專利名稱：前糖尿病狀態(tài)的篩選方法及其篩選試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及易檢出葡萄糖耐量受損引起的前糖尿病狀態(tài)的篩選方法，及其篩選試劑。
背景技術(shù)：
在日本據(jù)估計(jì)現(xiàn)在糖尿病人數(shù)約有690萬(wàn)，如包括可稱為前糖尿病狀態(tài)的葡萄糖耐量受損的人，將達(dá)到1370萬(wàn)。而且，據(jù)說(shuō)全國(guó)40歲以上人口的1/10是糖尿病人。
糖尿病已知是經(jīng)葡萄糖耐量受損發(fā)展而成的，習(xí)慣上稱為邊界型。因此，通過(guò)盡早地檢測(cè)這種狀態(tài)并治療病人就能夠抑制向糖尿病的發(fā)展。
常規(guī)的葡萄糖耐量受損和糖尿病臨床診斷，是通過(guò)測(cè)定禁食血糖水平和測(cè)定口服75克的葡萄糖耐量試驗(yàn)后1小時(shí)和/或2小時(shí)的血糖水平。禁食糖水平(下文稱為“FBS”)因其低負(fù)荷而用于篩選。按照日本糖尿病病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，低于110mg/dl水平判定為正常型，110至125mg/dl為邊界型，126mg/dl或以上者為糖尿病型。由于上述的診斷結(jié)果，對(duì)糖尿病的疑似病例，再進(jìn)行另一次口服的75克葡萄糖耐量試驗(yàn)以作出最終的決定(對(duì)于葡萄糖耐量試驗(yàn)后2小時(shí)的血糖水平)低于140mg/dl水平者判定為正常型，140至190mg/dl為邊界型，200mg/dl或以上者為糖尿病型)。
然而，上述借助FBS手段的測(cè)定方法未必被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確的測(cè)定方法，因?yàn)橛心承┮蛩刂T如不穩(wěn)定型糖尿病或受試驗(yàn)前晚餐的組成的影響。而且，75克口服葡萄糖耐量試驗(yàn)至少需要2小時(shí)，頻繁采血樣，并給病人帶來(lái)身體麻煩，因此，它并不是那么好的。
為了檢測(cè)前糖尿病狀態(tài)或糖尿病狀態(tài)，作為例子已提出下列的方法。
(1)一種此較哺乳動(dòng)物患者和健康人尿中的D-chiro-肌醇的數(shù)量或增加比率，它們是在眼用蔗糖預(yù)定時(shí)間后，以同樣的方式定量地測(cè)定的用于檢出前糖尿病狀態(tài)的方法已經(jīng)出現(xiàn)。
(2)使用來(lái)自病人的尿樣對(duì)哺乳動(dòng)物患者篩選患糖尿病可能性的一種篩選方法，該方法包括幾個(gè)步驟1)在無(wú)菌環(huán)境下保持這種樣品；2)分析這一種樣品是否存在(或缺乏)D-chiro-肌醇，這一步驟規(guī)定D-chiro-肌醇缺乏，或D-chiro-肌醇水平顯著低時(shí)，表明體內(nèi)沒(méi)有作用，因?yàn)楹褪茉囌咛幱谔悄虿〉臓顟B(tài)，此時(shí)，這種低水平至少是比非糖尿病水平低3個(gè)數(shù)量級(jí)(日本專利No.2,834,321)。
(3)一種與糖尿病癥狀有關(guān)的胰島素抗性的檢出方法，該法測(cè)定D-chiro-肌醇濃度作為來(lái)自浦乳動(dòng)物患者尿樣或血清樣中與糖尿病癥狀有關(guān)的胰島素抗性的指標(biāo)(日本專利No.3,118,458)。
(4)一種篩選人胰島素抗性的方法，它包含測(cè)定液中D-chiro-肌醇濃度的步驟，測(cè)定體液中myo-肌醇濃度的步驟，計(jì)算myo-肌醇對(duì)D-chiro-肌醇比率的步驟和比較這樣計(jì)算出的比率與胰島素抗性的特征性比率，此處，當(dāng)計(jì)算出的比率超過(guò)胰島素抗性的特征性比率時(shí)，此人看來(lái)可確定有胰島素抗性(日本國(guó)際出版物No.10-507826)。
上述的(1)至(4)的篩選方法是使用尿液的檢驗(yàn)方法，因此，不需要血樣品或類似物，但尿樣需要在葡萄糖耐量試驗(yàn)后一定時(shí)間內(nèi)的尿樣；在這一定對(duì)間內(nèi)，受試者處于約束狀態(tài)。從上述可見(jiàn)，這些方法對(duì)普查是不適合的。而且，它們還有一個(gè)問(wèn)題是操作如此復(fù)雜，不可能處理許多試驗(yàn)樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選方法和篩選試劑，用此方法，由葡萄糖耐量受損所引起的前糖尿病狀態(tài)能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定，受試者不因身體情況，時(shí)間和費(fèi)用而有沉重負(fù)擔(dān)，有可能處理大量試驗(yàn)樣品。
為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明對(duì)于前糖尿病狀態(tài)的篩選方法之一包含從受試者采集的體液中測(cè)定D-甘露糖濃度，并將D-甘露糖濃度與預(yù)定的D-甘露糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值作比較。
本發(fā)明對(duì)于前糖尿病狀態(tài)的另一個(gè)篩選方法包含從受試者采集的體液中測(cè)定D-甘露糖濃度和葡萄糖濃度，并將D-甘露糖濃度與預(yù)定的D-甘露糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值作比較，將葡萄糖濃度與D-葡萄糖預(yù)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)值作比較。
在本發(fā)明的篩選方法中，體液更可取的是受試者在禁食條件下的血液、血漿或血清。而且，D-甘露糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)值列可取的是在禁食條件下通過(guò)測(cè)定從健康人采集的血液、血漿或血清所得的D-甘露糖濃度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得的上限。
按照本發(fā)明的篩選方法，有可能更準(zhǔn)確地檢測(cè)出不穩(wěn)定型糖尿病人(這類病人很可能被使用FBS的常規(guī)判斷方法所漏檢)，以及顯示正常的FBS值的前糖尿病狀態(tài)諸如葡萄糖耐量潛在受損的病人。
另一方面，本發(fā)明前糖尿病狀態(tài)的篩選試劑包含在電子受體存在下通過(guò)脫氫作用對(duì)甘露糖具有氧化活性的酶和用于該酶的電子受體。
本發(fā)明的篩選試劑更可取地還包含葡萄糖清除劑。而且，酶更可取的是葡萄糖脫氫酶，該酶分類為EC1.1.1.119，更可選擇的是己醛糖脫氫酶，它來(lái)自屬于葡萄桿菌(GluconoBacter)屬的微生物。另外，葡萄糖清除劑應(yīng)更可取地包含葡萄糖6-位磷酸化酶和腺苷三磷酸。而且，電子受體更可取的是輔酶MADP。
本發(fā)明的篩選試劑能夠定量地測(cè)定D-甘露糖和處理大量的試驗(yàn)樣品，因?yàn)樗褂靡环N直接對(duì)D-甘露糖反應(yīng)的酶，而不通過(guò)復(fù)雜的酶偶聯(lián)系統(tǒng)，它經(jīng)脫氫作用而且有氧化活性。而且，因?yàn)楸景l(fā)明的篩選幾乎不受樣品中葡萄糖的影響，使用葡萄糖清除劑使之能夠更準(zhǔn)確地定量測(cè)定D-甘露糖。
附圖的簡(jiǎn)述(

圖1)表示用本發(fā)明的前糖尿病狀態(tài)篩選方法，在葡萄糖耐量試驗(yàn)之前，所得的血漿中D-甘露糖濃度和葡萄糖濃度比較的結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式用本發(fā)明的篩選方法所檢測(cè)的前糖尿病狀態(tài)是一種狀態(tài)或情況即當(dāng)經(jīng)進(jìn)餐而糖流入血液時(shí)，血糖不能充分地吸收到外周組織中，例如骨骼肌、肝臟和脂肪組織，導(dǎo)致血糖水平上升，也就是葡萄糖耐量受損。此處，應(yīng)用本發(fā)明的受試者主要是人類，但可以包括哺乳動(dòng)物如牲畜和寵物。在本發(fā)明中，“受試者”包括這樣的哺乳動(dòng)物。
在對(duì)受試者篩選前糖尿病狀態(tài)的本發(fā)明方法中，測(cè)定從受試者采集的體液中D-甘露糖的濃度，將這濃度與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)值比較。而且，當(dāng)篩選進(jìn)行得更準(zhǔn)確時(shí)，就進(jìn)行測(cè)定D-甘露糖濃度和葡萄糖濃度，并且這些濃度分別與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)值比較。
作為上述的體液，可提及采集自受試者的尿液、血液或類似物。體液更可取的尤其是血液、血漿或血清，因?yàn)楫?dāng)使用它們時(shí)，血葡萄糖水平也可測(cè)定，更可取的是在禁食條件下采集的樣品。
根據(jù)受試者體液測(cè)定的D-甘露糖濃度來(lái)制定前糖尿病狀態(tài)的D-甘露糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值，可說(shuō)明如下首先，在體液中(更可取的是血液、血漿或血清)D-甘露糖濃度由許多健康人測(cè)定(更可取的是幾十個(gè)至幾百個(gè)人)，這些人根據(jù)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)初步判定既不是前糖尿病，也不是糖尿病；其次，正常范圍是由它們經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理而確定的，然后取這一正常范圍的上限或類似值。
這標(biāo)準(zhǔn)值可通過(guò)對(duì)許多受試者進(jìn)行初步的試驗(yàn)更準(zhǔn)確地確定。因此，在本發(fā)明中，從下述的例子估計(jì)，D-甘露糖濃度在血液中的標(biāo)準(zhǔn)值約為9μg/ml，盡管沒(méi)有特殊限制。這樣，在下述的例子中，D-甘露糖濃度在血液中低于9μg/ml被判定為正常，9μg/ml或以上被判定為前糖尿病狀態(tài)的疑似病例。
作為測(cè)定D-甘露糖濃度的方法，可用常規(guī)的方法。其中優(yōu)選能處理許多受試者的方法，特別優(yōu)選使用下述的篩選試劑。
此外，作為葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)值，優(yōu)選使用日本糖尿病學(xué)會(huì)的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(低于110mg/dL水平判定為正常型，110至125mg/dL為邊界型，126mg/dL或以上為糖尿病型)，它用作FBS標(biāo)準(zhǔn)。葡萄糖濃度可通過(guò)使用商業(yè)上可獲得的用于自動(dòng)分析儀或者類似設(shè)備的試劑來(lái)測(cè)定。
在下文，對(duì)于本發(fā)明的前糖尿病狀態(tài)的篩選方法將參照優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行解釋。
首先，在優(yōu)選禁食條件下按照常規(guī)的方式，采集受試者血液，更優(yōu)選在其后分離血漿或血清(在下文簡(jiǎn)稱為樣品)。這里，受試者意思是指所有的檢驗(yàn)前糖尿病狀態(tài)的人，包括健康人、疑似糖尿病和糖尿病患者。
然后，在電子受體例如輔酶NADP存在下，由一種經(jīng)脫氫作用對(duì)甘露糖具有氧化活性的酶例如己醛糖脫氫酶作用于這種樣品，定量地測(cè)定電子受體所生成的還原劑以便測(cè)出D-甘露糖濃度。而且，通過(guò)使用商業(yè)上可獲得的分析試劑，也可測(cè)出同一樣品中的葡萄糖濃度。
這樣所測(cè)得的血液中D-甘露糖濃度和葡萄糖濃度與各自的標(biāo)準(zhǔn)值比較，以判定受試者是否處在前糖尿病狀態(tài)。例如，作為結(jié)果的特異性判斷，受試者具有超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值的D-甘露糖濃度和在診斷標(biāo)準(zhǔn)正常范圍之內(nèi)的葡萄糖濃度，將被懷疑有葡萄糖耐量受損。因此，對(duì)這樣的受試者，建議使用75克口服葡萄糖耐量試驗(yàn)再檢驗(yàn)。
此外，對(duì)于葡萄糖濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值的受試者，葡萄糖耐量受損的概率很高，但是，即使在這種情況下，如果D-甘露糖濃度不超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值，可懷疑為短暫的血糖上升。在這樣的例子，在詢問(wèn)受試者有關(guān)膳食攝取等以求證實(shí)之后，判斷短暫的葡萄糖耐量受損的可能性。
如上所述，通過(guò)測(cè)定在禁食條件下血液中D-甘露糖濃度，對(duì)于當(dāng)只用FBS判斷時(shí)，幾乎不能被檢出的葡萄糖耐量潛在受損的人卻能很容易被檢出。而且，在血液中D-甘露糖濃度，當(dāng)與血中葡萄糖水平由于進(jìn)餐等所引起的波動(dòng)相比較時(shí)，顯示出很小的波動(dòng)。因此，對(duì)于懷疑為短暫的血糖上升的受試者，有可能從D-甘露糖濃度判斷血糖上升是否是短暫的。
此外，通過(guò)測(cè)定在禁食條件下血液中D-甘露糖濃度和葡萄糖濃度，并將它們各自分別與各自的標(biāo)準(zhǔn)值比較，就有要能檢測(cè)出具有葡萄糖耐量受損或糖尿病的受試者和只通過(guò)75克口服葡萄糖耐量試驗(yàn)才可被檢出的受試者(它的血中葡萄糖水平在葡萄糖耐量試驗(yàn)后2小時(shí)所測(cè)得的是140mg/dL或以上)。
其次將解釋對(duì)于前糖尿病狀態(tài)的上述篩選方法所使用的試劑。
在本發(fā)明中所用的酶不受特別的限制，只要它們?cè)陔娮邮荏w存在下經(jīng)脫氫作用對(duì)甘露糖有氧化活性。但是，更可取的是分類于EC1.1.1.119的酶。例如，具體地可提出的是NADP依賴性葡萄糖脫氫酶，它可從弱氧化醋桿菌(Acetobactersuboxydans)獲得的如在OKAMOTO的文章中所描述的(J.Biochem.5315)，1963，pp348-353)，NADP依賴性己醛糖脫氫酶，它可從蠟狀葡萄糖桿菌(Gluconibactercerinus)獲得，如在AViGAD等的文章中所描述的(J.Biol.Chem.243(8)，1968，PP1936-1941)，NAD依賴性己醛糖脫氫酶，如在DAHMS等的文章中所描述的(J.Biol.Chem.247(7)，1972，PP2222-2227)等。
在本發(fā)明中，上述的酶特別優(yōu)選的是己醛糖脫氫酶，它來(lái)自屬于Gluconobacter屬的微生物。作為屬于Gluconobacter屬的微生物，可提到的例如有，淺井氏葡糖桿菌Gluconobacter asaii，G.asaii IFO 3276，Gluconobacter cerinus(G.Cerinus)IFO 3267，弗尼葡糖桿菌Gluconobacter frateurii，G.frateurii IFO 3264，氧化葡糖桿菌Gluconobacter oxidans，G.oxydans IFO 14819等。為了獲取酶，首先，應(yīng)通過(guò)培養(yǎng)這些微生物從中收集細(xì)胞，用超聲波或其他設(shè)施破碎細(xì)胞，制備出破碎的溶液；然后，將所得的破碎的溶液精制，可使用以下技術(shù)的任何一種，或者如有需要聯(lián)合使用，例如硫酸銨分級(jí)，柱層析包括離子交換層析，疏水層析，羥基磷灰石凝膠、凝膠滲透等。
所用的甘露糖脫氫酶濃度并不特別受限制，但優(yōu)選是在0.1至100單位(u)/ml范圍，更可取的是1至10單位(u)/ml。這里，上述的1個(gè)酶單位定義為按下列方法測(cè)定，每分鐘生成1μmol NADPH所需的酶量。
即0.3ml和10mM的NADP，0.85ml的精制水和0.3ml的500mM的D-甘露糖與1.5ml的200mM的Tris-Hcl(pH9.0)混和，在37℃預(yù)培育5分鐘，然后0.05ml的樣品與這種預(yù)培育的溶液混和，在37℃開(kāi)始其反應(yīng)，在340nm處每分鐘測(cè)定吸光度的增加。作為空白，精制的水用于替代D-甘露糖。滴度通過(guò)以下公式測(cè)定，代入從用上述的測(cè)定方法測(cè)定的樣品和空白各自的吸光度。
公式1u/ml＝((ΔOD樣品/分鐘-ΔOD空白/分鐘)×3/(6.3×0.05))×稀釋倍率。
在本發(fā)明中，作為電子受體，可選擇性地挑選使用一種或二種或更多的輔酶，例如NAD和NADP，氧甲基吩嗪，甲基硫酸鹽(phenazine melhosulfate)二氯酚，靛酚、鐵氰化物等。特別優(yōu)選的是輔酶NADP。所用的電子受體濃度優(yōu)選在0.1至10mmol/L，更優(yōu)選0.5至2mmol/L。
此外，為了定量地測(cè)定電子受體的還原劑，可合并使用通過(guò)還原電子受體而顯色的一種顯色劑。這樣的顯色劑可選擇性地挑選，取決于所用的電子受體。例如，為了定量地測(cè)定NADPH這種輔酶NADP的還原劑，一種比色方法以甲基吩嗪甲基硫酸鹽或黃遞酶作為電子載體，并且讓四唑鹽與其共存，使生成的甲染料進(jìn)行比色測(cè)定。
而且，因?yàn)樵诒景l(fā)明中所用的甘露糖脫氫酶除了與甘露糖外也可與葡萄糖反應(yīng)，尤其是當(dāng)測(cè)定在生物樣品諸如血清或血漿中的甘露糖時(shí)，結(jié)果受葡萄糖不小的影響。因此，為了提高對(duì)生物樣品測(cè)定的精度，優(yōu)選合并使用葡萄糖清除劑。作為葡萄糖清除劑，優(yōu)選使用含有葡萄糖6-位磷酸化酶和ATP的清除劑。
作為葡萄糖6-位磷酸化酶，可提到的有葡萄糖激酶，己糖激酶等，并且商業(yè)上可獲得的酶也可使用，沒(méi)有特別限制，只要屬于EC2.7.1.2或EC2.7.1.1即可。更可取的是使用葡萄糖激酶，它對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出高度特異性。其用量取決于樣品中的葡萄糖量，但通常為0.1至50μ/ml。此外，對(duì)葡萄糖磷酸化所需的ATP量，取決于樣品中的葡萄糖量，通常是1至20mM。而且，為加速葡萄糖的磷酸化，通常鎂離子如無(wú)機(jī)或有機(jī)鹽應(yīng)含有大約5至50mM的量。為清除葡萄糖，葡萄糖磷酸化在20至50℃，pH6至10的緩沖液中進(jìn)行。更可取的是在25至37℃，加入后立即反應(yīng)約10分鐘。
而且，作為清除葡萄糖的方法，例如，采用葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶的常規(guī)方法也可使用。
作為本發(fā)明中所用的緩沖溶液，可用通常的pH6至10的緩沖液如磷酸鹽緩沖液，甘氨酸緩沖液、Tris-HCL緩沖液、Good氏緩沖液、硼酸緩沖液等。
作為在本發(fā)明中所用的前糖尿病狀態(tài)的篩選試劑，葡萄糖清除劑和用于定量測(cè)定的酶可分別混合。更具體化的試劑更可取的是由兩種試劑構(gòu)成，即第一種試劑包含電子受體和葡萄糖清除劑，第二種試劑包含甘露糖脫氫酶。
在將定量測(cè)定甘露糖的試劑加入樣品后，反應(yīng)就進(jìn)行，在反應(yīng)溶液中被還原的電子受體的測(cè)定，例如可通過(guò)測(cè)定在電子受體的還原劑的特異性吸收波長(zhǎng)的吸光度，或者測(cè)定經(jīng)電子受體還原劑所顯色的顯色劑的顯色強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。
其后，本發(fā)明將結(jié)合有關(guān)的實(shí)施例具體描述。然而，應(yīng)當(dāng)提及的是本發(fā)明絕不限于這些實(shí)施例。
酶的制備實(shí)施例(由Gluconobacter asaii制備己醛糖脫氫酶)Gluconobacter asaii(保管號(hào)No.IFO 3276，保管機(jī)構(gòu)Foundation，Institute forFermentation，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-Ku，Osaka-shi，Osaka，Japan)在含0.5％酵母浸膏和1％果糖的培養(yǎng)基中，于28℃搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)，接著經(jīng)離心收集細(xì)胞。細(xì)胞懸浮于20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)，用超聲波震蕩器在冰冷卻下處理，然后，通過(guò)離心分離后從破碎的溶液中除去細(xì)胞殘?jiān)?，得到粗酶熔液?br> 加硫酸銨粉未于這粗酶溶液中，溶于其中，使硫酸銨達(dá)30％飽和，蛋白沉淀經(jīng)離心分離移去。所得上清液上Batyl Toyopearl柱吸附酶，酶用含有30至0飽和度的量的硫酸銨的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗脫。
測(cè)定被洗脫的每一級(jí)分的酶活性，收集有活性的級(jí)分、活性的級(jí)分通過(guò)對(duì)20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)透析脫鹽。然后，該樣品上DEAE Toyopearl柱吸附酶，酶用含0至0.25M的NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗脫。
測(cè)定被洗脫的每一級(jí)分的酶活性，收集活性級(jí)分，并且，活性的級(jí)分對(duì)20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)透析脫鹽。然后，此樣品上羥基磷灰石柱吸附酶，酶用20至5mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗脫。被洗脫的各級(jí)分進(jìn)行酶活性測(cè)定并回收活性的級(jí)分，這將用作精制的酶溶液。
實(shí)施例對(duì)59人作為被懷疑是糖尿病的受試者進(jìn)行75克口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，血液取樣可在糖耐量(禁食狀態(tài))之前即該，或糖耐量之后，分別在30分鐘、60分鐘和120分鐘時(shí)進(jìn)行，使用血糖測(cè)定使用的血液采樣管。然后，分離血漿、在各血漿中的葡萄糖濃度用商業(yè)上可獲得的自動(dòng)分析儀“Pureauto S-GLU”(商品名，由Daiichi pureChemicals Co.，Ltd.制造)的試劑進(jìn)行測(cè)定。
另一方面，D-甘露糖濃度測(cè)定通過(guò)使用定量測(cè)定用的試劑包括下面提及的第一試劑和第二試劑進(jìn)行。即，256μl的第一試劑加入到8μl的每一血漿中，在37℃反應(yīng)5分鐘，然后，加入56μl的第二試劑，同樣在37℃反應(yīng)5分鐘。然后，吸光度通過(guò)用主波長(zhǎng)450nm和次波長(zhǎng)700nm的雙波長(zhǎng)兩點(diǎn)檢測(cè)法來(lái)測(cè)定。這些操作是用Hitachi 7150型自動(dòng)分析儀進(jìn)行的。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以水溶液的形式使用，商業(yè)上獲得的D-甘露糖。而且，對(duì)于可能在這測(cè)定系統(tǒng)中引起測(cè)定誤差如溶血作用的樣品，獨(dú)立制備空白試劑，在第二試劑中除去己醛糖脫氫酶，并且同時(shí)測(cè)定相關(guān)的樣品，然后，所得的非特異性顯色從特異顯色中減去，以校正測(cè)定誤差。
第一試劑125mM Tris-Hcl緩沖液1.25mM NADP1.25％Tweenzo6.25u/ml黃遞酶12.5u/ml葡萄糖激酶10mM ATP2mM醋酸鎂(pH8.5)第二試劑20mM磷酸鹽緩沖液23u/ml己醛糖脫氫酶(在上述制備實(shí)施例中所得的酶)(pH7.0)測(cè)定結(jié)果示于圖1。
即，從75克口服葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果看，受試者依照日本糖尿病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)判定為三組即正常型，邊界型和糖尿病型。結(jié)果受試者24人判定為正常型，15人為邊界型，20人為糖尿病型。在圖1中，判定為正常型的人用◆表示，判定為邊界型的人用O表示、判定為糖尿病型的人用×表示。
另一方面，在圖1中，縱座標(biāo)軸代表D-甘露糖濃度，橫座標(biāo)軸代表在葡萄糖耐量前即該的血漿中葡萄糖濃度(在禁食條件下血糖水平FBS)，并標(biāo)繪出相應(yīng)的受試者。
FBS低于110mg/dL水平分類為正常型，110至125mg/dL水平分類為邊界型，126mg/dL或以上水平分類為糖尿病型。僅用FBS分類，正常型是46人，邊界型是7人，糖尿病型是6人。
而且，在本實(shí)例中，D-甘露糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)值是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，依照日本糖尿病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，從判定為正常型24人的D-甘露糖濃度計(jì)算而得。具體地假定判定為正常型的24人的D-甘露糖濃度顯示正態(tài)分布，估計(jì)健康人正常值范圍是“平均值±2SD”，健康人正常值范圍是6.6±2.4μg/ml，計(jì)算得上限是9μg/ml。此外，計(jì)算得這上限的95％置信區(qū)間是7.3至10.7μg/ml?？墒?，在這實(shí)施例中，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)值是9μg/ml作為上限。
結(jié)果，受試者13人超過(guò)FBS標(biāo)準(zhǔn)值，110mg/dl的，且根據(jù)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的結(jié)果判定為邊界型或糖尿病型，他們中有10人超過(guò)血漿中D-甘露糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值。也就是發(fā)現(xiàn)能夠用FBS檢出的邊界型或糖尿病受試者的70-80％也能夠用D-甘露糖濃度測(cè)定檢出。
而，按FBS的結(jié)果被判定為正常型的46人，包含按口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的結(jié)果被分類為邊界型或糖尿病型即懷疑是葡萄糖耐量受損的22人。雖然這些受試者是處在邊界型狀態(tài)或糖尿病型狀態(tài)，但是，在初次試驗(yàn)只使用FBS的常規(guī)診斷系統(tǒng)中他的仍被分類為正常型而漏檢。然而，按照在使用血漿由D-甘露糖濃度的本發(fā)明，就發(fā)現(xiàn)上述22個(gè)受試者中有8人超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值。
另一方面，對(duì)于在FBS和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)兩者都分類為正常型的24個(gè)受試者(圖1中◆)，證實(shí)無(wú)1人血漿中D-甘露糖濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值。
從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過(guò)測(cè)定血漿中D-甘露糖濃度，有可能高概率地檢出或查明患有輕度葡萄糖耐量受損的邊界型受試者，也就是這些受試者是處于前糖尿病狀態(tài)，由于他們自身的正常FBS值，至少一直被漏檢。
工業(yè)可應(yīng)用性如上文提及，本發(fā)明提供一種前糖尿病狀態(tài)的篩選方法，用此方法有可能更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定型糖尿病病人和葡萄糖耐量輕度受損的前糖尿病病人，這些人通過(guò)禁食條件下的常規(guī)測(cè)定方法使用血糖值，很容易被漏檢。因此，有可能在早期發(fā)現(xiàn)葡萄糖耐量輕度受損等的前糖尿病受試者，在早期階段用藥物或其他手段適當(dāng)?shù)闹委?，以使阻止向糖尿病進(jìn)展，并且進(jìn)一步監(jiān)檢治療過(guò)程。
而且，通過(guò)將本發(fā)明的篩選方法加入到目前到用的糖尿病檢驗(yàn)方法中，有可能應(yīng)用本發(fā)明構(gòu)建全面的糖尿病診斷系統(tǒng)，例如，做一組檢驗(yàn)項(xiàng)目的測(cè)定，并開(kāi)發(fā)用于此這目的的軟件等。
此外，因?yàn)楸景l(fā)明的前糖尿病狀態(tài)的篩選試劑有一個(gè)簡(jiǎn)單的反應(yīng)系統(tǒng)，就能夠很容易地應(yīng)用于各種自動(dòng)分析儀并適合于處理許多試驗(yàn)樣品。
權(quán)利要求
1.前糖尿病狀態(tài)的篩選方法，所述方法包括在采自受試者的體液中測(cè)定D-甘露糖濃度，并將D-甘露糖濃度與預(yù)先確定的D-甘露糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值比較。
2.前糖尿病狀態(tài)的篩選方法，所述方法包括在采自受試者的體液中測(cè)定D-甘露糖濃度和葡萄糖濃度，并將D-甘露糖濃度與預(yù)先確定的D-甘露糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值比較；將葡萄糖濃度與預(yù)先確定的D-葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)值比較。
3.如權(quán)利要求1或2所述的前糖尿病狀態(tài)的篩選方法，其特征在于，所述體液是在禁食條件下的受試者的血液、血漿或血清。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的前糖尿病狀態(tài)的篩選方法，其特征在于，所述D-甘露糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)值是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理D-甘露糖濃度所得的上限，D-甘露糖濃度是通過(guò)在禁食條件下測(cè)定從健康受試者采集的血液、血漿或血清獲得的。
5.前糖尿病狀態(tài)的篩選試劑，所述試劑包含在電子受體存在下通過(guò)脫氫作用對(duì)甘露糖具有氧化活性的一種酶和對(duì)該酶有用的電子受體。
6.如權(quán)利要求5所述的篩選試劑，其特征在于所述篩選試劑還包含葡萄糖清除劑。
7.如權(quán)利要求5或6所述的篩選試劑，其特征在于所述酶是分類為EC1.1.1.119是葡萄糖脫氫酶。
8.如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的篩選試劑，其特征在于，所述酶是來(lái)自葡糖桿菌屬微生物的己醛糖脫氫酶。
9.如權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的篩選試劑，其特征在于，所述葡萄糖清除劑包括葡萄糖6-位磷酸化酶和三磷酸腺苷。
10.如權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的篩選試劑，其特征在于，所述電子受體是作為輔酶的氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種篩選方法，通過(guò)該法，前糖尿病狀態(tài)能夠更準(zhǔn)確地確定，并能夠?qū)Σ∪藷o(wú)身體麻煩地處理許多試驗(yàn)樣品，以及用于該法的診斷試劑。通過(guò)測(cè)定從受試者采集的體液中的D－甘露糖濃度，更可取的是D－甘露糖濃度和葡萄糖濃度，將它們與其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)值比較，就能檢出前糖尿病狀態(tài)的病人。而且，甘露糖濃度的測(cè)定是通過(guò)在電子受體存在下使具有氧化活性的酶對(duì)樣品中的甘露糖脫氫而進(jìn)行的，并且定量地測(cè)定電子受體的生成的還原劑。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1502043SQ0280654
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月15日
發(fā)明者曾根博仁, 山田信博, 海老沼宏幸, 齋藤和典, 典, 博, 宏幸 申請(qǐng)人:第一化學(xué)藥品株式會(huì)社, 曾根博仁, 山田信博