專利名稱：活性微生物的偵測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用包封在多孔溶膠—凝膠的玻璃中的有機或無機物質(zhì)來快速偵測及計算低濃度活性微生物的方法及其混合物。
背景技術(shù)：
微生物偵測研究的主要目的在于發(fā)展便宜、快捷、可靠和靈敏的偵測器。現(xiàn)時已有可偵測微生物的標準實驗室程序，大部份程序基于利用瓊脂媒體，在一段時間內(nèi)讓指定微生物在其中生長。正常培養(yǎng)期為24至48小時，微生物繁殖后便可進行識別和量化。
現(xiàn)有測試的主要弊端在于得到結(jié)果所需的時間。水源染菌令水源和系統(tǒng)關(guān)閉，因此需使用其它更昂貴的水源供應，需要快速的微生物偵測以容許較短的關(guān)閉期。在醫(yī)學界，任何需要使用抗生素藥物的醫(yī)療情況都需要進行細菌識別和抗生素敏感測試，但測試結(jié)果需要72至96小時才能得到，縮短這段時間可達至更佳結(jié)果，并能令病人更早康復。在飲食業(yè)，原料和制成品都會進行常規(guī)染菌測試，測試所需的培養(yǎng)時間令實時處理過程無法進行，以致延遲貨品的生產(chǎn)和供應，縮短測試所需時間可節(jié)省結(jié)構(gòu)和人手。
過去幾年發(fā)展出幾種能在1.5至11.0小時內(nèi)識別和計算細菌的方法。較為簡單的方法需要大量細菌(在一毫升樣本內(nèi)多于104)，而可以偵測小量細菌的方法則昂貴、又不能應用于大型系統(tǒng)。
US 5,811,251公開了一種以電荷藕合組件(CCD)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的活性微生物計算系統(tǒng)，但這個系統(tǒng)只能提供細菌的總數(shù)，而不能分辨不同的細菌種類。US5,972,641和US 5,518,894公開一種用統(tǒng)計方法來確定細菌數(shù)量的快速大腸桿菌測試系統(tǒng)，該等方法用于低數(shù)量細菌時需要多達11小時才能得到結(jié)果。其它專利公開用熒光和激光光源來偵測微生物的方法(US 5,891,394、US 5,858,697、US5,763,203、US 5,751,839和US 5,663,057)，該等方法的缺點是需用昂貴的激光光源，而且直接在不平滑的過濾器上偵測微生物在分析時引起問題。另外，這些系統(tǒng)不可輕易攜帶，價錢亦較昂貴。
免疫測定法亦用于偵測某類微生物(Lee et al.，App.Environ.Microbiol.，Vol.56，pp.1541-1546)。這些方法利用以熒光或放射性染料標示的指定抗體來偵測微生物。不過，免疫測定法的限制在于其需要為每種欲偵測微生物生產(chǎn)抗體，以致需時甚久，而且價錢昂貴。
「溶膠—凝膠」指在室溫以金屬氧化物為基礎(chǔ)所生產(chǎn)的無機玻璃，其工序涉及一些陶瓷性物料，令溶膠(液態(tài))經(jīng)過水解、凝聚及聚合過程轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。一般溶膠—凝膠的起始物料為有機改性硅鹽(ormosils)或金屬氧化物。近年溶膠—凝膠已應用到有機硅烷中來創(chuàng)造「室溫玻璃」。溶膠—凝膠性物料以數(shù)十埃至數(shù)十納米的小孔所組成，并具有大的面積質(zhì)量比例，例如每克數(shù)百平方米。溶膠—凝膠物料即使在紫外線波長下都是透明的，并可簡易地造成不同形狀，如粉末、單塊、薄片、纖維等。
利用溶膠—凝膠物料在矩陣媒體中包封有機分子的方法曾在現(xiàn)有文獻中提及(Avnir et al.，Supramolecular architecture in two and three dimensions Bein T.(ed.)American Chemical Society Symposium Series XXX，1992)。應用上述技術(shù)，有機分子在室溫下會被包封在溶膠—凝膠矩陣之中，并且不會損害較敏感的有機分子結(jié)構(gòu)。加上，被包封的分子保留了接近全部的原本物理和化學特征，而溶膠—凝膠的大量小孔系統(tǒng)亦令外界的反應物可與之接觸。
US專利號6,022,748公開一種利用分析物選擇性粘結(jié)至某平面而產(chǎn)生的顏色變化以直接偵測分析物的方法。所述偵測方法在固定化生物聚合物料中進行，該物料以溶膠—凝膠方法包封在金屬氧化玻璃之中，這種方法的缺點在于只可偵測或計算大量細菌，因為只有大量細菌才能在溶膠—凝膠中引起可看見的顏色改變。再者，所述方法不能分辨活性微生物及非活性微生物，因為該方法只是基于微生物粘結(jié)在溶膠—凝膠表面的情況，與所述微生物為活性或非活性沒有關(guān)系。
Armon et al.(J.of Biotechnology 51，279-285)公開了一種偵測大量大腸桿菌(E.coli)的方法，該方法把細菌散布在涂上指定混合物的溶膠—凝膠上，所述混合物會被細菌吸收，令細菌發(fā)出特定波長的光。不過，這種方法不能提供一種適合計算指定樣本中細菌數(shù)量的方法，而且亦不能偵測低數(shù)量微生物。
現(xiàn)有技術(shù)未能提供一種既快速、又有足夠靈敏度在低微生物濃度的情況下可靠計算微生物數(shù)量的方法。
本發(fā)明的目的在于提供一種快速及靈敏的偵測活性微生物的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于計算低濃度樣本中微生物數(shù)量的方法及其混合物。
本發(fā)明的其它目的及長處會在以下說明中顯示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在2小時內(nèi)以包封在多孔溶膠—凝膠的玻璃中的有機或無機物質(zhì)(以下簡稱為標記)來偵測及計算濃度低于103ml-1的活性微生物。
本發(fā)明涉及利用包封在多孔溶膠—凝膠的玻璃中的有機或無機物質(zhì)(標記)來偵測及計算活性微生物的方法及其混合物。微生物使所述標記新陳代謝，從而發(fā)出可偵測到的輻射、電磁或熒光，因此，活性微生物可快速地在溶膠—凝膠玻璃上呈現(xiàn)。溶膠—凝膠玻璃的表面極度平滑和透明，能提供接近統(tǒng)一的焦點作高解像的顯微掃描。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，會進行以下步驟a)提供一種液態(tài)混合物，其包含一種或以上包封在液態(tài)溶膠—凝膠前體中的標記；b)在透明薄片上，例如玻璃片上，加上一層薄而均勻、為所述液態(tài)溶膠—凝膠前體混合物的涂層；c)將被分析的液態(tài)樣本倒進過濾器以分出微生物，然后把所述過濾器緊貼涂上溶膠—凝膠的薄片；d)把上述過濾器和上述涂上溶膠—凝膠的薄片放置在適合助長微生物吸收標記的溫度，如攝氏35至44度，一起培養(yǎng)一段時間，如0.5至6小時；e)以外界能源照射上述涂上溶膠—凝膠的薄片，以產(chǎn)生從微生物使標記新陳代謝過程中發(fā)放可偵測的訊號；及f)取得上述從微生物發(fā)出可偵測訊號的圖象，并以電子計算機系統(tǒng)分析所述圖象，從而識別和計算所述微生物。
本發(fā)明亦關(guān)于一種含有機或無機物質(zhì)的液態(tài)溶膠—凝膠混合物(標記)的制備方法。所述標記會為要識別的微生物新陳代謝。
本發(fā)明可偵測的大腸桿菌為一大組別的細菌，包括大腸桿菌(E.coli)、腸肝菌屬(Enterobacter spp.)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella spp.)和檸檬酸細菌屬(Citrobacter spp.)。識別大腸桿菌，可利用呈熒光或顯色物質(zhì)，即3-羰基傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(3-carboxyumbelliferylβ-D-galactopyranoside/CUG)或4-氯甲基-6，8-二氟傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-chloromethyl-6，8-difluoroumbelliferylβ-D-galactopyranoside/CMDiFUG)，來偵測酵素，即β-半乳糖酵素(β-Galactosidase/E.C.3.2.1.23)的活動。
根據(jù)本發(fā)明，識別大腸桿菌(E.coli)，可利用下列呈熒光或顯色物質(zhì)4-甲基傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-methylumbelliferylβ-D-galactopyranoside/MUG)、二β-D-半乳糖嘧喃糖熒光素(fluorescein diβ-D-galactopyranoside/FDG)、6，8-二氟-4-甲基傘形酮β-D-葡萄糖-酸鋰鹽(6，8-difluoro-4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide，lithium salt/DiFMUGGIcU)、2-十二烷基resorufin(2-dodecylresorufin)、Elf-97、二β-葡萄糖-酸熒光素(fluorescein di-β-glucoronide/FDGIcU)、5-(五氟苯氨基)二β-D-葡萄糖-酸熒光素(5-(pentafluorobenzoylamino)fluorescein di-β-D-glucoronide/PFB-FDGIcU)和β-三氟甲基傘形酮β-D-葡萄糖-酸(β-trifluoromethylumbelliferylβ-D-glucoronide)，來偵測大腸桿菌指定酵素(E.coli-specific-enzyme)，即β-葡萄糖酸酵素(β-Glucuronidase/GUS/EC 3.2.1.31)的活動。
根據(jù)本發(fā)明另一項優(yōu)選實施例，把一種抗生素物料與溶膠—凝膠混合物結(jié)合，以識別細菌對抗生素的抵抗力。細菌在某特定抗生素存在的環(huán)境下仍能發(fā)出熒光，表示所述細菌可抵抗抗生素。當某特定抗生素的存在令部份發(fā)出熒光的細菌數(shù)量減低，便表示細菌有部份抵抗力。下列抗生素會加入溶膠—凝膠混合物氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、鏈霉素、多粘菌素、萘啶酸、新生霉素、三甲基芐二氨嘧啶、Rifanapicin和青霉素。
根據(jù)本發(fā)明，標記可為以下列形式脂質(zhì)體、薄膜、多層物、辮子狀、片晶體、螺旋狀、管狀、及纖維狀、溶劑化桿、溶劑化卷、以及其組合。根據(jù)本發(fā)明，把丙酮酸鹽或硫酸鉀結(jié)合溶膠—凝膠，有可能偵測受損或受壓的微生物?，F(xiàn)有技術(shù)指出丙酮酸鹽或硫酸鉀可用作恢復或改善氯化受損大腸菌(＂enumeration anddifferentiation of chlorine-stressed total coliform bacteria＂Robert A Duncanson-Ph.D.dissertation-University of Rhode Island 1993)。
根據(jù)本發(fā)明，在溶膠—凝膠溶液加入濃度介乎每百萬10至100份的聚賴氨酸或相似物質(zhì)，有可能增進細菌吸收力。
以下優(yōu)選實施例更具體地說明本發(fā)明的上述及其它特征及其優(yōu)點，但本發(fā)明不受這些實施例所限制。


圖一顯示根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的識別和計算微生物系統(tǒng)；圖二為一幅在溶膠—凝膠表面的大腸桿菌(E.coli bacteria)放大四百倍的熒光照片；圖三為本發(fā)明優(yōu)選實施例的過程流程表。
具體實施例方式
根據(jù)一優(yōu)選實施例，計算細菌的系統(tǒng)包括圖一所示的下列部件配合電子計算機的標準影象擷取器、處理及控制軟件、以及馬達和光源控制儀器—全部以(1)標示，配以影象播放速率為30fps及影幅大小為640×480的標準電荷藕合組件數(shù)組(CCDarray)照相機(2)，以及配以放大400倍及/或1000倍功能及自動對焦系統(tǒng)的外熒光或熒光顯微鏡(3)，光源(4)，光線分散器(5)，機動x-y桌(6)，以及放在桌上的過濾器(7)。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例，標準電荷藕合組件(CCD)系統(tǒng)被電荷藕合組件連線方法(CCD Line Approach)取替，其包括一個電荷藕合組件連線(CCD line)相機，其線大小為512像素，線速率為70kHz，相等于每秒135格512×512像素、特制訊號同步化硬件、特制數(shù)碼或模擬訊號處理硬件。
為求清楚，并協(xié)助理解本發(fā)明，以下將采用下列簡稱CFU菌落形成單位MUG4-甲基傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-methylumbelliferylβ-D-galactopyranoside)FDG二β-D-半乳糖嘧喃糖熒光素(fluorescein di-β-D-galactopyranoside)CUG3-羰基傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(3-carboxyumbelliferylβ-D-galactopyranoside)例1預備涂上溶膠—凝膠玻璃薄片把標準顯微鏡用的薄片在肥皂水中溫和地搖晃三十分鐘，以作清洗。然后先以水喉水沖洗薄片，再以三重蒸餾水沖洗。把薄片放在培養(yǎng)器內(nèi)以攝氏36度隔夜風干。把潔凈過的薄片存放在軟的紙中備用。
預備溶膠—凝膠薄片的標準起始溶液如下把0.9毫升純吡啶、0.2毫升CUG溶液(100mM)和0.1毫升水以一塊小磁鐵攪拌一分鐘。如果基質(zhì)未能完全溶解，便只使用混合物的上面部份。把0.8毫升上述溶液和0.4毫升甲基三甲氧基硅烷(methyltrimethoxysilane/MTMS，F(xiàn)luka)混和。再以磁鐵攪拌器把所述溶液攪拌2分鐘。要開始化學反應，在所述溶液中加入30μl 0.1摩爾的鹽酸，再以磁鐵攪拌五分鐘。
利用精細吸移管把40μl的上述溶液涂在薄片上。溶液以旋轉(zhuǎn)涂復法均勻地涂在薄片上。然后把已涂溶液的玻璃薄片置在黑暗、干燥的室溫環(huán)境中風干24小時。在初部風干程序后，以錫紙包好有涂上溶膠—凝膠的薄片，并儲存于清涼的地方。
例二使用0.1毫升濃度為0.016mg/ml的4′-6-二氨基-2-苯基-吲哚(4′-6-diamino-2-phenylindole)溶液重復例一。所得結(jié)果與例一相若。
例三大腸桿菌(E.coli)識別及計算在攝氏36度的營養(yǎng)發(fā)酵液中，在24小時內(nèi)，大腸桿菌(E.coli)細菌生長。用滅菌蒸餾水準備約每毫升108細菌濃度的種菌溶液。以下列預計細菌濃度，準備一系列不同的溶液(每份溶液為350毫升)每100毫升109細菌，每100毫升108細菌，每100毫升107細菌，每100毫升106細菌，每100毫升105細菌。
所有細菌溶液在水樣下進行平行膜濾(MF)測試查證，在滅菌塑料瓶中以滅菌蒸餾水稀釋溶液，以準確達到1∶108的稀釋度。
為了在某一樣本中計算細菌數(shù)目，水樣先以微孔過濾器(0.47μm，13mm)過濾。然后把微孔過濾器倒轉(zhuǎn)放在溶膠—凝膠表面。為了要令過濾器和溶膠—凝膠彼此完全接觸，過濾器表面會加上小量滅菌水(10μl)和壓力(達每平方厘米0.5公斤)。
然后，細菌和溶膠—凝膠會在攝氏36度的濕潤容器(由一個大皮氏培養(yǎng)皿和濕潤的Wattman墊組成，以防止過濾器干燥而與溶膠—凝膠分離)一起培養(yǎng)兩小時。之后，拿走微孔過濾器，薄片則在攝氏44.5度擺放10至15分鐘風干。
為計算細菌，溶膠—凝膠薄片會在顯微鏡系統(tǒng)(配以外熒光照明系統(tǒng)和50瓦水銀燈的Zeiss Axiolab)下以LP420過濾器放大400倍。為淘汰可能造成錯誤陽性結(jié)果的自然熒光藻類，會使用指定光波長(例如LP420過濾器)。
熒光點的照片會在涂上溶膠—凝膠薄片的5個不同的隨機位置拍攝。圖二為溶膠—凝膠表面上的大腸桿菌(E.coli)細菌放大400倍的圖片。熒光點的數(shù)目會以圖像處理軟件(Image-Pro Plus，Media Cybernetics)計算。表一顯示分析得出的數(shù)目。
表一


由于已知顯微鏡的視象范圍，每塊薄片的熒光點數(shù)目能準確估計原本溶液中的細菌最初數(shù)量。
例四以Image-Pro Plus計算熒光點數(shù)目的算法說明此例說明偵測及計算溶膠—凝膠圖像上的細菌的算法。本算法的目的在于偵測預期大小的明亮斑點采用低通行的過濾以減少高頻率噪音，利用圖像分割得出黑色背景上白色細菌斑點的二元圖像，此圖像分割以簡單的界限應用程序，并利用固定的預早設定界限進行。
分析包括以下步驟A)把二元圖像標記，以造成一列小塊物體，亦即是可能被標為細菌的候選物。
B)計算該列小塊組件的幾何特性(面積、對比等)。
C)淘汰大小及對比不在預期范圍內(nèi)的候選物。
D)計算幾何過濾后余下的候選物。
圖三表示上述算法的流程例子，其中包括以下階段第一階段低通行的過濾以減少高頻率噪聲。
第二階段利用圖像分割以得出黑色背景上白色細菌斑點的二元圖像，此圖像分割以簡單的界限應用程序，并利用固定的預早設定界限進行。如有需要，可采用自動和/或動態(tài)的界限計算。
第三階段把二元圖像標記，以造成一列小塊物體，亦即是可能被標為細菌的候選物。
第四階段計算該列小塊組件的幾何特性(面積、對比等)。
第五階段淘汰大小及對比不在預期范圍內(nèi)的候選物。
第六階段計算幾何過濾后余下的候選物。
為說明本發(fā)明，上述皆為指定的實施例，但實際上本發(fā)明可為有經(jīng)驗的技術(shù)人員所應用，而得出不離開本發(fā)明精神及不超越本發(fā)明權(quán)利范圍的多種改進、變動和改編。
權(quán)利要求
1.一種偵測及計算活性微生物的方法，包括a)提供一種液態(tài)混合物，其包含一種或以上包封在液態(tài)溶膠—凝膠前體中的標記；b)在透明薄片上，例如玻璃片上，加上一層薄而均勻、為所述液態(tài)溶膠—凝膠前體混合物的涂層；c)將被分析的液態(tài)樣本倒進過濾器以分出微生物，然后把所述過濾器緊貼涂上溶膠—凝膠的薄片；d)把上述過濾器和上述涂上溶膠—凝膠的薄片放置在適合助長微生物吸收標記的溫度，一起培養(yǎng)一段時間；e)以外界能源照射上述涂上溶膠—凝膠的薄片，以產(chǎn)生為微生物所吸收的標記所發(fā)放可偵測的訊號；及f)取得上述從微生物發(fā)出可偵測訊號的圖象，并以電子計算機系統(tǒng)分析所述圖象，從而識別和計算所述微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述微生物為細菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述能源為可見的光、熒光、紫外光、紅外線、電磁場、聲納、超聲波、無線電波、或輻射短波。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述微生物與水、奶、食物、唾液、尿液、喉嚨分泌物測試、創(chuàng)傷、痰、胃物及排泄物分隔。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其特征在于所述標記由3-羰基傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(3-carboxyumbelliferylβ-D-galactopyranoside)、4-氯甲基-6，8-二氟傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-chloromethyl-6，8-difluoroumbelliferylβ-D-galactopyranoside)、4-甲基傘形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-methylumbelliferylβ-D-galactopyranoside)、二β-D-半乳糖嘧喃糖熒光素(fluorescein diβ-D-galactopyranoside)、6，8-二氟-4-甲基傘形酮β-D-葡萄糖-酸鋰鹽(6，8-difluoro-4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide lithium salt)、2-dodecylresorufin、Elf-97、二β-葡萄糖酸熒光素(fluorescein di-β-glucuronide)、5-(五氟苯氨基)二β-D-葡萄糖-酸熒光素(5-(pentafluorobenzoylamino)fluorescein di-β-D-glucuronide)和β-三氟甲基傘形酮β-D-葡萄糖-酸(β-trifluoromethylumbelliferylβ-D-glucuronide)中選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其特征在于所述標記由所依附或連結(jié)的抗生素物質(zhì)組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的混合物，其特征在于所述抗生素在氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、鏈霉素、多粘菌素、萘啶酸、新生霉素、三甲基芐二氨嘧啶、Rifanapicin和青霉素中選擇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其特征在于所述標記可為以下列形式脂質(zhì)體、薄膜、多層物、辮子狀、片晶體、螺旋狀、管狀、及纖維狀、溶劑化桿、溶劑化卷、以及其組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的混合物，其特征在于其包含吡啶或硫酸鉀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其計算的微生物數(shù)目少于103ml-1。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述薄片和過濾器會一起在介乎攝氏35至44度的溫度下培養(yǎng)0.5至6小時。
12.用以識別和計算微生物的系統(tǒng)，包括一個標準影像擷取器、一個電荷藕合組件數(shù)組(CCD array)照相機、一個顯微鏡、一個機動x-y桌、一個自動對焦系統(tǒng)和一個熒光光源。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其特征在于所述影像擷取器播放速率為每秒30幀，而影像的大小為640×480像素。
14.利用包含一種或多種標記的多孔溶膠—凝膠玻璃以識別和計算活性微生物，即本說明書所說明的。
全文摘要
偵測及計算活性微生物的方法。提供一種液態(tài)混合物，其包含一種或以上包封在液態(tài)溶膠－凝膠前體中的標記。在透明薄片涂上一層薄而均勻的液態(tài)溶膠－凝膠前體混合物，將樣本通過過濾器，把微生物從液態(tài)樣本分開，以作分析，然后把過濾器緊貼涂上溶膠－凝膠的薄片，將過濾器和涂上溶膠－凝膠的薄片放置在適合助長微生物吸收標記的溫度，一起培養(yǎng)一段時間，以外界能源照射涂上溶膠－凝膠的薄片，以產(chǎn)生為微生物所吸收的標記所發(fā)放可偵測的訊號，取得從微生物發(fā)出可偵測訊號的圖象，并以電子計算機系統(tǒng)分析圖象，從而識別和計算微生物。
文檔編號C12Q1/06GK1481440SQ01818622
公開日2004年3月10日 申請日期2001年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月9日
發(fā)明者艾域殊桑, 珍雅迪羅賓, 羅賓 申請人:拜可彰光學有限公司