專利名稱：Vegf多態(tài)性和抗血管發(fā)生療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本申請涉及與抗血管發(fā)生療法有關(guān)的人類疾病和病癥的治療。具體 而言，本發(fā)明涉及癌癥的抗血管發(fā)生療法，其或是單獨施用的或是與其它抗癌療法組合 施用的。
背景技術(shù)：
癌癥仍然是人類健康的最致命威脅之一，在美國每年影響超過1百萬新患者。 實體瘤對那些死亡大多負有責(zé)任。雖然某些癌癥的醫(yī)學(xué)治療取得了顯著進展，但是當前 的治療方法相對沒有選擇性手術(shù)切除患病組織；放射療法縮小實體瘤；及化學(xué)療法殺 死正在快速分裂的細胞。這些治療方法可導(dǎo)致眾多副作用，在有些情況中嚴重到限制可 給予的劑量并如此排除潛在有效藥物的使用。血管發(fā)生是重要的細胞事件，其中血管內(nèi)皮細胞增殖、消減和重新組織，從而 從現(xiàn)有的血管網(wǎng)絡(luò)形成新血管。血管發(fā)生對于大多數(shù)原發(fā)瘤的生長及其后續(xù)轉(zhuǎn)移是至關(guān) 重要的。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，也稱作VEGF-A或血管通透因子(VPF)，被 報道成正常和異常血管發(fā)生二者的樞軸調(diào)節(jié)物。Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18 4-25 ； Ferrara (1999) J.Mol.Med.77 527-543?？筕EGF 抗體“貝伐單抗”(Bevacizumab)，也稱作 “BV”、 “rhuMAbVEGF”、或“Avastin ，，，是依照 Presta et al. (1997)Cancer Res.57 4593-4599
生成的一種重組人源化抗VEGF單克隆抗體，當前在美國獲得批準用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸 直腸癌、非小細胞肺癌、和轉(zhuǎn)移性乳腺癌。與其它癌癥治療方法一樣，Avastin 療法與 某些副作用有關(guān)，包括升高的高血壓的風(fēng)險。當特定基因中的不同等位基因?qū)е虏煌硇蜁r，群體中存在遺傳多態(tài)性。此類 多態(tài)性可以在決定治療性藥物的功 效和安全性中發(fā)揮作用。例如，已經(jīng)顯示了 VEGF中 的特定多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病率有關(guān)。Schneider et al. (2008) Breast Cancer Research and Treatment 111 157—63。別的預(yù)示特定療法的功效或安全性的多態(tài)性的鑒定可用于更好地為那些會最佳 地受益于該療法的患者調(diào)整該療法。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于VEGF中如下的多態(tài)性的鑒定，所述多態(tài)性在正在經(jīng)歷抗VEGF 療法(包括用Avastin )的患者中預(yù)示升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性和/或 升高的高血壓的風(fēng)險。一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測患者是否處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選選自VEGF(-1498C/ Τ)和VEGF(_634G/C)的基因組多態(tài)性，其中若相應(yīng)的基因型包含VEGF(_1498C)或 VEGF(_634G)，則患者處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險。在一些實 施方案中，所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體，例如貝伐單抗。在一些實施方案中，所 述治療進一步包括施用抗腫瘤組合物。在一些實施方案中，所述患者正在治療癌癥，例 如乳腺癌。另一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)測患者是否處于升高的與VEGF拮抗劑治療 有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的試劑盒，包括對VEGF中選自下組的多態(tài)性特異性的第一寡核苷 酸和第二寡核苷酸VEGF(_1498C/T)和VEGF(_634G/C)。在一些實施方案中，所述 試劑盒中的所述寡核苷酸對于擴增VEGF中包含這些多態(tài)性之一的區(qū)域是有用的。另一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗 劑治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選VEGF(_2578C/A)或 VEGF(-1154G/A)處的基因組多態(tài)性，其中若相應(yīng)的基因型包含VEGF(-2578AA)或 VEGF(1154AA)，則患者具有升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性。在一些實施方 案中，所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體，例如貝伐單抗。在一些實施方案中，所述治 療進一步包括施用抗腫瘤組合物。在一些實施方案中，所述患者正在治療癌癥，例如乳 腺癌。另一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)測患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗劑 治療的可能性的試劑盒，包括對VEGF中選自下組的多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第 二寡核苷酸VEGF(_2578C/A)和VEGF(_1154G/A)。在一些實施方案中，所述試劑盒 中的所述寡核苷酸對于擴增VEGF中包含這些多態(tài)性之一的區(qū)域是有用的。發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物 學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這 些技術(shù)在文獻中有充分解釋，諸如“Molecular Cloning ALaboratory Manual”，第二版 (Sambrook et al.，1989) ； “Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait 編，1984); "Animal Cell Culture”(R.I.Freshney 編，1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.) ； "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M.Ausubel et al.編，1987，及其周期 性的更新)；“PCR: The Polymerase Chain Reaction”(Mullis et al.編，1994)。除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常的理解具有相同的含義。以下文獻為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請中所使用的許 多術(shù)語的——般性指導(dǎo)Singleton et al.， Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第 二版，J.Wiley&Sons (New York，N.Y. 1994)，和 March，Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure,第四版，John Wiley&Sons (New York, N.Y.1992)。通過述及完整收錄本文中所引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)。定義如本文中所使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”、“該”包括復(fù) 數(shù)，除非上下文另有明確說明。例如，“一個/種”細胞還會包括“多個/種細胞”。術(shù)語“包含”意圖指組合 物和方法包括所敘述的要件，但是不排除其它要件。
術(shù)語“VEGF”和“VEGF-A”可互換使用，指165個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞 生長因子及相關(guān)的121個、189個和206個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子，如Leung et al.，Science 246 1306(1989)和Houck et al.，Mol.Endocrin.5 1806(1991)所述，及其天 然存在等位形式和加工形式。術(shù)語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮 細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請中可能通過例如
“VEGF(8-109)，，、"VEGF (1-109)"或 “VEGF165” 來鑒別任何此類形式的 VEGF。 “截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然 VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短 的天然VEGF具有與天然VEGF相當?shù)膶DR和Flt-I受體的結(jié)合親和力?！癡EGF抗體”指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。優(yōu)選的是，本發(fā) 明的抗VEGF抗體可在靶向和干擾其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患時用作治療劑?？?VEGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其 它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。優(yōu)選的抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1結(jié)合相同表位的單克隆抗體。更優(yōu)選的是， 抗VEGF抗體是依照Presta etal.，Cancer Res.57 4593-4599(1997)生成的重組人源化抗 VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為bevacizumab(貝伐單抗；BV; Avastin )的抗 體?！癡EGF拮抗劑”指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性， 包括其與一種或多種VEGF受體的結(jié)合的分子。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗 原結(jié)合片段、受體分子及特異性結(jié)合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結(jié)合的衍生 物、抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，包括單克隆抗體(包括全長的或完整的單克隆抗 體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要 它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即 構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗 體是高度特異性的，針對單一抗原。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同 抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單 克隆”不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克 隆抗體可通過最初由Kohler etal.，Nature 256 495 (1975)記載的雜交瘤方法來制備，或 者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利No.4,816,567)。 “單克隆抗體”還 可使用例如 Clackson etal.，Nature 352 624-628 (1991)或 Marks et al.，J.Mol.Biol.222 581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離?！安“Y”指任 何會受益于使用抗體的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾 病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制 性例子包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì) 細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔病癥；及炎癥疾病、血管發(fā) 生性疾病和免疫學(xué)病癥。術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中，治療有效量的藥物可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度 的減緩，優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)腫 瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥 狀。根據(jù)藥物可阻止現(xiàn)有癌細胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制 性的和/或細胞毒性的 。對于癌癥療法，體內(nèi)功效可以通過例如評估總體存活(OS)、無 進展存活(PFS)、距疾病進展的時間(TTP)、響應(yīng)率(RR)、響應(yīng)持續(xù)時間、和/或生活 質(zhì)量來測量?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早 就患有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)控 的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病。此 類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺 癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)、 胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀 胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾 液腺癌、腎癌(kidney or renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺 癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各種類型的頭和頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/ 濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級 彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性 NHL>貯積病(bulky disease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特 倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞 性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥 (PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs) 綜合征有關(guān)的異常血管增殖。術(shù)語“抗腫瘤組合物”指在治療癌癥中有用的組合物，其包含至少一種能夠抑 制或阻止腫瘤生長或功能和/或引起腫瘤細胞破壞的活性治療劑。適合在抗腫瘤組合物 中用于治療癌癥的治療劑包括但不限于化療劑、放射性同位素、毒素、細胞因子諸如干 擾素、和靶向細胞因子、細胞因子受體或與腫瘤細胞有關(guān)的抗原的拮抗劑。優(yōu)選的是， 所述治療劑是化療劑?！盎焺敝冈诎┌Y治療中有用的化學(xué)化合物。“分離的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與多肽核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至 少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的 形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分 離的核酸分子包括通常表達該多肽的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在 所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。術(shù)語“多態(tài)性”指基因的序列中在群體內(nèi)變化的位置。多態(tài)性由不同的“等 位基因”構(gòu)成。這樣的多態(tài)性的位置通過其在基因中的位置及在那里找到的不同堿基來 鑒別。例如，VEGF-1498C/T指示VEGF基因中第-1498位處有C和T之間的變異。 這兩種可能的變體(C和T)是兩種不同等位基因。因為基因型由兩種分開的等位基因構(gòu)成，所以在任何一名個體中 可觀察到數(shù)種可能變體之任一(例如，這個例子是CC、CT、 或 TT)。術(shù)語“基因型”指細胞或組織樣品中某種基因的特定等位基因。在上文的例子 中，CC、CT>或TT是VEGF-1498C/T多態(tài)性處可能的基因型。術(shù)語“樣品”包括取自患者的細胞或組織樣品。例如，樣品可包括腫瘤樣品、 與腫瘤類型對應(yīng)的正常組織的樣品、取自腫瘤周圍區(qū)域的組織樣品、或血細胞。樣品中特定基因型的鑒定可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法任一來實施。 例如，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，通過克隆等位基因并對它測序，可實現(xiàn)多態(tài)性的鑒定。 或者，可以自基因組DNA擴增基因序列，例如使用PCR，并對產(chǎn)物測序。下文描述了用 于對患者DNA分析給定遺傳基因座處突變的數(shù)種非限制性方法?？墒褂肈NA微陣列技術(shù)，例如DNA芯片裝置和用于高通量篩選應(yīng)用的高密度 微陣列和低密度微陣列。用于制作微陣列的方法是本領(lǐng)域已知的，而且包括各種噴墨 (inkjet)和微量噴射沉積(microjet deposition)或點樣(spotting)技術(shù)和工藝、原位或芯片 上光刻(photolithographic)寡核苷酸合成工藝、和電子DNA探針尋址工藝。DNA微陣列 雜交應(yīng)用已經(jīng)在基因表達分析及短串聯(lián)重復(fù)(STR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、點突變的 基因型分析領(lǐng)域中成功應(yīng)用。別的方法包括干擾RNA微陣列及微陣列與其它方法諸如激 光捕捉顯微解剖(LCM)、比較性基因組雜交(CGH)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChiP)的組合。 參見例如 He et al. (2007) Adv.Exp.Med.Biol.593 117-133 和 Heller (2002) Annu.Rev.Biomed. Eng.4 129-153。其它方法包括PCR、xMAP、侵入者測定法、質(zhì)譜術(shù)、和焦磷酸測序 (Wang et al. (2007) 593 105-106)。另一種檢測方法是使用與多態(tài)性位點交疊且在多態(tài)性區(qū)域周圍具有約5個、或 約10個、或約20個、或約25個、或約30個核苷酸的探針的等位基因特異性雜交。例 如，將能夠特異性雜交至等位變體的數(shù)種探針附著至固相支持物，例如“芯片”?？梢?通過多種工藝(包括平板印刷術(shù)(lithography))將寡核苷酸結(jié)合至固體支持物。使用這些 包含寡核苷酸的芯片(也稱作“DNA探針陣列”)的突變檢測分析記載于例如Cranin et al. (1996) Human Mutation7 244。在其它檢測方法中，必須首先至少擴增基因的一部分，之后鑒定等位變體。擴 增可通過例如PCR和/或LCR或本領(lǐng)域公知的其它方法來實施。在一些情況中，來自受試者的DNA中特定等位基因的存在可通過限制酶分析來 顯示。例如，特定核苷酸多態(tài)性可導(dǎo)致包含限制性位點的核苷酸序列，該限制性位點在 其它等位變體的核苷酸序列中不存在。在又一個實施方案中，可使用針對切割劑(諸如核酸酶、羥胺或四氧化鋨及哌 啶)的保護來檢測RNA/RNA、DNA/DNA、或RNA/DNA異源雙鏈體中的錯配堿基(參 見例如Myers et al. (1985) Science 230 1242)。一般而言，“錯配切割”技術(shù)如下開始， 即提供通過將包含基因等位變體核苷酸序列的對照核酸(任選經(jīng)過標記的，例如RNA或 DNA)與自組織樣品獲得的樣品核酸(例如RNA或DNA)雜交而形成的異源雙鏈體。用 切割雙鏈體中單鏈區(qū)的試劑處理雙鏈的雙鏈體，其中雙鏈體諸如基于對照和樣品鏈間堿 基對錯配形成的雙鏈體。例如，可以用RNA酶處理RNA/DNA雙鏈體、用Sl核酸酶處理 DNA/DNA雜合物以酶促消化錯配區(qū)域?；蛘?，可以用羥胺或四氧化鋨及哌啶處理DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈體以消化錯配區(qū)域。在消化錯配區(qū)域后，在變性聚丙烯酰胺凝膠 上根據(jù)大小將所得材料分開以確定對照和樣品核酸是否具有相同核苷酸序列或它們有哪 些核苷酸不同。參見例如美國專利 No.6,455,249 ； Cotton et al. (1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 4397 ； Saleeba et al. (1992) Meth.Enzymol.217 286-295。電泳遷移率的改變也可用于鑒定特定等位變體。例如，可使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP)來檢測突變型與野生型核酸之間的電泳遷移率差異(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad.Sci USA 86 2766 ； Cotton (1993) Mutat.Res.285 125-144 和 Hayashi (1992) Genet. Anal.Tech.Appl.9 73-79)。將樣品和對照核酸的單鏈DNA片段變性并讓其復(fù)性。單鏈核 酸的二級結(jié)構(gòu)隨序列而變化，所得電泳遷移率改變能夠檢測甚至單個堿基的變化。DNA 片段可以標記或用經(jīng)過標記的探針檢測。通過使用RNA(而非DNA)，其中二級結(jié)構(gòu)對 序列中的變化更加敏感，可增強該測定法的靈敏度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該方 法基于電泳遷移率變化利用異源雙鏈體分析將雙鏈異雙鏈體分子分開(Keen et al.(1991) Trends Genet.7 5)。等位變體的身份還可如下獲得，即分析包含多態(tài)性區(qū)域的核酸在含有變性劑 梯度的聚丙烯酰胺凝膠中的移動，這使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)來測定(Myerset al. (1985)Nature 313 495)。當使用DGGE作為分析方法時，會修飾DNA以確保它不會 完全變性，例如通過PCR添加解鏈溫度高的、富含GC的DNA的大約40bp的GC夾。 在另一個實施方案中，使用溫度梯度代替變性劑梯度以鑒定對照和樣品DNA的遷移率差 異(Rosenbaum 和 Reissner (1987) Biophys.Chem.265 1275)。用于檢測2條核酸間至少一個核苷酸的差異的技術(shù)的例子包括但不限于選擇性 寡核苷酸雜交、選擇性擴增、或選擇性引物延伸。例如，可以制備寡核苷酸探針，其中 將已知的多態(tài)性核苷酸放置在中心(等位基因特異性探針)，然后在只在找到完美匹配才 容許雜交的條件下雜交至靶 DNA(Saiki et al. (1986)Nature 324 163) ； Saiki et al. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 6230)。此類等位基因特異性寡核苷酸雜交技術(shù)可用于檢測 基因多態(tài)性區(qū)域中的核苷酸變化。例如，將具有特定等位變體核苷酸序列的寡核苷酸附 著至雜交膜，然后將此膜與經(jīng)過標記的樣品核酸雜交。然后，對雜交信號的分析會揭示 樣品核酸的核苷酸的身份。或者，可以與本發(fā)明組合使用依賴于選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技 術(shù)。作為引物用于特異性擴增的寡核苷酸可以在分子的中心中(使得擴增依賴于差異 雜交)(Gibbs et al. (1989)Nucl.Acids Res. 17 2437-2448)或在一條引物的 3，末端盡頭 處(在適宜的條件下，可防止錯配或縮短聚合酶延伸)(Prossner(1993)Tibtech 11 238 禾口 Newton et al. (1989)Nucl.Acids Res. 17 2503)攜帶感興趣等位變體。此技術(shù)也稱作
“PROBE”，即探針寡聚物堿基延伸(Probe Oligo Base.Extension)。另夕卜，可能想要在 突變區(qū)域中引入新的限制性位點以創(chuàng)建基于切割的檢測(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell. Probes 6 1)。在另一個實施方 案中，等位變體的鑒定使用寡核苷酸連接測定法(OLA)來進 行，如例如美國專利 Νο.4,998,617 及 Laridegren，U.et al.Science241 1077-1080 (1988) 中所記載的。OLA方案使用設(shè)計成能夠雜交至靶物單鏈鄰接序列的兩種寡核苷酸。將 所述寡核苷酸之一連接至分離標志，例如生物素化的，并可檢測標記另一寡核苷酸。如果在靶分子中找到精確互補的序列，那么所述寡核苷酸會雜交，使得它們的末端鄰近， 并創(chuàng)建連接底物。然后連接容許經(jīng)過標記的寡核苷酸使用親合素或其它生物素配體來回 收。Nickerson，D.A.等人描述了組合PCR和OLA特性的核酸檢測測定法(Nickerson， D.A.etal. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 8923-8927)。在此方法中，使用 PCR 來實現(xiàn) 靶DNA的指數(shù)擴增，然后使用OLA來檢測。本發(fā)明提供用于檢測VEGF中單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法。因為單核苷酸多 態(tài)性側(cè)翼為不變序列的區(qū)域，所以它們的分析只需要檢測單個變異核苷酸的身份，而且 不必為每名患者測定完整基因序列。已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種方法來推動SNP的分析。通過使用專門化外切核酸酶抗性核苷酸，可檢測單堿基多態(tài)性，如例如美國專 利Νο.4,656,127中所披露的。依照該方法，容許與緊挨多態(tài)性位點3’的等位序列互補 的引物雜交至自特定動物或人獲得的靶分子。如果靶分子上的多態(tài)性位點含有與存在的 特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互補的核苷酸，那么該衍生物會摻入到雜交引物的末 端上。此類摻入使得引物對外切核酸酶有抗性，并由此容許其檢測。因為樣品中外切核 酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物變得對外切核酸酶有抗性的發(fā)現(xiàn)揭示靶分子 的多態(tài)性位點中存在的核苷酸與反應(yīng)中使用的核苷酸衍生物互補。此方法的優(yōu)點在于它 不需要測定大量的無關(guān)序列數(shù)據(jù)。一種基于溶液的方法也可用于測定多態(tài)性位點的核苷酸的身份 (W091/02087)。如上所述，采用與緊挨多態(tài)性位點3’的等位序列互補的引物。該方 法使用經(jīng)過標記的雙脫氧核苷酸衍生物來測定該位點的核苷酸的身份，如果與多態(tài)性位 點的核苷酸互補的話，該雙脫氧核苷酸衍生物會摻入到所述引物的末端上。一種備選方法記載于WO 92/15712。此方法使用經(jīng)過標記的終止物和與多態(tài)性 位點3’的序列互補的引物的混合物。所摻入的經(jīng)過標記的終止物由所評估的靶分子的 多態(tài)性位點中存在的核苷酸決定且與該核苷酸互補。該方法通常是異相測定法，其中將 引物或靶分子固定化至固相。用于測定DNA中多態(tài)性位點的許多其它引物指導(dǎo)核苷酸摻入規(guī)程已有記 載(Komher，J.S.et al. (1989)Nucl.Acids.Res.l7 7779-7784 ； Sokolov, B.P.(1990) Nucl.Acids Res. 18 3671 ； Syvanen, A-C., et al. (1990) Genomics8 684—692; Kuppuswamy, M.N.et al. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA88 1143-1147 ； Prezant, T.R.et al.(1992)Hum.Mutat.l 159-164 ； Ugozzoli, L.et al. (1992) GATA 9 107-112 ； Nyren, P.et al. (1993) Anal.Biochem.208 171-175)。這些方法都依賴于摻入經(jīng)過標記的脫氧核苷 酸以區(qū)分多態(tài)性位點處的堿基。此外，可以理解，上述任何用于檢測多態(tài)性變體或基因產(chǎn)物或基因改變的方法 可用于監(jiān)測療程或療法。本文所述方法可以通過例如利用預(yù)包裝的診斷試劑盒來實施，諸如下文所描述 的那些，其包含至少一種探針或引物核酸，它們可方便地用于例如測定受試者是否處于 形成與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險。供上述診斷和預(yù)后方法中使用的樣品核酸可以自任何細胞類型或受試者組織獲 得。例如，可以通過已知技術(shù)獲得受試者的體液(例如血液)?；蛘撸梢詫Ω蓸悠?例 如毛發(fā)或皮膚)實 施核酸測試。
本文所述發(fā)明涉及用于測定和鑒定VEGF基因座處存在的等位基因的方法和組 合物。此信息對于預(yù)測形成與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險水平是有用的。探 針可用于直接測定樣品的基因型，或者可以與擴增同時或序貫使用。術(shù)語“探針”包括 天然存在的或重組的單鏈或雙鏈核酸或化學(xué)合成的核酸。它們可以通過切口平移(nick translation)、Klenow補平反應(yīng)、PCR或本領(lǐng)域知道的其它方法來標記。本發(fā)明的探針、 它們的制備和/或標記記載于Sambrook et al. (1989)見上文。探針可以是適 合于選擇性 雜交至含有本發(fā)明多態(tài)性區(qū)域的核酸的任何長度多核苷酸。所使用的探針的長度會部分 取決于所使用的測定法的性質(zhì)和所采用的雜交條件。經(jīng)過標記的探針還可以與多態(tài)性的擴增聯(lián)合使用(Holland et al. (1991)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88 7276-7280)。美國專利No.5,210,015記載了用于在PCR期間提供擴增
產(chǎn)物實時測量的基于熒光的辦法。此類辦法或是采用嵌入染料(諸如溴化乙啶)來指示存 在的雙鏈DNA的量，或是采用含有熒光-淬滅劑對的探針(也稱作“Taq-Man”法)， 其中探針在擴增期間遭到切割以釋放熒光分子，其濃度與存在的雙鏈DNA的量成正比。 在擴增期間，當雜交至靶序列時，探針受到聚合酶的核酸酶活性的消化，從而釋放熒光 分子，與淬滅劑分子分開，由此引起來自報告分子的熒光出現(xiàn)。Taq-Man法使用與靶多 核苷酸含有多態(tài)性的區(qū)域退火的含有報告分子_淬滅劑分子對的探針。可以將探針附著于表面，以用作“基因芯片”。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的多 種技術(shù)，此類基因芯片可用于檢測遺傳變異。在一種技術(shù)中，在基因芯片上排列寡核苷 酸，通過以雜交法進行的測序，諸如美國專利No.6,025,136和6,018,041中概述的，用于 測定DNA序列。還可以將本發(fā)明的探針用于遺傳序列的熒光檢測。此類技術(shù)已有記載， 例如美國專利No.5,968,740和5,858,659。還可以將探針附著于電極表面，用于核酸序列 的電化學(xué)檢測，諸如美國專利No.5,952,172及Kelley，S.O.et al. (1999)Nucl.Acids Res.27 4830-4837中所記載的。另外，可修飾用于探針或引物的分離的核酸以使其變得更加穩(wěn)定。例示性的修 飾的核酸分子包括DNA的氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphothioate) 和甲基膦酸酯(methylphosphonate)類似物(還可參見美國專利No.5,176,996 ； 5,264,564 和 5,256,775)。如上所述，本發(fā)明還提供用于測定VEGF中存在的多態(tài)性區(qū)域的等位變體類型 的診斷方法。在一些實施方案中，所述方法使用包含與該VEGF多態(tài)性區(qū)域互補的核苷 酸序列的探針或引物。因而，本發(fā)明提供用于實施這些方法的試劑盒。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于測定受試者是否處于形成與VEGF拮抗劑 治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的試劑盒。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于測定受試者是 否具有受益于抗VEGF療法的較大可能性的試劑盒。此類試劑盒含有一種或多種上文所 述組合物和使用說明書。僅作為例子，本發(fā)明還提供用于測定患者是否處于形成與VEGF 拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的試劑盒，包含對例如下述VEGF多態(tài)性區(qū)域特異性的 第一和第二寡核苷酸VEGF(-2578C/A)、VEGF(-1498C/T)、VEGF(_1154G/A)或 VEGF(_634G/C)。又例如，本發(fā)明還提供用于確定受試者是否具有受益于抗VEGF療法 的較大可能性的試劑盒，包含對例如下述VEGF多態(tài)性區(qū)域特異性的第一和第二寡核苷 酸VEGF(_2578C/A)或VEGF(_1154G/A)。 “對(遺傳基因座)特異性的”寡核苷酸結(jié)合所述基因座的多態(tài)性區(qū)域或在所述基因座的多態(tài)性區(qū)域的附近結(jié)合。對于要用作擴 增引物的寡核苷酸，若引物足夠接近以用于生成包含多態(tài)性區(qū)域的多核苷酸，則說它們 是附近的。在一個實施方案中，若寡核苷酸在距離多態(tài)性約l_2kb內(nèi)，例如少于Ikb結(jié) 合，則說它們是附近的。特異性的寡核苷酸能夠雜交至序列，而且在合適的條件下會不 結(jié)合相差單個核苷酸的序列。 試劑盒可包含至少一種能夠特異性雜交至VEGF多態(tài)性區(qū)域的探針或引物和使 用說明書。所述試劑盒通常包含至少一種上文所述核酸。用于擴增VEGF至少一部分的 試劑盒一般包含兩種引物，其中至少一種能夠雜交至等位變體序列。此類試劑盒適合于 通過例如熒光檢測、電化學(xué)檢測、或其它檢測來檢測基因型。試劑盒中所包含的寡核苷酸(用作探針或引物)可以可檢測標記。標記物可以 直接(例如熒光標記物)或間接檢測。間接檢測可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何檢測 方法，包括生物素-親合素相互作用、抗體結(jié)合等等。熒光標記的寡核苷酸還可包含淬 滅分子。寡核苷酸可結(jié)合至表面。在一些實施方案中，所述表面是硅土或玻璃。在一 些實施方案中，所述表面是金屬電極。本發(fā)明的其它試劑盒包含實施所述測定法所必需的至少一種試劑。例如，所述 試劑盒可包含酶。或者，所述試劑盒可包含緩沖液或任何其它必需試劑。試劑盒可包括本文中為測定受試者在VEGF多態(tài)性區(qū)域中的基因型而描述的所 有或一些陽性對照、陰性對照、試劑、引物、測序標志物、探針和抗體。下面的實施例僅僅意圖例示本發(fā)明的實踐，而非作為限制而提供。通過述及明 確收錄將本文中所引用的所有專利和科學(xué)文獻的完整公開內(nèi)容。
實施例實施例1 : VEGF中的遺傳多態(tài)性及它們與后果的關(guān)聯(lián)E2100是一項III期組間試驗，其在將貝伐單抗添加至帕利他塞(paclitaxel)來治 療具有先前未治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的女性時證明了無進展存活(PFS)和響應(yīng)率(RR)的改 善。在接受貝伐單抗的女性中看到了顯著更多的高血壓和蛋白尿。樣品我們對來自E2100乳腺癌Avastin試驗的數(shù)據(jù)實施了回顧測試。該數(shù)據(jù)集包括 673名符合條件的患者及623例疾病進展事件和483例死亡。其中，我們對來自363例符 合條件的病例(隨訪中值43個月)的石蠟包埋腫瘤塊測定了基因型。另外，377例符合 條件的病例可用于VEGF IHC,而341例可用于VEGFR-2IHC。所有標本是在沒有患者 標識符或臨床結(jié)果信息的情況中“盲”分析的。多態(tài)性表1顯示了我們所測試的多態(tài)性。表1 所測試的單核苷酸多態(tài)性(SNP)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測患者是否處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的方法， 包括對自所述患者分離的樣品篩選VEGF(_1498C/T)處的基因組多態(tài)性，其中若相應(yīng)的 基因型包含VEGF(_1498C)，則患者處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險。
2.—種預(yù)測患者是否處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的方法，包 括對自所述患者分離的樣品篩選VEGF(_634G/C)處的基因組多態(tài)性，其中若相應(yīng)的基 因型包含VEGF(_634G)，則患者處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述患者正在用VEGF拮抗劑治療癌癥。
6.權(quán)利要求5的方法，進一步包括施用抗腫瘤組合物。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
10.權(quán)利要求8的方法，進一步包括施用抗腫瘤組合物。
11.一種用于預(yù)測患者是否處于升高的與VEGF拮抗劑治療有關(guān)的高血壓的風(fēng)險的 試劑盒，包括對VEGF中選自下組的多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸 VEGF (-1498C/T)和 VEGF (-634G/C)。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸可用于擴增包 含VEGF中選自下組的多態(tài)性的部分VEGF基因VEGF (-1498C/T)禾Π VEGF (-634G/ C)。
13.一種預(yù)測患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性的方法，包括對 自所述患者分離的樣品篩選VEGF(_2578C/A)處的基因組多態(tài)性，其中若相應(yīng)的基因型 包含VEGF (-2578AA)，則患者具有升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性。
14.一種預(yù)測患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性的方法，包括對 自所述患者分離的樣品篩選VEGF(_1154G/A)處的基因組多態(tài)性，其中若相應(yīng)的基因型 包含VEGF(_1154AA)，則患者具有升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
17.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述患者用VEGF拮抗劑治療癌癥。
18.權(quán)利要求17的方法，進一步包括施用抗腫瘤組合物。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。
22.權(quán)利要求20的方法，進一步包括施用抗腫瘤組合物。
23.—種用于預(yù)測患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗劑治療的可能性的試 劑盒，包括對VEGF中選自下組的多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸 VEGF (-2578C/A)和 VEGF (-1154G/A)。
24.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸可用于擴增包含VEGF中選自下組的多態(tài)性的部分VEGF基因VEGF (-2578C/A)禾Π VEGF (-1154G/ A)。
全文摘要
通過對自患者分離的樣品篩選特定基因組多態(tài)性，確定患者是否處于與抗VEGF療有關(guān)的高血壓的特定風(fēng)險或是否具有較大可能性受益于抗VEGF療法的方法。
文檔編號G01N33/50GK102016579SQ200880125826
公開日2011年4月13日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者喬治·W·斯萊奇, 布賴恩·P·施奈德, 米蘭·拉多維科 申請人:健泰科生物技術(shù)公司