、4.0mM草酸鈉和0.24體積的S30提取物。
省去作為能源的丙酮酸。在這種情況中，補(bǔ)充10mM磷酸鉀，pH7.2(用冰乙酸)有利于蛋白質(zhì)表達(dá)。除了用NTP(ATP、GTP、UTP和CTP)以外，也可用上述相同起始濃度的NMP(AMP、GMP、UTP和CMP)進(jìn)行反應(yīng)。起始于細(xì)胞提取物的每個反應(yīng)中有約3.3mM鎂、14.4mM鉀、2.4mM TRIS(pH8.2)和23.5mM乙酸。提取物占反應(yīng)體積的24％并用由鎂、鉀和tris乙酸鹽構(gòu)成的自身緩沖液配制。因此，該緩沖液加入反應(yīng)增加了這些物質(zhì)的濃度。以上濃度(3.3mM、14.4mM等)是已加入提取物后的終濃度。大腸桿菌總的tRNA混合物購自Roche MolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)。L-[U-14C]-亮氨酸得自Amersham PharmaciaBiotechnology(Uppsala，Sweden)。所有其它試劑得自Sigma(St.Louis，MO)。
使用大腸桿菌K12(菌株KCl，基因型A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaB met+)的粗S30提取物進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。按照以前所述制備提取物(Swartz等，(2004)，“使用原核的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄-翻譯的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成”(Cell-freeprotein synthesis with prokaryotic coupled transcription-translation)，刊于Balbas P，Lorence A編《重組蛋白質(zhì)方案分子生物學(xué)方法》(Recombinant Protein ProtocolsMethods in Molecular Biology)，系列第267卷，Totowa，NJHumana Press Inc.，第169-182頁)。質(zhì)粒pK7CAT用作蛋白質(zhì)合成的模板。pK7CAT使用T7啟動子和終止子編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的序列。按照Swartz等，(2004)制備的T7聚合酶加入反應(yīng)。從用液體閃爍計數(shù)儀檢測的TCA-不溶放射性和酶活性(Shaw，(1975)Methods Enzymol.43737-755)估算合成的蛋白質(zhì)的量。
本文顯示補(bǔ)充磷酸化合物在由谷氨酸代謝和氧化磷酸化激發(fā)的Cytomim系統(tǒng)中明顯有利于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)量。這描述于使用NTP或NMP的內(nèi)容中。就NTP而言，與不加磷酸化合物的反應(yīng)相比，我們觀察到表達(dá)6小時后氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)產(chǎn)生明顯增加(通過14C-亮氨酸摻入評價)(圖6)。當(dāng)使用核苷酸三磷酸時，加入磷酸化合物也增加了產(chǎn)量。
為優(yōu)化谷氨酸鹽/磷酸化合物系統(tǒng)中的CAT表達(dá)，測試了磷酸化合物濃度對Cytomim無細(xì)胞反應(yīng)(無丙酮酸鈉)的作用。在初始磷酸化合物濃度范圍上表達(dá)6小時后通過14C-亮氨酸摻入來評價氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)產(chǎn)生。加入10mM磷酸化合物觀察到最佳CAT產(chǎn)量(表2)。
表2
表1-Cytomim系統(tǒng)中基于相對總CAT表達(dá)的磷酸化合物優(yōu)化研究。使用Cytomim系統(tǒng)的條件(不用丙酮酸鈉和用NTP)進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。15微升反應(yīng)于37℃孵育6小時。使用以冰醋酸調(diào)節(jié)pH至7.25的磷酸鉀(二元，MallinckrodtPhillipsburg，NJ)。
為進(jìn)一步鑒定利用谷氨酸鹽代謝、NTP和補(bǔ)充磷酸化合物的該新方法，通過TCA可沉淀放射性和酶活性測定來定量CAT隨時間的累積。6小時孵育后，CAT的最終產(chǎn)量是802±48μg/mL(圖7)。CAT的可溶和活性部分約是70±3％(圖2)。由于加入磷酸鉀的成本低(10mM磷酸鉀為0.00016美元/mL反應(yīng)體積)，補(bǔ)充10mM磷酸化合物的蛋白質(zhì)生產(chǎn)產(chǎn)量增加了33％而不影響反應(yīng)的原料成本。
為證實(shí)新谷氨酸鹽和磷酸化合物系統(tǒng)的效用，進(jìn)行1mL夾套氣泡柱反應(yīng)。除了向反應(yīng)補(bǔ)充0.007％(v/v)Sigma0-30消泡劑以外，維持于37℃的轉(zhuǎn)錄和翻譯聯(lián)合反應(yīng)使用Cytomim條件(不用丙酮酸，用NTP并補(bǔ)充10mM磷酸化合物)進(jìn)行5小時。該試劑用于控制起泡。此外，向無細(xì)胞反應(yīng)室的底部以每秒2個氣泡的速度提供直徑約0.25cm的純氧氣泡以遞送ATP再生所需的氧。在每個時間點(diǎn)取樣通過14C-亮氨酸摻入測定來定量總CAT的量。圖8顯示了兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均CAT累積(～900μg/mL)。與15μl分批反應(yīng)相比(圖7)，氣泡柱形式具有較快的蛋白質(zhì)合成速度。
為定量用NMP替代NTP的影響，檢測在以標(biāo)準(zhǔn)起始濃度使用NMP或NTP的新系統(tǒng)中(谷氨酸鹽/10mM磷酸化合物)的CAT表達(dá)。蛋白質(zhì)合成反應(yīng)進(jìn)行6小時并取樣定量CAT累積。與使用NTP相比，使用NMP觀察到CAT產(chǎn)量降低了22％(圖9)。與使用NTP的反應(yīng)相比，盡管總蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低，但使用核苷一磷酸的成本益處導(dǎo)致明顯較高的生產(chǎn)產(chǎn)量(每一美元能源和核苷酸的毫克蛋白)(表3)。
也檢測了NMP反應(yīng)中磷酸化合物濃度范圍對蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量的作用。與以前的數(shù)據(jù)一致證實(shí)使用NMP的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)是磷酸化合物限制的，補(bǔ)充磷酸化合物對高產(chǎn)量至關(guān)重要。最佳的磷酸化合物濃度是10mM。與無磷酸化合物的無細(xì)胞反應(yīng)相比，加入10mM磷酸化合物后使產(chǎn)量增加超過400％(圖10)。
表3-1用當(dāng)前價格更新這些數(shù)值。現(xiàn)在它們與表1匹配。
表3-PANOx-SP(用NTP)、Cytomim(不用丙酮酸，用磷酸化合物和NTP)和Cytomim(不用丙酮酸，用磷酸化合物和NMP)系統(tǒng)的產(chǎn)物產(chǎn)量(mg蛋白質(zhì)/美元能源與核苷酸成本)。
在本文中，補(bǔ)充磷酸化合物顯示在由谷氨酸鹽激發(fā)的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中增加了33％的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量。除了通過增加產(chǎn)量提高該系統(tǒng)的效用之外，這增加產(chǎn)量而不影響原料(試劑成本)的總經(jīng)濟(jì)效益。特別是，與不用磷酸化合物的反應(yīng)相比，谷氨酸鹽代謝激發(fā)的無細(xì)胞反應(yīng)增加超過4倍。
補(bǔ)充磷酸化合物導(dǎo)致產(chǎn)量增加的結(jié)果是通過使用由谷氨酸代謝和氧化磷酸化激發(fā)的無細(xì)胞反應(yīng)，補(bǔ)充適度的磷酸化合物濃度和用NMP替代NTP使得與無細(xì)胞試劑相關(guān)的兩種主要試劑的成本(能量基質(zhì)與核苷酸)比常規(guī)PANOx-SP方法降低超過兩個數(shù)量級(增加160倍(59/0.37))(表3)。這些結(jié)果證實(shí)了無細(xì)胞rDNA蛋白質(zhì)合成的經(jīng)濟(jì)可行性。該新技術(shù)無需加入外源性輔因子。諸如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD+或乙酰輔酶A的化合物可用于補(bǔ)充蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量，但不是必需的。
權(quán)利要求
1.一種提高生物大分子體外合成的方法，該方法包括在存在外源性磷酸化合物時，在含有無磷酸化合物的能源的反應(yīng)混合物中合成所述生物大分子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述無磷酸化合物的能源是葡萄糖。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述無磷酸化合物的能源是谷氨酸鹽。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述無磷酸化合物的能源是丙酮酸。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化合物的濃度是約1mM-20mM。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷酸化合物以磷酸鉀、磷酸鎂或磷酸銨的形式提供。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸化合物以在反應(yīng)期間釋放的來源提供。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物含有核苷一磷酸。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述合成在沒有外源性核苷酸三磷酸時進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成包括翻譯mRNA以產(chǎn)生多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述合成還包括從DNA模板轉(zhuǎn)錄mRNA。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成以分批反應(yīng)進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子的合成以連續(xù)反應(yīng)進(jìn)行。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物含有在含葡萄糖培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌E.coli的提取物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌E.coli在含有葡萄糖和磷酸化合物的培養(yǎng)基中生長。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物含有濃度為約5mM-20mM的鎂。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物基本上不含聚乙二醇。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物含有精胺、亞精胺和腐胺中的一種或多種。
全文摘要
提供了體外合成生物分子的改進(jìn)方法，該方法提高了產(chǎn)量、降低了成本并增加了效用。通過在有外源性磷酸化合物，并且任選沒有外源性核苷酸三磷酸時使用無磷酸化合物的能源來提高產(chǎn)量和降低成本。
文檔編號C12P19/34GK101014716SQ200480033981
公開日2007年8月8日 申請日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者K·卡爾霍恩, M·C·朱伊特, J·R·斯沃茨 申請人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會