專利名稱：以重組牛免疫缺陷病毒為基礎的基因轉移系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及病毒載體領域，并且更具體地涉及新的重組慢病毒載體，產生所述載體的基因轉移系統(tǒng)，以及用于表達基因轉移系統(tǒng)和包裝及遞送重組載體的細胞系。
背景技術：
本公開文本及其它材料在文中用于闡釋本發(fā)明的背景，并且特別地，將提供了有關實施本發(fā)明的附加細節(jié)的案例特此并入作為參考，并且為方便計，在下文中以作者和日期引用，并在所附的參考文獻列表中分別分組。慢病毒含有基因gag、pol、env以及具有調控或結構功能的其它基因。慢病毒能夠侵染分裂和非分裂細胞，這與致腫瘤逆轉錄病毒大不相同，例如后者只能侵染分裂的細胞。正是這種侵染非分裂細胞的能力使得慢病毒成為體內和離體基因治療尤為有用的系統(tǒng)。在將慢病毒用于基因治療時的一個重要考慮是用作為載體的“安全”慢病毒的可獲得性。安全的逆轉錄病毒載體能夠將目的基因遞送到細胞中，但此過程中產生有復制能力病毒顆粒的能力下降。使這些載體安全的方法之一是在不同的DNA構建體上分離必需基因，其中病毒RNA包裝所需的必需基因如gag、pol和env基因，與向侵染的細胞核和染色體遞送異源目的基因所必需的DNA序列和基因在不同DNA構建體上提供。已研發(fā)了包裝細胞系和載體產生細胞系以滿足這種需要。簡要地，這種方法使用兩種組分，即慢病毒載體和包裝細胞系。慢病毒載體含使原病毒DNA整合到宿主染色體所必需的長末端重復(LTR)、要轉移的異源核苷酸序列以及使得病毒RNA能夠包裝進入傳染性但復制缺陷型載體的包裝序列。向真核細胞進行基因遞送所用的病毒載體通常如此構建，從而許多必需的病毒基因缺失并替換為目的基因。復制缺陷型慢病毒載體自身不會復制，因為編碼結構和包膜蛋白如GAG、POL和ENV的基因不包含在載體基因組內。從載體上缺失掉的基因通常由包裝細胞系中的一個或多個輔助或包裝構建體提供。包裝細胞系含有編碼必需的GAG、POL和ENV蛋白的基因，但這些基因構建體不含包裝信號(文中也稱之為“包裝序列”)。從而，包裝細胞系自身只能夠形成空的病毒粒子顆粒。然而，為了包裝目的基因以遞送到靶細胞中，必須反式提供必需的病毒基因，從而重組病毒載體構建體能夠組裝為傳染性但復制缺陷型載體。當將具有包裝信號的慢病毒載體構建體引入到包裝細胞系中時，細胞系將產生含有慢病毒載體構建體基因組的載體顆粒，而無其它必需慢病毒基因。通過從載體構建體中除去必需基因，所產生的傳染性病毒顆?；蜉d體能夠將異源目的基因遞送到侵染的細胞中，而不會產生有復制能力的病毒。在這種方式下，只有當反式提供必需基因時，宿主細胞才能生產包含帶目的基因的載體構建體的重組復制缺陷型載體(PCT申請?zhí)朠CT/US00/33725(WO 01/44458))。不過，目前應用的載體和包裝構建體細胞系存在若干缺點。一個問題涉及生產者細胞產生有復制能力的慢病毒。簡要地，例如當含載體DNA的構建體與含另外的必需病毒基因的構建體相互重組時，或者當載體DNA或含另外的必需病毒基因的構建體與生產者細胞中同源的隱含內源逆轉錄病毒元件重組時，有復制能力的病毒可在常規(guī)的生產者細胞中產生。此外，在轉染載體構建體后，如果重組慢病毒載體遇到宿主細胞中的同源序列，侵染的宿主細胞很可能允許載體基因組和存在于宿主細胞內的內源病毒序列之間的重組。最近的一個構建更為安全的包裝細胞系的途徑涉及使用輔助病毒元件的互補部分，其分割在兩個不同的質粒間，一個含gag和pol，而另一個含env(見Markowitz等，J.Virol.621120-1124；以及Markowitz等，Virology 167600-606，1988)。這種雙質粒系統(tǒng)的一個有益之處在于產生有復制能力的基因組需要三個重組事件。該途徑使得野生型病毒基因組多組分共包裝和隨后轉移的能力降至最低程度，而且由于包裝細胞中包含重組慢病毒系統(tǒng)的不同DNA組分的存在，顯著降低了重組頻率。然而，雙組分系統(tǒng)的缺點包含與載體構建體同源的DNA部分，因而保留了通過構建體之間的同源重組產生有復制能力的病毒的可能性?；谌祟惷庖呷毕莶《?HIV)的基因轉移系統(tǒng)是迄今為止研發(fā)得最多的慢病毒系統(tǒng)，文檔記載的有體內大鼠大腦、視網膜和肌肉以及肝細胞的轉導。然而，HIV是AIDS的致病因子。另外，已用HIV-1衍生的載體離體轉導了人類角膜組織，而且體外轉染的未刺激的造血干細胞已發(fā)育為淋巴細胞發(fā)育體內模型中的成熟T和B細胞(Douglas等，Hum Gene Ther.12(4)401-413(2001)；Miyoshi等，Virol.728150-8157(1999))?；贖IV的重組慢病毒載體引起了基因治療的多種安全顧慮。例如，已假設如果復制缺陷型HIV載體要與潛伏或瞬時侵染細胞的內源人類慢病毒重組，則將會存在產生有復制能力的HIV的幾率。非人或者特別是非靈長類慢病毒例如BIV在同一宿主細胞內遭遇同源病毒序列的幾率是極不可能發(fā)生的。為規(guī)避與基于HIV的慢病毒載體相關的安全顧慮，動物慢病毒例如貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)、綿羊髓鞘脫落病毒(visna virus)已被用來產生基因轉移載體。不過，已經證明由這些動物慢病毒衍生的載體不如由HIV衍生的載體性能好(PriceMA等，2002，Molecular Therapy；O′Rourke JP等，2002，Journal ofVirology；Ikeda Y等，2002，Gene Therapy；Berkowitz RD等，2001，Virology)。牛免疫缺陷病毒(BIV)被分類在逆轉錄病毒亞科慢病毒科。慢病毒是外生的非致瘤性逆轉錄病毒，并且其中包含馬傳染性貧血病病毒(EIAV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、綿羊髓鞘脫落病毒和行進性綿羊肺炎病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)和人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)。在慢病毒中，科之間具有截然不同的同源性等級。牛免疫缺陷病毒與HIV、SIV、FIV、EIAV、綿羊髓鞘脫落病毒沒有明顯的總體同源性(Garvey KJ等，1990，Virology；Gonda MA等，1994，Virus Research)。在系統(tǒng)發(fā)生分析中，BIV是離HIV和SIV最遠的慢病毒(Gonda MA等，1994，Virus Research)。與其它慢病毒不同，BIV尚未深入研究，某些重要的BIV元件例如包裝信號序列和Rev應答元件(RRE)的定位尚未鑒定。因此，由該病毒得到改進的基因轉移系統(tǒng)構成重大挑戰(zhàn)。在深入研究后，本發(fā)明繪制了BIV包裝信號序列和RRE序列，并產生了改進的BIV載體。由BIV衍生的載體在滴度、轉導效率以及體外和體內的基因表達持續(xù)時間上同基于HIV的載體性能一樣好。BIV感染奶牛，且有害作用不明。同HIV一樣，BIV具有輔助基因，但多數(shù)與HIV的截然不同。BIV在系統(tǒng)發(fā)生上與HIV截然不同，并且不輕易感染T細胞。其在體內主要地見于單核細胞和脾的巨噬細胞。水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV-G)與其它病毒的基因組和基質組分有效地形成假型病毒粒子。含VSV-G包膜的重組BIV病毒構建體已被成功地引入到人類細胞中，具有接近于HIV基因轉移系統(tǒng)中所看到的異源基因的轉導和表達效率(Berkowitz等，J.Virol.7(7)3371-3382(2001))。Olsen的美國專利6,277,633描述了基于EIAV的重組慢病毒載體表達系統(tǒng)，包含屬于gag/pol表達載體的第一載體，具有載體基因組反轉錄所必需的順式作用序列元件的第二載體，包裝序列，而且額外包含可插入異源基因的多克隆位點。Olsen所述的系統(tǒng)也利用表達病毒包膜蛋白的第三載體。第一和第三載體是包裝信號缺陷型的。本發(fā)明提供了優(yōu)化的基于BIV基因組的基因轉移系統(tǒng)，用以向廣范圍的真核細胞轉移異源基因。設計本發(fā)明的系統(tǒng)、載體和包裝細胞系以使系統(tǒng)中不同構建體之間的同源性最小化，由此減小產生有復制能力的BIV載體的可能性。
發(fā)明概述本發(fā)明包含基因轉移系統(tǒng)，其中包裝病毒RNA和將原病毒DNA整合到侵染的細胞染色體中所必需的BIV慢病毒包裝基因和順式作用基因在不同的DNA構建體上提供，其中一個或多個構建體含一個或多個BIV包裝基因，其可與另外的DNA構建體互補以提供將異源目的基因遞送給靶細胞的復制缺陷型傳染顆粒。構建體的多種組分可在同一個或不同的DNA分子上提供，并且可包含3、4或5個單獨的構建體。在一個實施方案中，本發(fā)明包含重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，其中產生重組復制缺陷型載體所必需的基因在三個不同的DNA構建體上提供，該系統(tǒng)包含包裝構建體，包含BIV gag基因和BIV pol基因；病毒表面蛋白基因構建體，包含病毒表面蛋白基因；以及轉移載體構建體，含DNA片段，所述片段包含異源目的基因和最小化的用以將異源目的基因包裝到復制缺陷型載體中的BIV包裝序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了三構建體系統(tǒng)，包含(a)包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的第一啟動子；(b)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的第二啟動子；和(c)轉移載體構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含的第三啟動子可操作地順序連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR(非翻譯區(qū))區(qū)、最小BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的第四啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)、第二R區(qū)以及任選地第二U5區(qū)；位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上的rev基因；其中所有的啟動子可以相同或不同。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，其中產生重組復制缺陷型載體所必需的基因在四個不同的DNA表達構建體上提供，該系統(tǒng)包含包裝構建體，含包含BIV gag基因和BIV pol基因的DNA片段；rev構建體，含包含BIV rev基因的DNA片段；病毒表面蛋白基因構建體，含包含病毒表面蛋白基因的DNA片段；以及轉移載體構建體，含包含異源目的基因和BIV包裝序列的DNA片段，所述包裝序列用以將異源目的基因包裝到復制缺陷型載體中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種四構建體系統(tǒng)，包含重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，其包含(a)包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的第一啟動子；(b)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的第二啟動子；(c)rev構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的第三啟動子；和(d)轉移載體構建體，包含DNA片段，所述DNA片段的第四啟動子包含可操作地順序連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、最小BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的第五啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)、第二R區(qū)以及任選地第二U5區(qū)；其中所有的啟動子可以相同或不同。又在另一實施方案中，本發(fā)明包含重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，其中產生重組復制缺陷型載體所必需的基因在五個不同的DNA表達構建體上提供，該系統(tǒng)包含第一包裝構建體，包含BIV gag基因；第二包裝構建體，包含BIV pol基因；rev構建體，包含rev基因；病毒表面蛋白基因構建體，包含病毒表面蛋白基因；以及轉移載體構建體，含DNA片段，所述片段包含異源目的基因和BIV包裝序列，后者用以將異源目的基因包裝到復制缺陷型載體中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種五構建體系統(tǒng)，包含(a)第一包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；(b)第二包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子；(c)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的第三啟動子；(d)rev構建體，包含可操作地連接于rev基因的第四啟動子；和(e)轉移載體構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含的第五啟動子可操作地順序連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的第六啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)、第二R區(qū)以及任選地第二U5區(qū)；其中所有的啟動子可以相同或不同。在一個實施方案中，一個或多個啟動子是調控型啟動子。例如，在多個例示性的實施方案中，調控型啟動子選自誘導和抑制型啟動子、誘導型啟動子、抑制型啟動子以及組織特異性啟動子。在另一個實施方案中，可操作地連接于異源基因的啟動子是組成型啟動子。在另一個實施方案中，可操作地連接于異源基因的啟動子是調控型啟動子。在另一個實施方案中，可操作地連接于異源基因的啟動子是組織特異性啟動子。在另一個實施方案中，可操作地連接于異源基因的啟動子是誘導型或抑制型的。在另一個實施方案中，可操作地連接于gag或pol基因中至少之一的啟動子是調控型的。在另一個實施方案中，可操作地連接于gag或pol基因中至少之一的啟動子是誘導型或抑制型的。在另一個實施方案中，可操作地連接于病毒表面蛋白基因的啟動子是調控型的。在另一個實施方案中，可操作地連接于病毒表面蛋白基因的啟動子是誘導型或抑制型的。在優(yōu)選的實施方案中，具有BIV包裝序列和異源目的基因的轉移載體構建體包含的啟動子可操作地連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝序列、BIV RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的啟動子、U3區(qū)和第二R區(qū)以及任選地第二U5區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的多種基因轉系統(tǒng)包含重新編碼的(密碼子優(yōu)化的)核酸序列，其中重新編碼的序列編碼野生型BIV基因功能，但與以前的BIV基因轉移系統(tǒng)相比，在系統(tǒng)的不同DNA構建體之間具有降低的序列同源性。在另一實施方案中，本發(fā)明的多種基因轉系統(tǒng)包含重新編碼的核酸序列，其中重新編碼的序列編碼野生型BIV基因功能，但包含重新編碼的真核細胞中蛋白翻譯的最佳使用的密碼子。在尤其優(yōu)選的實施方案中，真核細胞是人類細胞。本發(fā)明進一步提供了利用本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)的包裝細胞和包裝細胞系。所述包裝細胞和細胞系包含包裝構建體(單個或數(shù)個)和病毒表面蛋白基因構建體。本發(fā)明進一步提供了利用本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)的生產者細胞和生產者細胞系，其包含包裝構建體(單個或數(shù)個)、病毒表面蛋白構建體以及轉移載體構建體。本發(fā)明另外提供了利用本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)、細胞和細胞系產生復制缺陷型重組慢病毒載體的方法。本發(fā)明也提供了通過在生產者細胞中表達本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)產生的載體。向包裝細胞中加入轉移載體構建體則導致形成生產者細胞。生產者細胞產生病毒粒子或含載體RNA的載體。用載體侵染細胞則導致異源目的基因轉移到細胞中和異源目的基因在細胞中的表達。又在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療動物的方法，包含使動物細胞與本發(fā)明的重組慢病毒載體接觸。動物細胞的接觸可在體內或體外發(fā)生。本發(fā)明進一步提供了用于人類的具有提高的安全性的重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，其中當被引入到例如被野生型HIV侵染的編碼和表達HIV包裝基因的細胞中時，系統(tǒng)中基于BIV的載體RNA不能被包裝到傳染性載體中。本發(fā)明進一步提供了基因轉移載體以及基因轉移和表達的方法，其可用于基因功能研究中改變特定細胞類型中的基因表達模式。根據(jù)本發(fā)明，已確定了含BIV包裝序列中將病毒RNA有效包裝到傳染性載體中所必需的最小核酸序列在BIV基因組中的遺傳定位。也已經確定了BIV基因組的含cPPT(中心聚嘌呤帶)遺傳定位，所述cPPT促進含原病毒核酸的慢病毒預整合復合體進入侵染細胞的核膜。已經證明cPPT增強慢病毒預整合復合體核輸入到非分裂細胞中，盡管cPPT不是慢病毒載體轉導非分裂細胞絕對必需的。也已經確定了BIV基因組的含核糖體移碼位點的遺傳定位，所述位點使得BIV gag和pol基因能夠從單個mRNA轉錄物共同翻譯。在一個實施方案中，運用gag和pol基因之間移碼位點的知識重新編碼這些基因。結果，重新編碼的gag和pol以更大的效率在宿主細胞中翻譯，提供了具有提高的病毒滴度的重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)。同樣，重新編碼的gag和pol基因提供了在包裝構建體和載體構建體之間具有減小的同源性的重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)。此外，并非束縛于任何理論，相信重新編碼的gag和pol基因序列在由其表達的mRNA中具有改變的二級結構，由此提供了無需RRE序列而在載體產出細胞中功能性表達gag和pol的重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)。從gag/pol構建體中消除RRE消除了與載體構建體中RRE序列的所有同源性，由此進一步消除了產生有復制能力的重組慢病毒的可能性。本發(fā)明的這個方面提供了附加的安全措施。也已經確定了BIV pol基因的RNA編碼序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了由SEQ ID NO50所示的野生型pol組成的核酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了如SEQ ID NO52所示的重新編碼的pol序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼BIV pol基因產物的多肽序列的如SEQ ID NO51所示的分離的核酸。又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了如SEQ ID NO53所示的合成的核酸，它是在野生型BIV pol基因序列中添加了ATG密碼子的合成序列。又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了如SEQ ID NO54所示的合成的核酸，它是在重新編碼的BIV pol基因序列中添加了ATG密碼子的合成序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的gag/pol構建體含有如PCR申請PCT/EP02/02807(WO 02/072851)中所述的突變，其中蛋白酶編碼序列包含與編碼的慢病毒蛋白酶中T26S取代相應的突變。也已經確定了BIV基因組中rev基因的遺傳定位。利用rev定位的知識，合成了在單個開放讀框中編碼rev基因的DNA。從而構建了重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因在不同于gag和pol的表達載體上提供。rev基因可以作為包含在兩個外顯子中的剪接信息，或者作為在一個外顯子和開放讀框中編碼的單個信息表達。也已經確定了BIV基因組中BIV RRE的遺傳定位。它是位于BIV env區(qū)含BIV RRE基因序列的312個核苷酸序列，如SEQ ID NO40所示。本發(fā)明進一步包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)基包含組蛋白脫乙?；敢种苿?，由此與無組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的條件相比，產生具有更高滴度和更高宿主細胞侵染性的重組復制缺陷型載體。
附圖簡述

圖1是表示BIV三基因轉移系統(tǒng)的示意圖。圖2是表示BIV四基因轉移系統(tǒng)的示意圖。圖3顯示了由含不同量的gag序列的BIV載體轉導的細胞中eGFP表達的流式細胞儀分析。圖A)假侵染的，B)來自pBSV4MGppt的BIV載體，C)來自pBIVminivec的BIV載體，D)來自含28 bp gag序列的pBV28的BIV載體，E)來自含54 bp gag序列的pBV54的BIV載體，F(xiàn))來自含101 bp gag序列的pBV101的BIV載體。圖4顯示了含BIV或HIV cPPT的BIV載體的轉導效率的功能比較。圖5顯示了BIV Pol翻譯核糖體移碼位點。圖6顯示了表示重新編碼的BIV gag/pol表達構建體的示意圖。圖7顯示了在病毒載體生產期間添加組蛋白脫乙?；敢种苿谂Ｃ庖呷毕莶《镜穆《据d體生產的成效。圖8顯示了在病毒載體生產期間添加組蛋白脫乙酰基酶抑制劑對基于牛免疫缺陷病毒的慢病毒載體轉導效率的成效。
序列表的簡短說明伴隨本公開文本的序列表特此并入作為本公開文本的參考。以下是對該序列表中所含序列的說明SEQ ID NO1牛免疫缺陷病毒。SEQ ID NO2-9 寡核苷酸。SEQ ID NO10 Rev基因。SEQ ID NO11-38寡核苷酸。SEQ ID NO39 BIV包裝信號。SEQ ID NO40 含BIV RRE序列的312 bp BIV env序列。SEQ ID NO41-48寡核苷酸。SEQ ID NO49 重新編碼的BIV gag/pol的DNA序列。SEQ ID NO50BIV pol DNA序列。SEQ ID NO51BIV pol氨基酸序列。SEQ ID NO52重新編碼的BIV pol DNA序列。SEQ ID NO53帶ATG的野生型BIV Pol序列。SEQ ID NO54帶ATG的重新編碼的BIV pol DNA序列。SEQ ID NO55HIV蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQ ID NO56BIV蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQ ID NO57突變HIV HXB2蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQ ID NO58突變BIV蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQ ID NO59具有蛋白酶突變的重新編碼的gag/pol。SEQ ID NO60小鼠RdCVF1 cDNA。SEQ ID NO61翻譯的小鼠RdCVF1 cDNA的氨基酸序列。SEQ ID NO62人類RdCVF1 cDNA。SEQ ID NO63翻譯的人類RdCVF1 cDNA的氨基酸序列。SEQ ID NO64小鼠RdCVF2 cDNA。SEQ ID NO65翻譯的小鼠RdCVF2 cDNA的氨基酸序列。SEQ ID NO66人類RdCVF2 cDNA。SEQ ID NO67翻譯的人類RdCVF2 cDNA的氨基酸序列。SEQ ID NO68索戈托病毒包膜。SEQ ID NO69翻譯的索戈托病毒包膜的氨基酸序列。SEQ ID NO70重新編碼的索戈托病毒包膜。SEQ ID NO71翻譯的重新編碼的索戈托病毒包膜的氨基酸序列。
發(fā)明詳述除非另行指出，本發(fā)明的實施將使用本領域技術人員所熟知的細胞生物、分子生物、細胞培養(yǎng)、病毒學、免疫學等常規(guī)技術。這些技術充分公開在當前的文獻中，并且可參照例如Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，Sambrook等(1989)；Cell Biology，ALaboratory Handbook，Celis(1994)；Bahnson等，J.of Virol.Methods，54131-143(1995)；Culture of Animal Cells，A Manualof Basic Techniques.Freshney(1994)；Rigg等，Virology 218290-295。如本文所用，單數(shù)形式的“一”、 “一個”以及“該”包含復數(shù)援引，除非上下文另行明確指出。例如，援引“載體顆?！睂瑥蛿?shù)個的載體顆粒。術語“構建體”在質粒上下文中通常是指DNA序列，但在同一個質粒上可提供多個構建體。術語“基因”和“編碼序列”在文中互換使用，并且指編碼蛋白的“開放讀框”。術語“缺陷型”在文中是指與野生型相比在生物活性、編碼或表達其基因產物或作為順式作用核酸序列方面沒有功能或具有下降的功能的病毒載體或核酸序列。以非限制性的實例舉例說明缺陷型env基因序列將不會編碼ENV蛋白；缺陷型包裝信號將不會與天然包裝信號以相同的效率促進該缺陷型信號所定位的核酸分子的包裝；而復制“缺陷型”慢病毒顆粒在進入宿主細胞后將不能夠復制和產生新的傳染性病毒顆粒。所述核酸序列可通過本領域公知的任何方法制備，包含缺失某些或全部序列、使序列置于框外、或以其它方式封閉序列。如本文所用，術語“缺失掉”或“缺失”是指特定片段的整體缺失，或者特定片段中按照標準用法足以使該片段無效或無功能的部分缺失。如本文所用的術語“復制缺陷型”是指編碼BIV結構蛋白的構建體在生產者或包裝細胞中不能被核衣殼包裹或者以可忽略的水平被核衣殼包裹。所得的慢病毒顆粒是復制缺陷型的，是因為包裝的載體不包含核衣殼化所需的所有病毒結構蛋白，至少一個所需的結構蛋白從中缺失掉，從而包裝的載體不能夠復制全部的病毒基因組。如本文所用的短語“必需基因”或“BIV必需基因”是指編碼BIV基因組核衣殼化(如包裝)所需的蛋白以產生傳染性慢病毒顆粒的基因，并且包含gag、pol、env和rev，載體基因組RNA反轉錄為原病毒DNA以及原病毒DNA整合到靶細胞基因組中所需的順式作用元件(如BIV LTR)。“表達構建體”是指包含一個或多個基因的DNA片段，或者包含在該DNA片段上的基因的一部分，其中基因或基因的一部分可包含啟動子和增強子區(qū)的組合，包含本領域公知的編碼的蛋白或核酸轉錄和翻譯的所有附屬區(qū)、編碼蛋白的開放讀框、順式作用調控元件等。另外，此類構建體可含有復制起點，從而整個構建體可在宿主細胞中復制。
本發(fā)明的構建體在一個或多個DNA構建體中提供。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的每一個構建體都在不同的DNA分子上提供?！安《颈砻娴鞍谆驑嫿w”是指編碼和表達病毒表面蛋白基因的DNA片段。如本文所用的術語“核酸序列”或“基因序列”旨在指核酸分子(優(yōu)選DNA或RNA)。此類核苷酸序列可源自于許多來源，包含基因組DNA、cDNA、合成DNA、原病毒DNA、病毒RNA、mRNA、合成RNA或其組合。此類基因序列可包含基因組DNA，它可能或可能不包含天然存在的內含子。而且，此類基因DNA可與啟動子序列或多聚腺苷?；蛄幸黄皤@得?；蚪M或cDNA可以本領域普通技術人員熟知的許多方法獲得。例如，基因組DNA可通過本領域熟知的方法從合適的細胞中提取和純化。或者，可從細胞中分離mRNA，并通過反轉錄或其它方法用于制備cDNA。術語“可操作地連接于”用來描述基因序列和啟動子或其它調控或加工序列之間的鏈接，從而所述基因序列的轉錄由可操作連接的啟動子序列指導，所述基因序列的翻譯由可操作連接的翻譯調控序列指導，和/或所述基因序列的翻譯后加工由可操作連接的加工序列指導。非限制性的實例包含ATG起始密碼子、輸出多肽的前導序列、核糖體結合位點等。例如，可操作地連接于基因的啟動子將維系該基因在宿主細胞中的表達。如果基因序列不含其自身的啟動子和ATG起始密碼子，就像BIV pol基因序列的情況一樣，這些附屬序列可利用本領域熟知的技術提供。術語“同一的”或“同一性”百分比在兩個或多個核酸或蛋白序列的上下文中是指，當比較和比對最大一致性時，通過使用文中所述的序列比較算法之一如Smith-Waterman算法或通過視覺觀察判斷，兩個或多個序列或亞序列是相同的，或者特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的。對于序列比較，典型地是一個序列作為參照序列，測試序列與之進行比較。當使用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，如有必要設計亞序列坐標，并設計序列算法程序參數(shù)。序列比較算法進而根據(jù)設計的程序參數(shù)，計算測試序列相對于參照序列的序列同一性百分比。例如，用于比較的最佳序列比對可通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性對比算法、通過Pearson和Lipman，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 852444(1988)查找相似性的方法、通過這些算法的計算機化執(zhí)行(Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)、通過BLAST算法，Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)，其軟件公眾可通過國家生物技術信息中心(http//www.ncbi.nlm.n ih.gov/)獲得，或者通過視覺觀察(大致參見Ausubel等，下文)進行。對于本發(fā)明的目的，用于比較的最佳序列比對最優(yōu)選通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法進行。在本發(fā)明的上下文中，術語“分離的”是指通過人工遠離其天然環(huán)境存在因而不是天然產物的核酸分子、多肽、病毒或細胞。分離的核酸分子或多肽可以純化的形式存在，或可存在于非天然環(huán)境中例如象重組宿主細胞中。分離的病毒或細胞可以純化的形式存在，例如在細胞培養(yǎng)物中，或者可存在于非天然環(huán)境中例如重組或異種生物體中。術語“天然的”是指存在于野生型病毒或細胞基因組中的基因。術語“天然存在的”或“野生型”用來描述能夠在自然中見到的與人工制備的截然不同的物質。例如，存在于生物體(包含病毒)中的蛋白或核苷酸序列，其可以從自然來源分離，并且未在實驗室中被人為地故意修飾，是天然存在的。談及特定核酸序列的術語“基本上包含”是指該特定序列在5’或3’端或兩端可具有多達20個附加殘基，其中附加殘基實質上不影響所述序列基本的和新的特征。本發(fā)明的啟動子序列可包含真核或原核起源的啟動子，并且將足以指導位于遠端的序列(即連接該啟動子3’端的序列)在細胞中的轉錄。啟動子區(qū)也可以包含增強或阻遏轉錄的控制元件。合適的啟動子有巨細胞病毒即早期啟動子(pCMV)、勞斯肉瘤病毒長末端重復啟動子(pRSV)、以及SP6、T3或T7啟動子。任選地，啟動子上游的增強子序列或編碼區(qū)下游的終止子序列可包含在本發(fā)明的載體中以促進表達。本發(fā)明的載體也可以包含附加的核酸序列，例如多聚腺苷?；蛄校⑶铱删幋a定位序列或信號序列，足以使細胞快速和有效地加工由載體核酸表達的蛋白。優(yōu)選的多聚腺苷?；蛄械膶嵗荢V40早區(qū)多聚腺苷酰化位點(C.V.Hall等，J Molec.App.Genet.2，101(1983))和SV40晚區(qū)多聚腺苷?；稽c(S.Carswell和J.C.Alwine，Mol.Cell Biol.9，4248(1989))。如果期望轉錄，則將此類附加序列插入到載體中，從而它們可操作地與啟動子序列連接，或者如果期望翻譯和加工，則額外具有起始和加工序列?；蛘撸迦胄蛄锌煞胖迷谳d體的任何位置上。術語“包裝構建體”有時也稱之為“輔助者構建體”，是指DNA序列，通常存在于質粒上，但其可以摻入到生產者細胞的基因組中，它能夠指導反式提供的一個或多個慢病毒必需基因表達為獲得慢病毒載體顆粒所必需的蛋白。如本發(fā)明中所用的“包裝信號”或“包裝信號序列”是指將病毒載體RNA有效包裝為傳染性病毒粒子所必需的病毒RNA(或DNA)?！爸匦戮幋a的”基因是指以此種方式改變的基因(單個或數(shù)個)，即核酸編碼的多肽仍與未變的序列相同，但編碼該多肽的核酸序列改變了。本領域熟知由于遺傳密碼的簡并性，存在可編碼相同氨基酸翻譯產物的多個DNA和RNA密碼子。例如，在一個實施方案中，編碼BIV gag和/或pol基因的DNA序列被“重新編碼”，從而核苷酸序列被改變，但GAG和POL多肽的氨基酸翻譯序列仍與野生型氨基酸序列完全相同。此外，也公知不同的生物體具有使用特定密碼子合成氨基酸的不同的偏好。術語“載體”是指當編碼病毒載體構建體序列的RNA包裝到病毒載體顆粒中時獲得的重組復制缺陷型慢病毒載體。因而，重組慢病毒載體既指顆粒又指其中所含的RNA?！拜d體構建體”是指DNA序列，通常是在質粒的上下文中，編碼將產生能夠包裝到傳染性病毒載體顆粒中的RNA的序列。一般而言，慢病毒共有復制循環(huán)的基本特征，包含將病毒RNA包裝到病毒載體顆粒中、侵染靶細胞、產生RNA基因組的DNA原病毒拷貝、將DNA運輸?shù)剿拗骷毎酥?、將原病毒DNA整合到靶細胞染色體中、由整合的DNA轉錄病毒mRNA、表達gag、pol和env基因、以及將RNA病毒轉錄物包裝到從宿主細胞中釋放的成熟病毒顆粒中。慢病毒基因組的長末端重復(LTR)含有對于反轉錄、病毒DNA整合和轉錄以及腺苷?；匾捻樖阶饔眯蛄校⑶乙粋€或多個這些元件可摻入到本發(fā)明的構建體中。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體構建體包含與LTR 5’端足夠數(shù)目的核苷酸相應的核苷酸以產生功能性LTR，它能夠指導載體RNA反轉錄為原病毒DNA，并將原病毒DNA整合到靶細胞基因組中。所述構建體也可以包含3′LTR區(qū)并且包含U3區(qū)、R區(qū)以及任選地U5區(qū)。gag基因是慢病毒基因組中最5′端的基因，并且編碼形成成熟病毒顆粒的結構蛋白。所述gag基因被翻譯產生前體多肽，其隨后被切割產生3到5個結構蛋白。pol基因編碼酶，參與切割慢病毒聚蛋白產物、反轉錄病毒RNA和整合原病毒DNA進入宿主染色體。env基因編碼包膜蛋白，其包含BIV和逆轉錄病毒的病毒表面蛋白。如本公開文本中所用的，env基因不僅包含天然env基因序列，而且包含env基因的修飾(包含改變逆轉錄病毒和慢病毒靶特異性的修飾)，或者包含用于產生假型逆轉錄病毒/慢病毒的env基因(如參見WO 92/14829)。一般而言，術語“包膜表面蛋白基因”和“env基因”意味著具有相同的含義，除非另行具體指出。env基因可來源于任何病毒，包含逆轉錄病毒。env優(yōu)選允許轉導人類或其它物種的細胞?？赡芷谕ㄟ^用抗體或靶向受體或特定細胞類型的特定配體連接包膜蛋白以靶向所述重組病毒。在這樣的實施方案中，與包膜蛋白組合的抗體或配體都將包含病毒表面蛋白基因。優(yōu)選地，配體是在遺傳上摻入到ENV蛋白中的肽序列。例如，載體可通過插入糖脂、蛋白或肽而變成靶特異性的。此外，靶向可通過利用抗體或重組抗體類分子如單鏈抗體的抗原結合部分實現(xiàn)，以靶向慢病毒載體。此外，載體趨向性或特異性靶向可通過載體包膜蛋白的特異性修飾完成，例如向包膜中插入配體(如硫酸肝素蛋白聚糖結合基序)。包膜包含但不限于VSV-G包膜、LCMV包膜(Beyer等，J Virol.，1；76(3)1488-95)、突變VSV-G包膜或突變體LCMV包膜。在另一個實施方案中，配體可在親嗜性包膜蛋白上表達，它將作為支架展示所述配體。在優(yōu)選的實施方案中，親嗜性包膜被修飾以提高載體穩(wěn)定性(PCT申請PCT/USO 1/2903 6(WO 02/22663))。本領域技術人員將會知曉，或者無需過度實驗能夠容易地確定實現(xiàn)向特定靶遞送慢病毒載體的特定方法。BIV的基本基因組組織在Garvey等(Virology，175391-409，1990)和美國專利5,380,830中公開。BIV克隆127的原病毒LTR長度為589個核苷酸，并且由U3、R和U5元件組成(見美國專利5,380,830)。根據(jù)本文提供的以及來自保藏中心和數(shù)據(jù)庫的公開內容如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，例如ATCC保藏號68092和ATCC保藏號68093以及GENBANK，適用于制備載體構建體的編碼BIV的序列以及含慢病毒基因組的質?？扇菀椎孬@得。如本發(fā)明中所用的“最小包裝信號”是指含有效包裝病毒載體RNA必需的所有序列，而同時消除了有效包裝非必需的多數(shù)核苷酸的包裝信號。以這種方式，有可能最小化包裝信號和存在于慢病毒基因轉移系統(tǒng)的重組構建體中的其它病毒基因或核酸片段之間的同源性。BIV的最小包裝信號示于SEQ ID NO39，它含非翻譯區(qū)(在5’LTR和gag起始密碼子以及gag編碼序列的頭101個核苷酸之間)。本領域技術人員將會容易地意識到有可能進一步缺失核苷酸而同時能夠有效包裝病毒載體RNA。文中報道了另外的BIV核酸序列，包含最小BIV RRE，位于gag和pol基因之間的核糖體移碼位點，以及重新編碼的gag和pol序列，其保障了本發(fā)明的包裝構建體和載體構建體之間減小的同源性。“RRE”或“RRE序列”是指與rev基因產物相互作用以促進病毒RNA從侵染細胞的細胞核中輸出的核酸序列?！白钚RE”或“最小RRE序列”是指包含從宿主細胞核中有效輸出含RRE的RNA必需的所有序列，而同時消除了有效RNA輸出非必需的多數(shù)核苷酸的RRE。以這種方式，有可能最小化RRE和存在于慢病毒基因轉移系統(tǒng)的重組構建體中的其它病毒基因或核酸片段之間的同源性。本領域技術人員將會容易地意識到有可能進一步缺失而仍然保留RRE功能。BIV的最小RRE描述在SEQ ID NO40中。以前已經描述過在不同的DNA片段上包含多種BIV基因組組分的一、二和三構建體系統(tǒng)。如參見WO 01/44458。這些系統(tǒng)包含利用BIV gag和pol基因的包裝構建體，編碼病毒表面蛋白基因的env構建體，以及具有BIV包裝信號的載體構建體，以將目的異源序列包裝到重組慢病毒粒子中。以前描述的包裝BIV RNA必需的包裝信號據(jù)報道跨越BIV gag基因的頭200個堿基對。以前描述的三組分系統(tǒng)包含BIV載體構建體，含包裝序列和轉基因(或異源目的基因)，BIV包裝構建體，含來自BIV的gag和pol基因，以及env構建體，含編碼病毒表面蛋白的基因。本發(fā)明提供了三組分慢病毒基因轉移系統(tǒng)，包含(i)包裝構建體，含BIV gag和BIV pol基因，(ii)病毒表面蛋白基因構建體，含病毒表面蛋白基因；和(iii)轉移載體構建體，含異源目的基因和BIV包裝信號以及位于所述構建體之一上的rev基因。本發(fā)明也提供了四組分慢病毒基因轉移系統(tǒng)，包含(i)包裝構建體，含BIV gag和BIV pol基因，(ii)病毒表面蛋白基因構建體，含病毒表面蛋白基因，(iii)轉移載體構建體，含異源目的基因和BIV包裝信號，和(iv)包含rev基因的rev表達構建體。本發(fā)明進一步提供了五組分慢病毒基因轉移系統(tǒng)，包含第一包裝構建體，含BIV gag基因，第二包裝構建體，含BIV pol基因，病毒表面蛋白基因構建體，含病毒表面蛋白基因，轉移載體構建體，含異源目的基因和BIV包裝信號，以及rev基因構建體。本發(fā)明的轉移載體構建體也提供了功能性基因轉移載體必需的順式作用病毒序列。此類序列包含包裝序列(Ψ)、反轉錄信號、引物結合位點、整合信號以及多聚腺苷酰化序列。轉移載體構建體也可以包含將目的異源序列轉移到分裂或非分裂細胞中的克隆位點。在優(yōu)選的實施方案中，具有BIV包裝信號和異源目的基因的轉移載體構建體按5′到3′次序包含可操作地連接于R區(qū)的啟動子、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝信號、RRE、可操作地連接于異源目的基因的啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)、第二R區(qū)以及任選地第二U5區(qū)。轉移載體構建體中的異源核酸序列可操作地連接于調控核酸序列。如本文所用，術語“異源基因”或“異源核酸序列”是指起源于外來物種的序列，或者如果來自于同一物種，則它在其核苷酸或氨基酸序列或表達水平上例如由其原始形式被充分修飾。該術語也涵蓋無變化的核酸序列，其正常地不在細胞中表達，或者以不同于作為異源基因存在時的表達水平的水平表達。優(yōu)選地，異源序列是可操作地連接于啟動子的開放讀框，形成嵌合基因。異源核酸序列優(yōu)選處于病毒LTR啟動子-增強子信號或內部啟動子的調控之下，并且慢病毒LTR內保留的信號仍然能夠使載體有效地整合到宿主細胞基因組中。廣范圍的啟動子可用于表達目的異源序列，包含病毒或哺乳動物啟動子。細胞或組織特異性啟動子可用于靶向基因序列在特定細胞群中的表達。本發(fā)明合適的哺乳動物和病毒啟動子是可獲得的并且是本領域熟知的。另一個實施方案利用誘導型啟動子。可控型啟動子系統(tǒng)的一個實例是的Tet-On TM和Tet-Off TM系統(tǒng)，目前可由Clontech(PaloAlto，CA)獲得。該啟動子系統(tǒng)允許四環(huán)素或四環(huán)素衍生物如強力霉素控制轉基因可調控的表達。該系統(tǒng)可用于控制本發(fā)明中異源目的基因的表達。其它調控型啟動子系統(tǒng)描述在PCT/EP01/08190(WO 02/06463)和PCT/EP00/10430(WO 01/30843)中。本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)的另一個構建體是含BIV gag和pol基因的包裝構建體。BIV gag和pol基因處于不同的讀框中，并彼此重疊。在本發(fā)明的一個實施方案中，基因轉移系統(tǒng)包含兩個包裝構建體，一個包含gag基因，而一個包含pol基因。當gag和pol基因在不同的構建體上提供時，蛋白酶由pol基因編碼。BIV rev基因由兩個外顯子構成。第一個位于靠近中心區(qū)的3′端，并與5′端的env基因重疊。第二個rev外顯子見于env的3′端，但處于不同的讀框中。REV蛋白運輸含內含子的病毒mRNA到胞漿中，包含編碼GAG和POL以及病毒粒子包裝信號的全長RNA，無需剪接。REV蛋白通過與稱之為“Rev應答元件”或RRE的病毒基因組順式作用序列相互作用行使功能。期望本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)中的BIV轉移載體構建體包含5′序列，包含可操作地連接于含R、U5、以及包裝序列的DNA片段的啟動子、BIV RRE序列、可操作地連接于另一啟動子的異源目的基因、以及BIV 3′LTR。在優(yōu)選的實施方案中，包裝序列是BIV包裝序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，BIV包裝序列是最小包裝序列或“最小包裝信號”?？衫脧娜魏蜝IV株系或克隆中獲得的BIV基因組核酸片段構建本發(fā)明的構建體。應當理解對于BIV基因組核苷酸序列，不改變疾病病理生理學的天然變體可存在于BIV病毒之間。這些變體可導致一個或多個核苷酸的缺失、取代、插入、置換或添加，只要基因(單個或多個)的功能不喪失。編碼此類變體的DNA序列可通過標準克隆方法產生。類似地，熟練技術人員應當理解本發(fā)明的核苷酸和氨基酸序列可容易地改變而不改變相應核酸或多肽的功能，或者說不偏離本發(fā)明的范圍。在以前描述的BIV病毒載體中，所有或部分BIV gag基因被摻入到包含BIV包裝序列的DNA片段中，它是在轉移載體構建體上提供的。BIV gag基因大約為1,431個核苷酸(Garvey等，Virology，175391-409，1990)。期望的安全和有效的復制缺陷型重組慢病毒載體系統(tǒng)的目的特征將最小化包裝構建體和轉移載體構建體之間的同源性。通過最小化構建體之間的同源性，同源重組的發(fā)生率將被降低，從而降低不促進包裝和輸出轉移載體必需的程度上包含gag基因的5′部分。優(yōu)選地，最小BIV包裝序列將含有多于頭54bp的gag基因和少于頭200bp的gag基因。更優(yōu)選地，最小BIV包裝序列將含有多于頭75bp的gag基因序列且優(yōu)選多于頭90bp但少于頭150bp，優(yōu)選小于頭125bp的gag基因序列。更優(yōu)選地，BIV包裝序列將只含有頭101bp的gag基因序列。在優(yōu)選的實施方案中，作為包裝序列一部分的gag基因片段中ATG起始密碼子被突變，以防止由含所述最小包裝序列的DNA構建體或任何所得的重組體蛋白合成GAG多肽。在一個實施方案中，轉移載體構建體以及任選地包裝構建體編碼最小BIV RRE。所述最小BIV RRE具有SEQ ID NO40所示的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉移載體構建體將包含中心聚嘌呤帶(cPPT)。cPPT可來自BIV或另一種慢病毒，包含例如HIV的cPPT。在尤其優(yōu)選的實施方案中，載體構建體的U3元件中的一個或多個序列被突變或缺失，以降低或完全消除U3介導的任何下游基因的轉錄。該實施方案從而提供了自身失活(SIN)載體構建體(Yu等，PNAS 83(10)3194-3198(1986))。在這樣的實施方案中，異源目的基因可操作地連接于內部啟動子，并且優(yōu)選U3元件額外包含增強多聚腺苷酰化的序列。在一個特別的實施方案中，利用增強子元件上游的SV40晚期多聚腺苷?；盘柕亩嗑巯佘挣；蛄?。在一個實施方案中，rev和RRE分別包含來自BIV的rev和RRE序列。在其它實施方案中，本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)可包含來自除BIV以外的慢病毒的rev和RRE片段，只要RRE和REV能夠彼此互補，促進病毒RNA從宿主細胞核的運輸。在一個這樣的實施方案中，REV和RRE均來自于HIV。在優(yōu)選的實施方案中，REV和RRE均來自于BIV。本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)的第二構建體是病毒表面蛋白基因構建體。在優(yōu)選的實施方案中，病毒表面蛋白基因是env基因。在一個實施方案中，env基因編碼淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)包膜或突變的LCMV包膜。優(yōu)選的LCMV包膜是來自LCMV-GP(WE-HPI)株的包膜(Beyer等，J Virol.，1；76(3)1488-95)。在尤其優(yōu)選的實施方案中，env基因編碼VSV-G包膜。例如參見Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.908033-8037(1993)，Yee等，Proc.Natl.Acad.Sci.919563-9568(1994)以及Yee等的美國專利No.5,817,491。盡管由于VSV-G賦予重組病毒廣泛的宿主范圍，VSV-G蛋白是期望的env基因，但是VSV-G對生產者或包裝細胞有害。因而，當使用例如VSV-G的基因時，優(yōu)選使用誘導型啟動子系統(tǒng)，從而可調控VSV-G的表達以在無需表達VSV-G時使對生產者或包裝細胞的毒性降至最小化。例如，可使用Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)895547-5551)的四環(huán)素調控型基因表達系統(tǒng)以提供VSV-G的誘導型表達。所述tet/VP16翻譯激活劑可存在于第一載體上，而VSV-G編碼序列可克隆到另一載體中受tet操縱子控制的啟動子的下游?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的env基因的非限制性實例包含VSV-Genv、MoMLV env、長臂猿白血病病毒(如GaLV)env以及Phabdoviridae科(如狂犬病毒、莫科拉病毒和恐水病病毒)的env基因、甲病毒屬(如羅斯河病毒、辛德畢斯病毒)、副粘病毒屬(如仙臺病毒)、黃熱病病毒屬(如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)、逆轉錄病毒屬(如MLV、10A1、Xeno)、沙粒病毒屬(如LCMV或LCMV Env突變體)、索戈托病毒、桿狀病毒屬和副流感病毒的env基因。尤其優(yōu)選的env來自LCMV-GP(WE-HPI)株(Beyer等，J Virol.，176(3)1488-95(2002))或VSVG。在本發(fā)明的另一方面，提供了穩(wěn)定的包裝細胞系，包含包裝構建體、包膜構建體以及任選地本發(fā)明的rev基因構建體。尤其優(yōu)選的包裝細胞系是此類細胞系，其能夠穩(wěn)定的表達至少10ng/ml的BIV反轉錄酶(RT)蛋白。由于包裝細胞系缺少編碼包裝信號和其它順式作用元件的慢病毒核酸，沒有載體構建體就不能產生傳染性載體。包裝細胞系的構建體可以是游離的或者整合到細胞染色體中。一般地，本發(fā)明的細胞系包含多種不同的構建體，它們提供了包裝重組載體所需的全部功能，例如gag、pol、env和rev，如上文所討論的那樣。對于所用的構建體的數(shù)目沒有限制，只要它們能夠用來轉化并產生包裝細胞系，以便在細胞中也存在載體構建體時，產生重組復制缺陷型慢病毒顆粒。多種構建體通過轉染或侵染引入到包裝細胞系中。包裝細胞系產生含載體基因組的病毒顆粒。轉染或侵染的方法是本領域技術人員熟知的。因而，包裝構建體可通過例如磷酸鈣轉染、脂轉染或電穿孔，通常連同顯性選擇標記如neo、DHFR、Gln合酶或ADA一起引入到人類細胞系中，繼之以在合適的藥物存在下選擇和分離克隆。包裝細胞用轉移載體構建體轉染以制備生產者細胞。培養(yǎng)生產者細胞，并且它產生大量本發(fā)明的重組復制缺陷型慢病毒載體顆粒。所述載體用于侵染期望的靶細胞，由此將異源目的基因轉移到靶細胞中。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生產者細胞系進一步的特征在于能夠產生至少105轉導單位/ml的慢病毒載體滴度。合適的宿主細胞系可包含例如293細胞、293T細胞、COS細胞、HeLa細胞、Cf2TH細胞等。慢病毒載體顆粒可由本發(fā)明的穩(wěn)定的生產者細胞系獲得。產生慢病毒載體顆粒的方法包含用慢病毒載體構建體轉染本發(fā)明的穩(wěn)定包裝細胞系、分離并在合適的培養(yǎng)基中繁殖所述生產者細胞、并由培養(yǎng)基中獲得慢病毒載體顆粒制備物的步驟。本發(fā)明從而進一步提供了通過收集用本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)轉染的細胞上清獲得的重組慢病毒載體貯備庫。本發(fā)明基于BIV的重組慢病毒載體可單獨使用或者聯(lián)合使用以轉導幾乎任何宿主細胞或細胞系。許多靶細胞，包含細胞系和人類及非人來源的原代細胞，可由本發(fā)明的重組載體在體外或體內侵染。本發(fā)明的載體尤其可用于侵染非分裂原代人類細胞如造血細胞，例如包含干細胞、紅細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞、血小板、肥大細胞、嗜曙紅細胞、嗜堿細胞以及B和T淋巴細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠侵染分裂和非分裂細胞的重組慢病毒載體。所述重組慢病毒包含BIV GAG蛋白、BIV POL蛋白、病毒ENV蛋白、可操作地連接于調控核酸序列的異源核酸序列以及包裝、反轉錄和整合所必需的順式作用LTR核酸序列，其中包裝信號來自BIV。本發(fā)明的重組慢病毒能夠侵染分裂細胞以及非分裂細胞。本發(fā)明的重組慢病毒因此在遺傳上如此修飾，從而天然病毒的某些結構、調控基因已被除去，并替換為待遞送到靶細胞中的核酸序列。在由病毒載體顆粒侵染細胞后，病毒載體顆粒釋放其核酸進入細胞，慢病毒載體構建體被反轉錄，然后整合到宿主細胞基因組中。轉移的慢病毒遺傳物質接著在宿主細胞內被轉錄并翻譯為蛋白。本發(fā)明通過用如上所述的三、四或五DNA構建體系統(tǒng)轉染合適的宿主細胞并回收重組病毒，提供了產生能夠侵染分裂或非分裂細胞的重組慢病毒的方法。一般地，基因在宿主真核細胞中表達，從中回收成熟重組病毒顆粒或載體。一般地，利用標準技術收集病毒上清，例如在合適的時間點過濾上清。收集由轉染細胞產生的病毒粒子的方法描述在Riggs(Virology 218290-295)中。載體制備物可隨后利用本領域公知的技術在體外或在體內用于侵染靶細胞。本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)可用于提供向分裂或非分裂細胞轉移核酸的方法，以提供特定核酸序列的表達。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明通過用本發(fā)明的重組病毒載體顆粒侵染非分裂細胞、并在非分裂細胞中表達異源核酸序列，提供了在非分裂細胞中引入和表達異源核酸序列的方法。通稱為轉基因的廣泛種類的核苷酸序列可作為異源目的基因由本發(fā)明基于BIV的轉移載體構建體攜帶。所述核苷酸序列應當具有足夠的大小以允許產生病毒顆粒或載體。優(yōu)選地，基于BIV的轉移載體構建體的大小在1KB到10KB之間。此類轉基因的非詳盡性的列表包含編碼蛋白、抗原、核酶、反義序列、RNAi(Clin Exp Pharmacol Physiol30(1-2)96-102，2003)、剪接體介導的RNA反式剪接(Nat Biotechnol17(3)246，1999；J Invest Dermatol 115(2)332，2000)、寡核苷酸等的序列。任選地，選擇標記基因可與轉基因一起存在。標記基因被用來測定載體的存在從而確認侵染和整合。標記基因也可用于選擇已被載體轉導的細胞。選擇標記基因的存在確保僅僅那些含載體構建體的宿主細胞生長。典型的選擇基因編碼賦予對抗生素和其它毒性物質例如組氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、氨甲喋呤等抗性的蛋白。文中某些舉例說明性的實例利用β-半乳糖苷酶、螢光素酶或增強型綠色熒光蛋白(eGFP)報告基因或標記系統(tǒng)。反義核酸是與至少部分特定的mRNA分子互補的DNA或RNA分子(Weintraub，Scientific American，26240，1990)。在細胞中，反義核酸與相應的mRNA雜交，形成雙鏈分子。反義核酸干擾mRNA的翻譯，因為細胞不會翻譯呈雙鏈的mRNA。利用反義方法抑制基因的體外翻譯是本領域熟知的(如Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172289，1988)。反義核酸可用于封閉突變蛋白或顯性活性基因產物的表達，例如在阿爾茨海默氏病中累積的淀粉狀蛋白前體蛋白。此類方法也可用于治療Huntington′s病、遺傳性帕金森病及其它疾病。反義核酸也可用于抑制與毒性相關的蛋白的表達。利用寡核苷酸停止轉錄公知為三螺旋體策略，因為寡聚體纏繞雙螺旋DNA，形成三鏈螺旋。因此，可設計這些三螺旋體化合物識別選定基因上的獨特位點(Maher等，Antisense Res.and Dev.，1(3)227，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)569，1991)。核酶是具有以類似于DNA限制性內切酶的方式特異性切割其它單鏈RNA的能力的RNA分子。通過修飾編碼這些RNA的核苷酸序列，有可能設計分子識別RNA分子中的特定核苷酸序列并對其切割(Cech，J.Amer.Med.Assn.，2603030，1988)。該方法的主要優(yōu)勢在于，因為它們是序列特異性的，所以只有具有特定序列的mRNA被失活。也可能需要轉移表達具有抗血管生成效應的產物的核酸序列。此類化合物和編碼其的基因是公知的并且以前已有描述。血管生成可通過抑制分子例如α-干擾素、凝血栓蛋白-1、血管他丁(angiostatin)、內皮他丁(endotatin)。另外，已發(fā)現(xiàn)某些比天然存在的更短的色氨酰-tRNA合成酶來源的多肽，在抑制血管生成中有活性，尤其是眼部新血管形成中(Otani等，PNAS 99(1)178-183(January 2002)；Wakasugi等，PNAS 99(1)173-177(January 2002))。其它可用于本發(fā)明的抗血管生成基因包含但不限于METH-1、METH-2、TrpRS片段、增殖蛋白相關蛋白、催乳素片段、PEDF、血管抑制素(vasostatin)、多種胞外基質蛋白片段以及生長因子/細胞因子抑制劑。多種胞外基質蛋白片段包含但不限于血管他丁、內皮他丁、激肽抑制素(kininostatin)、纖維蛋白原-E片段、凝血栓蛋白、腫瘤抑制素(tumstatin)、canstatin和restin。生長因子/細胞因子抑制劑包含但不限于VEGF/VEGFR拮抗劑、可溶性VEGF受體、sFlt-1、sFlk、sNRP1、血管生成素(angiopoietin)/tie拮抗劑、sTie-2、趨化因子(IP-10、PF-4、Gro-β、IFN-γ(Mig)、IFNα、FGF/FGFR拮抗劑(sFGFR)、Ephrin/Eph拮抗劑(sEphB4和sephrinB2)、PDGF、TGFβ和IGF-1。通過本發(fā)明的重組慢病毒載體遞送此類肽或蛋白將可用于調節(jié)與眼疾相關的新血管形成的生長和增殖，例如老年性黃斑變性、糖尿病眼并發(fā)癥、紅變青光眼、糖尿病增殖性視網膜病、糖尿病增殖性視網膜病、未成熟兒視網膜病變、角膜炎、局部缺血性視網膜病等。介由本發(fā)明的重組慢病毒載體通過向腫瘤遞送抗血管生成因子，有可能抑制新血管生成及與之相關的病理學效應。此類抑制肽的實例可見于PCT申請?zhí)朠CT/US02/05185(WO02/067970)和PCT/US02/23868中，特此全文并入作為參考。具有Eph B受體或ephrin B配體的某些或全部氨基酸序列的可溶性肽也是有效的血管生成抑制劑，如遞交于2001年9月28日的PCT申請PCT/EP01/11252(WO 02/26827)所證明的那樣，特此全文并入作為參考。從而，本發(fā)明將可用于向動物尤其是人類遞送編碼且能夠表達此類肽的核酸。此類肽已對腫瘤細胞表現(xiàn)出抗血管生成和抗腫瘤效應。轉基因也可以包含編碼生物應答調節(jié)劑的核酸。包含在此范疇之內的是免疫增效劑，包含編碼許多歸類為“白介素”細胞因子的核酸。同樣包含在此范疇之內的，盡管未必根據(jù)相同的機制運轉，是干擾素，并且尤其是γ干擾素(γ-IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)以及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)?？赡芷谕蚬撬杓毎蚓奘杉毎f送此類核酸以治療酶不足或免疫缺陷。也可將編碼生長因子、毒性肽、配體、受體或其它生理學上重要的蛋白的核酸引入到特定細胞中。例如，本發(fā)明的載體可用于修飾宿主免疫應答，例如在同種異體骨髓移植后發(fā)生的移植物抗宿主疾病中。被用本發(fā)明的慢病毒載體侵染的宿主細胞和動物可進一步用諸如生長因子、神經節(jié)苷脂、抗生素、神經遞質、神經激素、毒素、神經突促進分子和抗代謝物以及這些分子的前體如多巴胺前體L-DOPA的藥物治療。此外，存在許多其中缺陷基因可替換的遺傳性神經疾病，包含例如，溶酶體貯存病例如那些涉及β-氨基己糖苷酶或葡糖腦苷脂酶的疾?。淮吸S嘌呤磷酸核糖基轉移酶活性不足(“Lesch-Nyhan綜合癥”)；淀粉狀蛋白多發(fā)性神經病(-前白蛋白)；Duchenne′s肌肉萎縮癥以及成例如視網膜細胞瘤。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療眼疾的方法。這些疾病包含但不限于原發(fā)性開角型青光眼(POAG)、增殖性玻璃體視網膜病、涉及光感受器累積性退行性變和最終死亡的疾病以及由眼新血管形成導致的疾病。可用本發(fā)明的方法治療的眼疾包含例如濕性AMD(老年性黃斑變性)、糖尿病增殖性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、由糖尿病性視網膜病導致的新血管形成、非糖尿病性視網膜病、分支靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、未成熟嬰兒視網膜病變、虹膜紅變、新生血管性青光眼、凹周圍毛細血管擴張、鐮狀細胞視網膜病、Eale′s病、視網膜血管炎、Von Hippel Lindau病、放射性視網膜病變、視網膜冷凍損傷、視網膜色素變性、視網膜脈絡膜缺損、因單純皰疹病毒性角膜炎所致的角膜新血管形成、角膜潰瘍、角膜移植術、pterigyia或創(chuàng)傷。治療眼疾(包含上文所指出的那些眼疾)的方法，包含向個體施用表達一個或多個編碼選自抗血管生成基因、視桿細胞源的視錐生存因子(Rod-derived Cone Viability Factor)(RdCVF)、抗-細胞凋亡基因、視神經堿(optineurin)基因以及小梁網蛋白基因(TIGR)的基因的BIV視神經堿(optineurin)基因以及小梁網蛋白基因(TIGR)的基因的BIV轉移載體。載體優(yōu)選通過直接眼內注射遞送到眼中。向眼中注射的方法是本領域熟知的。這些方法包含但不限于注射到眼前房或后房，例如注射到水狀液或玻璃體液?；蛘?，注射可以是視網膜下的，例如通過在視網膜后面注射小份(例如每小份1到10μl)含載體的溶液，之后溶液被吸收，并且傳染性載體顆粒侵染眼組織的局部細胞。此類給藥可包含同一天給藥的單次注射、多次注射，為期數(shù)周或數(shù)月給藥的單次注射，或者為期數(shù)周或數(shù)月給藥的多次注射。已發(fā)現(xiàn)視桿細胞源的視錐生存因子(RdCVF)是的視錐保護性因子(PCT申請PCT/EP02/03810(WO 02/081513))。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的BIV載體含至少一個編碼如SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65或SEQ ID NO67中所編碼的RdCVF多肽的核酸序列。從而，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過利用本發(fā)明的BIV載體系統(tǒng)向細胞中轉移RdCVF基因而在體外或在體內展示視錐保護效應的方法。在優(yōu)選的實施方案中，BIV載體編碼人類RdCVF1和/或RdCVF2。表達RdCVF的BIV載體可用于治療多種與眼相關的疾病。因而，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有視網膜營養(yǎng)不良的人的方法，例如色素性視網膜炎(retinitus pigmentosa)、老年性黃斑變性、Bardet-Biedel綜合癥、Bassen-kornzweig綜合癥、卵黃狀黃斑變性、無脈絡膜、回旋狀萎縮、先天性黑曚(congenitalamourosis)、Refsun綜合癥、Stargard病和Usher綜合癥。對于因蛋白產物不足引起的疾病，基因轉移可將正?；蛞氲交疾〉慕M織中用于替換治療?；蜻f送技術也可用于產生轉基因動物。在一個實施方案中，BIV載體可用作為鑒定基因功能的工具。從而，該載體可用于在體外將表達盒轉移到細胞中，以過度表達特定基因或降低特定基因的表達。通過觀察與特定基因表達上調或下調相關的表型，有可能確定該基因的功能。這種信息在確定基因產物是否為藥物研發(fā)的有效靶中具有極大的價值。
且包含表達核酶、反義寡核苷酸或指向待降低表達的基因的mRNA的RNAi。降低表達的另一策略可以是編碼終止密碼子的3′外顯子序列的反式剪接。另一個替代策略是表達功能為待降低功能的蛋白的顯性失活物的蛋白。在另一實施方案中，BIV載體可用于在體內鑒定基因功能。從而，該載體可用于將表達盒轉移到體內細胞中，以過度表達特定基因或降低特定基因的表達。這可通過經由直接注射到組織或體腔中向動物給藥載體或通過直接向循環(huán)中給藥載體而實現(xiàn)。備選地，載體可在體外向細胞給藥，然后將細胞注射到或植入到動物中。合適的注射部位或植入裝置是本領域技術人員公知的。在體內鑒定基因功能在確定基因產物是否為藥物研發(fā)的有效靶中將具有極大的價值。在另一個實施方案中，載體可用于篩選文庫以克隆具有特定功能的基因。在該實施方案中，文庫，有可能是cDNA文庫，可由轉移載體構建體編碼。轉移載體構建體然后可用于產生載體，而載體在體外或在體內施用于細胞。表現(xiàn)出期望功能的細胞將被分離。目的基因可容易地從BIV載體整合物中回收。利用整合載體進行基因克隆的方法是本領域技術人員熟知的。文中描述的技術相對于用于基因克隆的逆轉錄病毒載體系統(tǒng)具有顯著的優(yōu)勢，因為BIV載體將會在體內有效地轉導細胞，而逆轉錄病毒不會。在另一個實施方案中，BIV載體可用于建立針對特定蛋白的強免疫應答。向動物給藥BIV載體，尤其是經靜脈內注射，導致脾臟內細胞的有效轉導。在這種設置中，編碼的轉基因的表達可導致針對表達蛋白的強免疫應答。這種技術可用于提高用于研究、診斷或治療目的的抗體(包含單克隆抗體)產生效率。該技術也可直接在人類中用于免疫治療的目的。本發(fā)明優(yōu)選的載體來自于BIV。可從感染病毒的細胞中分離天然BIV核酸，并由其制備載體。例如，可利用本領域公知的方法，通過反轉錄由BIV RNA制備cDNA。然后可以產生雙鏈BIV cDNA并克隆到克隆載體中，例如細菌克隆載體?？墒褂帽绢I域技術人員公知和使用的任何克隆載體，例如細菌、酵母或真核載體。包含本發(fā)明的DNA構建體的大量核酸可通過如下制或(a)利用本領域熟知的技術在適合的宿主或轉基因動物中復制或(b)化學合成。制備用于引入原核或真核宿主的構建體可包含為宿主識別的復制系統(tǒng)，包含編碼目的多肽的所需的多核苷酸片段，并且優(yōu)選也將包含轉錄和翻譯起始調控序列，可操作地連接于所述多肽編碼片段。這些可包含，例如復制起點或自主復制序列(ARS)以及表達調控序列，啟動子、增強子以及必要的加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷?；稽c、轉錄終止子序列以及mRNA穩(wěn)定序列。適當?shù)臅r候也可以包含分泌信號，其將允許蛋白穿越和/或嵌在細胞膜中，從而獲得其功能拓撲結構，或者從細胞中分泌。此類載體可通過本領域熟知的標準重組技術制備。根據(jù)上文，構思本發(fā)明的下列實施方案并構成部分發(fā)明。1.重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，包含(a)(i)包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子，或(ii)包含DNA片段的第一包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及包含DNA片段的第二包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子；(b)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的啟動子；(c)轉移載體構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含的啟動子可操作地連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)以及第二R區(qū)；和(d)(i)rev基因，位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上，或(ii)包含DNA片段的rev構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。2. 1中的基因轉移系統(tǒng)，包含含DNA片段的包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子。3. 1中的基因轉移系統(tǒng)，包含第一包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及第二包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子。4. 2中的基因轉移系統(tǒng)，其中包裝構建體進一步包含RRE序列。5. 3中的基因轉移系統(tǒng)，其中至少一個包裝構建體進一步包含RRE序列。6. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因和RRE序列來自BIV。7. 2中的基因轉移系統(tǒng)，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。8. 2中的基因轉移系統(tǒng)，其中gag和pol基因分別包含重新編碼的核苷酸序列。9. 2中的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。10. 3中的基因轉移系統(tǒng)，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。11. 3中的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。12. 11中的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因在5′端包含ATG起始密碼子。13. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因的蛋白酶區(qū)在蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中發(fā)生突變，且其中所述的突變蛋白酶與未突變的BIV蛋白酶相比對宿主細胞毒性較小。14. 13中的基因轉移系統(tǒng)，其中蛋白酶區(qū)編碼蛋白酶多肽氨基酸26位上Thr到Ser的突變。15. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中BIV包裝序列包含不超過BIV gag基因開放讀框序列的頭101個堿基對。16. 15中的基因轉移系統(tǒng)，其中包裝序列基本上由SEQ IDNO39的核苷酸序列組成。17. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中轉移載體構建體包含DNA片段，所述DNA片段包含的啟動子可操作地連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)、第二R區(qū)和第二U5區(qū)。18. 2中的基因轉移系統(tǒng)，其中包裝構建體進一步包含rev基因。19. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中病毒表面蛋白基因構建體包含env基因。20. 19中的基因轉移系統(tǒng)，其中env基因選自VSV-G env、LCMV env、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、長臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成員的env基因、甲病毒屬env基因、副粘病毒屬env基因、黃熱病病毒屬env基因、逆轉錄病毒屬env基因、沙粒病毒屬env基因、副流感病毒env基因、索戈托病毒env基因以及桿狀病毒屬env基因。21. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中病毒編碼蛋白基因編碼VSV-G env。22. 1中的基因轉移系統(tǒng)，包含位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上的rev基因。23. 1中的基因轉移系統(tǒng)，包含含DNA片段的rev構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。24. 6中的基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因不包含天然BIVrev內含子。25. 24中的基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因包含SEQ ID NO10。26. 22中的基因轉移系統(tǒng)，包含可操作地連接于rev基因的EF-1啟動子。27. 23中的基因轉移系統(tǒng)，其中可操作地連接于rev基因的啟動子是EF-1啟動子。28. 6中的基因轉移系統(tǒng)，其中RRE序列基本上由SEQ IDNO40的核酸序列組成。29. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中至少兩個啟動子是相同的。30. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中所有的啟動子都不同。31. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中至少一個啟動子是調控型啟動子。32. 1中的基因轉移系統(tǒng)，它不含cPPT。33. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中轉移載體構建體進一步包含cPPT。34. 33中的基因轉移系統(tǒng)，其中cPPT是來自人類免疫缺陷病毒的cPPT。35. 33中的基因轉移系統(tǒng)，其中cPPT是BIV cPPT。36. 35中的基因轉移系統(tǒng)，其中cPPT基本上由與SEQ IDNO1從堿基對4758到5293包含端點在內的核苷酸相對應的535個堿基對組成。37. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中U3區(qū)包含多聚腺苷?；鰪娮?。38. 37中的基因轉移系統(tǒng)，其中多聚腺苷?；鰪娮踊旧嫌蒘V40晚期多聚腺苷?；鰪娮釉M成。39. 1中的基因轉移系統(tǒng)，它不編碼BIV的vif、vpw、vpy或tat基因中至少之一。40. 1中的基因轉移系統(tǒng)，它不編碼BIV的vif、vpw、vpy、tmx和tat基因。41. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中U3區(qū)的一個或多個核苷酸改變或缺失，從而U3介導的轉錄減低或消除。42. 1中的基因轉移系統(tǒng)，包含可操作地連接于異源目的基因的土撥鼠肝炎病毒調控應答元件。43. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中異源目的基因編碼選自T2-TrpRS、Eph B受體、ephrin B配體、血纖蛋白原E片段、VEGF可溶性受體、血管他丁、內皮他丁、視神經堿、小梁網蛋白、視桿細胞源的視錐生存因子(RdCVF)以及抗-細胞凋亡基因產物的多肽。44. 1中的基因轉移系統(tǒng)，其中異源目的基因編碼選自SEQID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65和SEQ ID NO67的RdCVF多肽。45. 生產者細胞，包含1-44中任一項的基因轉移系統(tǒng)。46. 45中的生產者細胞，其中基因轉移系統(tǒng)穩(wěn)定地整合到生產者細胞的基因組中。47. 45中的生產者細胞，其中基因轉移系統(tǒng)短暫轉染到生產者細胞中。48. 產生復制缺陷型慢病毒載體顆粒的方法，包含(a)在足以允許所述細胞產生復制缺陷型慢病毒載體顆粒的細胞培養(yǎng)條件下，在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)45中的生產者細胞；和(b)從培養(yǎng)基中收集所述復制缺陷型慢病毒載體顆粒。49. 根據(jù)48中的方法，進一步包含向培養(yǎng)基中添加組蛋白脫乙?；敢种苿?。50. 根據(jù)49中的方法，其中組蛋白脫乙酰基酶抑制劑是丁酸。51. 復制缺陷型慢病毒載體顆粒，由根據(jù)48中的方法產生。52. 在具有或處于感染疾病風險的動物中治療或預防所述疾病的方法，包含用根據(jù)51中的復制缺陷型重組慢病毒載體顆粒侵染該動物的一個或多個細胞，其中異源目的基因編碼能有效治療或預防所述疾病的治療產物。53. 52中的方法，其中動物是人類。54. 52中的方法，其中一個或多個細胞是眼細胞。55. 54中的方法，其中疾病選自眼新血管形成、濕性AMD(老年性黃斑變性)、糖尿病增殖性視網膜病、非糖尿病性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、視網膜分支靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、未成熟嬰兒視網膜病變、虹膜紅變、新生血管性青光眼、凹周圍毛細血管擴張、鐮狀細胞視網膜病、Eale′s病、視網膜血管炎、Von Hippel Lindau病、放射性視網膜病變、視網膜冷凍損傷、視網膜色素變性、視網膜脈絡膜缺損、因單純皰疹病毒性角膜炎所致的角膜新血管形成、角膜潰瘍、角膜移植術、pterigyia，或創(chuàng)傷性視網膜營養(yǎng)不良、病理性衰老、色素性視網膜炎(retinitus p gmentosa)、Bardet-Biedel綜合癥、Bassen-kornzweig綜合癥、卵黃狀黃斑變性、無脈絡膜、回旋狀萎縮、先天性黑曚(congenital amourosis)、Refsun綜合癥、Stargardt病和Usher綜合癥。56. 55中的方法，其中治療產物選自T2-TrpRS、Eph B受體、ephrin B配體、血纖蛋白原E片段、VEGF可溶性受體、血管他丁、內皮他丁、視神經堿(optineurin)、小梁網蛋白、視桿細胞源的視錐生存因子(RdCVF)以及抗-細胞凋亡基因產物。57. 55中的方法，其中治療產物是選自SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65和SEQ ID NO67的Rdcvf多肽。58. 52中的方法，其中疾病選自癌癥、與同種異體骨髓移植相關的移植物抗宿主病以及神經疾病。59. 52中的方法，其中一個或多個細胞在體內侵染。60. 52中的方法，其中一個或多個細胞在體外侵染。61. 在體外用重組慢病毒載體顆粒轉導細胞的方法，包含使細胞與根據(jù)51中的重組慢病毒載體顆粒接觸，藉此細胞得以轉導。62. 在體內用重組慢病毒載體顆粒轉導細胞的方法，包含使細胞與根據(jù)51中的重組慢病毒載體顆粒接觸，藉此細胞得以轉導。63. 在細胞中表達異源目的基因的方法，包含用根據(jù)51中的重組慢病毒載體顆粒轉導細胞，藉此異源目的基因在細胞中表達。64. 包裝細胞，包含(a)(i)包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子，或(ii)含DNA片段的第一包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及含DNA片段的第二包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子；(b)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的啟動子；和(c)(i)rev基因，位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上，或(ii)含DNA片段的rev構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。65. 64中的包裝細胞，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和]BIV pol基因的啟動子。66. 64中的包裝細胞，包含含DNA片段的第一包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及含DNA片段的第二包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子。67. 65中的包裝細胞，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。68. 65中的包裝細胞，其中gag和pol基因分別包含重新編碼的核苷酸序列。69. 65中的包裝細胞，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。70. 66中的包裝細胞，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。71. 66中的包裝細胞，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。72. 64中的包裝細胞，其中pol基因的蛋白酶區(qū)在蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中發(fā)生突變，且其中所述的突變蛋白酶與未突變的BIV蛋白酶相比對宿主細胞毒性較小。73. 72中的包裝細胞，其中蛋白酶區(qū)在蛋白酶多肽氨基酸26位上編碼Thr到Ser的突變。74. 64中的包裝細胞，其中病毒表面蛋白基因構建體包含env基因。75. 74中的包裝細胞，其中env基因選自VSV-Genv、LCMVenv、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、長臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成員的env基因、甲病毒屬env基因、副粘病毒屬env基因、黃熱病病毒屬env基因、逆轉錄病毒屬env基因、沙粒病毒屬env基因和副流感病毒env。76. 64中的包裝細胞，其中病毒表面蛋白基因編碼VSV-Genv。77. 64中的包裝細胞，包含位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上的rev基因。78. 64中的包裝細胞，包含含DNA片段的rev構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。79. 64中的包裝細胞，其中rev基因來自BIV但不包含天然BIV rev內含子。80. 79中的包裝細胞，其中rev基因包含SEQ ID NO10。81. 77中的包裝細胞，包含可操作地連接于rev基因的EF-1啟動子。82. 78中的包裝細胞，其中可操作地連接于rev基因的啟動子是EF-1啟動子。83. 64中的包裝細胞，其中至少兩個啟動子是相同的。84. 64中的包裝細胞，其中所有的啟動子都不同。85. 64中的包裝細胞，其中細選自由293細胞、293T細胞、COS細胞、HeLa細胞和Cf2TH細胞。86. 分離的BIV POL蛋白，包含與SEQ ID NO51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。87. 86中的分離的BIV POL蛋白，包含SBQ ID NO51。88. 86中的分離的BIV POL蛋白，在所述POL蛋白的N-末端包含甲硫氨酸。89. 分離的核酸分子，包含編碼86-88中任一項的BIV POL蛋白的核苷酸序列。90. 分離的核酸分子，包含編碼87中的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO50組成。91. 分離的核酸分子，包含編碼88中的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO53組成。92. 分離的核酸分子，包含最小的BIV包裝序列，其中所述的最小BIV包裝序列與SEQ ID NO39所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。93. 92中的分離的核酸分子，其中的最小BIV包裝序列基本上由SEQ ID NO39所示的核苷酸序列組成。94. 分離的核酸分子，包含編碼BIV REV蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼與SEQ ID NO10所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。95. 94中的分離的核酸分子，其中編碼BIV REV蛋白的核苷酸序列編碼由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列編碼的同一個氨基酸序列。96. 94中的分離的核酸分子，其中的核苷酸序列與SEQ IDNO10所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。97. 94中的分離的核酸分子，其中的核苷酸序列基本上由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成。98. 分離的核酸分子，包含最小的BIV RRE序列，其中所述的最小BIV RRE序列與SEQ ID NO40所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。99. 98中的分離的核酸分子，其中的最小BIV RRE序列基本上由SEQ ID NO40所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明進一步在以下實施例中詳述，所述實施例是作為舉例說明提供的而并非旨在以任何方式限制本發(fā)明。利用本領域熟知的標準技術或者下文具體描述的技術。
實施例實施例1
SEQ ID NO1顯示了牛免疫缺陷病毒原病毒的DNA序列。
實施例2質粒構建
包裝構建體通過將必要的BIV構建體連接到哺乳動物表達質粒pCI(Promega，Madison，WI)中產生。主要剪接供體(MSD)位點以及gag和pol的編碼序列作為4485個堿基對的BspEI-BstUI片段由BIV原病毒中分離(Garvey等Virology.1990 Apr；175(2)391-409，Genbank登錄號NC_001413和M32690)。該片段通過Klenow處理平末端化，并連接到由EcoRI線性化并且也通過Klenow處理平末端化的pCI中以產生pCIigp。下一步，由引物RRE65′NotI(5′-AAAGCGGCCGCTCCGGTGGATTCTTGTAAAGG-3′)(SEQ ID NO2)和RRE63′NotI(5′-AAAGCGGCCGCGGCGCCTCCAAGTATGAAACTC-3′)(SEQ ID NO3)對BIV原病毒的PCR擴增產生最小RRE片段。該344個堿基對的PCR片段用NotI消化，并連接到也用NotI消化且磷酸酶(CIP)處理的pCIigp中。產生的質粒命名為pCIigpRRE，并用于四組分系統(tǒng)。最后，融合了兩個外顯子的鄰近的rev編碼序列，通過兩種不同的方法RT-PCR和PCRSOEing如下文所述產生。四組分系統(tǒng)中所用的rev序列通過RT-PCR產生。簡要地，接種在10-cm培養(yǎng)皿中的239T細胞利用ProFectin哺乳動物轉染系統(tǒng)(Promega)由20ug pBH2質粒(Berkowitz等，2001)轉染。轉染后48小時，收集細胞并用Trizol試劑(Invitrogen)純化總RNA。RT-PCR用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)按照制造商的說明進行。利用5ug總RNA合成cDNA。rev cDNA序列利用引物Rev15Af13(5′-GGACGCGTCGACTCTAGATCTAGGAATCAACTATGG-3′)(SEQ ID NO4)和Rev23Age12(5′-TTTACCGGTCGCGAGCTTAGCTTACAATCTACTGAGAACC-3′)(SEQ ID NO5)擴增。PCR反應在如下條件下進行94℃1分；25個循環(huán)的94℃1分，54℃1分和72℃1分；以及72℃另外10分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上檢測到0.7kb的rev cDNA片段，并隨后按照TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)的說明克隆到pCR4-TOPO載體中。鑒定了具有rev cDNA插入物的兩個克隆。Rev插入物的取向通過限制性酶消化確定。在通過自動序列分析確認rev cDNA克隆之后，將rev基因亞克隆到pTracerA質粒(Invitrogen)中用于在哺乳動物細胞中表達。Rev序列插入在PmeI和NotI位點之間，處于EF-1a啟動子的調控之下，產生pTracerARev。PCIigpRRE和pTracerARev都進行DNA測序以確認構建體的完整性。連接到用于三構建體系統(tǒng)的pCIigpRRE中的rev編碼序列通過PCR SOEing(通過重疊延伸的剪接)產生。rev的第一個外顯子利用引物Rev155868(5′-GTTCTAGATGGCTGGCTTTTCTGG-3′)(SEQ ID NO6)和Rev13(新)(5′-GAGAATCGTTATTGATCCATGTTTG-3′)(SEQ ID NO7)通過PCR由BIV原病毒擴增。第二外顯子也利用引物Rev25(新)(5′-GGATCAATAACGATTCTCCTAGGTATGT-3′)(SEQ ID NO8)和Rev237526(5′-TTACTAGTGGTTATTTTGTTCCCTGG-3′)(SEQ ID NO9)由原病毒擴增。兩產物以等摩爾比的量混合，并利用引物Rev155868和Rev237526擴增。最終698個堿基對的產物用XbaI和SpeI消化，并連接到用XbaI消化的pCIigpRRE中。所得的質粒命名為pBIVminipack，并且僅含CMV即早期啟動子驅動BIV gag/pol編碼序列，接著是融合的rev編碼序列，最小RRE，以及最后的SV40多聚腺苷?；盘枴Ｈ匀槐Ａ鬵ag起點上游的MSD位點和rev剪接受體(SA)位點。然后對包裝構建體進行DNA序列分析以確認構建體的完整性。沒有居間內含子的rev基因序列示于SEQ IDNO10。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了其中rev基因不含天然BIV居間內含子的基因轉移系統(tǒng)，而在另一個實施方案中，rev基因不含任何居間內含子。轉移載體構建體pBIVminivec衍生自pBC4MGppt，其先前已有描述(Berkowitz等，2001)。為促進克隆，將完整的BIV轉移載體編碼序列克隆到表達質粒pBS II KS+(Stratagene，La Jolla，Ca.)中，通過用BspMI消化pBC4MGppt并連接到事先由HincII消化的pBSIIKS+中，作為鈍端連接產生質粒pBSV4MGppt。質粒pBSV4MGppt用BglII和EcoNI消化，Klenow處理并重新連接，以除去297bp的gag基因片段產生質粒pBSV4MGpptΔGAG。由于在緊接著增強型綠色熒光蛋白(eGFP)報告基因之后缺乏獨特和便利的限制性位點，利用引物WPRE5(5′-GAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCAACCCTCCTGCAG-AAACTCCTTTGGG-3′)(SEQID NO11)和WPRE3(5′-GGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCC-3′)(SEQ IDNO12)摻入獨特的PstI位點，產生質粒pBSV4MGpptΔGAG PstI。然后將土撥鼠肝炎轉錄后調控元件(PRE)克隆到主鏈上，pBSV4MGpptΔGAGPstI事先由PstI消化，用Klenow處理，并連接到PRE片段上，產生質粒pBSV4MGpptΔGAG PRE。質粒pBSV4MGpptΔGAG PRE作進一步修飾，通過除去所有推定的rev應答元件(RRE)，其在原始BIV轉移載體中大約是778bp(Berkowitz等，2001)，并將其替換為312bp的我們發(fā)現(xiàn)充分負責RRE功能的RRE片段。首先，質粒pBSV4MGpptΔGAG PRE用KasI和BbvCI消化。該區(qū)域然后利用引物RRE1(5′-GTTGGCGCCCAACGTGGGGCTCGAGTAAGAGAG-3′)(SEQ ID NO13)、RRE2(5′-AGATCTGAATTCTAAGTG-ACCTATTTC-3′)(SEQ ID NO14)、RRE3(5′-GAATTCAGATCTTATG-GGAATGAAAGACC-3′)(SEQ ID NO15)和RRE4(5′-AACTGCTGAGGGCGGGACCGCATCTGG-3′)(SEQ ID NO16)PCR擴增。RRE1和RRE2擴增所述推定的RRE的上游區(qū)域，而引物RRE3和RRE4擴增所述推定的RRE的下游區(qū)域。然后以等摩爾比混合產物，并用引物RRE1和RRE4擴增。終產物摻入了KasI和BbvCI位點，而全部推定的RRE被缺失掉。此外，構建了獨特的EcoRI和BglII位點，以在引物RRE2和RRE3之間產生接合位點，用于終產物退火的目的，但主要是為了隨后克隆RRE的多個區(qū)域。該PCR策略產生質粒pBSV4MGpptΔGAGΔRRE PRE。推定的RRE然后用7對引物(表1)在均編碼5′EcoRI位點和3′BglII位點的不同區(qū)域進行PCR擴增，以便克隆到主鏈pBSV4MGpptΔGAGΔRREPRE中。一經建立，各片段用EcoR1和BglII消化，并如前所述克隆(表1)。含RRE6的載體構建體命名為pBIVminivec。含本實施例中所用的病毒表面蛋白基因構建體、表達VsV-G的質粒以前已有描述(Burns等，1993，PNAS.USA 908033-8037)。
表1 為進一步缺失最小載體中剩余的212bp gag序列，構建體pBSV4MGpptΔGAGΔRRE PRE(為簡化命名為pBvΔRRE)用作為PCR反應的模板，進行gag序列的缺失，以確定包裝信號的定位。上文描述的構建體pBvΔRRE通過用ClaI和Hind III消化，由klenow處理，然后重新連接用于缺失184bp的GAG。這個克隆策略產生含28bp Gag編碼序列的構建體，產生質粒pBv28ΔRRE。下一步，我們產生含54bp gag序列的載體構建體。首先，模板pBvΔRRE用KasI和EcoRI消化并用堿性磷酸酶處理。Gag編碼區(qū)利用引物NRS1(5′AACAGTTGGCGCCCAACGTGGGGCTC-3′)(SEQ ID NO31)、NRS2(5′ATGCATCACGTGGGGTGTCACCCTAACCTTACGAA-3′)(SEQ ID NO32)、NRS3(5′CACGTGATGCATCGATCTAAAAGACAGATTGGC-3′)(SEQ ID NO33)和NRS4(5′CATAAGATCTGAATTCAATGATCTAAGTG-3′)(SEQ ID NO34)擴增。NRS1和NRS2用于擴增Gag起始密碼子(ATG)5′區(qū)到Gag堿基對54。NRS3和NRS4擴增Gag 3′終止密碼子直到BIV cPPT。然后以等摩爾比混合產物并用引物NRS1和NRS4擴增。終產物摻入了KasI和EcoRI位點，缺失了模板內后面的158bp Gag，產生含54bp Gag編碼序列的構建體。此外，摻入了獨特的NsiI和PmlI位點，以在引物NRS2和NRS3之間產生接合位點，用于終產物的退火和篩選。該PCR策略產生質粒pBv54ΔRRE。執(zhí)行相同的PCR策略產生構建體pBv104ΔRRE。NRS1和NRS4用作為外部引物，而新的內部引物是NRS 32(5′ATGCATCACGTGATTCTAATGGCCCATTGAAGATTC-3′)(SEQ ID NO35)以及NRS33(5′CACGTGATGCATCGATCTAAAAGACAGATTGGC-3′)(SEQ ID NO36)。NRS1和NRS32用于擴增Gag起始密碼子(ATG)5′區(qū)到Gag堿基對101。NRS33和NRS4擴增Gag 3′終止密碼子3′直到BIV cPPT。然后以等摩爾比混合產物并用引物NRS1和NRS4擴增。終產物摻入了KasI和EcoRI位點，缺失了模板pBv104RRE內Gag后面的111bp。并且，如上文所述，摻入了獨特的NsiI和PmlI位點，以在引物NRS32和NRS33之間產生接合位點，用于終產物的退火和篩選。最后，所有三個構建體pBv28ΔRRE、pBv54ΔRRE和pBv104ΔRRE都用EcoRI和Bg1II消化，堿性磷酸酶處理，然后將上文所述的最小RRE6作為EcoRI和Bg1II片段克隆進來，分別產生質粒pBv28、pBv54和pBv101。對所有這些轉移載體構建體進行DNA序列分析，以確認構建體的完整性。pBv101被命名為pBIVfinalvecATG。為突變BIV gag的起始密碼子，我們利用QuickChangestrategy(Stratagene，LaJolla，CA)。pBSIIKS+(Stratagene，LaJolla，CA)用NotI和HindIII消化，并用堿性磷酸酶處理(CIP)。下一步，pBIVminivec用NotI和HindIII消化。將來自pBIVminivec的NotI至HindIII片段亞克隆到pBSIIKS+主鏈中。用于QuickChange反應的引物是KOATG正向(5′-GCGTGTTTTCCCCGGGGTGAAGAGAAGGGAG-3′)SEQ ID NO37以及KOATG反向(5′-CTCCCTTCTCTTCACCCCGGGGAAAACACGC-3′)SEQ IDNO38。該質粒被稱之為pBSIIKS+NHΔATG。然后對產物進行DNA序該質粒被稱之為pBSIIKS+NHΔATG。然后對產物進行DNA序列分析以確認產物的完整性。然后pBSIIKS+NHΔATG用NotI和HindIII消化，接著克隆回pBIVfinalvecATG中。產生的終產物命名為pBIVfinalvec，且gag的ATG被突變。然后對整個pBIVfinalvec進行DNA序列分析以確認構建體的完整性。
實施例33.1
現(xiàn)在參照圖1，顯示了代表BIV三組分基因轉移系統(tǒng)的示意圖，含有(i)包裝構建體，(ii)轉移載體構建體，和(iii)病毒表面蛋白基因構建體。包裝構建體pBIVminipack和轉移載體構建體pBIVfinalvec的質粒構建在實施例2中描述。包裝構建體pBIVminipack，僅含驅動BIV gag/pol編碼序列的CMV即早期啟動子，接著是融合的rev編碼序列，最小RRE，以及最后的SV40多聚腺苷?；盘?。仍然保留gag起點上游的MSD位點和rev剪接受體(SA)位點。轉移載體構建體pBIVfinalvec具有CMV啟動子，繼之以R、U5、UTR、cPPT、RRE、驅動轉基因的內部啟動子、修飾的U3(SIN)、R和U5(CMVCMV早期啟動子；Δ包裝信號序列缺失；MSD主要剪接供體位點；SA剪接受體位點；revBIV rev；RREBIV Rev應答元件；UTR非翻譯的前導序列；ΔGAG頭101bp的BIV gag序列；cPPT中心聚嘌呤帶；SIN自身失活；SV40USE增強子元件上游的SV40多聚腺苷酰化信號；VSV-G水泡性口膜炎病毒包膜糖蛋白G)。
3.2
現(xiàn)在參照圖2，顯示了代表BIV四組分基因轉移系統(tǒng)的示意圖，其含有(i)無rev的包裝構建體，(ii)rev表達構建體，(iii)轉移載體構建體，和(iv)病毒表面蛋白基因表達構建體。包裝構建體pCIigpRRE、rev表達構建體pTracerARev、轉移載體構建體pBIVfinalvec以及病毒表面蛋白基因表達構建體的質粒構建在實施例2中描述。EF-1áEF1á啟動子。
實施例4BIV包裝信號序列的鑒定
轉移載體pBIVminivec具有gag缺失導致只有212bp殘余的gag，其與具有509bp gag序列的親本載體pBC4MGppt以相同的效率轉導293T細胞。對用含509bp gag序列或212bp gag序列的BIV載體轉導的細胞進行eGFP表達的流式細胞儀分析。eGFP表達通過流式細胞儀分析測量。如下結果是以eGFP陽性細胞的百分比給出的假轉導0.1％；用載體pBSV4MGppt轉導的細胞85％；用pBIVminivec轉導的細胞95.5％。此外，從pBIVminivec 3′端缺失另外的gag序列，分別產生只含28(pBV28)、54(pBv54)或101(pBv101)bp gag序列的pBIVfinalvec。存在于pBv101和pBIVfinalvecATG中的101bp gag序列示于SEQ ID NO39。由構建體pBv101產生的載體是具有完全功能的，并且能夠有效地轉導細胞，而pBv28和pBv54是缺陷型的(圖3)。因此，含101bp gag序列的pBv101被命名為pBIVfinalvecATG。有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)即使是pBIVfinalvecATG，RRE依然是載體轉導靶細胞的生物功能絕對必需的，因為徹底除去RRE則廢止了轉導效率(圖3，表B)。我們推斷起始于gag ATG的前101bp BIV gag序列含BIV包裝信號。該101bp的BIV gag序列，連同位于5′U5和gag起始密碼子ATG之間的非翻譯前導序列，構成了如SEQ ID NO39中所描繪的最小BIV包裝信號序列。
實施例5BIV Rev應答元件的鑒定
質粒pBC4MGppt含有778bp包膜編碼區(qū)中推定的RRE序列(Berkowitz等，2001；PCT專利申請WO 01/44458)。為確定BIV RRE的精確定位，產生了具有推定的RRE區(qū)的數(shù)個獨立部分的多個構建體。產生這些不同的構建體以鑒定核輸出所必需的最小核酸序列。進行最小RRE的確定，以致力于減小具有BIV包裝信號的載體構建體與BIVgag/pol表達包裝構建體之間的序列同源性?？偣伯a生了摻入了推定的同BIV包裝構建體pBH2(Berkowitz等，2001；PCT專利申請PCT/US00/33725(WO 01/44458))和VSV-G表達質粒分別地轉染到293T細胞中。轉染后48小時，收集病毒上清。各上清通過測定反轉錄酶(RT)活生的量(Reverse Transcriptase Assay，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN，Cat.#1828657)標準化，并且含相同量RT的載體上清被用來轉導相同數(shù)目的293T細胞。RT是載體顆粒的精確度量，相同量的RT輸入代表相同數(shù)目的載體顆粒輸入。在產生的7個構建體中，由載體構建體pBSV4MGpptΔGAGPRERRE6產生的載體與由構建體pBSV4MGpptΔGAGPRE產生的具有全長778bp推定的RRE序列(表1)的親本載體以等同的效率轉導細胞。該數(shù)據(jù)證明含有312bp SEQ ID NO40的序列的這個載體，含有足夠的負責核輸出的RRE序列。該312bp的最小RRE被用于我們所有的需要RRE的BIV包裝和轉移載體構建體中。
實施例66.1.細胞系和培養(yǎng)條件
293T細胞(ATCC；CRL 11268)和HeLa(ATCC；CCL-2)細胞在Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM；BRL Life Technology，Rockville，MD)中培養(yǎng)，補充有10％熱失活的胎牛血清(Hyclone，SaltLake City，UT)、50IU青霉素/ml、50ug鏈霉素/ml以及2mm L-谷氨酰胺(Complete DMEM)。小鼠神經元和阿米巴狀干細胞(Neuro-2A)獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Va.)。Neuro-2A細胞在最低必需培養(yǎng)基(BRL Life Technology，Rockville，MD)中培養(yǎng)，補充有10％熱失活的胎牛血清、50IU青霉素/ml、50ug鏈霉素/ml、1.0mm丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉以及0.1mM非必需氨基酸。人類原代骨骼肌細胞(SkMC)(BioWhittaker，Walkersville，MD)在SkBM基礎培養(yǎng)基中用含0.1％人類表皮生長因子、1％胰島素、5％BSA、5％胎球蛋白、1％慶大霉素-兩性霉素B以及0.5M地塞米松的SkGM子彈試劑盒培養(yǎng)。細胞系在潮濕的溫箱中由5％CO2于37℃維持。
6.2.病毒載體的生產293T細胞以4×106的密度接種在10cM皿中過夜。第二天排出培養(yǎng)基，并替換為新鮮的完全DMEM。4小時后，所述293T細胞利用Profection哺乳動物轉染系統(tǒng)由磷酸鈣共沉淀法(Promega，Madison，WI)轉染。典型地，利用15μg轉移載體構建體、15μg包裝構建體和4.5μg VSV-G病毒表面蛋白基因構建體轉染各皿中接種的細胞。在四構建體系統(tǒng)的情況下，利用15μg轉移載體構建體、15μg包裝構建體(pCIigpRRE)、9μg rev表達構建體(pTracerARev)、4.5μg VSV-G病毒表面蛋白基因構建體轉染各皿中接種的細胞。24小時后，排出培養(yǎng)基，并替換為新鮮的完全DMEM。轉染后48小時收集病毒上清，于2000 RPM離心10分鐘，以清除細胞碎片，并以小份于-80℃冷凍貯存。裂解5μl清除后的上清并利用商業(yè)試劑盒(Reverse Transcriptase Assay，RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN，Cat.#1828657)分析反轉錄酶(RT)活性。編碼eGFP的VSV-G假型鼠白血病病毒(MLV)載體的產生以前已有描述(Berkowitz等，2001)。
6.3.轉導
為轉導分裂細胞，將2×105細胞接種到6-孔板的每孔中。24小時后，抽出培養(yǎng)基，并且典型地向細胞中添加2ml病毒上清(含大約2×106轉導單位的載體顆粒)。然后以8μg/ml的終濃度向孔中添加魚精蛋白硫酸鹽。細胞然后在潮濕的溫箱中由5％CO2于37℃維持3小時。3小時后，抽出病毒上清，并替換為新鮮的培養(yǎng)基，并在潮濕的溫箱中由5％CO2于37℃溫育48小時。為轉導非分裂細胞，將1×105細胞接種到6-孔板的每孔中。24小時后，以4μg/ml的終濃度添加阿非迪霉素。用阿非迪霉素處理16小時后，抽出培養(yǎng)基，并且典型地在阿非迪霉素的存在下向細胞中添加2ml病毒上清。然后以8μg/ml的終濃度向孔中添加魚精蛋白硫酸鹽。細胞在潮濕的溫箱中由5％CO2于37℃維持3小時。抽出病毒上清，并替換為含2μg/ml終濃度的阿非迪霉素的新鮮培養(yǎng)基，并且細胞在潮濕的溫箱中由5％CO2于37℃溫育48小時。
6.4.流式細胞儀分析及滴定方法
為分析eGFP表達，從孔中抽出培養(yǎng)基。細胞用2ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗。然后抽出PBS，并且細胞用胰蛋白酶消化，洗滌并重懸于含5％熱失活的胎牛血清的PBS中。細胞在FACS Calibur(BectonDickinson Biosciences)中分析eGFP表達。為確定編碼eGFP的BIV載體的滴度，6-孔板中的Cf2Th細胞(4×105細胞/孔)用2ml含不同稀釋度病毒載體的培養(yǎng)基在魚精蛋白硫酸鹽的存在下轉導。3小時后，抽出病毒上清并替換為新鮮培養(yǎng)基，并且細胞在潮濕的溫箱中由5％CO2于37℃溫育48小時。然后回收細胞，并通過流式細胞儀測定eGFP的表達。載體滴度以如下方式計算滴度(轉導單位/ml)＝％陽性細胞×4×105細胞×稀釋系數(shù)。
實施例7由基于BIV三構建體的基因轉移系統(tǒng)產生的載體介導的基因表達7.1.分裂和非分裂細胞的轉導
編碼eGFP的BIV載體如實施例6.2中所描述的那樣，通過用包裝和轉移構建體連同VSV-G病毒表面蛋白基因構建體共轉染293T細胞產生。測定載體上清的反轉錄酶(RT)活性(Reverse TranscriptaseAssay，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，Cat.#1828657)。含等量RT的未濃縮載體上清(2ml中的40ng RT等同載體顆粒)(除了不測定RT的基于MLV的腫瘤逆轉錄病毒載體之外)以等體積使用。MLV載體用作為對照確認細胞的分裂或非分裂狀態(tài)，因為基于MLV的腫瘤逆轉錄病毒載體僅轉導分裂細胞，但不能轉導非分裂細胞。然后利用MLV載體轉導分裂和非分裂(見實施例6.3)的HeLa和Neuro-2A細胞(表2)。盡管VSV-G假型MLV有效地轉導分裂的HeLa和Neuro-2A細胞，阿非迪霉素處理的細胞(阿非迪霉素以1μg/ml的終濃度應用)如預期的那樣，對MLV介導的轉導是完全抗性的(表2)，說明阿非迪霉素處理的細胞在我們的實驗條件下很可能不分裂。不過，非分裂HeLa和Neuro-2A都相對高效地被未濃縮的最小化BIV載體轉導，說明由最小化BIV包裝和最小化轉移載體構建體產生的載體完全能夠介導分裂和非分裂細胞中的轉基因表達。
表2HeLa細胞
Neuro-2A細胞
人類原代骨骼肌細胞
7.2.人類原代細胞的轉導
為檢查最小化BIV載體轉導和在原代細胞中表達的能力，人類原代骨骼肌細胞(BioWhittaker，Walkersville，MD)用阿非迪霉素(阿非迪霉素以1μg/ml的終濃度應用)或不用阿非迪霉素處理?；贛LV的載體很好地轉導分裂的原代細胞，但在非分裂細胞中未獲得任何顯著的轉導(表2)。相反，未濃縮的最小化BIV載體有效地轉導分裂和非分裂原代細胞(表2)，證明BIV包裝和轉移載體構建體的顯著最小化并不影響載體轉導人類原代非分裂細胞的能力。
實施例8由基于BIV三組分和四組分的基因轉移系統(tǒng)產生的載體的比較
表3顯示了由基于BIV三構建體和四構建體的基因轉移系統(tǒng)產生的載體在轉導的293T細胞中eGFP表達的流式細胞儀分析的比較。293T細胞用假模擬物(假模擬物在文中是指在沒有載體轉染時由293T細胞收集的細胞培養(yǎng)基)、用由BIV三組分系統(tǒng)產生的載體或用由BIV四組分系統(tǒng)(表3)產生的載體如實施例6.2所述轉導。由RT活性所測量的等量載體顆粒(40ng RT等同載體顆粒)用于BIV三和四組分系統(tǒng)。結果(表3)顯示基于BIV四組分的基因轉移系統(tǒng)產生與由三組分系統(tǒng)產生的載體等同質量的載體。而且，四組分系統(tǒng)是BIV REV依賴性的，因為在缺乏BIV rev表達構建體pTracerARev時，沒有功能性載體產生(表3-Rev)。
表3
實施例9HIV中心聚嘌呤帶(HIVcPPT)對BIV中心聚嘌呤帶(BIVcPPT)的替換
為最小化包裝和轉移載體構建體之間的重疊，BIV轉移載體構建體中的cPPT由HIVcPPT替換。具體地，pBIVminivec用ClaI和EcoRI消化以除去BIVcPPT、平末端化并作為平末端連接與HIVcPPT連接。HIVcPPT由Charneau等描述(Charneau等，1992.J.Virology，652415-2421)。產生載體，并通過RT使含不同cPPT的載體顆粒標準化。相同量的RT用于轉導分裂和非分裂HeLa細胞。結果提示具有BIVcPPT或HIVcPPT的載體同樣好地轉導分裂和非分裂的靶細胞，說明BIVcPPT在功能上可替換為HIVcPPT(圖4)。BIV最小cPPT基本上由與BIV RNA基因組序列(BIV分離物127)pol編碼區(qū)中從堿基對4374到4909的核苷酸相應的535個堿基對組成。實施例10BIV GAG/POL表達中核糖體移碼位點的鑒定
對于某些逆轉錄病毒和慢病毒，gag和pol基因位于不同的翻譯讀框中，gag的3′端與pol的5′端重疊。因此，產生GAG-POL融合蛋白將需要信使RNA加工或翻譯移碼。后一種機制已在勞氏肉瘤病毒(RSV)、禽肉瘤/造白細胞組織增生病毒(ASLV)、鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)以及貓免疫缺陷病毒(FIV)的GAG-POL蛋白合成中證明。對這些病毒的研究證明核糖體移碼需要移碼位點處的7堿基序列和該位點下游緊接著的二級結構元件(即莖環(huán))。移行(如本文所用的術語“移行”是指核糖體翻譯復合體向后移動一個核苷酸并利用同一mRNA起始另一個蛋白的翻譯)序列的實例有A AAU UUA(SEQ ID NO41；ASLV)、U UUU UUA(SEQ ID NO42；HIV-1)、A AAA AAC(SEQ ID NO43；MMTV)和G GGA AAC(SEQ ID NO44；FIV)。因而，移碼位點的通用形式為序列X XXY YYZ，其中三聯(lián)體是最初的(或″0″)翻譯框架，且X可與Y相同。與HIV或SIV不同，BIV未被深入研究。BIV pol基因翻譯起點翻譯移碼的精確定位以前未曾確定。曾提出移碼發(fā)生在序列C AAAAAT(SEQ ID NO45，其中C處于BIV病毒基因組RNA株系127的核苷酸1576處(Garvey等，Virology，175391-409，1990)處。然而，我們鑒定到翻譯移碼改為發(fā)生在序列A AAA AAC(SEQ ID NO46)中，相應于BIV病毒基因組RNA中的核苷酸1629到1635，并且相應于BIV原病毒DNA序列SEQ ID NO1中的核苷酸2013到2019。此外，我們發(fā)現(xiàn)了如圖5中的附圖所示的緊接著移碼序列的莖環(huán)。圖5所示的并且也在SEQ ID NO47(DNA)和SEQ ID NO48(RNA)中顯示的病毒序列和結構，構成了牛免疫缺陷病毒Gag/Pol核糖體移碼位點。
實施例11具有重新編碼的gag/pol序列的BIV包裝構建體
認為慢病毒例如HIV、SIV和BIV在其病毒RNA中含有導致RNA不穩(wěn)定的核酸序列，從而阻止了病毒RNA的有效核輸出。這被認為是由于慢病毒采用稀有密碼子選擇的事實和/或由RNA序列決定的RNA二級結構的緣故。沒有rev/RRE，含這些稀有密碼子的病毒RNA就不能被有效地運輸?shù)郊毎送?。為從包裝構建體中消除RRE，以最小化或消除包裝和轉移載體構建體之間的重疊，并提高BIV gag/pol基因的表達水平，我們利用優(yōu)選的人類密碼子重新編碼BIV gag/pol編碼序列(SEQID NO49)。將重新編碼的gag/pol編碼序列克隆到pCI哺乳動物表達載體中，產生pCIigpSyn(圖6)。合成的BIV gag/pol基因利用本領域公知的技術和PCT申請WO01/68835中描述的那些技術構建。具體地，在合成重新編碼的gag/pol時，將XhoI位點和XbaI位點分別摻入到重新編碼的gag/pol編碼區(qū)的5′和3′端兩翼。然后用XhoI和XbaI消化重新編碼的gag/pol，并克隆到事先用XhoI和XbaI消化的pCI表達構建體(Promega，Madison，WI)中，創(chuàng)建pCIgpSyn。pCIigpSyn的產生允許我們通過共轉染CIigpSyn，、pTracerARev、pBIVfinalvec和pCMVVSV-G，由四組分系統(tǒng)中制備BIV載體。由該系統(tǒng)產生的具有重新編碼的gag/pol的BIV載體具有完全的功能，如通過其有效轉導細胞的能力所指示的那樣。表4顯示了293T細胞中eGFP表達的流式細胞儀分析結果。293T細胞用由四組分系統(tǒng)中產生的BIV載體轉導，除了在“Rev-”的情況下，其中病毒載體的生產在不存在表達組分時進行。該實驗將由野生型BIV gag/pol表達組分產生的病毒載體與由重新編碼的BIV gag/pol表達組分產生的病毒載體進行比較(表4)。
表4 基因或基因的一部分的重新編碼可利用本領域熟知的技術進行。作為非限制性的實例，Casimiro DR等描述了用于基因合成的基于PCR的方法(Structure 1997 Nov 15；5(11)1407-12)(也參見Brocca等″Design，total synthesis，and functional overexpressionof the Candida rugosa lip 1 gene coding for a major industriallipase″Protein Sci 1998 Jun；7(6)1415-22；Withers-MartinezC等，″PCR-based gene synthesis as an efficient approach forexpression of the A+T-rich malaria genome″Protein Eng 1999 Dec；12(12)1113-20；以及Stemmer等，″Single-step assembly of a geneand entire plasmid from large numbers ofoligodeoxyribonucleotides″Gene 1995 Oct 16；164(1)49-53))。為比較具有重新編碼的gag/pol的包裝構建體與具有野生型gag/pol的重組包裝構建體，測試了包裝構建體補充載體生產的能力。BIV載體如實施例6.2所述產生。具有重新編碼的gag/pol的BIV包裝構建體比具有野生型BIV gag/pol的包裝構建體更有效。BIV載體用pCIigpRRE或用pCIigpSyn以低10倍的質粒輸入(1.5μg對15μg)產生。由重新編碼的gag/pol產生的載體與由含野生型gag/pol的包裝構建體產生的載體轉導的細胞百分比(27％)相比，可轉導更高的細胞百分比(47％)，如通過FACS分析eGFP表達所顯示的那樣。假的模擬轉導細胞轉導0％的細胞。對重新編碼的gag/pol和野生型gag/pol樣品使用等體積的載體。數(shù)據(jù)顯示具有重新編碼的gag/pol的包裝構建體pCIigpSyn比具有野生型gag/pol的包裝構建體pCIigpRRE更有效。同樣，重新編碼gag/pol的無RRE元件存在時具有完全功能。重新編碼的gag/pol構建體中RRE的缺乏起進一步最小化或消除與含野生型RRE的轉移載體的同源性的作用。既然如實施例10已確定了核糖體移碼位點，則利用標準DNA密碼子和開放讀框分析確定BIV pol基因的氨基酸序列。野生型BIVpol基因示于SEQ ID NO50。BIV pol基因推斷的氨基酸序列是建立在gag和pol基因之間核糖體移碼位點的鑒定的基礎上的，示于SEQ ID NO51。由于已確定了BIV pol的氨基酸序列，這易化了BIV pol基因的重新編碼。既然已確定了BIV pol基因的氨基酸序列，本領域的普通技術人員可修飾該序列，進行重新編碼，以優(yōu)化在特定細胞類型中的表達。利用類似于重新編碼gag/pol組合DNA片段所用的那些方法，也重新編碼了pol基因的DNA。重新編碼的BIV DNA pol基因示于SEQ ID NO52。如SEQ ID NO51中所表明的，BIV pol基因不編碼起始met氨基酸，并且如SEQ ID NO52中所表明的，這里該基因的5′端不含met和蛋白合成起始的密碼子。為構建其中gag和pol基因在不同構建體上提供的BIV轉移系統(tǒng)，構建編碼pol基因的在開放讀框5′端具有額外的密碼子的合成DNA，它能夠合成具有起始的met密碼子的POL多肽。該合成DNA的序列示于SEQ ID NO53。pol已經重新編碼并且也含有met起始密碼子的合成DNA的序列示于SEQ ID NO54。
實施例12組蛋白脫乙酰基酶抑制劑提高慢病毒載體的產量并增強載體轉導效率
與慢病毒載體廣泛應用有關的技術障礙之一是相對低的滴度(大約105到107轉導單位/ml，取決于不同的載體系統(tǒng))。為克服該障礙，可通過超速離心濃縮載體。重要的是通過不會影響載體質量的手段提高慢病毒載體的滴度。在本發(fā)明的一個實施方案中，組蛋白脫乙?；敢种苿┒∷?BA)顯著提高基于牛免疫缺陷病毒的慢病毒載體的產量5到10倍，如通過在載體生產的細胞的培養(yǎng)基中反轉錄酶活性所指示的那樣(圖7)。具體地，在收集載體之前24小時，以5mM的終濃度向載體生產者細胞中添加丁酸(Sigma，St.Louis，MO)。反轉錄酶活性是對載體顆粒的度量。此外，如通過轉導效率所測量的那樣在丁酸存在下產生的載體更具有傳染性(圖8)。BIV載體顆粒如實施例6.2所述生產。
實施例13BIV載體的視網膜色素上皮細胞的體內轉導
視網膜色素上皮細胞(RPE)是眼睛內眼基因治療的靶之一。為測試用BIV載體的RPE轉導效率，由三組分系統(tǒng)產生編碼eGFP的BIV載體，并通過視網膜下注射(5×105轉導單位/眼)注射到小鼠眼中。在從注射后1周到10周的不同時間點內收集眼組織、切片并檢查eGFP的表達。切片的組織通過免疫熒光顯微鏡檢直接檢查eGFP的表達或由免疫組織化學染色檢測。如通過eGFP表達所指示的那樣，顯著部分的視網膜色素上皮(RPE)細胞被BIV載體轉導。在載體注射后1、2、8和10周對眼進行低溫切片。1周時在RPE層觀察到GFP的表達。載體注射后2周eGFP的表達在RPE層觀察到，并且也在視網膜、光感受器和神經膠質細胞中檢測到。載體注射后8周，在RPE層和視網膜中都觀察到eGFP的表達。載體注射后10周，表達eGFP的RPE細胞清晰地見于眼底。
實施例14小鼠大腦中BIV載體介導的轉基因表達
慢病毒載體介導的基因表達在許多治療人類疾病的應用中具有極大的潛力。神經元和眼疾病代表了最適合基于慢病毒載體基因治療的兩個有前景的領域。測試了本發(fā)明基于重組BIV的慢病毒載體在小鼠大腦中介導轉基因表達的能力。將編碼eGFP的BIV載體(1×106轉導單位，2μl)注射到小鼠黑質中。注射后17天，通過免疫組織化學染色檢查小鼠大腦切片中eGFP的表達。小鼠大腦中的細胞被相對高效地轉導。某些細胞的確是神經元細胞，正如通過eGFP(綠色)和NeuN(紅色，神經元細胞特異性標志)共染色產生黃斑所指示的那樣。
實施例15全身遞送后大鼠脾臟中BIV載體介導的轉基因表達
將編碼螢光素酶載體的BIV載體(1×109轉導單位，250μl)通過靜脈內注射(尾靜脈)注射到大鼠中。作為對照，也將TBS(Tris緩沖鹽)注射到作為陰性對照的對照組大鼠中。載體注射后15天，向大鼠給藥熒光素(螢光素酶底物)，并用Xenogen成像系統(tǒng)檢查大鼠。大鼠脾臟被BIV載體有效地轉導，而且通過成像系統(tǒng)觀察到高水平的螢光素酶表達。相同的條件下在陰性對照大鼠中檢測不到顯著的信號。
實施例16由BIV載體介導的抗血管生成基因表達對眼新生血管形成的體內抑制
舉例來說，許多新生血管形成相關的眼疾例如老年性黃斑變性(AMD)尚無有效的療法，并代表了主要的尚未滿足的醫(yī)學需求。如實施例13所示，本發(fā)明基于重組BIV的載體有效地轉導小鼠視網膜色素上皮細胞。通過視網膜下注射象轉基因小鼠(IRBP/rtTA-TRE/VEGFtgMICE)給藥編碼鼠內皮他丁(一種抗血管生成基因)的BIV載體(O′Reilly等，Cell；88(2)277-85(1997))，所述轉基因小鼠在強力霉素誘導下表達來自小鼠光感受器細胞的血管內皮生長因子。將BIV載體注射到小鼠右眼中，而左眼作為對照不注射載體。載體注射后3周，將0.5mg/ml的強力霉素置于轉基因小鼠的飲用水中。強力霉素誘導5天后分析結果。如通過熒光素血管造影照片顯示的那樣，強力霉素誘導的VEGF表達導致轉基因小鼠左眼重度的新血管形成。VEGF誘導的新血管形成被同一動物右眼中BIV載體介導的內皮他丁表達完全封閉。
實施例17HIV和BIV不交叉包裝
與基于慢病毒載體的基因治療相關的議題之一就是安全性。人們能夠想象如果患者感染了HIV，野生型HIV可潛在地行使包裝功能，通過動用進行治療的慢病毒載體產生新的重組子。為解決該問題，進行了交叉包裝實驗，其中采用基于BIV的包裝構建體產生基于BIV的載體(BIV/BIV)，或者采用基于HIV的包裝構建體產生基于HIV的載體(HIV/HIV)。為測試交叉包裝，我們利用基于BIV的包裝構建體嘗試并產生基于HIV的載體包裝到載體中(BIV/HIV)，或者利用基于HIV的包裝構建體嘗試并產生基于BIV的載體(HIV/BIV)包裝到載體中。產生載體，并利用如通過RT活性測定所指示的等量的載體顆粒轉導相等數(shù)目的Cf2Th細胞。在轉導了HIV載體、BIV載體、HIV/BIV交叉包裝載體或BIV/HIV交叉包裝載體的Cf2Th細胞中eGFP表達分析通過FACS分析。由BIV/BIV產生的BIV載體和由HIV/HIV產生的HIV載體分別轉導31％和21％的細胞。然而，由BIV/HIV或HIV/BIV對產生的載體顆粒不產生可檢測的eGFP陽性細胞，說明由所述兩對產生的載體是空的或缺陷型顆粒。假的模擬轉導用作為陰性對照，0％的細胞是eGFP陽性的。在假的模擬、BIV/HIV或HIV/BIV侵染的細胞之間未觀察到差異。我們的數(shù)據(jù)說明HIV包裝構建體不能交叉包裝BIV載體的生產，而BIV包裝構建體不能交叉包裝HIV載體。在進一步的分析中，HIV包裝構建體由BIV載體構建體和BIV Rev構建體共轉染，以確保BIV載體RNA的核輸出。再次地未觀察到靶細胞的轉導，進一步說明HIV不能包裝，或至少不能有效地包裝BIV載體。
實施例18BIV蛋白酶的突變
在產生穩(wěn)定的基于慢病毒的包裝細胞系時遭遇的主要障礙之一是不能維持GAG和POL蛋白的高水平表達。HIV蛋白酶的催化中心包含包含三氨基酸基序Asp-Thr-Gly(Konvalinka，J.等，J.Virol.697180-7186，1995)。這三個氨基酸在迄今為止文獻記載的HIV和SIV分離物中是保守的(Korber B，Theiler J，Wolinsky S，Science 1998 Jun19 2805371 1868-71)。Konvalinka，J.等將Thr殘基(相應于HIV分離物HXB2中蛋白酶從起點起的氨基酸26)突變?yōu)镾er。他們發(fā)現(xiàn)突變的HIV蛋白酶在保留蛋白酶活性的同時具有顯著降低的毒性。這個信息使得可能產生表達高水平慢病毒Gag/Pol蛋白的穩(wěn)定細胞系。為了建立用于慢病毒載體、尤其是用于以HIV或BIV為基礎的慢病毒載體的穩(wěn)定包裝細胞系，這些蛋白的表達是絕對必需的。Asp-Thr-Gly基序也存在于BIV蛋白酶的相同位置上。比較HIV和BIV蛋白酶的頭29個氨基酸揭示氨基酸編號25到29在HIV和BIV蛋白酶之間是完全相同的，包含所述Asp-Thr-Gly基序HIV蛋白酶(HXB2)1-PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGAD(SEQ ID NO55)BIV蛋白酶(127分離物)1-SYIRLDKQPFIKVFIGGRWVKGLVDTGAD(SEQ ID NO56)HIV蛋白酶突變1-PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDSGAD(SEQ ID NO57)相應的BIV蛋白酶突變1-SYIRLDKQPFIKVFIGGRWVKGLVDSGAD(SEQ ID NO58)
在包裝構建體pCIigpSyn SEQ ID NO40的氨基酸Thr處進行點突變，其中氨基酸26處的Thr(由相應于BIV病毒基因組RNA分離物127的核苷酸1806-1808的核苷酸ACT編碼，Garvey等，1990；SEQ ID NO56和SEQ ID NO58代表了BIV蛋白酶的部分序列，其全序列在本發(fā)明載體的一個實施方案中編碼，以突變或重新編碼的形式存在)在相同的位置上由Ser替換，而包裝構建體的任何其它編碼區(qū)無任何改變。具有Thr到Ser突變的這個包裝構建體被命名為pCIigpSynSer。比較pCIigpSynSer和pCIigpSyn支持BIV載體生產的能力以及所述BIV載體達到的轉導效率。具體地，10-CM皿中的8×106293T細胞用pCIigpSyn或pCIigpSynSer(1ug)、pTracerARev(10ug)、pBIVminiVec(15ug)及pCMVVSV-G(4.5ug)轉染。轉染后48小時，從轉染的細胞中收集載體。HeLa細胞用如反轉錄酶(RT)活性所指示的等數(shù)目的載體顆粒轉導。轉導后48小時，進行流式細胞儀分析以計分eGFP陽性的HeLa細胞。如表5所示，由具有Thr到Ser突變的包裝構建體pCIigpSynSer產生的載體與由包裝構建體pCIigpSyn產生的載體同樣有效地轉導HeLa細胞。該突變的gag/pol基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO59。
表5包裝構建體轉導效率平均GFP強度模擬0％ 0pCIigpSyn 91％ 1000pCIigpSynSer92％ 1050比較HeLa細胞中BIV載體介導的eGFP表達。編碼GFP的BIV載體通過包裝構建體pCIigpSyn或pCIigpSynSer產生，并比較其對HeLa細胞的轉導效率以及eGFP表達的強度。轉導效率通過陽性HeLa細胞百分比測量。平均eGFP強度以相對熒光強度計分。轉導效率和平均eGFP強度都通過FACS Calibur(Becton Dickinson Biosciences)上的流式細胞儀分析予以分析。
實施例19從BIV轉移載體中除去cPPT
BIV轉移載體構建體之一具有推定的cPPT(Berkowitz等，2001b；Matukonis等，2002；Molina等，2002)。為確定所述BIV cPPT是否為體外或體內轉導效率必需的，我們在非分裂的培養(yǎng)的HeLa細胞和大鼠視網膜中比較了有或無cPPT的載體。無推定的cPPT的載體形式通過用ClaI和EcorI消化pBIVminivec去除cPPT、使片段平末端化并重新連接而產生。有或無cPPT的載體以相等的載體顆粒輸入分別轉導35％和34％非分裂的HeLa細胞。此外，對于如下實驗，去除cPPT并不顯著影響體內的基因轉移效率。將有或無cPPT的編碼eGFP的BIV載體注射到大鼠右眼的視網膜下空間(4.8×105T.U./眼)，而左眼作為對照，每組5只大鼠。注射后兩周，直接在熒光顯微鏡下檢查視網膜平面封固標本的eGFP表達。結果未注射的左眼不表現(xiàn)出任何可檢測的GFP表達。相反，注射了eGFP BIV載體的右眼表現(xiàn)出大量的GFP表達。含cPPT的和cPPT缺失的BIV載體都轉導眼中近似量的細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。這證明體外和體內轉導可利用不含推定的cPPT的BIV載體實現(xiàn)。同時，去除cPPT消除了與包裝構建體364bp區(qū)段的序列相似性。這些修飾形成這樣的系統(tǒng)，即其中轉移載體和包裝構建體只共有101bp的序列(包裝信號)相似性，而同一性不長于8bp。如實施例11中所述重新編碼gag/pol將去除所述101bp區(qū)段的同源性。
實施例20
POAG的治療可通過向患者遞送本發(fā)明的編碼視神經堿(Optineurin)基因(Rezaie等，Science 2951077-1079(2002))和/或小梁網蛋白基因(TIGR；Stone等，Science 275668-670)的載體實現(xiàn)。載體將優(yōu)選通過直接眼內注射到眼中遞送。向眼中注射的方法是本領域熟知的。光感受器退行變性導致的疾病包含但不限于遺傳性視網膜營養(yǎng)不良(例如，視網膜色素變性、老年性黃斑變性、Bardet-Biedel綜合癥、Bassen-kornzweig綜合癥、卵黃狀黃斑變性、無脈絡膜、回旋狀萎縮、先天性黑曚(congenital amourosis)、Refsun綜合癥、Stargardt病和Usher綜合癥)、視網膜脫離、老年性黃斑變性及其它黃斑病變。這些疾病的治療可通過向患者遞送本發(fā)明的編碼視桿源生的視錐生存因子(RdCVF；PCT申請PCT/EP02/03810(WO 02/081513))或抗-細胞凋亡基因的載體實現(xiàn)。另外，本發(fā)明的載體可用于表達視神經堿(optineurin)、TIGR、血管生成基因等，以治療諸如歸因于組織胞漿菌和病理性近視的脈絡膜新血管形成的疾病，以及由血管樣條紋癥、前部缺血性視神經病變、細菌性心內膜炎、卵黃狀黃斑變性、鳥槍視網膜脈絡膜病變(birdshot retinochoroidopathy)、脈絡膜血管瘤、脈絡膜痣、脈絡膜不滿(choroidal nonperfusion)、脈絡膜骨瘤、脈絡膜破裂、無脈絡膜、慢性視網膜脫離、視網膜缺損、Drusen、內生性假絲酵母眼內炎、視網膜色素上皮乳頭外錯構瘤、眼底黃色斑點癥、特發(fā)癥、黃斑裂孔、惡性黑素瘤、膜增生血管球性腎炎(II型)、金屬眼內異物、牽牛椎間盤綜合癥、多發(fā)易散性白斑綜合癥(MEWDS)、鋸狀緣新血管形成、手術顯微鏡燒傷、視神經頭傷痕、光凝固術、點狀內部膜脈絡膜病變、風疹、肉狀瘤病、匐行脈絡膜炎或局域性脈絡膜炎(serpiginous orgeographic choroiditis)、視網膜下積液引流、傾斜性椎間盤綜合癥、錯漿視網膜脈絡膜炎(Taxoplasma retinochoroiditis)、肺結核或Vogt-Koyanagi-Harada綜合癥等引起的脈絡膜新血管形成。
實施例21BIV載體對RdCVF基因的治療性轉移和表達
光感受器是特化的負責視覺的視網膜神經元亞群。光感受器由視桿和視錐組成，它們是視網膜的感光細胞。每個視桿和視錐精細地構造為特化的纖維管胞，稱之為外節(jié)段，其容納光傳導機器。視桿含特殊的光吸收視色素視紫質。人類存在三類視錐，以表達截然不同的視色素為特征藍錐、綠錐和紅錐色素。各類視色素蛋白調整在不同的波長最大限度地吸收光。視桿視紫質介導暗視覺(在暗光下)，而視錐色素負責亮視覺(在亮光下)。所述紅、藍和綠色素也構成了人類色覺的基礎。視桿和視錐中的視色素響應光，并在輸出細胞視桿雙極神經元中產生動作電位，它隨即由視網膜神經節(jié)神經元傳遞在視皮層中產生視覺刺激。在人類中，許多視網膜疾病涉及光感受器的累積性退行變性和最終死亡，無情地導致失明。光感受器退行變性例如遺傳性視網膜營養(yǎng)不良(如視網膜色素變性)、老年性黃斑變性、青光眼及其它黃斑病變、或者視網膜脫離，都以光感受器外節(jié)段的累積性萎縮和功能喪失為特征。另外，光感受器死亡或光感受器功能喪失在視網膜營養(yǎng)不良患者中導致二級視網膜神經元(視桿雙極細胞和水平細胞)的部分傳入神經阻滯，由此降低光感受器產生的電信號傳播的總體效率。光感受器退行變性繼發(fā)的二級神經膠質和色素上皮改變導致血管改變，引起局部缺血和神經膠質增生。能夠拯救光感受器免于細胞死亡和/或恢復功能障礙(萎縮或營養(yǎng)不良)光感受器的功能的營養(yǎng)因子可能代表了治療此類病況的有用的療法。另外，表達RdCVF基因的BIV轉移載體能夠在細胞中可調控地表達，以測定這些基因的過度表達或表達不足的生理學效應，以及表達與多種眼疾的關系。這些病況的發(fā)展指向了兩類光感受器的相繼喪失最初視桿作為遺傳或環(huán)境或未知損傷的直接結果而喪失，導致夜盲癥和視野的下降，接著是不可避免的視錐喪失，導致完全失明。從而，視錐間接地死亡，因為它們不表達原發(fā)性損傷。已發(fā)現(xiàn)視桿源生的視錐生存因子(RdCVF)是視錐保護性因子(PCT申請PCT/EP02/03810(WO 02/081513))。視桿源生的視錐生存因子(RdCVF)在眼組織中表達，并且尤其是在視桿細胞中生產。RdCVF基因可由其它細胞類型在視桿細胞的局部區(qū)域表達，而仍然提供保護益處。在患有視網膜營養(yǎng)不良的人中，RdCVF的產生在量上相對于未患視網膜營養(yǎng)不良的人的相應組織中的表達下降。由RdCVF基因轉錄的信使RNA，以及由此mRNA翻譯的蛋白，存在于視桿組織和/或與此組織相關的組織中，其量為未患視網膜營養(yǎng)不良的人的相應組織中發(fā)現(xiàn)的mRNA和蛋白的水平的至少一半，優(yōu)選比其少至少大約5倍，更優(yōu)選少至少10倍的量，最優(yōu)選少至少大約100倍。RdCVF mRNA轉錄的這種下降在文中稱之為“下降的轉錄”。在優(yōu)選的實施方案中，BIV載體含有編碼RdCVF的核酸序列。SEQ ID NO60和SEQ ID NO62分別為鼠RdCVF1和RdCVF2基因，而SEQ ID NO61和SEQ ID NO63分別編碼鼠RdCVF1和RdCVF2多肽(Genbank登錄號XM_134263、BC017153和BC021911)。SEQ ID NO64和SEQ ID NO66分別是人類RdCVF1和人類RdCVF2的基因，且進一步在Genbank登錄號NM_138454和BC014127中描述。人類RdCVF1和RdCVF2多肽的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO65和SEQ ID NO67。本領域普通技術人員將會意識到編碼RdCVF的核酸可通過改變密碼子而不改變最終RdCVF蛋白的氨基酸序列加以修飾。同樣提供的是編碼RdCVF的核酸的變體，其中變體編碼RdCVF蛋白氨基酸序列的相應功能變體。功能變體可能在氨基酸序列上有一個或多個取代、添加、缺失或截短的差異，其可以任意組合存在，但將保留與參照RdCVF相同的生物功能。在本申請含義之內的“生物功能”應在廣義上理解。它包含但不限于本申請公開的RdCVF蛋白的獨特功能。因而，生物功能不僅是多肽在其生理環(huán)境下即作為活生物體或細胞的一部分所展示的那些功能，而且包含它在非生理設置中如在體外可能表現(xiàn)的生物功能。例如，在本申請含義之內RdCVF蛋白的生物功能是例如在體外或體內表現(xiàn)出視錐保護功效的能力。評估所需性質的方法是本領域普通技術人員熟知的。同樣，可進行細小的密碼子取代、缺失和插入，而不消除RdCVF蛋白的治療功效。因而，盡管SEQ ID NO 61、63、65和67編碼RdCVF蛋白，本發(fā)明包含編碼具有相同或相似治療功效或生物功能的任何RdCVF蛋白的BIV載體。在優(yōu)選的實施方案中，所述BIV載體編碼人類RdCVF1和/或RdCVF2。表達RdCVF的BIV載體可用于治療與眼相關的多種疾病。這樣的載體也可用于分析RdCVF表達在細胞中的生理功效。將RdCVF基因(單個或多數(shù))插入到本發(fā)明的BIV載體中，并將載體轉移到眼細胞中，其中RdCVF基因以等同于正常眼細胞中的水平表達。如本申請所述的含異源目的基因的載體將具有多種用途，包含但不限于表達異源目的基因用于基因治療。正如本領域普通技術人員將容易地理解的那樣，這些載體可用于修飾基因表達，以測定此修飾對細胞生長、存活和功能的影響。例如，基因表達的修飾可提供對多種生理學現(xiàn)象的洞悉，例如象美國專利6,465,715(秀麗線蟲(C.elegans)發(fā)育)；美國專利6,465,246(腫瘤發(fā)生)和美國專利6,461,807(通過修飾藥物靶篩選藥物)。
實施例22索戈托病毒包膜糖蛋白假型慢病毒載體
VSV-G已被廣泛地用作為多種假型慢病毒載體的包膜糖蛋白。可是，VSV-G對細胞是毒性的。測試了索戈托病毒包膜糖蛋白對假型BIV載體的能力。將索戈托病毒糖蛋白編碼序列(SEQ ID NO68)作為平末端連接克隆到pCI表達質粒的XhoI位點處。對所得的構建體pCIThogotoGP進行DNA序列分析以確認構建體的完整性。然后通過用pCIgpSynSer(包裝構建體)、pTracerA Rev(Rev表達構建體)、pBIVfinalvec(轉移載體構建體)和pCIThogotoGP(索戈托病毒包膜糖蛋白表達構建體)通過實施例6.2(病毒載體生產)中所描述的方法共轉染293T細胞產生BIV載體。檢查由索戈托病毒包膜假型的BIV載體的滴度、穩(wěn)定性和在多種人類和動物細胞包含人類原代細胞中的轉導效率。進一步分別如實施例13和實施例14中所述測試載體轉導視網膜細胞、神經元細胞的能力。為增強索戈托病毒包膜糖蛋白在人類細胞中的表達效率，索戈托病毒包膜糖蛋白的編碼序列被優(yōu)化(重新編碼)。重新編碼的序列示于SEQ ID NO70。表達索戈托病毒包膜蛋白的細胞可用作為BIV載體的包裝細胞系。
實施例23桿狀病毒包膜蛋白假型慢病毒載體
可用于BIV載體系統(tǒng)的另一種病毒包膜是桿狀病毒包膜蛋白。優(yōu)選是來自于加利福尼亞病毒(Autographa Californica virus)的GP64。GP64區(qū)的DNA編碼區(qū)通過本領域技術人員公知的技術克隆。將該編碼序列克隆到與上文所述的BIV系統(tǒng)相容的表達構建體中。例如，將其克隆到pCi質粒中。這可以與實施例22中描述的索戈托病毒包膜或者Burns等(1993，PNAS.USA 908033-8037)用于VSV-G的相似的方式進行。含GP64包膜的BIV病毒載體通過用pCIgpSynSer(包裝構建體)、pTracerA Rev(Rev表達構建體)、pBIVfinalvec(轉移載體構建體)和pCIGP64(桿狀病毒包膜糖蛋白表達構建體)通過實施例6.2中描述的方法共轉染293T細胞產生。如實施例7中大致描述的那樣，使用這種帶GP64包膜的BIV病毒載體轉導分裂和非分裂原代RPE(ARPE)和HUVEC細胞。結果示于表6。非分裂ARPE和HUVEC細胞都相對高效地被BIV載體轉導，這說明由最小化的BIV包裝及最小化的轉移載體構建體產生的載體完全有能力介導分裂和非分裂細胞中的轉基因表達。
表6ARPE
HUVEC 并且，根據(jù)其耐受超速離心的能力，發(fā)現(xiàn)BIV-GP64顆粒是穩(wěn)定的。通過視網膜下注射，BIV-GP64也被注射到大鼠的視網膜下空間。這個發(fā)現(xiàn)提示P64假型BIV病毒載體可用于在體內轉導視網膜色素上皮細胞。表達桿狀病毒包膜蛋白的細胞可用作為BIV載體的包裝細胞系。盡管在本專利申請中本發(fā)明是參照本發(fā)明優(yōu)選實施方案的細節(jié)公開的，應當理解這種公開旨在舉例說明，而并非限制性意義的，因為考慮到在本發(fā)明的精神和所附權利要求書的范圍之內，本領域技術人員很容易想到修飾。
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美國專利No.5,817,491，由Yee等發(fā)表美國專利No.6,277,633Weintraub，Scientific American，26240，(1990)WO 92/14829WO 01/30843WO 01/44458WO 01/68835WO 02/06463WO 02/22663WO 02/26827WO 02/067970WO 02/072851WO 02/081513Yee等，Proc.Natl.Acad.Sci.，919563-9568(1994)Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83(10)3194-3198(1986)
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ttggtagcag ctatgaaaga aatggggatc caatcaccaa ttccagcagt cttgcctcac1860acaccagaag catatgcctc ccaaacctca gggcccgagg atggtaggag atgttacgga1920tgtgggaaga caggacattt gaagaggaat tgtaaacagc aaaaatgcta ccattgtggc1980aaacctggcc accaagcaag aaactgcagg tcaaaaaacg ggaagtgctc ctctgcccct2040tatgggcaga ggagccaacc acagaacaat tttcaccaga gcaacatgag ttctgtgacc2100ccatctgcac cccctcttat attagattag acaaacagcc ttttataaag gtgttcatag2160ggggaagatg ggtaaaaggg ttagtagaca ctggagcaga tgaggtagtg cttaagaaca2220tacattggga taggataaaa gggtatccag ggacaccaat taaacaaatt ggggtaaatg2280gagtaaatgt ggccaaaagg aagacccacg tagagtggag atttaaggat aagactggga2340taattgatgt cttgttctca gatactcctg taaacctttt tgggagatct cttctacgta2400gcatagtgac ttgcttcacc ctacttgttc acacagaaaa aatcgaaccc ctacccgtca2460aggtaagggg accagggcct aaggtacccc agtggccctt gacaaaagaa aagtatcagg2520ctcttaagga aattgtgaaa gatcttttag cagaaggaaa aatttccgaa gctgcttggg2580ataacccata taatacccca gtttttgtta taaagaaaaa gggaacggga agatggagga2640tgctaatgga ttttagggaa ttaaataaga taacagttaa aggacaagaa ttctctacag2700gcttacctta ccctccagga attaaggaat gtgaacactt aactgcaata gatataaaag2760atgcctactt tactatccct ttacatgagg actttagacc ctttacagcc ttctctgtag2820tccctgtaaa tcgagaagga cctatagaga ggttccagtg gaatgttcta ccacaaggat2880gggtatgtag ccctgccatt tatcagacta ccacccagaa gattatagaa aacattaaaa2940agagtcaccc agatgtcatg ttgtatcaat atatggatga tttgttgatt gggtctaata3000gggatgatca taagcaaata gtgcaggaaa tcagggataa gttaggatca tatggtttca3060agactccaga tgaaaaggtc caggaagaga gagtgaaatg gatcggtttt gagctcacac3120ccaagaaatg gcgttttcag cccaggcaac taaagataaa aaacccactc acagtaaatg3180aattacagca attagtaggt aattgtgttt gggtacagcc agaagtaaaa atccctctat3240accccttaac cgatctactg agggataaga ccaatctcca agaaaagata caactaacac3300cagaagccat caagtgtgta gaagaattca atctaaaact aaaagatcca gaatggaaag3360atagaataag agaaggagca gaattagtca taaaaataca gatggttcct cggggcatag3420tatttgatct gttgcaagat ggaaatccca tatggggagg agtaaaagga ctaaattatg3480atcattcaaa caaaataaaa aagatactta gaactatgaa tgagctgaac agaacagtgg3540taattatgac aggaagagaa gctagtttcc tgcttcctgg gtcttctgaa gattgggaag3600cggcactcca gaaggaagaa agtctaacac aaatattccc agtaaagttt tataggcact3660cctgcagatg gacctccata tgtgggccag taagagaaaa tctaaccacc tactatactg3720acggagggaa gaaagggaaa acagctgcag cagtatattg gtgtgaagga aggactaagt3780caaaggtatt tccaggaacc aatcaacagg cggaattgaa ggccatatgc atggctctct3840tggatggacc accaaaaatg aatatcataa cagatagtag atacgcctat gagggaatga3900gagaagaacc agaaacgtgg gccagggaag gaatctggct ggagattgcc aagatattgc3960cctttaagca gtacgtgggg gtcgggtggg tgcctgcaca taaagggata ggaggaaata4020cagaggcaga tgaaggagtt aagaaagcct tagaacagat ggccccgtgt agccctcctg4080aggccattct attaaaacca ggagaaaaac aaaatctgga gacagggatc tacatgcagg4140ggcttagacc acaaagcttc ctcccaagag cagacttacc agtagccatc acaggaacca4200tggtagattc agagctacag ctacagctac ttaacatagg aactgagcat ataagaatcc4260aaaaagatga ggtcttcatg acctgtttcc tagaaaatat cccctcagcc actgaagatc4320atgagagatg gcatacctca ccagacattt tggttaggca gttccatctc cctaagagaa4380tagctaaaga gatagtagcc agatgccaag aatgtaaaag gacaaccact agcccagtca4440gaggaacaaa ccccagaggt cgattcttat ggcagatgga caatactcac tggaataaaa4500caattatttg ggtagcagta gagacaaatt caggattagt ggaagctcag gtgatccctg4560aagaaacagc actacaagta gctctctgca ttttacagct aatccagaga tatacagttc4620ttcacttaca tagtgacaac gggccgtgct ttactgcaca caggatagaa aatctatgta4680agtatctggg gatcacaaaa actacgggaa taccctacaa cccacaatcc cagggagttg4740tagaaagagc ccacagagat ctaaaagaca gattggcagc ttatcaggga gattgtgaaa4800ccgtagaagc agcccttagc ctcgcattag tttctttaaa taaaaaaaga gggggaatag4860ggggccatac accatatgaa atatacctag aatcagaaca taccaaatac caagaccaac4920tagaacaaca attttcaaaa caaaaaattg aaaagtggtg ttacgtaagg aacagaagaa4980aggaatggaa aggaccctac aaagtgttgt gggacggaga cggggcagca gtaatagagg5040aagagggaaa aacagcctta tatccacacc gtcatatgcg cttcatcccc cccccagatt5100cagatatcca agatgggagt tcgtgaggca gacagaatac agcatgaccg cgtgcgtaag5160aaaagggaaa ttagtcctta cttaccagta cgcgatctgg aaaagagtct ggacgataga5220aacaggattt acagatccaa gtctgtttat gaccccagct ggaacacaca ccactgaaga5280aataggtcac ttagatctct tttggcttag gtactgttca tgtccgcatg agatgccccc5340
gtggctagac ttccttagag gcaccctcaa tctacgcatt tcctgtcgac gcgctcttca 5400agcgtcagtg ttgactagca cccctagaca ctccctccaa cgcttagctg cacttcagct 5460gtgcactaac gcatgtctct gttggtaccc gttaggacgc atcaacgaca ccaccccgtt 5520gtggttgaac ttttcgtctg ggaaggaacc aacgatccaa caactgagtg gccaccccta 5580actcgtcgta acattcatag attgtggcaa tatgcccgga ccttgggtgg cgatgataat 5640gttgccacag cccaaagaaa gctttggagg aaagccaatt ggctggcttt tctggaacac 5700gtgcaaagga cctaggcggg actgtccaca ttgttgttgt cccatatgta gttggcattg 5760tcagctttgc tttttgcaga aaaatctagg aatcaactat ggatcaggac ctagacggcg 5820cggaacgcgg ggaaagggga ggaggatccg aagaactgct tcaggaggag atcaacgaag 5880ggaggctgac agccagagaa gctttacaaa catggatcaa taacggtgag atccaccctt 5940gggtcctggc aggaatgctg tccatgggag taggaatgct actaggagta tattgtcagt 6000taccagacac actgatttgg atactaatgt ttcaattatg cctttattgg ggtttgggtg 6060aaacatctag agaattagac aaggatagtt ggcagtgggt cagaagtgta tttataatag 6120caatattggg aactctcact atggcaggaa ctgctttggc cgacgacgat caaagtactt 6180taatccccaa tatcacaaaa attcctacaa aggacacgga acccggttgc acctatccgt 6240ggatattaat cctcttgatt ttggctttca tactgggaat tctgggtata atacttgtct 6300tgagacgcag caactcggag gatatattgg cagccagaga taccatagat tggtggctct 6360cagctaatca ggaaatacct ccaaagtttg ctttcccaat aatattaata tcttcccctc 6420tagcaggcat aataggatat tatgtcatgg aaaggcactt agagatcttc aaaaagggat 6480gtcaaatttg tgggagcctg agcagcatgt ggggaatgct tttggaagaa attggcaggt 6540ggctcgcacg tagggaatgg aatgttagta gagtaatggt tatcctctta atcagcttca 6600gttggggaat gtatgtcaat agggtaaatg cctcagggtc acatgtagcc atggtcacca 6660gccctccagg gtaccgcata gtgaatgata ccagccaggc accttggtat tgcttctcct 6720cggcaccaat cccaacgtgt agttcctctc agtggggaga caaatatttt gaggagaaaa 6780taaacgagac actggtcaaa caggtgtatg aacaggccgc gaaacattcg agagccacat 6840ggattgaacc tgatctattg gaggaagcag tctatgagct agctctgtta tcagctaatg 6900acagtcgtca ggtggtggta gaaaatggta cagacgtatg tagctcacag aactcgagca 6960caaacaaagg ccacccaatg acgcttctaa agttgagagg gcaggtgtca gaaacttgga 7020tagggaattc ctccctccag ttttgtgtcc agtggccata tgtcttggta ggtcttaata 7080atagtgatag taatattagc ttcaattcgg gagattggat agcaaccaat tgtatgcacc 7140caattacact aaataaaagt gcacaagatc taggaaaaaa ttttccgaga ctaacatttc 7200ttgacggaca actgtcccag ttgaagaaca cactgtgcgg acataacaca aactgtttga 7260aatttggaaa caagtccttc agtacaaatt ccctaatact atgccaagac aaccccatcg 7320gcaacgacac cttttatagc ctaagtcatt ccttctcaaa acaggcctct gcccggtgga 7380ttcttgtaaa ggtccccagc tatgggtttg tggtagtaaa tgacacagat acaccaccat 7440ccctccgcat ccgaaagcct cgagcagtcg gactagcaat attcctgctt gtgctggcta 7500tcatggccat cacatcctcc ttggtggcag ctacaacgct cgtgaaccag cacacgacgg 7560ctaaggttgt ggagagggtt gtgcaaaatg tgtcatatat tgctcaaacc caggaccaat 7620tcacccacct gttcaggaat ataaacaaca gattaaatgt cctacaccat agagtttcat 7680acttggagta tgtagaggaa atcagacaaa aacaagtatt ctttggttgc aaacctcatg 7740gaaggtattg ccactttgac tttggaccag aggaagttgg atggaacaat agttggaata 7800gcaaaacttg gaatgatcta caagatgagt atgataagat agaagaaaaa atattaaaaa 7860ttcgagtgga ctggctcaat agctccctga gtgacacaca ggacaccttt ggcctggaga 7920cctctatttt tgaccattta gtgcaattgt ttgattggac ttcttggaaa gactggataa 7980aaatcattat agtaatcatt gtactttggc ttctgataaa gattctccta ggtatgttaa 8040gaagctgcgc caaggtcagc cagaattacc aacatctccc ggcggaggag gaggacgggg 8100acacagagcc agaaagctcc ccggcgagag gagacccggc ttctggaagt ctctacgaga 8160attggttgaa caaaatagga gaaagcaaga acgacgccta tcgggtctgg acagaagaat 8220acaacagctt gaggatcttg ttcgccacat gtcgctggga tctcctgacc cctcaactcc 8280ttcagcttcc gttctttctg ttaaccctcc tgctcaaact cctttgggac atcttccgcc 8340acgctcctat tttaaactta aaagggtgga ctgtggggca gggtgggacc tcaggacaac 8400agcagccccc ggacttccca tatgtgaatt ggactggatc cagggaacaa aataacccag 8460aagggggatt agactctggg gcttggtatg aaggcctgag aggttctcag tagattgtaa 8520gtcttcggcg agactgcatg tctgcacgta gacaggaaat gtttatcttc tcagctgatt 8580gtggttaggc cgattactgg aaactagaca acctgattca ttagtggtta agattatgca 8640taagtgctcg caatgatgta gctgcttacg cttgcttact ccgccctgaa acgcctacct 8700taacacgcaa cacgcccacc tgtaagaata tataaaccat atcttcactc tgtacttcag 8760ctcgtgtagc tcattagctc cgagctcccc aacctacagc ctgagaggca ctggctcggt 8820tgggtagcca gcctttcggg taataaaggc ttgttggcat tcggcatcta cccgtgcctc 8880
ctgtcttgtc ttactcgagc gaacccacaa ctccgtcctg ctgagctcac agctcgcggg8940gcggtgaaga acacccaaca8960<210> 2<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物RRE65′NotI<400> 2aaagcggccg ctccggtgga ttcttgtaaa gg 32<210> 3<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物RRE63′NotI<400> 3aaagcggccg cggcgcctcc aagtatgaaa ctc 33<210> 4<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Rev15Af13<400> 4ggacgcgtcg actctagatc taggaatcaa ctatgg 36<210> 5<211> 40<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Rev23Age12<400> 5tttaccggtc gcgagcttag cttacaatct actgagaacc 40<210> 6<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Rev155868<400> 6gttctagatg gctggctttt ctgg 24<210> 7
<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Rev13<400> 7gagaatcgtt attgatccat gtttg 25<210> 8<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Rev25<400> 8ggatcaataa cgattctcct aggtatgt 28<210> 9<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Rev237526<400> 9ttactagtgg ttattttgtt ccctgg26<210> 10<211> 561<212> DNA<213> 牛免疫缺陷病毒<220>
<221> misc_feature<223> Rev gene<400> 10atggatcagg acctagacgg cgcggaacgc ggggaaaggg gaggaggatc cgaagaactg 60cttcaggagg agatcaacga agggaggctg acagccagag aagctttaca aacatggatc120aataacgatt ctcctaggta tgttaagaag ctgcgccaag gtcagccaga attaccaaca180tctcccggcg gaggaggagg acggggacac agagccagaa agctccccgg cgagaggaga240cccggcttct ggaagtctct acgagaattg gttgaacaaa ataggagaaa gcaagaacga300cgcctatcgg gtctggacag aagaatacaa cagcttgagg atcttgttcg ccacatgtcg360ctgggatctc ctgacccctc aactccttca gcttccgttc tttctgttaa ccctcctgct420caaactcctt tgggacatct tccgccacgc tcctatttta aacttaaaag ggtggactgt480ggggcagggt gggacctcag gacaacagca gcccccggac ttcccatatg tgaattggac540tggatccagg gaacaaaata a 561<210> 11<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物WPRE5<400> 11gagctgtaca agtaaagcgg ccaaccctcc tgcagaaact cctttggg 48<210> 12<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物WPRE3<400> 12ggaacaaaag ctgggtaccg ggccccccc 29<210> 13<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物RRE1<400> 13gttggcgccc aacgtggggc tcgagtaaga gag 33<210> 14<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物RRE2<400> 14agatctgaat tctaagtgac ctatttc27<210> 15<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物RRE3<400> 15gaattcagat cttatgggaa tgaaagacc 29<210> 16<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
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<223> PCR引物5′GAGRRE1<400> 17ggcgaattcg atctaggaaa aaattttccg 30<210> 18<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE1<400> 18ggaagatctc cacaaaccca tagctgg27<210> 19<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物5′GAGRRE2<400> 19cccgaattca aaggtcccca gc 22<210> 20<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE2<400> 20ggaagatctc tctatggtgt aggac 25<210> 21<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物5′GAGRRE3<400> 21ccggaattcg agtttcatac ttggag 26<210> 22<211> 23<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE3<400> 22ggaagatctt gcactaaatg gtc23<210> 23<211> 23<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物5′GAGRRE4<400> 23ccggaattcc ctaatactat gcc23<210> 24<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE4<400> 24ggaagatctc ttagccgtcg tgtgc 25<210> 25<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物5′GAGRRE5<400> 25ggcgaattcg ggttgtgcaa aatgtg 26<210> 26<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE5<400> 26cctagatctc attccaagtt ttgct 25<210> 27<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物5′GAGRRE6
<400> 27ccggaattcg tggattcttg taaagg 26<210> 28<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE6<400> 28ggaagatctc tccaagtatg aaactc 26<210> 29<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物5′GAGRRE7<400> 29ccagaattcc accaccatcc ctcc 24<210> 30<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物3′GAGRRE7<400> 30ggaagatctc aaccaaagaa tact 24<210> 31<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物NRS1<400> 31aacagttggc gcccaacgtg gggctc 26<210> 32<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物NRS2<400> 32atgcatcacg tgggtgtcac cctaacctta cgaa34
<210> 33<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物NRS3<400> 33cacgtgatgc atcgatctaa aagacagatt ggc 33<210> 34<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物NRS4<400> 34cataagatct gaattcaatg atctaagtg 29<210> 35<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物NRS32<400> 35atgcatcacg tgattctaat ggcccattga agattc 36<210> 36<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> PCR引物NRS33<400> 36cacgtgatgc atcgatctaa aagacagatt ggc 33<210> 37<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> QuickChange反應引物KOATAG正向<400> 37gcgtgttttc cccggggtga agagaaggga g 31<210> 38<211> 31<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> QuickChange反應引物KOATAG反向<400> 38ctcccttctc ttcaccccgg ggaaaacacg c31<210> 39<211> 210<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> BIV包裝信號序列<400> 39gttggcgccc aacgtggggc tgagtaagag agactcggct cgagtaaaag aagacccagc 60tcgaacgaga agactccgga caggtgagta gttgcgtgtt ttccccgggg tgaagagaag120ggagttagaa aagaagcttc gtaaggttag ggtgacaccc caacaggata aatattatac180tatagggaat cttcaatggg ccattagaat210<210> 40<211> 312<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 312bp的BIV env序列含有BIV RRE序列<400> 40gtggattctt gtaaaggtcc ccagctatgg gtttgtggta gtaaatgaca cagatacacc60accatccctc cgcatccgaa agcctcgagc agtcggacta gcaatattcc tgcttgtgct120ggctatcatg gccatcacat cctccttggt ggcagctaca acgctcgtga accagcacac180gacggctaag gttgtggaga gggttgtgca aaatgtgtca tatattgctc aaacccagga240ccaattcacc cacctgttca ggaatataaa caacagatta aatgtcctac accatagagt300ttcatacttg ga312<210> 41<211> 7<212> RNA<213> 禽肉瘤/白血病病毒<400> 41aaauuua 7<210> 42<211> 7<212> RNA<213> 人免疫缺陷病毒<400> 42uuuuuua 7<210> 43<211> 7<212> RNA<213> 鼠哺乳動物腫瘤病毒<400> 43
aaaaaac 7<210> 44<211> 7<212> RNA<213> 貓免疫缺陷病毒<400> 44gggaaac 7<210> 45<211> 7<212> DNA<213> 牛免疫缺陷病毒<400> 45caaaaat 7<210> 46<211> 7<212> DNA<213> 牛免疫缺陷病毒<400> 46aaaaaac 7<210> 47<211> 48<212> DNA<213> 牛免疫缺陷病毒<400> 47aaaaaacggg aagtgctcct ctgcccctta tgggcagagg agccaacc 48<210> 48<211> 48<212> RNA<213> 牛免疫缺陷病毒<400> 48aaaaaacggg aagugcuccu cugccccuua ugggcagagg agccaacc 48<210> 49<211> 4427<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 重新編碼的BIV gag/pol的DNA序列<400> 49atgaagcgga gagagctgga gaagaaactg aggaaagtgc gcgtgacacc tcaacaggac60aagtactata ccatcggcaa cctgcagtgg gccatccgca tgatcaacct gatgggcatc120aagtgcgtgt gcgacgagga atgcagcgcc gctgaggtcg ccctgatcat cacccagttt180agcgccctcg acctggagaa ctcccctatc cgcggcaagg aagaggtggc catcaagaat240accctgaagg tgttttggag cctgctggcc ggatacaagc ctgagagcac cgagaccgcc300ctgggatact gggaagcctt cacctacaga gagagggaag ctagagccga caaggaggga360gagatcaaga gcatctaccc tagcctgacc cagaacaccc agaacaagaa acagaccagc420aatcagacaa acacccagag cctgcccgct atcaccacac aggatggcac ccctcgcttc480
gaccccgacc tgatgaagca gctgaagatc tggtccgatg ccacagagcg caatggagtg540gacctgcatg ccgtgaacat cctgggagtg atcacagcca acctggtgca agaagagatc600aagctcctgc tgaatagcac acccaagtgg cgcctggacg tgcagctgat cgagagcaaa660gtgagagaga aggagaacgc ccaccgcacc tggaagcagc atcaccctga ggctcccaag720acagacgaga tcattggaaa gggactgagc tccgccgagc aggctaccct gatcagcgtg780gagtgcagag agaccttccg ccagtgggtg ctgcaggctg ccatggaggt cgcccaggct840aagcacgcca cacccggacc tatcaacatc catcaaggcc ctaaggaacc ctacaccgac900ttcatcaacc gcctggtggc tgccctggaa ggaatggccg ctcccgagac cacaaaggag960tacctcctgc agcacctgag catcgaccac gccaacgagg actgtcagtc catcctgcgc 1020cctctgggac ccaacacacc tatggagaag aaactggagg cctgtcgcgt ggtgggaagc 1080cagaagagca agatgcagtt cctggtggcc gctatgaagg aaatggggat ccagtctcct 1140attccagccg tgctgcctca cacacccgaa gcctacgcct cccaaacctc agggcccgag 1200gatggtagga gatgttacgg atgtgggaag acaggacatt tgaagaggaa ttgtaaacag 1260caaaaatgct accattgtgg caaacctggc caccaagcaa gaaactgcag gtcaaaaaac 1320gggaagtgct cctctgcccc ttatgggcag aggagccaac cacagaacaa ttttcaccag 1380agcaacatga gttctgtgac cccatctgca ccccctctta tattagatta gacaaacagc 1440cttttataaa ggtgttcatt ggcggccgct gggtgaaggg actggtggac acaggcgctg 1500acgaggtggt gctgaagaac atccactggg accgcatcaa aggctaccct ggaacaccca 1560tcaagcagat cggcgtgaac ggcgtgaacg tggctaagcg caaaacacat gtggagtgga 1620gattcaaaga caagaccggc atcattgacg tcctcttcag cgacacacct gtgaacctgt 1680ttggcagaag cctgctcaga tccatcgtga cctgctttac cctgctggtg cacaccgaga 1740agatcgagcc actgcctgtg aaggtgcgcg gccctggacc taaggtgcca caatggcccc 1800tgaccaagga gaaataccag gccctgaagg agatcgtgaa ggacctgctg gccgagggaa 1860agatcagcga agctgcctgg gacaaccctt acaacacacc cgtgttcgtg atcaagaaga 1920aaggcaccgg ccgctggcgc atgctgatgg acttccgcga gctgaataag atcaccgtga 1980aaggccaaga gttcagcaca ggactccctt atccacccgg catcaaggag tgtgagcacc 2040tgaccgccat cgacatcaag gacgcctact tcaccatccc tctgcacgag gacttcagac 2100ccttcacagc cttcagcgtg gtcccagtga accgcgaggg ccccatcgag cgcttccagt 2160ggaacgtcct gcctcaaggc tgggtgtgct cccctgccat ctaccagacc acaacccaga 2220agatcattga gaacatcaag aagagccatc ccgacgtgat gctgtatcag tacatggatg 2280acctcctgat tggcagcaat cgcgatgacc acaagcagat cgtgcaggag atcagagaca 2340agctgggcag ctatggcttc aagacacccg acgagaaagt gcaggaagag cgcgtgaagt 2400ggatcggctt cgagctgaca cctaagaaat ggagattcca gcctaggcaa ctgaagatca 2460agaacccact gaccgtgaac gaactccagc agctggtcgg caactgtgtg tgggtgcagc 2520ccgaggtgaa gatccctctg tacccactga ccgatctgct ccgcgacaag accaacctgc 2580aggaaaagat ccagctgaca cccgaggcca tcaagtgcgt ggaagagttc aacctgaagc 2640tgaaagatcc cgagtggaag gacagaattc gcgaaggagc cgagctggtg atcaagatcc 2700aaatggtccc tcgcggcatc gtgttcgacc tgctgcaaga cggcaatcct atctggggag 2760gcgtgaaagg actgaactac gaccacagca acaagatcaa gaagatcctg cgcaccatga 2820acgagctgaa ccgcaccgtg gtgatcatga ccggacgcga agctagcttt ctcctgcctg 2880gatccagcga ggattgggag gccgccctgc agaaggaaga gagcctgacc caaatctttc 2940ccgtgaagtt ctaccgccat agctgtagat ggacaagcat ctgtggaccc gtccgcgaga 3000acctgaccac ctactatacc gacggcggga agaaaggaaa gacagctgcc gcagtgtact 3060ggtgtgaagg aagaactaag agcaaagtgt tccctggaac caatcaacag gctgagctga 3120aggcaatctg catggctctg ctggacggac ctcccaagat gaacatcatc accgacagcc 3180gctacgctta tgagggcatg agagaggaac ctgagacctg ggctcgcgag ggcatctggc 3240tggagattgc aaagatcctg ccattcaagc aatacgtcgg agtgggctgg gtccctgctc 3300acaaaggcat tggaggcaat accgaggctg acgaaggagt gaagaaagcc ctggagcaaa 3360tggcaccatg ttcccctccc gaggctatcc tgctcaaacc tggcgagaag caaaacctgg 3420agaccggcat ctacatgcaa ggcctgagac ctcagagctt cctgccccgc gctgacctcc 3480ctgtcgcaat cactggcacc atggtggact ccgagctgca gctccaactg ctgaacatcg 3540gcaccgagca cattcgcatc cagaaggacg aggtgttcat gacatgcttc ctggagaaca 3600tccctagcgc caccgaagac cacgagagat ggcacacatc cccagacatc ctggtccgcc 3660agttccacct gcccaagcgc atcgccaagg agatcgtcgc ccgctgccag gagtgcaaga 3720gaaccacaac ctccccagtg cgcggcacca accctagagg acgcttcctg tggcagatgg 3780acaacacaca ctggaacaaa accatcattt gggtcgcagt ggagactaac agcggactgg 3840tggaggctca ggtgattccc gaagagaccg cactgcaagt ggccctgtgt atcctccagc 3900tgatccaacg ctacaccgtc ctgcacctgc acagcgacaa cggaccctgc ttcacagctc 3960accgcatcga gaacctgtgc aagtacctgg gcatcaccaa gacaaccggc attccctaca 4020
atcctcagag ccaaggagtc gtggaaagag cccatcgcga cctgaaggac agactggctg4080cctatcaagg cgactgcgag accgtggaag ctgcactgag cctcgccctg gtcagcctga4140acaagaagag aggaggcatc ggcggacaca caccctacga gatctatctg gagagcgagc4200acaccaagta tcaggaccaa ctggagcagc aattcagcaa gcagaagatc gagaaatggt4260gctacgtccg caacagacgc aaggagtgga agggccctta caaggtgctg tgggatggcg4320acggagctgc agtgatcgag gaagagggca agaccgctct gtatccccac cggcacatgc4380gcttcatccc acctcccgac agcgatatcc aggacggctc cagctga 4427<210> 50<211> 3108<212> DNA<213> 牛免疫缺陷病毒<220>
<221> misc_feature<223> BIV Pol DNA序列<400> 50cgggaagtgc tcctctgccc cttatgggca gaggagccaa ccacagaaca attttcacca 60gagcaacatg agttctgtga ccccatctgc accccctctt atattagatt agacaaacag120ccttttataa aggtgttcat agggggaaga tgggtaaaag ggttagtaga cactggagca180gatgaggtag tgcttaagaa catacattgg gataggataa aagggtatcc agggacacca240attaaacaaa ttggggtaaa tggagtaaat gtggccaaaa ggaagaccca cgtagagtgg300agatttaagg ataagactgg gataattgat gtcttgttct cagatactcc tgtaaacctt360tttgggagat ctcttctacg tagcatagtg acttgcttca ccctacttgt tcacacagaa420aaaatcgaac ccctacccgt caaggtaagg ggaccagggc ctaaggtacc ccagtggccc480ttgacaaaag aaaagtatca ggctcttaag gaaattgtga aagatctttt agcagaagga540aaaatttccg aagctgcttg ggataaccca tataataccc cagtttttgt tataaagaaa600aagggaacgg gaagatggag gatgctaatg gattttaggg aattaaataa gataacagtt660aaaggacaag aattctctac aggcttacct taccctccag gaattaagga atgtgaacac720ttaactgcaa tagatataaa agatgcctac tttactatcc ctttacatga ggactttaga780ccctttacag ccttctctgt agtccctgta aatcgagaag gacctataga gaggttccag840tggaatgttc taccacaagg atgggtatgt agccctgcca tttatcagac taccacccag900aagattatag aaaacattaa aaagagtcac ccagatgtca tgttgtatca atatatggat960gatttgttga ttgggtctaa tagggatgat cataagcaaa tagtgcagga aatcagggat 1020aagttaggat catatggttt caagactcca gatgaaaagg tccaggaaga gagagtgaaa 1080tggatcggtt ttgagctcac acccaagaaa tggcgttttc agcccaggca actaaagata 1140aaaaacccac tcacagtaaa tgaattacag caattagtag gtaattgtgt ttgggtacag 1200ccagaagtaa aaatccctct atacccctta accgatctac tgagggataa gaccaatctc 1260caagaaaaga tacaactaac accagaagcc atcaagtgtg tagaagaatt caatctaaaa 1320ctaaaagatc cagaatggaa agatagaata agagaaggag cagaattagt cataaaaata 1380cagatggttc ctcggggcat agtatttgat ctgttgcaag atggaaatcc catatgggga 1440ggagtaaaag gactaaatta tgatcattca aacaaaataa aaaagatact tagaactatg 1500aatgagctga acagaacagt ggtaattatg acaggaagag aagctagttt cctgcttcct 1560gggtcttctg aagattggga agcggcactc cagaaggaag aaagtctaac acaaatattc 1620ccagtaaagt tttataggca ctcctgcaga tggacctcca tatgtgggcc agtaagagaa 1680aatctaacca cctactatac tgacggaggg aagaaaggga aaacagctgc agcagtatat 1740tggtgtgaag gaaggactaa gtcaaaggta tttccaggaa ccaatcaaca ggcggaattg 1800aaggccatat gcatggctct cttggatgga ccaccaaaaa tgaatatcat aacagatagt 1860agatacgcct atgagggaat gagagaagaa ccagaaacgt gggccaggga aggaatctgg 1920ctggagattg ccaagatatt gccctttaag cagtacgtgg gggtcgggtg ggtgcctgca 1980cataaaggga taggaggaaa tacagaggca gatgaaggag ttaagaaagc cttagaacag 2040atggccccgt gtagccctcc tgaggccatt ctattaaaac caggagaaaa acaaaatctg 2100gagacaggga tctacatgca ggggcttaga ccacaaagct tcctcccaag agcagactta 2160ccagtagcca tcacaggaac catggtagat tcagagctac agctacagct acttaacata 2220ggaactgagc atataagaat ccaaaaagat gaggtcttca tgacctgttt cctagaaaat 2280atcccctcag ccactgaaga tcatgagaga tggcatacct caccagacat tttggttagg 2340cagttccatc tccctaagag aatagctaaa gagatagtag ccagatgcca agaatgtaaa 2400aggacaacca ctagcccagt cagaggaaca aaccccagag gtcgattctt atggcagatg 2460
gacaatactc actggaataa aacaattatt tgggtagcag tagagacaaa ttcaggatta2520gtggaagctc aggtgatccc tgaagaaaca gcactacaag tagctctctg cattttacag2580ctaatccaga gatatacagt tcttcactta catagtgaca acgggccgtg ctttactgca2640cacaggatag aaaatctatg taagtatctg gggatcacaa aaactacggg aataccctac2700aacccacaat cccagggagt tgtagaaaga gcccacagag atctaaaaga cagattggca2760gcttatcagg gagattgtga aaccgtagaa gcagccctta gcctcgcatt agtttcttta2820aataaaaaaa gagggggaat agggggccat acaccatatg aaatatacct agaatcagaa2880cataccaaat accaagacca actagaacaa caattttcaa aacaaaaaat tgaaaagtgg2940tgttacgtaa ggaacagaag aaaggaatgg aaaggaccct acaaagtgtt gtgggacgga3000gacggggcag cagtaataga ggaagaggga aaaacagcct tatatccaca ccgtcatatg3060cgcttcatcc cccccccaga ttcagatatc caagatggga gttcgtga 3108<210> 51<211> 1035<212> pRT<213> 牛免疫缺陷病毒<220>
<221> MISC_FEATURE<223> BIV Pol氨基酸序列<400> 51Arg Glu Val Leu Leu Cys Pro Leu Trp Ala Glu Glu Pro Thr Thr Glu1 5 10 15Gln Phe Ser Pro Glu Gln His Glu Phe Cys Asp Pro Ile Cys Thr Pro20 25 30Ser Tyr Ile Arg Leu Asp Lys Gln Pro Phe Ile Lys Val Phe Ile Gly35 40 45Gly Arg Trp Val Lys Gly Leu Val Asp Thr Gly Ala Asp Glu Val Val50 55 60Leu Lys Asn Ile His Trp Asp Arg Ile Lys Gly Tyr Pro Gly Thr Pro65 70 75 80Ile Lys Gln Ile Gly Val Asn Gly Val Asn Val Ala Lys Arg Lys Thr85 90 95His Val Glu Trp Arg Phe Lys Asp Lys Thr Gly Ile Ile Asp Val Leu100 105 110Phe Ser Asp Thr Pro Val Asn Leu Phe Gly Arg Ser Leu Leu Arg Ser115 120 125Ile Val Thr Cys Phe Thr Leu Leu Val His Thr Glu Lys Ile Glu Pro130 135 140Leu Pro Val Lys Val Arg Gly Pro Gly Pro Lys Val Pro Gln Trp Pro145 150 155 160Leu Thr Lys Glu Lys Tyr Gln Ala Leu Lys Glu Ile Val Lys Asp Leu165 170 175Leu Ala Glu Gly Lys Ile Ser Glu Ala Ala Trp Asp Asn Pro Tyr Asn180 185 190Thr Pro Val Phe Val Ile Lys Lys Lys Gly Thr Gly Arg Trp Arg Met195 200 205Leu Met Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Ile Thr Val Lys Gly Gln Glu210 215 220Phe Ser Thr Gly Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Cys Glu His225 230 235 240Leu Thr Ala Ile Asp Ile Lys Asp Ala Tyr Phe Thr Ile Pro Leu His245 250 255Glu Asp Phe Arg Pro Phe Thr Ala Phe Ser Val Val Pro Val Asn Arg260 265 270Glu Gly Pro Ile Glu Arg Phe Gln Trp Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp275 280 285Val Cys Ser Pro Ala Ile Tyr Gln Thr Thr Thr Gln Lys Ile Ile Glu
290 295 300Asn Ile Lys Lys Ser His Pro Asp Val Met Leu Tyr Gln Tyr Met Asp305 310 315 320Asp Leu Leu Ile Gly Ser Asn Arg Asp Asp His Lys Gln Ile Val Gln325 330 335Glu Ile Arg Asp Lys Leu Gly Ser Tyr Gly Phe Lys Thr Pro Asp Glu340 345 350Lys Val Gln Glu Glu Arg Val Lys Trp Ile Gly Phe Glu Leu Thr Pro355 360 365Lys Lys Trp Arg Phe Gln Pro Arg Gln Leu Lys Ile Lys Asn Pro Leu370 375 380Thr Val Asn Glu Leu Gln Gln Leu Val Gly Asn Cys Val Trp Val Gln385 390 395 400Pro Glu Val Lys Ile Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Asp Leu Leu Arg Asp405 410 415Lys Thr Asn Leu Gln Glu Lys Ile Gln Leu Thr Pro Glu Ala Ile Lys420 425 430Cys Val Glu Glu Phe Asn Leu Lys Leu Lys Asp Pro Glu Trp Lys Asp435 440 445Arg Ile Arg Glu Gly Ala Glu Leu Val Ile Lys Ile Gln Met Val Pro450 455 460Arg Gly Ile Val Phe Asp Leu Leu Gln Asp Gly Asn Pro Ile Trp Gly465 470 475 480Gly Val Lys Gly Leu Asn Tyr Asp His Ser Asn Lys Ile Lys Lys Ile485 490 495Leu Arg Thr Met Asn Glu Leu Asn Arg Thr Val Val Ile Met Thr Gly500 505 510Arg Glu Ala Ser Phe Leu Leu Pro Gly Ser Ser Glu Asp Trp Glu Ala515 520 525Ala Leu Gln Lys Glu Glu Ser Leu Thr Gln Ile Phe Pro Val Lys Phe530 535 540Tyr Arg His Ser Cys Arg Trp Thr Ser Ile Cys Gly Pro Val Arg Glu545 550 555 560Asn Leu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Gly Gly Lys Lys Gly Lys Thr Ala565 570 575Ala Ala Val Tyr Trp Cys Glu Gly Arg Thr Lys Ser Lys Val Phe Pro580 585 590Gly Thr Asn Gln Gln Ala Glu Leu Lys Ala Ile Cys Met Ala Leu Leu595 600 605Asp Gly Pro Pro Lys Met Asn Ile Ile Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Tyr610 615 620Glu Gly Met Arg Glu Glu Pro Glu Thr Trp Ala Arg Glu Gly Ile Trp625 630 635 640Leu Glu Ile Ala Lys Ile Leu Pro Phe Lys Gln Tyr Val Gly Val Gly645 650 655Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Thr Glu Ala Asp Glu660 665 670Gly Val Lys Lys Ala Leu Glu Gln Met Ala Pro Cys Ser Pro Pro Glu675 680 685Ala Ile Leu Leu Lys Pro Gly Glu Lys Gln Asn Leu Glu Thr Gly Ile690 695 700Tyr Met Gln Gly Leu Arg Pro Gln Ser Phe Leu Pro Arg Ala Asp Leu705 710 715 720Pro Val Ala Ile Thr Gly Thr Met Val Asp Ser Glu Leu Gln Leu Gln725 730 735Leu Leu Asn Ile Gly Thr Glu His Ile Arg Ile Gln Lys Asp Glu Val740 745 750Phe Met Thr Cys Phe Leu Glu Asn Ile Pro Ser Ala Thr Glu Asp His755 760 765
Glu Arg Trp His Thr Ser Pro Asp Ile Leu Val Arg Gln Phe His Leu770 775 780Pro Lys Arg Ile Ala Lys Glu Ile Val Ala Arg Cys Gln Glu Cys Lys785 790 795 800Arg Thr Thr Thr Ser Pro Val Arg Gly Thr Asn Pro Arg Gly Arg Phe805 810 815Leu Trp Gln Met Asp Asn Thr His Trp Asn Lys Thr Ile Ile Trp Val820 825 830Ala Val Glu Thr Asn Ser Gly Leu Val Glu Ala Gln Val Ile Pro Glu835 840 845Glu Thr Ala Leu Gln Val Ala Leu Cys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Arg850 855 860Tyr Thr Val Leu His Leu His Ser Asp Asn Gly Pro Cys Phe Thr Ala865 870 875 880His Arg Ile Glu Asn Leu Cys Lys Tyr Leu Gly Ile Thr Lys Thr Thr885 890 895Gly Ile Pro Tyr Asn Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Arg Ala His900 905 910Arg Asp Leu Lys Asp Arg Leu Ala Ala Tyr Gln Gly Asp Cys Glu Thr915 920 925Val Glu Ala Ala Lau Ser Leu Ala Leu Val Ser Leu Asn Lys Lys Arg930 935 940Gly Gly Ile Gly Gly His Thr Pro Tyr Glu Ile Tyr Leu Glu Ser Glu945 950 955 960His Thr Lys Tyr Gln Asp Gln Leu Glu Gln Gln Phe Ser Lys Gln Lys965 970 975Ile Glu Lys Trp Cys Tyr Val Arg Asn Arg Arg Lys Glu Trp Lys Gly980 985 990Pro Tyr Lys Val Leu Trp Asp Gly Asp Gly Ala Ala Val Ile Glu Glu995 10001005Glu Gly Lys Thr Ala Leu Tyr Pro His Arg His Met Arg Phe Ile101010151020Pro Pro Pro Asp Ser Asp Ile Gln Asp Gly Ser Ser102510301035<210> 52<211> 3108<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 重新編碼的BIV Pol的DNA序列<400> 52cgggaagtgc tcctctgccc cttatgggca gaggagccaa ccacagaaca attttcacca 60gagcaacatg agttctgtga ccccatctgc accccctctt atattagatt agacaaacag120ccttttataa aggtgttcat tggcggccgc tgggtgaagg gactggtgga cacaggcgct180gacgaggtgg tgctgaagaa catccactgg gaccgcatca aaggctaccc tggaacaccc240atcaagcaga tcggcgtgaa cggcgtgaac gtggctaagc gcaaaacaca tgtggagtgg300agattcaaag acaagaccgg catcattgac gtcctcttca gcgacacacc tgtgaacctg360tttggcagaa gcctgctcag atccatcgtg acctgcttta ccctgctggt gcacaccgag420aagatcgagc cactgcctgt gaaggtgcgc ggccctggac ctaaggtgcc acaatggccc480ctgaccaagg agaaatacca ggccctgaag gagatcgtga aggacctgct ggccgaggga540aagatcagcg aagctgcctg ggacaaccct tacaacacac ccgtgttcgt gatcaagaag600aaaggcaccg gccgctggcg catgctgatg gacttccgcg agctgaataa gatcaccgtg660aaaggccaag agttcagcac aggactccct tatccacccg gcatcaagga gtgtgagcac720ctgaccgcca tcgacatcaa ggacgcctac ttcaccatcc ctctgcacga ggacttcaga780cccttcacag ccttcagcgt ggtcccagtg aaccgcgagg gccccatcga gcgcttccag840tggaacgtcc tgcctcaagg ctgggtgtgc tcccctgcca tctaccagac cacaacccag900
aagatcattg agaacatcaa gaagagccat cccgacgtga tgctgtatca gtacatggat960gacctcctga ttggcagcaa tcgcgatgac cacaagcaga tcgtgcagga gatcagagac1020aagctgggca gctatggctt caagacaccc gacgagaaag tgcaggaaga gcgcgtgaag1080tggatcggct tcgagctgac acctaagaaa tggagattcc agcctaggca actgaagatc1140aagaacccac tgaccgtgaa cgaactccag cagctggtcg gcaactgtgt gtgggtgcag1200cccgaggtga agatccctct gtacccactg accgatctgc tccgcgacaa gaccaacctg1260caggaaaaga tccagctgac acccgaggcc atcaagtgcg tggaagagtt caacctgaag1320ctgaaagatc ccgagtggaa ggacagaatt cgcgaaggag ccgagctggt gatcaagatc1380caaatggtcc ctcgcggcat cgtgttcgac ctgctgcaag acggcaatcc tatctgggga1440ggcgtgaaag gactgaacta cgaccacagc aacaagatca agaagatcct gcgcaccatg1500aacgagctga accgcaccgt ggtgatcatg accggacgcg aagctagctt tctcctgcct1560ggatccagcg aggattggga ggccgccctg cagaaggaag agagcctgac ccaaatcttt1620cccgtgaagt tctaccgcca tagctgtaga tggacaagca tctgtggacc cgtccgcgag1680aacctgacca cctactatac cgacggcggg aagaaaggaa agacagctgc cgcagtgtac1740tggtgtgaag gaagaactaa gagcaaagtg ttccctggaa ccaatcaaca ggctgagctg1800aaggcaatct gcatggctct gctggacgga cctcccaaga tgaacatcat caccgacagc1860cgctacgctt atgagggcat gagagaggaa cctgagacct gggctcgcga gggcatctgg1920ctggagattg caaagatcct gccattcaag caatacgtcg gagtgggctg ggtccctgct1980cacaaaggca ttggaggcaa taccgaggct gacgaaggag tgaagaaagc cctggagcaa2040atggcaccat gttcccctcc cgaggctatc ctgctcaaac ctggcgagaa gcaaaacctg2100gagaccggca tctacatgca aggcctgaga cctcagagct tcctgccccg cgctgacctc2160cctgtcgcaa tcactggcac catggtggac tccgagctgc agctccaact gctgaacatc2220ggcaccgagc acattcgcat ccagaaggac gaggtgttca tgacatgctt cctggagaac2280atccctagcg ccaccgaaga ccacgagaga tggcacacat ccccagacat cctggtccgc2340cagttccacc tgcccaagcg catcgccaag gagatcgtcg cccgctgcca ggagtgcaag2400agaaccacaa cctccccagt gcgcggcacc aaccctagag gacgcttcct gtggcagatg2460gacaacacac actggaacaa aaccatcatt tgggtcgcag tggagactaa cagcggactg2520gtggaggctc aggtgattcc cgaagagacc gcactgcaag tggccctgtg tatcctccag2580ctgatccaac gctacaccgt cctgcacctg cacagcgaca acggaccctg cttcacagct2640caccgcatcg agaacctgtg caagtacctg ggcatcacca agacaaccgg cattccctac2700aatcctcaga gccaaggagt cgtggaaaga gcccatcgcg acctgaagga cagactggct2760gcctatcaag gcgactgcga gaccgtggaa gctgcactga gcctcgccct ggtcagcctg2820aacaagaaga gaggaggcat cggcggacac acaccctacg agatctatct ggagagcgag2880cacaccaagt atcaggacca actggagcag caattcagca agcagaagat cgagaaatgg2940tgctacgtcc gcaacagacg caaggagtgg aagggccctt acaaggtgct gtgggatggc3000gacggagctg cagtgatcga ggaagagggc aagaccgctc tgtatcccca ccggcacatg3060cgcttcatcc cacctcccga cagcgatatc caggacggct ccagctga 3108<210> 53<211> 3111<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 帶ATG的野生型BIV Pol序列<400> 53atgcgggaag tgctcctctg ccccttatgg gcagaggagc caaccacaga acaattttca 60ccagagcaac atgagttctg tgaccccatc tgcaccccct cttatattag attagacaaa120cagcctttta taaaggtgtt cataggggga agatgggtaa aagggttagt agacactgga180gcagatgagg tagtgcttaa gaacatacat tgggatagga taaaagggta tccagggaca240ccaattaaac aaattggggt aaatggagta aatgtggcca aaaggaagac ccacgtagag300tggagattta aggataagac tgggataatt gatgtcttgt tctcagatac tcctgtaaac360ctttttggga gatctcttct acgtagcata gtgacttgct tcaccctact tgttcacaca420gaaaaaatcg aacccctacc cgtcaaggta aggggaccag ggcctaaggt accccagtgg480cccttgacaa aagaaaagta tcaggctctt aaggaaattg tgaaagatct tttagcagaa540ggaaaaattt ccgaagctgc ttgggataac ccatataata ccccagtttt tgttataaag600aaaaagggaa cgggaagatg gaggatgcta atggatttta gggaattaaa taagataaca660gttaaaggac aagaattctc tacaggctta ccttaccctc caggaattaa ggaatgtgaa720
cacttaactg caatagatat aaaagatgcc tactttacta tccctttaca tgaggacttt 780agacccttta cagccttctc tgtagtccct gtaaatcgag aaggacctat agagaggttc 840cagtggaatg ttctaccaca aggatgggta tgtagccctg ccatttatca gactaccacc 900cagaagatta tagaaaacat taaaaagagt cacccagatg tcatgttgta tcaatatatg 960gatgatttgt tgattgggtc taatagggat gatcataagc aaatagtgca ggaaatcagg1020gataagttag gatcatatgg tttcaagact ccagatgaaa aggtccagga agagagagtg1080aaatggatcg gttttgagct cacacccaag aaatggcgtt ttcagcccag gcaactaaag1140ataaaaaacc cactcacagt aaatgaatta cagcaattag taggtaattg tgtttgggta1200cagccagaag taaaaatccc tctatacccc ttaaccgatc tactgaggga taagaccaat1260ctccaagaaa agatacaact aacaccagaa gccatcaagt gtgtagaaga attcaatcta1320aaactaaaag atccagaatg gaaagataga ataagagaag gagcagaatt agtcataaaa1380atacagatgg ttcctcgggg catagtattt gatctgttgc aagatggaaa tcccatatgg1440ggaggagtaa aaggactaaa ttatgatcat tcaaacaaaa taaaaaagat acttagaact1500atgaatgagc tgaacagaac agtggtaatt atgacaggaa gagaagctag tttcctgctt1560cctgggtctt ctgaagattg ggaagcggca ctccagaagg aagaaagtct aacacaaata1620ttcccagtaa agttttatag gcactcctgc agatggacct ccatatgtgg gccagtaaga1680gaaaatctaa ccacctacta tactgacgga gggaagaaag ggaaaacagc tgcagcagta1740tattggtgtg aaggaaggac taagtcaaag gtatttccag gaaccaatca acaggcggaa1800ttgaaggcca tatgcatggc tctcttggat ggaccaccaa aaatgaatat cataacagat1860agtagatacg cctatgaggg aatgagagaa gaaccagaaa cgtgggccag ggaaggaatc1920tggctggaga ttgccaagat attgcccttt aagcagtacg tgggggtcgg gtgggtgcct1980gcacataaag ggataggagg aaatacagag gcagatgaag gagttaagaa agccttagaa2040cagatggccc cgtgtagccc tcctgaggcc attctattaa aaccaggaga aaaacaaaat2100ctggagacag ggatctacat gcaggggctt agaccacaaa gcttcctccc aagagcagac2160ttaccagtag ccatcacagg aaccatggta gattcagagc tacagctaca gctacttaac2220ataggaactg agcatataag aatccaaaaa gatgaggtct tcatgacctg tttcctagaa2280aatatcccct cagccactga agatcatgag agatggcata cctcaccaga cattttggtt2340aggcagttcc atctccctaa gagaatagct aaagagatag tagccagatg ccaagaatgt2400aaaaggacaa ccactagccc agtcagagga acaaacccca gaggtcgatt cttatggcag2460atggacaata ctcactggaa taaaacaatt atttgggtag cagtagagac aaattcagga2520ttagtggaag ctcaggtgat ccctgaagaa acagcactac aagtagctct ctgcatttta2580cagctaatcc agagatatac agttcttcac ttacatagtg acaacgggcc gtgctttact2640gcacacagga tagaaaatct atgtaagtat ctggggatca caaaaactac gggaataccc2700tacaacccac aatcccaggg agttgtagaa agagcccaca gagatctaaa agacagattg2760gcagcttatc agggagattg tgaaaccgta gaagcagccc ttagcctcgc attagtttct2820ttaaataaaa aaagaggggg aatagggggc catacaccat atgaaatata cctagaatca2880gaacatacca aataccaaga ccaactagaa caacaatttt caaaacaaaa aattgaaaag2940tggtgttacg taaggaacag aagaaaggaa tggaaaggac cctacaaagt gttgtgggac3000ggagacgggg cagcagtaat agaggaagag ggaaaaacag ccttatatcc acaccgtcat3060atgcgcttca tccccccccc agattcagat atccaagatg ggagttcgtg a 3111<210> 54<211> 3111<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 帶ATG的重新編碼的BIV Pol的DNA序列<400> 54atgcgggaag tgctcctctg ccccttatgg gcagaggagc caaccacaga acaattttca 60ccagagcaac atgagttctg tgaccccatc tgcaccccct cttatattag attagacaaa120cagcctttta taaaggtgtt cattggcggc cgctgggtga agggactggt ggacacaggc180gctgacgagg tggtgctgaa gaacatccac tgggaccgca tcaaaggcta ccctggaaca240cccatcaagc agatcggcgt gaacggcgtg aacgtggcta agcgcaaaac acatgtggag300tggagattca aagacaagac cggcatcatt gacgtcctct tcagcgacac acctgtgaac360ctgtttggca gaagcctgct cagatccatc gtgacctgct ttaccctgct ggtgcacacc420gagaagatcg agccactgcc tgtgaaggtg cgcggccctg gacctaaggt gccacaatgg480cccctgacca aggagaaata ccaggccctg aaggagatcg tgaaggacct gctggccgag540
ggaaagatca gcgaagctgc ctgggacaac ccttacaaca cacccgtgtt cgtgatcaag600aagaaaggca ccggccgctg gcgcatgctg atggacttcc gcgagctgaa taagatcacc660gtgaaaggcc aagagttcag cacaggactc ccttatccac ccggcatcaa ggagtgtgag720cacctgaccg ccatcgacat caaggacgcc tacttcacca tccctctgca cgaggacttc780agacccttca cagccttcag cgtggtccca gtgaaccgcg agggccccat cgagcgcttc840cagtggaacg tcctgcctca aggctgggtg tgctcccctg ccatctacca gaccacaacc900cagaagatca ttgagaacat caagaagagc catcccgacg tgatgctgta tcagtacatg960gatgacctcc tgattggcag caatcgcgat gaccacaagc agatcgtgca ggagatcaga 1020gacaagctgg gcagctatgg cttcaagaca cccgacgaga aagtgcagga agagcgcgtg 1080aagtggatcg gcttcgagct gacacctaag aaatggagat tccagcctag gcaactgaag 1140atcaagaacc cactgaccgt gaacgaactc cagcagctgg tcggcaactg tgtgtgggtg 1200cagcccgagg tgaagatccc tctgtaccca ctgaccgatc tgctccgcga caagaccaac 1260ctgcaggaaa agatccagct gacacccgag gccatcaagt gcgtggaaga gttcaacctg 1320aagctgaaag atcccgagtg gaaggacaga attcgcgaag gagccgagct ggtgatcaag 1380atccaaatgg tccctcgcgg catcgtgttc gacctgctgc aagacggcaa tcctatctgg 1440ggaggcgtga aaggactgaa ctacgaccac agcaacaaga tcaagaagat cctgcgcacc 1500atgaacgagc tgaaccgcac cgtggtgatc atgaccggac gcgaagctag ctttctcctg 1560cctggatcca gcgaggattg ggaggccgcc ctgcagaagg aagagagcct gacccaaatc 1620tttcccgtga agttctaccg ccatagctgt agatggacaa gcatctgtgg acccgtccgc 1680gagaacctga ccacctacta taccgacggc gggaagaaag gaaagacagc tgccgcagtg 1740tactggtgtg aaggaagaac taagagcaaa gtgttccctg gaaccaatca acaggctgag 1800ctgaaggcaa tctgcatggc tctgctggac ggacctccca agatgaacat catcaccgac 1860agccgctacg cttatgaggg catgagagag gaacctgaga cctgggctcg cgagggcatc 1920tggctggaga ttgcaaagat cctgccattc aagcaatacg tcggagtggg ctgggtccct 1980gctcacaaag gcattggagg caataccgag gctgacgaag gagtgaagaa agccctggag 2040caaatggcac catgttcccc tcccgaggct atcctgctca aacctggcga gaagcaaaac 2100ctggagaccg gcatctacat gcaaggcctg agacctcaga gcttcctgcc ccgcgctgac 2160ctccctgtcg caatcactgg caccatggtg gactccgagc tgcagctcca actgctgaac 2220atcggcaccg agcacattcg catccagaag gacgaggtgt tcatgacatg cttcctggag 2280aacatcccta gcgccaccga agaccacgag agatggcaca catccccaga catcctggtc 2340cgccagttcc acctgcccaa gcgcatcgcc aaggagatcg tcgcccgctg ccaggagtgc 2400aagagaacca caacctcccc agtgcgcggc accaacccta gaggacgctt cctgtggcag 2460atggacaaca cacactggaa caaaaccatc atttgggtcg cagtggagac taacagcgga 2520ctggtggagg ctcaggtgat tcccgaagag accgcactgc aagtggccct gtgtatcctc 2580cagctgatcc aacgctacac cgtcctgcac ctgcacagcg acaacggacc ctgcttcaca 2640gctcaccgca tcgagaacct gtgcaagtac ctgggcatca ccaagacaac cggcattccc 2700tacaatcctc agagccaagg agtcgtggaa agagcccatc gcgacctgaa ggacagactg 2760gctgcctatc aaggcgactg cgagaccgtg gaagctgcac tgagcctcgc cctggtcagc 2820ctgaacaaga agagaggagg catcggcgga cacacaccct acgagatcta tctggagagc 2880gagcacacca agtatcagga ccaactggag cagcaattca gcaagcagaa gatcgagaaa 2940tggtgctacg tccgcaacag acgcaaggag tggaagggcc cttacaaggt gctgtgggat 3000ggcgacggag ctgcagtgat cgaggaagag ggcaagaccg ctctgtatcc ccaccggcac 3060atgcgcttca tcccacctcc cgacagcgat atccaggacg gctccagctg a3111<210> 55<211> 29<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒<220>
<221> MISC_FEATURE<223> HIV蛋白酶部分氨基酸序列<400> 55Pro Gln Val Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly1 5 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp20 25
<210> 56<211> 29<212> PRT<213> 牛免疫缺陷病毒<220>
<221> MISC_FEATURE<223> BIV蛋白酶部分氨基酸序列<400> 56Ser Tyr Ile Arg Leu Asp Lys Gln Pro Phe Ile Lys Val Phe Ile Gly1 5 10 15Gly Arg Trp Val Lys Gly Leu Val Asp Thr Gly Ala Asp20 25<210> 57<211> 29<212> PRT<213> 人工序列<223> 突變的HIV HXB2蛋白酶的部分氨基酸序列<400> 57Pro Gln Val Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly1 5 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Asp20 25<210> 58<211> 29<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 點突變的127分離物<400> 58Ser Tyr Ile Arg Leu Asp Lyg Gln Pro Phe Ile Lys Val Phe Ile Gly1 5 10 15Gly Arg Trp Val Lys Gly Leu Val Asp Ser Gly Ala Asp20 25<210> 59<211> 4427<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 具有蛋白酶突變的重新編碼的gag/pol<400> 59atgaagcgga gagagctgga gaagaaactg aggaaagtgc gcgtgacacc tcaacaggac 60aagtactata ccatcggcaa cctgcagtgg gccatccgca tgatcaacct gatgggcatc120aagtgcgtgt gcgacgagga atgcagcgcc gctgaggtcg ccctgatcat cacccagttt180agcgccctcg acctggagaa ctcccctatc cgcggcaagg aagaggtggc catcaagaat240accctgaagg tgttttggag cctgctggcc ggatacaagc ctgagagcac cgagaccgcc300ctgggatact gggaagcctt cacctacaga gagagggaag ctagagccga caaggaggga360gagatcaaga gcatctaccc tagcctgacc cagaacaccc agaacaagaa acagaccagc420
aatcagacaa acacccagag cctgcccgct atcaccacac aggatggcac ccctcgcttc480gaccccgacc tgatgaagca gctgaagatc tggtccgatg ccacagagcg caatggagtg540gacctgcatg ccgtgaacat cctgggagtg atcacagcca acctggtgca agaagagatc600aagctcctgc tgaatagcac acccaagtgg cgcctggacg tgcagctgat cgagagcaaa660gtgagagaga aggagaacgc ccaccgcacc tggaagcagc atcaccctga ggctcccaag720acagacgaga tcattggaaa gggactgagc tccgccgagc aggctaccct gatcagcgtg780gagtgcagag agaccttccg ccagtgggtg ctgcaggctg ccatggaggt cgcccaggct840aagcacgcca cacccggacc tatcaacatc catcaaggcc ctaaggaacc ctacaccgac900ttcatcaacc gcctggtggc tgccctggaa ggaatggccg ctcccgagac cacaaaggag960tacctcctgc agcacctgag catcgaccac gccaacgagg actgtcagtc catcctgcgc 1020cctctgggac ccaacacacc tatggagaag aaactggagg cctgtcgcgt ggtgggaagc 1080cagaagagca agatgcagtt cctggtggcc gctatgaagg aaatggggat ccagtctcct 1140attccagccg tgctgcctca cacacccgaa gcctacgcct cccaaacctc agggcccgag 1200gatggtagga gatgttacgg atgtgggaag acaggacatt tgaagaggaa ttgtaaacag 1260caaaaatgct accattgtgg caaacctggc caccaagcaa gaaactgcag gtcaaaaaac 1320gggaagtgct cctctgcccc ttatgggcag aggagccaac cacagaacaa ttttcaccag 1380agcaacatga gttctgtgac cccatctgca ccccctctta tattagatta gacaaacagc 1440cttttataaa ggtgttcatt ggcggccgct gggtgaaggg actggtggac tcaggcgctg 1500acgaggtggt gctgaagaac atccactggg accgcatcaa aggctaccct ggaacaccca 1560tcaagcagat cggcgtgaac ggcgtgaacg tggctaagcg caaaacacat gtggagtgga 1620gattcaaaga caagaccggc atcattgacg tcctcttcag cgacacacct gtgaacctgt 1680ttggcagaag cctgctcaga tccatcgtga cctgctttac cctgctggtg cacaccgaga 1740agatcgagcc actgcctgtg aaggtgcgcg gccctggacc taaggtgcca caatggcccc 1800tgaccaagga gaaataccag gccctgaagg agatcgtgaa ggacctgctg gccgagggaa 1860agatcagcga agctgcctgg gacaaccctt acaacacacc cgtgttcgtg atcaagaaga 1920aaggcaccgg ccgctggcgc atgctgatgg acttccgcga gctgaataag atcaccgtga 1980aaggccaaga gttcagcaca ggactccctt atccacccgg catcaaggag tgtgagcacc 2040tgaccgccat cgacatcaag gacgcctact tcaccatccc tctgcacgag gacttcagac 2100ccttcacagc cttcagcgtg gtcccagtga accgcgaggg ccccatcgag cgcttccagt 2160ggaacgtcct gcctcaaggc tgggtgtgct cccctgccat ctaccagacc acaacccaga 2220agatcattga gaacatcaag aagagccatc ccgacgtgat gctgtatcag tacatggatg 2280acctcctgat tggcagcaat cgcgatgacc acaagcagat cgtgcaggag atcagagaca 2340agctgggcag ctatggcttc aagacacccg acgagaaagt gcaggaagag cgcgtgaagt 2400ggatcggctt cgagctgaca cctaagaaat ggagattcca gcctaggcaa ctgaagatca 2460agaacccact gaccgtgaac gaactccagc agctggtcgg caactgtgtg tgggtgcagc 2520ccgaggtgaa gatccctctg tacccactga ccgatctgct ccgcgacaag accaacctgc 2580aggaaaagat ccagctgaca cccgaggcca tcaagtgcgt ggaagagttc aacctgaagc 2640tgaaagatcc cgagtggaag gacagaattc gcgaaggagc cgagctggtg atcaagatcc 2700aaatggtccc tcgcggcatc gtgttcgacc tgctgcaaga cggcaatcct atctggggag 2760gcgtgaaagg actgaactac gaccacagca acaagatcaa gaagatcctg cgcaccatga 2820acgagctgaa ccgcaccgtg gtgatcatga ccggacgcga agctagcttt ctcctgcctg 2880gatccagcga ggattgggag gccgccctgc agaaggaaga gagcctgacc caaatctttc 2940ccgtgaagtt ctaccgccat agctgtagat ggacaagcat ctgtggaccc gtccgcgaga 3000acctgaccac ctactatacc gacggcggga agaaaggaaa gacagctgcc gcagtgtact 3060ggtgtgaagg aagaactaag agcaaagtgt tccctggaac caatcaacag gctgagctga 3120aggcaatctg catggctctg ctggacggac ctcccaagat gaacatcatc accgacagcc 3180gctacgctta tgagggcatg agagaggaac ctgagacctg ggctcgcgag ggcatctggc 3240tggagattgc aaagatcctg ccattcaagc aatacgtcgg agtgggctgg gtccctgctc 3300acaaaggcat tggaggcaat accgaggctg acgaaggagt gaagaaagcc ctggagcaaa 3360tggcaccatg ttcccctccc gaggctatcc tgctcaaacc tggcgagaag caaaacctgg 3420agaccggcat ctacatgcaa ggcctgagac ctcagagctt cctgccccgc gctgacctcc 3480ctgtcgcaat cactggcacc atggtggact ccgagctgca gctccaactg ctgaacatcg 3540gcaccgagca cattcgcatc cagaaggacg aggtgttcat gacatgcttc ctggagaaca 3600tccctagcgc caccgaagac cacgagagat ggcacacatc cccagacatc ctggtccgcc 3660agttccacct gcccaagcgc atcgccaagg agatcgtcgc ccgctgccag gagtgcaaga 3720gaaccacaac ctccccagtg cgcggcacca accctagagg acgcttcctg tggcagatgg 3780acaacacaca ctggaacaaa accatcattt gggtcgcagt ggagactaac agcggactgg 3840tggaggctca ggtgattccc gaagagaccg cactgcaagt ggccctgtgt atcctccagc 3900tgatccaacg ctacaccgtc ctgcacctgc acagcgacaa cggaccctgc ttcacagctc 3960
accgcatcga gaacctgtgc aagtacctgg gcatcaccaa gacaaccggc attccctaca4020atcctcagag ccaaggagtc gtggaaagag cccatcgcga cctgaaggac agactggctg4080cctatcaagg cgactgcgag accgtggaag ctgcactgag cctcgccctg gtcagcctga4140acaagaagag aggaggcatc ggcggacaca caccctacga gatctatctg gagagcgagc4200acaccaagta tcaggaccaa ctggagcagc aattcagcaa gcagaagatc gagaaatggt4260gctacgtccg caacagacgc aaggagtgga agggccctta caaggtgctg tgggatggcg4320acggagctgc agtgatcgag gaagagggca agaccgctct gtatccccac cggcacatgc4380gcttcatccc acctcccgac agcgatatcc aggacggctc cagctga 4427<210> 60<211> 468<212> DNA<213> 小鼠<220>
<221> misc_feature<223> 小鼠RdCVF1 cDNA<400> 60atcggatccc tctctgggtc cccagctcct tgcatactgc taccatggca tctctcttct 60ctggacgcat cttgatcagg aacaacagcg accaggatga agtggagaca gaggcagagc120tgagccgtag gttagagaat cgtctggtgt tgctgttctt cggcgccggc gcctgtcccc180agtgccaggc ctttgcccca gtcctcaaag acttcttcgt gcggctcact gacgagttct240acgtgctgcg ggcagcacag ctggccctgg tctatgtgtc ccaggaccct acagaggagc300aacaggacct cttcctcagg gacatgcctg aaaaatggct cttcctgccg ttccatgatg360aactgaggag gtgaggcccc agggaagacc agggagggct tcctggagaa ggcatttccc420tggaggttta ctgtcctggt actacttgtg cataaagagg tattcctc 468<210> 61<211> 109<212> PRT<213> 小鼠<220>
<221> MISC_FEATURE<223> 翻譯的小鼠RdCVF1 cDNA的氨基酸序列<400> 61Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp1 5 10 15Gln Asp Glu Val Glu Thr Glu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Leu Glu Asn20 25 30Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln Cys Gln35 40 45Ala Phe Ala Pro Val Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu50 55 60Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln65 70 75 80Asp Pro Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Arg Asp Met Pro Glu85 90 95Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe His Asp Glu Leu Arg Arg100 105<210> 62<211> 353<212> DNA<213> 人<220>
<221> misc_feature<223> 人RdCVF1 cDNA<400> 62cccagcaccc aacccaggtt accatggcct ccctgttctc tggccgcatc ctgatccgca 60acaatagcga ccaggacgag ctggatacgg aggctgaggt cagtcgcagg ctggagaacc120ggctggtgct gctgttcttt ggtgctgggg cttgtccaca gtgccaggcc ttcgtgccca180tcctcaagga cttcttcgtg cggctcacag atgagttcta tgtactgcgg gcggctcagc240tggccctggt gtacgtgtcc caggactcca cggaggagca gcaggacctg ttcctcaagg300acatgccaaa gaaatggctt ttcctgccct ttgaggatga tctgaggagg tga 353<210> 63<211> 109<212> PRT<213> 人<220>
<221> MISC_FEATURE<223> 翻譯的人RdCVF1 cDNA的氨基酸序列<400> 63Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn Ser Asp1 5 10 15Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Glu Asn20 25 30Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln cys Gln35 40 45Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr Asp Glu50 55 60Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val Ser Gln65 70 75 80Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met Pro Lys85 90 95Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg100 105<210> 64<211> 600<212> DNA<213> 小鼠<220>
<221> misc_feature<223> 小鼠RdCVF2 cDNA<400> 64ataaaataga gggtgggaga ggttgatggc gtggctctgc tttttggtgc ggggcaccca 60gctgtcatcg ctgctgtcgc agcttctgga gtggccactg tgctctctcc tcccttcggc120tcaaggtgag ctgttccagc agaaggcggg gctgagaggc gcctagtgct gcgggaggct180cagtgtcatc ttccagctaa caggtggccg tgcagcccag ggctcgtctc tccactgtgt240cctcttcacg ccgagctcgt ggcgatggtg gacgtgctgg gcgggcggcg cctggtgacc300cgggagggca cggtggtgga ggccgaggtg gcgctgcaga acaaggtggt agctttgtac360tttgcggcgg gccggtgctc gcccagccgc gacttcacgc cgctgctctg cgacttctac420acggagctgg tgagcgaggc gcggcggccc gctcccttcg aggtggtttt cgtgtcggca480gacggcagtg cggaggagat gttggacttc atgcgcgagc tgcacggctc ctggctggca540ttgcccttcc acgaccccta ccggcagtga gtggggaccc aggggtcatg gggctggcgc600<210> 65<211> 101
<212> PRT<213> 小鼠<220>
<221> MISC_FEATURE<223> 翻譯的小鼠RdCVF2 cDNA的氨基酸序列<400> 65Met Val Asp Val Leu Gly Gly Arg Arg Leu Val Thr Arg Glu Gly Thr1 5 10 15Val Val Glu Ala Glu Val Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr20 25 30Phe Ala Ala Gly Arg Cys Ser Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu35 40 45Cys Asp Phe Tyr Thr Glu Leu Val Ser Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro50 55 60Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Ala Glu Glu Met Leu65 70 75 80Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ser Trp Leu Ala Leu Pro Phe His85 90 95Asp Pro Tyr Arg Gln100<210> 66<211> 1472<212> DNA<213> 小鼠<220>
<221> misc_feature<223> 人RdCVF2 cDNA<400> 66gtgtgggcgg ggcgcagttg ggggagggtg cagagacctg agggcttgag gttgcctggc 60tggccccgct cccagaggcg ggtgccgcgc tgtcgcccag gtatctgggg tctctggtgt 120ctgagtgtct cattgtcggc gcgaacacaa ttgctccagc cacaggcgag gcctggccaa 180ggtgtgggcg catctagggc aggtcttgag aggtccagcg cccggtggtg cggacagagg 240cggggcaccg cggcgctcgc cgccgcctcc ccgcaggtga tcatcctcct gcaggtgtcc 300tcgggtctca ggtggctgcg tgtctgcgcc atggttgaca ttctgggcga gcggcacctg 360gtgacctgta agggcgcgac ggtggaggcc gaggcggcgc tgcagaacaa ggtggtggca 420ctgtacttcg cggcggcccg gtgcgcgccg agccgcgact tcacgccgct gctctgcgac 480ttctatacgg cgctggtggc cgaggcgcgg cggcccgcgc ccttcgaagt ggtcttcgtg 540tcagccgacg gcagctgcca ggagatgctg gacttcatgc gcgagctgca tggcgcctgg 600ctggcgctgc ccttccacga cccctaccgg caacggagtc tcgctctgtt gcccaggctg 660gagtgcagtg gcgtgatctt agctcactgc aacctttgcc tcctgggttc aagtgattct 720ctagccttag cctcctgagc atctgggact acagccattg ctgtgaatta cgtgagggaa 780agatattgaa gaggagttgg acactccgag agtgcagctg ttctcccccc gcaccatccg 840tgtcctgcat tctgcgagtc tgtgctcatt aacaatgtgc tgtgaccatg tgactcagca 900atcctgctgc tgggtatata cccgaaagaa aggaaaagga agccagtata ttgaagaggt 960atctgcaccc ccatgtttat tgcagcactg ttcacaacag ccaagatttg gaagcaacct1020aagtgtccat caacagatga atggataaag aaaacgtggt acatatacac aatggagtac1080tcttcagcca ttaaaaaaat gagattctgt catttgcaat aatatagatg gaaaaggagg1140cccttatgtg aagtgaaata agccaggcac agaaagacaa acatcacatg ttctcactta1200tttgtgggat ctaatgatca aaacaattga actcttggac atagagagta gaaggttggt1260taccagaagc tggaaaggaa agtggggttg ggaggaaggt gggaatggtt aataggtaca1320aaaaaataca aagaataaat aagacctaat atttgatagc acaacagtgt gactactgtc1380aataatcatt taattgtaca tttaaaaata actataattg cattgtttgt aacacaaaag1440ataaatgctt gaggagaaaa aaaaaaaaaa aa 1472
<210> 67<211> 135<212> PRT<213> 人<220>
<221> MISC_FEATURE<223> 翻譯的人RdCVF2 cDNA的氨基酸序列<400> 67Met Val Asp Ile Leu Gly Glu Arg His Leu Val Thr Cys Lys Gly Ala1 5 10 15Thr Val Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Asn Lys Val Val Ala Leu Tyr20 25 30Phe Ala Ala Ala Arg Cys Ala Pro Ser Arg Asp Phe Thr Pro Leu Leu35 40 45Cys Asp Phe Tyr Thr Ala Leu Val Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ala Pro50 55 60Phe Glu Val Val Phe Val Ser Ala Asp Gly Ser Cys Gln Glu Met Leu65 70 75 80Asp Phe Met Arg Glu Leu His Gly Ala Trp Leu Ala Leu Pro Phe His85 90 95Asp Pro Tyr Arg Gln Arg Ser Leu Ala Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys100 105 110Ser Gly Val Ile Leu Ala His Cys Asn Leu Cys Leu Leu Gly Ser Ser115 120 125Asp Ser Leu Ala Leu Ala Ser130 135<210> 68<211> 1539<212> DNA<213> Thogoto病毒<220>
<221> CDS<222> (1)..(1539)<400> 68atg ttc ctt cag act gca ctg ctt ctg cta tcc tta ggg gta gca gaa 48Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Glu1 5 10 15cct gac tgc aat aca aaa aca gcc aca ggc cca tat ata ttg gac aga 96Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro Tyr Ile Leu Asp Arg20 25 30tat aaa ccc aag cca gtc act gta tcc aag aag ttg tat tcg gcc acc144Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys Leu Tyr Ser Ala Thr35 40 45aga tac aca acc tct gca caa aat gag cta ctt acc gct ggt tat cgc192Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu Thr Ala Gly Tyr Arg50 55 60aca gcc tgg gtg gct tac tgc tat aac ggt ggc ctc gtt gat tct aat240Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly Leu Val Asp Ser Asn65 70 75 80act ggt tgt aat gct agg cta ctg cat tac ccg ccc agc aga gat gag288Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu85 90 95tta ctg ctt tgg gga tca tct cac cag tgt tca tac ggg gac atc tgc336Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser Tyr Gly Asp Ile Cys
100 105 110cat gat tgc tgg ggg agc gat tcc tat gca tgc ctg gga cag ctg gac 384His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Gln Leu Asp115 120 125cct gcc aaa cat tgg gcg cca agg aag gag ctc gtc aga aga gat gct 432Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu Val Arg Arg Asp Ala130 135 140aac tgg aaa ttc gca tac cat atg tgc aac atc gac tgg aga tgc gga 480Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile Asp Trp Arg Cys Gly145 150 155 160gtc acc acc tcc ccc gta ttc ttc aat ttg cag tgg gta aag aat gaa 528Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln Trp Val Lys Asn Glu165 170 175gta aag gtc agc act ctt ctg cct aat gga agc act gtg gaa cac tct 576Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser Thr Val Glu His Ser180 185 190gct ggg gag cct ctg ttc tgg act gag aag gac ttc tca tat ctg gtc 624Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Val195 200 205aaa gac aat ttc gaa ata cag agg gaa gaa gta aaa atc agc tgc ttc 672Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val Lys Ile Ser Cys Phe210 215 220gta gat cca gac tat tgg gta gga gaa agg aag acc aag aaa gcg ttt 720Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys Thr Lys Lys Ala Phe225 230 235 240tgc caa gac ggg acc aac ttc ttc gaa gtg act tca cac caa ttt tgt 768Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr Ser His Gln Phe Cys245 250 255cat caa tat gca tgt tac aac ttc tct aag gac gaa ctg ctg gaa gct 816His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ala260 265 270gtc tac aaa gaa aga gct cac gag aaa agc aag gac ctg ccc ttt ggt 864Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys Asp Leu Pro Phe Gly275 280 285aat aaa agc tgg act gtg gtg aca gcc tcc ata gat gac ctc cac gca 912Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile Asp Asp Leu His Ala290 295 300ctc agt gca gca cag gca ttt gag ctg gaa ggg ctc aga gca tct ttt 960Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser phe305 310 315 320gct gaa ctg gat tca cga ttt agg cag ctg tca gaa att ttg gac aca1008Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser Glu Ile Leu Asp Thr325 330 335gtg ata tcc agt atc gcc aag atc gac gag aga ctt atc ggc aga ctg1056Val Ile Ser Ser Ile Als Lys Ile Asp Glu Arg Leu Ile Gly Arg Leu340 345 350atc aaa gca ccc gtt tct agc aga ttc atc tca gag gac aag ttt ctg1104Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser Glu Asp Lys Phe Leu35 360 365cta cat cag tgc gtg gac agt gtg gcc aac aac acc aac tgc gtg gga1152Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn Thr Asn Cys Val Gly370 375 380gac agt gca tat gtg gac ggc agg tgg acc cat gtt ggg gac aac cat1200Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His Val Gly Asp Asn His385 390 395 400cct tgc aca acc gtg gta gat gaa cca ata ggc att gac atc tat aac1248Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly Ile Asp Ile Tyr Asn405 410 415ttc agt gcc ctc tgg tac cct tct gcc gcc gaa gtc gat ttt agg gga1296
Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Val Asp Phe Arg Gly420 425 430act gtc cag tca gaa gat ggt tgg tct ttt gtg gtc aaa tct aaa gac1344Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val Val Lys Ser Lys Asp435 440 445gcg ctc atc cag acc atg atg tac acc aaa aac ggc ggt aaa ggg act1392Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn Gly Gly Lys Gly Thr450 455 460tct ctc acg gac ctc ttg gac tac cct tct ggt tgg ctt aag ggg cag1440Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Trp Leu Lys Gly Gln465 470 475 480ctg ggg ggc ttg cta tat ggc aat atc ggt gtg tac ttg tta att gct1488Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val Tyr Leu Leu Ile Ala485 490 495ttc gct ttt gtg cta ttg atc aga cta att aag agt gct gga tta tgc1536Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly Leu Cys500 505 510taa1539<210> 69<211> 512<212> PRT<213> Thogoto病毒<400> 69Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Val Ala Glu1 5 10 15Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro Tyr Ile Leu Asp Arg20 25 30Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys Leu Tyr Ser Ala Thr35 40 45Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu Thr Ala Gly Tyr Arg50 55 60Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly Leu Val Asp Ser Asn65 70 75 80Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu85 90 95Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser Tyr Gly Asp Ile Cys100 105 110His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Gln Leu Asp115 120 125Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu Val Arg Arg Asp Ala130 135 140Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile Asp Trp Arg Cys Gly145 150 155 160Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln Trp Val Lys Asn Glu165 170 175Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser Thr Val Glu His Ser180 185 190Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Val195 200 205Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val Lys Ile Ser Cys Phe210 215 220Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys Thr Lys Lys Ala Phe225 230 235 240Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr Ser His Gln Phe Cys245 250 255His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ala260 265 270
Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys Asp Leu Pro Phe Gly275 280 285Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile Asp Asp Leu His Ala290 295 300Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser Phe305 310 315 320Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser Glu Ile Leu Asp Thr325 330 335Val Ile Ser Ser Ile Ala Lys Ile Asp Glu Arg Leu Ile Gly Arg Leu340 345 350Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser Glu Asp Lys Phe Leu355 360 365Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn Thr Asn Cys Val Gly370 375 380Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His Val Gly Asp Asn His385 390 395 400Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly Ile Asp Ile Tyr Asn405 410 415Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Val Asp Phe Arg Gly420425 430Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val Val Lys Ser Lys Asp435 440 445Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn Gly Gly Lys Gly Thr450 455 460Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Trp Leu Lys Gly Gln465 470 475480Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val Tyr Leu Leu Ile Ala485 490 495Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly Leu Cys500 505 510<210> 70<211> 1567<212> DNA<213> Thogoto病毒<220>
<221> CDS<222> (19)..(1557)<223> 重新編碼的thogoto病毒包膜<400> 70ccgctcgagc gggccacc atg ttc ctg cag aca gct ctc ctg ctc ctg tcc 51Met Phe Leu Gln Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ser1 5 10ctg gga gtg gcc gaa cct gac tgc aac acc aag acc gcc aca ggc ccc 99Leu Gly Val Ala Glu Pro Asp Cys Asn Thr Lys Thr Ala Thr Gly Pro15 20 25tac att ctg gac cgg tac aag ccc aag ccc gtg acc gtg agc aag aag147Tyr Ile Leu Asp Arg Tyr Lys Pro Lys Pro Val Thr Val Ser Lys Lys30 35 40ctg tac tcc gcc acc aga tac acc acc agc gcc cag aac gag ctg ctg195Leu Tyr Ser Ala Thr Arg Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Asn Glu Leu Leu45 50 55aca gct ggc tac cgg acc gct tgg gtg gcc tac tgc tac aac ggc gga243Thr Ala Gly Tyr Arg Thr Ala Trp Val Ala Tyr Cys Tyr Asn Gly Gly60 65 70 75ctg gtg gac agc aac aca gga tgc aac gcc aga ctg ctg cac tat cct291Leu Val Asp Ser Asn Thr Gly Cys Asn Ala Arg Leu Leu His Tyr Pro
80 85 90cct tcc cgg gac gaa ctg ctc ctg tgg ggc tcc agc cat cag tgt agc339Pro Ser Arg Asp Glu Leu Leu Leu Trp Gly Ser Ser His Gln Cys Ser95 100 105tac ggc gac atc tgt cac gac tgc tgg ggc tcc gat agc tsc gcc tgc387Tyr Gly Asp Ile Cys His Asp Cys Trp Gly Ser Asp Ser Tyr Ala Cys110 115 120ctg ggc cag ctg gat cct gcc aag cac tgg gct cct cgg aag gaa ctg435Leu Gly Gln Leu Asp Pro Ala Lys His Trp Ala Pro Arg Lys Glu Leu125 130 135gtg aga cgg gac gcc aac tgg aag ttc gcc tac cac atg tgc aac atc483Val Arg Arg Asp Ala Asn Trp Lys Phe Ala Tyr His Met Cys Asn Ile140145 150 155gac tgg cgg tgc ggc gtg acc aca agc cct gtc ttc ttc aac ctg cag531Asp Trp Arg Cys Gly Val Thr Thr Ser Pro Val Phe Phe Asn Leu Gln160 165 170tgg gtc aag aac gaa gtg aag gtg agc acc ctg ctg ccc aat gga agc579Trp Val Lys Asn Glu Val Lys Val Ser Thr Leu Leu Pro Asn Gly Ser175 180 185acc gtg gag cac agc gct ggc gag ccc ctg ttc tgg acc gag aag gac627Thr Val Glu His Ser Ala Gly Glu Pro Leu Phe Trp Thr Glu Lys Asp190 195 200ttc agc tac ctg gtg aaa gac aac ttc gag atc cag cgg gag gag gtg675Phe Ser Tyr Leu Val Lys Asp Asn Phe Glu Ile Gln Arg Glu Glu Val205 210 215aag atc agc tgc ttc gtg gat cct gac tac tgg gtg ggc gag cgg aag723Lys Ile Ser Cys Phe Val Asp Pro Asp Tyr Trp Val Gly Glu Arg Lys220 225 230 235acc aag aaa gcc ttc tgt cag gac ggc acc aac ttc ttc gaa gtg acc771Thr Lys Lys Ala Phe Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr240 245 250agc cac cag ttc tgc cac cag tac gcc tgc tac aac ttc tcc aag gac819Ser His Gln Phe Cys His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp255 260 265gag ctg ctg gaa gct gtg tac aag gag cgg gcc cac gag aag agc aag867Glu Leu Leu Glu Ala Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys270 275 280gac ctg ccc ttc ggc aac aag tcc tgg acc gtg gtg acc gcc tcc atc915Asp Leu Pro Phe Gly Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile285 290 295gac gac ctg cat gct ctg agc gcc gct cag gcc ttc gaa ctg gag gga963Asp Asp Leu His Ala Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly300 305 310 315ctg cgg gct agc ttt gct gaa ctg gac tcc aga ttc cgg cag ctg agc 1011Leu Arg Ala Ser Phe Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser320 325 330gag atc ctg gac acc gtg atc agc agc atc gcc aag atc gac gag aga 1059Glu Ile Leu Asp Thr Val Ile Ser Ser Ile Ala Lys Ile Asp Glu Arg335 340 345ctg atc ggc aga ctc atc aaa gct cct gtg agc agc cgg ttc atc agc 1107Leu Ile Gly Arg Leu Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser350 355 360gag gac aag ttc ctg ctg cac cag tgc gtg gac agc gtg gcc aac aac 1155Glu Asp Lys Phe Leu Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn365 370 375acc aac tgt gtg gga gac agc gcc tac gtg gac ggc cgg tgg aca cat 1203Thr Asn Cys Val Gly Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His380 385 390395gtg ggc gac aat cat ccc tgc acc aca gtg gtg gac gag ccc atc ggc 1251
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225 230 235 240Cys Gln Asp Gly Thr Asn Phe Phe Glu Val Thr Ser His Gln Phe Cys245 250 255His Gln Tyr Ala Cys Tyr Asn Phe Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ala260 265 270Val Tyr Lys Glu Arg Ala His Glu Lys Ser Lys Asp Leu Pro Phe Gly275 280 285Asn Lys Ser Trp Thr Val Val Thr Ala Ser Ile Asp Asp Leu His Ala290 295 300Leu Ser Ala Ala Gln Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Ala Ser Phe305 310 315 320Ala Glu Leu Asp Ser Arg Phe Arg Gln Leu Ser Glu Ile Leu Asp Thr325 330 335Val Ile Ser Ser Ile Ala Lys Ile Asp Glu Arg Leu Ile Gly Arg Leu340 345 350Ile Lys Ala Pro Val Ser Ser Arg Phe Ile Ser Glu Asp Lys Phe Leu355 360 365Leu His Gln Cys Val Asp Ser Val Ala Asn Asn Thr Asn Cys Val Gly370 375 380Asp Ser Ala Tyr Val Asp Gly Arg Trp Thr His Val Gly Asp Asn His385 390 395 400Pro Cys Thr Thr Val Val Asp Glu Pro Ile Gly Ile Asp Ile Tyr Asn405 410 415Phe Ser Ala Leu Trp Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Val Asp Phe Arg Gly420 425 430Thr Val Gln Ser Glu Asp Gly Trp Ser Phe Val Val Lys Ser Lys Asp435 440 445Ala Leu Ile Gln Thr Met Met Tyr Thr Lys Asn Gly Gly Lys Gly Thr450 455 460Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Tyr Pro Ser Gly Trp Leu Lys Gly Gln465 470 475 480Leu Gly Gly Leu Leu Tyr Gly Asn Ile Gly Val Tyr Leu Leu Ile Ala485 490 495Phe Ala Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly Leu Cys500 505 510
權利要求
1.重組慢病毒基因轉移系統(tǒng)，包含(a)(i)包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子，或(ii)第一包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子，以及第二包裝構建體，其包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子；(b)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的啟動子；(c)轉移載體構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含的啟動子可操作地連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)以及第二R區(qū)；和(d)(i)rev基因，位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上，或(iii)rev構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。
2.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，包含包裝構建體，所述構建體包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子。
3.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，包含第一包裝構建體，其包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及第二包裝構建體，其包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子。
4.權利要求2的基因轉移系統(tǒng)，其中包裝構建體進一步包含RRE序列。
5.權利要求3的基因轉移系統(tǒng)，其中至少一個包裝構建體進一步包含RRE序列。
6.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因和RRE序列來自BIV。
7.權利要求2的基因轉移系統(tǒng)，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。
8.權利要求2的基因轉移系統(tǒng)，其中gag基因和pol基因分別包含重新編碼的核苷酸序列。
9.權利要求2的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。
10.權利要求3的基因轉移系統(tǒng)，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。
11.權利要求3的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。
12.權利要求11的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因在5′端包含ATG起始密碼子。
13.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中pol基因的蛋白酶區(qū)在該蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中發(fā)生突變，且其中所述的突變蛋白酶與未突變的BIV蛋白酶相比對宿主細胞毒性較小。
14.權利要求13的基因轉移系統(tǒng)，其中蛋白酶區(qū)在蛋白酶多肽氨基酸26位上編碼Thr到Ser的突變。
15.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中BIV包裝序列包含不超過BIVgag基因開放讀框序列的頭101個堿基對。
16.權利要求15的基因轉移系統(tǒng)，其中包裝序列基本上由SEQ ID NO39的核苷酸序列組成。
17.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中轉移載體構建體包含DNA片段，所述DNA片段包含的啟動子可操作地連接于第一R區(qū)、U5區(qū)、UTR區(qū)、BIV包裝序列、RRE序列、可操作地連接于異源目的基因的啟動子、3′聚嘌呤帶、U3區(qū)、第二R區(qū)和第二U5區(qū)。
18.權利要求2的基因轉移系統(tǒng)，其中包裝構建體進一步包含rev基因。
19.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中病毒表面蛋白基因構建體包含env基因。
20.權利要求19的基因轉移系統(tǒng)，其中env基因選自VSV-G env、LCMV env、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、長臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成員的env基因、甲病毒屬env基因、副粘病毒屬env基因、黃熱病病毒屬env基因、逆轉錄病毒屬env基因、沙粒病毒屬env基因、副流感病毒env基因、索戈托病毒env基因以及桿狀病毒屬env基因。
21.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中病毒表面蛋白基因編碼VSV-Genv。
22.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，包含位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上的rev基因。
23.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，包含rev構建體，所述rev構建體含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。
24.權利要求6的基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因不包含天然BIV rev內含子。
25.權利要求24的基因轉移系統(tǒng)，其中rev基因包含SEQ ID NO10。
26.權利要求22的基因轉移系統(tǒng)，包含可操作地連接于rev基因的EF-1啟動子。
27.權利要求23的基因轉移系統(tǒng)，其中可操作地連接于rev基因的啟動子是EF-1啟動子。
28.權利要求6的基因轉移系統(tǒng)，其中RRE序列基本上由SEQ ID NO40的核酸序列組成。
29.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中至少兩個啟動子是相同的。
30.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中所有的啟動子都不同。
31.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中至少一個啟動子是調控型啟動子。
32.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，它不含cPPT。
33.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中轉移載體構建體進一步包含cPPT。
34.權利要求33的基因轉移系統(tǒng)，其中cPPT是來自人類免疫缺陷病毒的cPPT。
35.權利要求33的基因轉移系統(tǒng)，其中cPPT是BIV cPPT。
36.權利要求35的基因轉移系統(tǒng)，其中cPPT基本上由與SEQ ID NO1的從堿基對4758到5293包含端點在內的核苷酸相對應的535個堿基對組成。
37.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中U3區(qū)包含多聚腺苷?；鰪娮?。
38.權利要求37的基因轉移系統(tǒng)，其中多聚腺苷?；鰪娮踊旧嫌蒘V40晚期多聚腺苷?；鰪娮釉M成。
39.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，它不編碼BIV的至少vif、vpw、vpy或tat基因之一。
40.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，它不編碼BIV的vif、vpw、vpy、tmx和tat基因。
41.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中U3區(qū)的一個或多個核苷酸改變或缺失，從而U3介導的轉錄減低或消除。
42.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，包含可操作地連接于異源目的基因的美國土撥鼠肝炎病毒調控應答元件。
43.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中異源目的基因編碼選自T2-TrpRS、Eph B受體、ephrin B配體、血纖蛋白原E片段、VEGF可溶性受體、血管他丁、內皮他丁、視神經堿(optineurin)、小梁網蛋白、視桿細胞源的視錐生存因子(Rod-derived Cone Viability Factor)(RdCVF)以及抗-細胞凋亡基因產物的多肽。
44.權利要求1的基因轉移系統(tǒng)，其中異源目的基因編碼選自SEQ IDNO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65和SEQ ID NO67的RdCVF多肽。
45.生產者細胞，包含權利要求1-44中任一項的基因轉移系統(tǒng)。
46.權利要求45的生產者細胞，其中基因轉移系統(tǒng)穩(wěn)定地整合到生產者細胞的基因組中。
47.權利要求45的生產者細胞，其中基因轉移系統(tǒng)短暫地轉染到生產者細胞中。
48.產生復制缺陷型慢病毒載體顆粒的方法，包含(a)在足以允許所述細胞產生復制缺陷型慢病毒載體顆粒的細胞培養(yǎng)條件下，在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求45的生產者細胞；和(b)從培養(yǎng)基中收集所述復制缺陷型慢病毒載體顆粒。
49.根據(jù)權利要求48的方法，進一步包含向培養(yǎng)基中添加組蛋白脫乙酰基酶抑制劑。
50.根據(jù)權利要求49的方法，其中組蛋白脫乙酰基酶抑制劑是丁酸。
51.復制缺陷型慢病毒載體顆粒，由根據(jù)權利要求48的方法產生。
52.在具有或處于感染疾病風險的動物中治療或預防所述疾病的方法，包含用根據(jù)權利要求51的復制缺陷型重組慢病毒載體顆粒侵染該動物的一個或多個細胞，其中異源目的基因編碼能有效治療或預防所述疾病的治療性產物。
53.權利要求52的方法，其中動物是人類。
54.權利要求52的方法，其中一個或多個細胞是眼細胞。
55.權利要求54的方法，其中疾病選自眼新血管形成、濕性AMD(老年性黃斑變性)、糖尿病增殖性視網膜病、非糖尿病性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、視網膜分支靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、未成熟嬰兒視網膜病變、虹膜紅變、新生血管性青光眼、凹周圍毛細血管擴張、鐮狀細胞視網膜病、Eale′s病、視網膜血管炎、Von Hippel Lindau病、放射性視網膜病變、視網膜冷凍損傷、視網膜色素變性、視網膜脈絡膜缺損、因單純皰疹病毒性角膜炎所致的角膜新血管形成、角膜潰瘍、角膜移植術、pterigyia，或創(chuàng)傷性視網膜營養(yǎng)不良、病理性衰老、色素性視網膜炎(retinitus pigmentosa)、Bardet-Biedel綜合癥、Bassen-kornzweig綜合癥、卵黃狀黃斑變性、無脈絡膜、回旋狀萎縮、先天性黑曚(congenital amourosis)、Refsun綜合癥、Stargardt病和Usher綜合癥。
56.權利要求55的方法，其中治療產物選自T2-TrpRS、Eph B受體、ephrin B配體、血纖蛋白原E片段、VEGF可溶性受體、血管他丁、內皮他丁、視神經堿、小梁網蛋白、視桿細胞源的視錐生存因子(RdCVF)以及抗-細胞凋亡基因產物。
57.權利要求55的方法，其中治療產物是選自SEQ ID NO61、SEQID NO63、SEQ ID NO65和SEQ ID NO67的Rdcvf多肽。
58.權利要求52的方法，其中疾病選自癌癥、與同種異體骨髓移植相關的移植物抗宿主病以及神經疾病。
59.權利要求52的方法，其中一個或多個細胞在體內侵染。
60.權利要求52的方法，其中一個或多個細胞在體外侵染。
61.在體外用重組慢病毒載體顆粒轉導細胞的方法，包含使細胞與根據(jù)權利要求51的重組慢病毒載體顆粒接觸，藉此細胞得以轉導。
62.在體內用重組慢病毒載體顆粒轉導細胞的方法，包含使細胞與根據(jù)權利要求51的重組慢病毒載體顆粒接觸，藉此細胞得以轉導。
63.在細胞中表達異源目的基因的方法，包含用根據(jù)權利要求51的重組慢病毒載體顆粒轉導細胞，藉此異源目的基因在細胞中表達。
64.包裝細胞，包含(a)(i)包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子，或(ii)第一包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及第二包裝構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子；(b)病毒表面蛋白基因構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于病毒表面蛋白基因的啟動子；和(c)(i)rev基因，位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上，或(ii)rev構建體，包含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。
65.權利要求64的包裝細胞，包含含有DNA片段的包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于BIV gag基因和BIV pol基因的啟動子。
66.權利要求64的包裝細胞，包含含DNA片段的第一包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV gag基因的DNA片段的第一啟動子；以及含DNA片段的第二包裝構建體，所述DNA片段包含可操作地連接于包含BIV pol基因的DNA片段的第二啟動子。
67.權利要求65的包裝細胞，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。
68.權利要求65的包裝細胞，其中gag基因和pol基因分別包含重新編碼的核苷酸序列。
69.權利要求65的包裝細胞，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。
70.權利要求66的包裝細胞，其中gag基因包含重新編碼的核苷酸序列。
71.權利要求66的包裝細胞，其中pol基因包含重新編碼的核苷酸序列。
72.權利要求64的包裝細胞，其中pol基因的蛋白酶區(qū)在蛋白酶催化中心的三氨基酸基序中發(fā)生突變，且其中所述突變的蛋白酶與未突變的BIV蛋白酶相比對宿主細胞毒性較小。
73.權利要求72的包裝細胞，其中蛋白酶區(qū)在蛋白酶多肽的氨基酸26位上編碼Thr到Ser的突變。
74.權利要求64的包裝細胞，其中病毒表面蛋白基因構建體包含env基因。
75.權利要求74的包裝細胞，其中env基因選自VSV-G env、LCMVenv、LCMV-GP(WE-HPI)env、MoMLV env、長臂猿白血病病毒(GaLV)env、Phabdoviridae科成員的env基因、甲病毒屬env基因、副粘病毒屬env基因、黃熱病病毒屬env基因、逆轉錄病毒屬env基因、沙粒病毒屬env基因和副流感病毒env基因。
76.權利要求64的包裝細胞，其中病毒表面蛋白基因編碼VSV-Genv。
77.權利要求64的包裝細胞，包含位于所述包裝構建體、病毒表面蛋白基因構建體及轉移載體構建體之一上的rev基因。
78.權利要求64的包裝細胞，包含rev構建體，所述rev構建體含DNA片段，所述DNA片段包含可操作地連接于rev基因的啟動子。
79.權利要求64的包裝細胞，其中rev基因來自BIV但不包含天然BIV rev內含子。
80.權利要求79的包裝細胞，其中rev基因包含SEQ ID NO10。
81.權利要求77的包裝細胞，包含可操作地連接于rev基因的EF-1啟動子。
82.權利要求78的包裝細胞，其中可操作地連接于rev基因的啟動子是EF-1啟動子。
83.權利要求64的包裝細胞，其中至少兩個啟動子是相同的。
84.權利要求64的包裝細胞，其中所有的啟動子都不同。
85.權利要求64的包裝細胞，其中細胞選自293細胞、293T細胞、COS細胞、HeLa細胞和Cf2TH細胞。
86.分離的BIV POL蛋白，包含與SEQ ID NO51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
87.權利要求86的分離的BIV POL蛋白，包含SEQ ID NO51。
88.權利要求86的分離的BIV POL蛋白，其在所述POL蛋白的N-末端包含甲硫氨酸。
89.分離的核酸分子，包含編碼權利要求86-88中任一項的BIV POL蛋白的核苷酸序列。
90.分離的核酸分子，包含編碼權利要求87的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO50組成。
91.分離的核酸分子，包含編碼權利要求88的BIV POL蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列基本上由SEQ ID NO53組成。
92.分離的核酸分子，包含最小的BIV包裝序列，其中所述的最小BIV包裝序列與SEQ ID NO39所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
93.權利要求92的分離的核酸分子，其中的最小BIV包裝序列基本上由SEQ ID NO39所示的核苷酸序列組成。
94.分離的核酸分子，包含編碼BIV REV蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼與SEQ ID NO10所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
95.權利要求94的分離的核酸分子，其中編碼BIV REV蛋白的核苷酸序列編碼由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列所編碼的同一個氨基酸序列。
96.權利要求94的分離的核酸分子，其中的核苷酸序列與SEQ ID NO10所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
97.權利要求94的分離的核酸分子，其中的核苷酸序列基本上由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成。
98.分離的核酸分子，包含最小的BIV RRE序列，其中所述的最小BIV RRE序列與SEQ ID NO40所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
99.權利要求98的分離的核酸分子，其中該最小BIV RRE序列基本上由SEQ ID NO40所示的核苷酸序列組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組慢病毒載體和產生所述載體的基因轉移系統(tǒng)，產生所述重組慢病毒載體中所用的細胞系，以及所述重組載體和基因轉移系統(tǒng)所用的牛免疫缺陷病毒DNA序列。
文檔編號C12N15/867GK1643164SQ03807285
公開日2005年7月20日 申請日期2003年2月4日 優(yōu)先權日2002年2月4日
發(fā)明者羅天賜, M·卡勒克, D·格里特雷, R·莫里那, 李孟陶, G·拉姆布羅 申請人:諾瓦提斯公司