專利名稱：基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)及相關(guān)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到基因芯片的雜交，標(biāo)記，洗脫，信號(hào)檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析技術(shù)。
基因芯片是近幾年來(lái)剛剛興起的基因分析技術(shù)，它是利用平行分析原理將大量不同序列的核酸分子，作為分析樣品中靶基因的基因探針，以高密度陣列的方式固化在硅片，玻璃，尼龍膜等基質(zhì)上，從而制作成通常意義上的基因芯片，或稱為基因微陣列，微方陣(1-2)。經(jīng)過(guò)短短幾年的迅猛發(fā)展，為了滿足不同的市場(chǎng)需要，在平行分析思想的指導(dǎo)下，基因芯片已衍生出各種不同的表現(xiàn)形式，如美國(guó)Affymetrix公司(3)寡聚核苷酸芯片(4)，Genomic Solutions(5)公司，Incyte(6)公司，上海聯(lián)合基因科技集團(tuán)(7)等生產(chǎn)的玻璃基因芯片(8)，用于基因表達(dá)譜的研究(9)、疾病診斷與治療、新藥研究和環(huán)境保護(hù)(4，8)。由美國(guó)的Nanogen(10)，Aclara(11)，Motorola(12)等公司生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室芯片(Lab-on-a-chi補(bǔ)骨脂素(PS)，)以及基因膜方陣等。上述各種芯片在集成度，特異性，靈敏度，過(guò)程自動(dòng)化等諸多方面各有千秋。
基因芯片應(yīng)用技術(shù)發(fā)展到當(dāng)今，作為最實(shí)用，最方便的一種，玻璃DNA芯片以其特異性，制造成本，規(guī)模或小批量基因芯片內(nèi)容安排的靈活性與生產(chǎn)效率，從而為最廣大的科研和工業(yè)界所采用，成為應(yīng)用中的主流。這種基因芯片的制造技術(shù)已趨成熟，國(guó)內(nèi)制造成本已可降低到普及化程度。我國(guó)已掌握了先進(jìn)的優(yōu)質(zhì)基因芯片點(diǎn)陣技術(shù)，點(diǎn)制的基因芯片集成度可達(dá)每只基因芯片(18mm×36mm)16800個(gè)基因點(diǎn)，多種化學(xué)表面修飾(7)。而且這種基因芯片的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)正逐漸在國(guó)際社會(huì)確立，其產(chǎn)品的批間穩(wěn)定性和批內(nèi)重復(fù)性已可得到很好控制?；蛐酒蚱渥畲蟮氖袌?chǎng)--臨床診斷等實(shí)用領(lǐng)域--普及應(yīng)用的大舉挺進(jìn)似乎已萬(wàn)事俱備，正蓄勢(shì)待發(fā)。然而，從全球范圍來(lái)講，基因芯片在實(shí)用領(lǐng)域里的應(yīng)用方面并沒(méi)有像預(yù)想的那樣樂(lè)觀和迅速發(fā)展。綜觀各種形式的基因芯片應(yīng)用系統(tǒng)，可以發(fā)現(xiàn)它們總在如下某個(gè)或若干方面的暴露出缺陷(1)基因芯片生化操作步驟繁雜，對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高在基因芯片使用中，基因分離，純化，標(biāo)記，PCR，雜交，洗脫，信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理等諸多復(fù)雜技術(shù)過(guò)程使得基因芯片仍然只有訓(xùn)練有素而且理論素養(yǎng)較高的專業(yè)科研人員才能掌握。而在廣闊的實(shí)用領(lǐng)域，如醫(yī)療診斷，食品，藥品等衛(wèi)生檢疫，法學(xué)鑒定等，一般從業(yè)人員難以達(dá)到專業(yè)科研人員的技術(shù)水平；(2)儀器和運(yùn)行(指試劑盒，基因芯片等耗材價(jià)格)成本高；(3)檢測(cè)靈敏度低，不能滿足檢測(cè)微量病毒和研究大量低豐度基因的實(shí)際要求等；
(4)系統(tǒng)集成化，自動(dòng)化程度低，多以單個(gè)功能產(chǎn)品形式出現(xiàn)，如檢測(cè)儀，判讀儀，雜交儀等，難以提高用戶的時(shí)效和方便程度；(5)所采用的基因芯片存在各自的問(wèn)題寡聚核苷酸芯片基因密度高但假陽(yáng)性也高；芯片實(shí)驗(yàn)室功能集成度高，特異性好而密度太低，而且還不適合于規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；玻璃基因芯片基因密度高，特異性好，適合規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，而配套硬件系統(tǒng)的功能過(guò)程自動(dòng)化程度低等等。
綜合分析一下，基因芯片在實(shí)用領(lǐng)域中的推廣普及應(yīng)用要求每一種基因芯片應(yīng)用系統(tǒng)必須同時(shí)滿足下面的所有必要條件(1)系統(tǒng)所采用的基因芯片必須特異性好，基因密度高，生產(chǎn)效率高，制造成本低，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模生產(chǎn)，并能達(dá)到足夠高的穩(wěn)定性和重復(fù)性，(2)系統(tǒng)本身必須功能集成度高，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)易，系統(tǒng)硬件及試劑盒成本低，介面友好，功能強(qiáng)大，技術(shù)性能穩(wěn)定，(3)系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度必須達(dá)到足夠高水平，可以滿足絕大多數(shù)用戶的對(duì)分析靈敏度的要求，(4)最后，充足的基因資源是所有基因芯片及其面向各實(shí)用領(lǐng)域的配套處理系統(tǒng)挺進(jìn)相應(yīng)市場(chǎng)的先決條件(面向科研和制藥工業(yè)的基因芯片系統(tǒng)除外)。
除了最后一點(diǎn)依賴于人類基因組計(jì)劃和后人類基因組計(jì)劃的逐步完成之外，其他三個(gè)方面都是對(duì)基因芯片及其處理系統(tǒng)本身的要求。就本人的了解來(lái)看，在全球范圍內(nèi)，目前尚無(wú)任何一種基因芯片處理體系可以同時(shí)符合上述要求。因此，同時(shí)滿足上述所有要求的基因芯片處理系統(tǒng)成為目前國(guó)際基因芯片技術(shù)領(lǐng)域的首要之務(wù)，同時(shí)也是基因芯片事業(yè)發(fā)展的瓶頸所在。
本發(fā)明的目的，從技術(shù)上講，就是提供一套大幅度提升玻璃基因芯片檢測(cè)靈敏度，經(jīng)濟(jì)實(shí)用性和可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化運(yùn)行的技術(shù)方法系統(tǒng)，并在最后提供一種實(shí)現(xiàn)上述功能的設(shè)備及試劑盒。其宗旨就在于提供基因芯片在社會(huì)各領(lǐng)域普及應(yīng)用所需要的基礎(chǔ)分子生物學(xué)處理，信號(hào)檢測(cè)及結(jié)果分析系統(tǒng)，配套試劑盒及實(shí)用的基因芯片雜交室2。
本發(fā)明率先在基因芯片處理技術(shù)中采用聚苯乙烯熒光微球作為標(biāo)記物進(jìn)行分子信號(hào)放大，具體方法可以如下(1)將聚苯乙烯熒光微球通過(guò)共價(jià)鍵連接特異性地標(biāo)記到基因芯片表面已雜交的雙鏈核酸分子上；(2)或通過(guò)將樣品中待分析的核酸連接到聚苯乙烯熒光微球上，用攜帶目標(biāo)基因的聚苯乙烯熒光微球直接與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交，最后經(jīng)過(guò)洗脫等過(guò)程后進(jìn)行光學(xué)激發(fā)和信號(hào)檢測(cè)。這種通過(guò)聚苯乙烯熒光微球的信號(hào)放大技術(shù)可以大大提高對(duì)基因芯片的檢測(cè)靈敏度并降低其對(duì)高精度光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的要求，乃至通過(guò)零下10度到零下15度冷卻CCD即可實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)的水平。再者，由于通過(guò)了信號(hào)放大，簡(jiǎn)化了基因芯片分子生物學(xué)的技術(shù)處理步驟，尤其是省去了DNA擴(kuò)增的PCR過(guò)程，使整個(gè)過(guò)程可以通過(guò)溫度，光和各種流體的程序化控制實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，去除了各步驟人工操作帶來(lái)的不確定性，同時(shí)也使實(shí)驗(yàn)人員從冗繁膩味的，程序性的，機(jī)械的操作中解放出來(lái)。更重要的是，該技術(shù)的采用還避免了由PCR技術(shù)過(guò)程給基因芯片分析本身所帶來(lái)的特異性差，難以定量，技術(shù)操作難度大等致命問(wèn)題。
本發(fā)明還首度采用了表面等離子體共振(SPR)信號(hào)激發(fā)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)背景光的完全屏蔽，提高信噪比，進(jìn)一步改進(jìn)了信號(hào)檢測(cè)效果。
本發(fā)明還在基因芯片的雜交，標(biāo)記，洗脫等過(guò)程中全面引入了程序化交變電磁場(chǎng)作用，用于加快上述過(guò)程的效率，縮短過(guò)程所需時(shí)間。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)不僅在于提高了基因芯片檢測(cè)靈敏度，處理時(shí)效，降低成本，同時(shí)還使非專業(yè)技術(shù)人員經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)短操作培訓(xùn)或指導(dǎo)，可以利用這種高度自動(dòng)化的設(shè)備進(jìn)行高水平和高效率的基因分析。這一切都為基因芯片的普及化應(yīng)用提供了技術(shù)推動(dòng)力。
本發(fā)明從總體上分為1.基因芯片技術(shù)處理(雜交，標(biāo)記，洗脫，光化反應(yīng)等)系統(tǒng)-HCL儀及HCL試劑盒19部分，2.基因芯片光學(xué)檢測(cè)(含新型基因芯片)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，3.基因芯片雜交室2，4.自動(dòng)化全系統(tǒng)集成-GC基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)，5.智能芯片診斷用戶介面，利用多元信號(hào)數(shù)據(jù)融合技術(shù)或多因素?cái)?shù)據(jù)回歸技術(shù)對(duì)臨床診斷中基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)的工作原理本發(fā)明通過(guò)聚苯乙烯熒光微球?qū)蛐酒想s交了的雙鏈核酸進(jìn)行特異性標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。HCL儀是將基因芯片檢測(cè)以前所要經(jīng)過(guò)的雜交，標(biāo)記，洗脫等前處理步驟實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作及控制的設(shè)備，在HCL儀中運(yùn)行的所有生化試劑及各種溶液統(tǒng)稱為HCL試劑盒19?；蛐酒?jīng)過(guò)HCL儀處理之后，將通過(guò)信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)才能最終得到我們所要的檢測(cè)結(jié)果。加上最后兩個(gè)部分合稱基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)(GC)。下面就各個(gè)子系統(tǒng)進(jìn)行分述。
HCL試劑盒19HCL試劑盒19是整個(gè)GC基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)的核心。根據(jù)生化過(guò)程，可以分為以下幾個(gè)程序一、基因分離，純化在這個(gè)方面我們利用目前有市售的各種DNA，RNA，mRNA等基因純化試劑盒，由于基因純化，雜交緩沖液等無(wú)專利性，且不同的標(biāo)本有不同的生物學(xué)處理過(guò)程，因而以原理的方式給出。大體過(guò)程如下1.生物標(biāo)本的DNA或RNA(包括mRNA)的抽提2.DNA或RNA的純化3.如RNA檢測(cè)，則首先逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并進(jìn)行產(chǎn)品的純化(合適的溫度及時(shí)間)4.將DNA或逆轉(zhuǎn)錄后的DNA進(jìn)行堿變性或高溫變性5.變性后的模板在雜交液與芯片探針進(jìn)行雜交(合適的溫度及時(shí)間)6.雜交后進(jìn)行洗脫，以清除雜交液殘留。
我們將在HCL儀中加入如下技術(shù)，以提高HCL儀的處理效率(1)泳滲快速雜交通過(guò)對(duì)基因芯片點(diǎn)陣區(qū)域(即基因芯片雜交室2的有效雜交體系)施加交變的電場(chǎng)促使核酸分子(攜帶負(fù)電荷)在基因芯片雜交室2中做有規(guī)則的電泳運(yùn)動(dòng)增加靶基因與探針基因的接觸機(jī)會(huì)，從而加速雜交過(guò)程。在雜交緩沖溶液的設(shè)計(jì)中，利用高離子強(qiáng)度檸檬酸或磷酸鈉鹽緩沖液在電場(chǎng)下所產(chǎn)生的較強(qiáng)的電滲效應(yīng)(運(yùn)動(dòng)方向與核酸在溶液中的方向相同)進(jìn)一步提高核酸分子伴隨溶液整體在固相表面的運(yùn)動(dòng)效率。促使核酸分子以合適的速度和方式在基因芯片表面移動(dòng)，將有效地提高探針與靶基因的接觸機(jī)會(huì)，從而提高雜交效率。
(2)泳滲快速標(biāo)記 為了達(dá)到針對(duì)基因芯片上已雜交的DNA雙鏈進(jìn)行特異性標(biāo)記，我們選擇可以特異性嵌入DNA雙鏈的有機(jī)試劑4’-胺甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(補(bǔ)骨脂素(PS))等作為特異性嵌入核酸(DNA或RNA)互補(bǔ)雜交雙鏈的“探頭”部分。在330-380納米紫外光光照下，發(fā)生與DNA雙鏈鏈間共價(jià)鍵交聯(lián)的光化學(xué)反應(yīng)。反應(yīng)后，將之用連接臂(L)與聚苯乙烯熒光微球(LB)進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)信號(hào)標(biāo)記?；蛘?，將補(bǔ)骨脂素(PS)或其衍生物直接與連接臂合成為一體。程序如下①補(bǔ)骨脂素(PS)-Ln+/n--SH，②補(bǔ)骨脂素(PS)-Ln+/n--B，③LBn+/n--Ln+/n--MAL(表面活性劑)注B為生物素，Mal-為馬來(lái)酰亞胺修飾的功能團(tuán)。
(3)聚苯乙烯熒光微球 聚苯乙烯熒光微球目前已有市售各種表面功能基團(tuán)修飾(如胺基，羧基，羥基，磺酸基等)，含有各種激發(fā)波長(zhǎng)(350-750nm)和發(fā)射波長(zhǎng)(400-800nm)的熒光染料的熒光微球。粒徑也可以根據(jù)需要在20nm到幾十微米任意選取，相當(dāng)于每個(gè)微球中分別含有102-1010個(gè)以上熒光素染料分子。我們選擇的具體參數(shù)特征將根據(jù)基因芯片玻片26的表面修飾，檢測(cè)靈敏度和線性范圍需要，泳滲雜交及標(biāo)記過(guò)程的離子電性要求，激發(fā)光源等諸多因素。比如，為了避免非特異性標(biāo)記，在考慮聚苯乙烯熒光微球的表面功能基團(tuán)時(shí)，需要充分考慮到基因芯片玻片26的表面功能團(tuán)修飾如果玻片表面修飾基團(tuán)是醛基修飾，基因芯片點(diǎn)樣后，對(duì)未固化核酸的醛基進(jìn)行封閉使其轉(zhuǎn)化為羥基。那么，聚苯乙烯熒光微球的表面修飾基團(tuán)最好避免羧基，而可以選擇胺基或羥基。聚苯乙烯熒光微球的粒徑與系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度和線性檢測(cè)范圍的實(shí)際要求直接相關(guān)。粒徑越大檢測(cè)靈敏度越高而線性檢測(cè)范圍越窄。為滿足泳滲操作，聚苯乙烯熒光微球的表面攜帶電荷如銨離子，咪唑，羧酸根，磺酸根陰離子，內(nèi)部可包埋磁芯，以便于磁場(chǎng)下操作。
表面活性劑 為消除聚苯乙烯熒光微球因表面疏水作用而產(chǎn)生的集結(jié)，在標(biāo)記試劑成分中，加入表面活性劑，并用超聲波震蕩使聚苯乙烯熒光微球有效地均勻分散在溶液中。為了使聚苯乙烯熒光微球表面的功能基團(tuán)不被表面活性劑的分子鏈“淹沒(méi)”起來(lái)，影響標(biāo)記效率，最好選擇短分子鏈且臨界膠束濃度低的氟系列表面活性劑，如3M公司生產(chǎn)的FC-143，F(xiàn)C-129等。
HCL儀HCL儀是為了幫助HCL試劑盒19完成所需的分子生物學(xué)過(guò)程而設(shè)計(jì)的。它提供HCL試劑盒19在各個(gè)過(guò)程中所需要的溫度控制，光化學(xué)反應(yīng)，交變電磁場(chǎng)，各種溶液的程序化輸送等外界條件的硬件支持。在由計(jì)算機(jī)20(上位機(jī)及軟件)及單片機(jī)14(下位機(jī)CPU及其軟件)所組成的自動(dòng)控制系統(tǒng)的控制下，按對(duì)基因芯片雜交室2(控制終端)所執(zhí)行的任務(wù)劃分有如下幾個(gè)執(zhí)行系統(tǒng)，控制原理示意圖如

圖1所示。
圖中各編號(hào)對(duì)應(yīng)如下紫外燈1，基因芯片雜交室2，快接鍵3，基因芯片雜交室中的電子線路印制版接線端口4，半導(dǎo)體熱泵5，設(shè)置于基因芯片雜交室2和半導(dǎo)體熱泵5之間的溫度探針6，用于檢測(cè)工作端的溫度；用于檢測(cè)半導(dǎo)體熱泵5的環(huán)境溫度(空氣冷或水冷時(shí)的介質(zhì)溫度)的溫度探針7，三通8，蠕動(dòng)泵泵頭9，可接受單片機(jī)14指令的蠕動(dòng)泵馬達(dá)10，開(kāi)關(guān)電源12，集成電路13，接受單片機(jī)14指令的空氣制冷或水冷執(zhí)行終端11，單片機(jī)14，多通道螺線管閥15，i＝1，2，3；步進(jìn)馬達(dá)16，步進(jìn)馬達(dá)伺服器17，激光器18，HCL試劑盒19，計(jì)算機(jī)20。
一、溫度控制系統(tǒng)該系統(tǒng)由半導(dǎo)體熱泵5及空氣冷或水冷器件11，開(kāi)關(guān)電源12，溫度探針6，7等組成。利用半導(dǎo)體熱泵5進(jìn)行溫度控制是根據(jù)帕爾帖效應(yīng)的原理，冷端與熱端之間的溫度差(ΔT)與電流(I)成一定關(guān)系。溫度探針7和6分別檢測(cè)工作端(面向基因芯片雜交室22)和環(huán)境(面向用于散熱的工作介質(zhì)水或空氣)的溫度。
二、交變電場(chǎng)控制系統(tǒng)(見(jiàn)圖1所示)該系統(tǒng)有功率放大集成電路13/三極管，接線端子，基因芯片雜交室2電子印制版PCB芯23等器件，PCB芯23的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖3所示；幾組沿不同角度及方位安置的磁芯線圈等；注雜交緩沖液小孔29，印制線路板PCB芯23。
三、光控系統(tǒng)該系統(tǒng)由紫外燈1，開(kāi)關(guān)量輸出控制；四、流體輸送系統(tǒng)該系統(tǒng)由HCL試劑盒19，多通道閥，計(jì)算機(jī)20兼容變速泵，管道，快接鍵3，三通8，四通等組成。
五、基因芯片雜交室2其結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖2所示。
基因芯片雜交室2，由塑料上蓋、不透明塑料基座、基因芯片、泳滲PCB芯等器件構(gòu)成，其特征是，基座為框形結(jié)構(gòu)，基因芯片玻片26正面朝上地鑲嵌于基座中央，基座下部框形開(kāi)口大于基因芯片玻片26正面的基因點(diǎn)陣區(qū)而小于基因芯片本身，使得激發(fā)光束經(jīng)折射后仍能充分地覆蓋基因芯片玻片26正面的基因點(diǎn)陣區(qū)，同時(shí)又能托住基因芯片玻片26，在基因芯片玻片26之上放置框形泳滲PCB芯，后者框內(nèi)壁列有分立的金屬化表面，由PCB加工過(guò)程中形成的金屬化孔通過(guò)后裁制工藝形成，這些框內(nèi)壁的金屬化(金或銀等)表面通過(guò)蝕刻出來(lái)的金屬鍍層線路與框外壁分立的金屬化表面相連，后者作為PCB芯的外接口，與HCL儀的泳滲離子操縱部分相連，整個(gè)泳滲PCB芯、基因芯片和基座部分被一個(gè)塑料上蓋蓋住，液體進(jìn)出通道設(shè)于塑料上蓋或基座之上，而基因芯片雜交室2濕度保持緩沖液存儲(chǔ)小孔在泳滲PCB芯上，并由塑料上蓋相應(yīng)位置的小孔通往外界，該小孔由一個(gè)橡皮小塞封度其出口，基因芯片自下而上分別由玻片、金屬鉻(1～100鈉米，最佳厚度可以是3鈉米)、銀(或金10～1000鈉米，最佳厚度可以是40、50、75鈉米等)、石英(1～100鈉米，最佳厚度可以是3鈉米或5鈉米)等鍍層構(gòu)成，在石英鍍層表面經(jīng)過(guò)硅烷化、胺基或醛基等表面修飾工藝形成可以直接固化基因分子的基因芯片玻片26，再經(jīng)基因芯片點(diǎn)制工藝形成基因芯片。
注圖2中的編號(hào)說(shuō)明如下電子印制線板23(詳細(xì)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)，PCB接線端口24，基因芯片雜交室底座25，基因芯片玻片26，基因芯片雜交室窗蓋27，基因芯片雜交室出入口28，緩沖液小槽29，基因芯片雜交室窗蓋上的玻璃窗口30，基因芯片雜交室的液體操演內(nèi)腔31。
基因芯片雜交室2的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)目的是為了滿足光，電磁，熱，物流等外界各種因素對(duì)基因芯片的程序性作用。
HCL儀將用來(lái)實(shí)現(xiàn)如下控制要求(如下過(guò)程順序不能變更)
1.快速雜交過(guò)程泳滲快速雜交。該過(guò)程所需要的雜交緩沖液及DNA溶液由技術(shù)人員借助于微量加液器透過(guò)基因芯片雜交室2兩端的小孔中滴加到基因芯片上。并把緩沖液滴加到基因芯片雜交室2的緩沖液小槽29中。隨后，通過(guò)快接健將裝載有DNA雜交液的基因芯片雜交室2裝入HCL儀基因芯片處理中心，進(jìn)入如下自動(dòng)雜交程序。
注給出參數(shù)變化范圍的往往要求設(shè)計(jì)成實(shí)驗(yàn)室可以通過(guò)計(jì)算機(jī)20方便可調(diào)的，以方便于通過(guò)HCL樣機(jī)的自動(dòng)化過(guò)程找到更加優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。HCL試劑盒19中各溶液組成分別如下No.1溶液雜交緩沖液，如5×SSC，DNA溶液，pH2.5-10.0；No.2溶液雜交洗脫液，選用傳統(tǒng)成熟SDS洗脫配方；雜交過(guò)程，根據(jù)具體需要調(diào)整并控制溫度。協(xié)同過(guò)程(1)通過(guò)電磁閥關(guān)閉基因芯片雜交室2；(2)啟動(dòng)交變電場(chǎng)系統(tǒng)加快雜交動(dòng)力學(xué)過(guò)程；No.3溶液探針?lè)肿尤芤海腥鐚?shí)施例中所述的通式(I)類化合物，溶解于低于10mM的Na2HPO4緩沖液。最終溶液的pH值應(yīng)在2.5-10.0范圍內(nèi)，而且鹽濃度須確保低于20mM。該過(guò)程可以在室溫下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間從5分鐘到1小時(shí)不等；No.4溶液基因芯片上非特異性或未結(jié)合探針?lè)肿拥南疵撊芤?。具體成分視探針?lè)肿佣?；No.5溶液標(biāo)記溶液，在聚苯乙烯熒光微球的表面修飾有大量與探針?lè)肿涌梢蕴禺愋苑磻?yīng)的分子識(shí)別基團(tuán)或免疫特異反應(yīng)分子等，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)詳見(jiàn)實(shí)施例。同時(shí)，為了克服聚苯乙烯熒光微球之間的粘附作用，在標(biāo)記溶液的配制中加入足量的短鏈表面活性劑(如氟表面活性劑等)，并通過(guò)超聲震蕩使之形成均勻的體系。
No.6溶液洗脫溶液，使用同樣濃度的上述氟表面活性劑或SDS溶液。
No.7溶液漂洗液，為三重蒸餾水，或去離子水。
(a)輻照時(shí)可以在零攝氏度下的靜態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行，根據(jù)輻照劑量持續(xù)時(shí)間從5分鐘到60分鐘不等。光源高壓汞燈或RUL3500弧光燈，其與基因芯片雜交室的距離小于2厘米。350～380nm，最好365nm的UV輻射同步進(jìn)行，輻射劑量約8.3-40kJ/m2；(b)風(fēng)淋過(guò)程中所使用的氣流經(jīng)過(guò)空氣濾過(guò)性設(shè)備。
SPR信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)該系統(tǒng)利用表面等離子體共振信號(hào)激發(fā)技術(shù)，在用于生產(chǎn)基因芯片的玻片材料上鍍上一層超薄(只有幾十納米的厚度)的金屬及石英鍍膜，并在所鍍的石英表面上固化核酸分子，實(shí)現(xiàn)雜交，標(biāo)記，洗脫和信號(hào)檢測(cè)等必要的過(guò)程。其原理示意圖如圖4所示。
1.全系統(tǒng)由SPR信號(hào)激發(fā)，CCD信號(hào)采集以及基因芯片三個(gè)部分構(gòu)成。前兩個(gè)系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成嚴(yán)格的光隔離，即被設(shè)計(jì)得相互光隔離和各自與外界的光隔離。激發(fā)光源18、平行光管、擴(kuò)束鏡37等的角度在設(shè)計(jì)和制造時(shí)位置與角度在整個(gè)儀器中是固定的。用戶將基因芯片雜交室2放置時(shí)，其與激發(fā)光平行光束所成的角度通常不是臨界角，此時(shí)主要依靠臨界角伺服系統(tǒng)42通過(guò)步進(jìn)馬達(dá)(microstepper motor)16等執(zhí)行器件通過(guò)求極值的方式自動(dòng)調(diào)整基因芯片雜交室2的角度，使入射角達(dá)到SPR臨界角，從而在基因芯片正面產(chǎn)生表面等離激元TM波，即表面等離子體共振波。在基因芯片正面，我們以此表面等離子體共振波為二次激發(fā)光源激發(fā)基因芯片上的基因標(biāo)記物-聚苯乙烯熒光微球，從而產(chǎn)生基因芯片表面近距離倏逝的激發(fā)場(chǎng)。在此激發(fā)場(chǎng)中的信號(hào)載體受到激發(fā)后產(chǎn)生的熒光信號(hào)，被光學(xué)成像系統(tǒng)將這些信號(hào)聚焦并投影在CCD芯片上，從而實(shí)現(xiàn)由光學(xué)影象到數(shù)碼信息的轉(zhuǎn)換。最后，再由計(jì)算機(jī)對(duì)這些數(shù)碼信息進(jìn)行處理和分析。由于作為激發(fā)光源的表面等離激元是在離表面納米到微米尺寸內(nèi)作用的倏逝場(chǎng)，無(wú)法有效進(jìn)入成像系統(tǒng)中成為背景噪音，而其激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)卻可以遠(yuǎn)離基因芯片表面而到達(dá)成像系統(tǒng)，所以激發(fā)光噪音可以有效屏蔽。
2.SPR信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)和CCD信號(hào)采集系統(tǒng)二者相互且各自皆為光學(xué)密閉系統(tǒng)。
上述三個(gè)部分的設(shè)計(jì)要點(diǎn)在下面分別闡述。
3.SPR信號(hào)激發(fā)部分如圖4所示，在SPR信號(hào)激發(fā)部分，通過(guò)擴(kuò)束鏡將激光器18發(fā)出的偏振光束平行擴(kuò)束，使之平行地照射到基因芯片的背面。在用于點(diǎn)制基因的基因芯片玻片26表面分別鍍上鉻、銀和石英，之后經(jīng)硅烷化、功能團(tuán)表面修飾，用以點(diǎn)制基因芯片。信號(hào)檢測(cè)時(shí)，平行偏振激發(fā)光經(jīng)平面棱鏡47與光學(xué)匹配液48從基因芯片的背面入射，借助臨界角伺服系統(tǒng)42調(diào)整載有基因芯片雜交室2活動(dòng)托架平臺(tái)49(平面棱鏡47固定其中)的角度直至光能量計(jì)38檢測(cè)到的反射光能量達(dá)到極小值時(shí)，臨界角伺服系統(tǒng)42角度調(diào)節(jié)終止并使角度固定在此角度，從而使入射的激發(fā)光束與基因芯片成SPR臨界角入射，致使在基因芯片正面產(chǎn)生表面等離子共振波，由該共振波激發(fā)基因芯片表面已標(biāo)記的信號(hào)載體，從而產(chǎn)生熒光或相應(yīng)的光學(xué)信號(hào)，利用透鏡成像系統(tǒng)33將信號(hào)傳送至CCD32并被轉(zhuǎn)換成可以被計(jì)算機(jī)20記錄并分析的數(shù)碼信息。
圖4中的編號(hào)說(shuō)明電荷耦合器件CCD 32(內(nèi)含CCD驅(qū)動(dòng)電路和數(shù)據(jù)采集電路板)，成像系統(tǒng)33，基因芯片雜交室34，托架平臺(tái)49，轉(zhuǎn)軸(支點(diǎn))35，36；擴(kuò)束鏡37，光能量計(jì)38，激光器18(內(nèi)置準(zhǔn)直頭)，步進(jìn)馬達(dá)16，調(diào)角器39，開(kāi)關(guān)電源40，41；臨界角伺服系統(tǒng)42，單片機(jī)43，計(jì)算機(jī)20，SPR信號(hào)激發(fā)室44和CCD信號(hào)采集室45，偏振器46，平面棱鏡47(折射率1.70)，光學(xué)匹配液48(甘油，為Cargill產(chǎn)品，折射率為1.70)。
2.CCD信號(hào)采集部分基因芯片的光學(xué)設(shè)計(jì)基因芯片玻片26制備及清洗步驟如下1.將折射率為1.70，表面平整度在0.5個(gè)牛頓環(huán)的玻片用鏡頭紙擦去表面污點(diǎn)及灰塵。
2.放入異丙醇及氯仿中各浸泡30分鐘，然后，置入濃硫酸和雙氧水(30％)混合液中(V/V，1∶1)中過(guò)夜。
3.取出后以超純水沖洗，再放入KOH的乙醇飽和溶液中約20分鐘。
4.再經(jīng)超純水沖洗，置于10％HCL的乙醇溶液中保存。
5.沉積金屬膜前，用超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑糜贓DWARDS E306A真空鍍膜機(jī)中濺射沉積金屬膜依次沉積3納米鈦，50納米銀，10納米二氧化硅薄膜。
6.將此基片按半導(dǎo)體材料的清洗步驟進(jìn)行清洗，再放入HF稀溶液中處理2分鐘，取出后用蒸餾水反復(fù)沖洗，之后在氮?dú)庀赂稍铩?br> 基因芯片玻片26的表面修飾步驟如下1.將基片浸入到APTES(APTES是γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，東京化成)的苯溶液中(10-1mmol/l)反應(yīng)6小時(shí)，取出后用甲苯，丙酮清洗，同時(shí)用氮?dú)獯蹈伞?br> 2.將基片浸入含有1％戊二醛(戊二醛，上?；瘜W(xué)試劑站分裝。其余試劑皆國(guó)產(chǎn)分析純)的PBS緩沖液中(pH7.2，0.05M)反應(yīng)2小時(shí)。
3.活化的載體用丙酮，乙醇，及蒸餾水沖洗，并在氮?dú)庀赂稍铩?br> 由于在玻璃或石英表面固化核酸的工藝很多，且已十分成熟，可以保障核酸的牢固連接，密度可調(diào)，此處縮略。
基因芯片玻片26的點(diǎn)制該部分技術(shù)因無(wú)專利性，屬常規(guī)技術(shù)，因而不再贅述。
除表面鍍鉻、金、銀等金屬膜外再鍍石英薄膜之外，也可以免去在金或銀表面再鍍石英，而是直接固定核酸的方法。因?yàn)樵诮鸨砻婀潭ê怂岬募夹g(shù)已比較成熟，因而，不再贅述。
數(shù)據(jù)分析系統(tǒng) 現(xiàn)在基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件市場(chǎng)上種類很多，因此，這方面以購(gòu)買(mǎi)為主。
發(fā)明與
背景技術(shù)：
相比的有益效果本發(fā)明與背景技術(shù)相比的有益效果有如下幾個(gè)方面1、系統(tǒng)對(duì)基因芯片的檢測(cè)靈敏度高，信噪比高，可以滿足絕大多數(shù)科研和實(shí)用領(lǐng)域?qū)`敏度方面的極高要求，有利于推動(dòng)基因芯片在臨床診斷、工商檢疫和環(huán)境檢測(cè)等方面的普及應(yīng)用，2、系統(tǒng)處理過(guò)程集成化程度高，集雜交，標(biāo)記，洗脫，信號(hào)檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理等于一體，使專業(yè)技術(shù)人員的處理效率提高，同時(shí)也降低了對(duì)非專業(yè)技術(shù)人員的專業(yè)技術(shù)要求，提高了基因芯片使用中結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性，3、系統(tǒng)對(duì)基因芯片處理的效率高，由于在雜交，標(biāo)記，洗脫等過(guò)程中采用了(交變)電泳，電滲技術(shù)，使上述基因芯片處理中的主要過(guò)程的時(shí)效大大提高，4、系統(tǒng)成本及運(yùn)行成本低廉，適合于基因芯片的普及應(yīng)用，5、系統(tǒng)適用于玻璃基因芯片，并有利于該種基因芯片普及化應(yīng)用，成為各種基因平行檢測(cè)技術(shù)中的主流產(chǎn)品。
實(shí)施例關(guān)于HCL試劑盒成分的說(shuō)明基因芯片雜交信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)中，有兩類試劑必須提到。它們分別是在基因芯片經(jīng)過(guò)雜交過(guò)程之后，作為與基因芯片上互補(bǔ)配對(duì)的核酸雜交雙鏈在一定條件下可以特異性結(jié)合的探針?lè)肿踊衔?I)，以及作為聚苯乙烯熒光微球?qū)B接有探針?lè)肿拥碾s交雙鏈核酸進(jìn)行熒光信號(hào)標(biāo)記的化合物(II)。它們的結(jié)構(gòu)特征分別是化合物(I)補(bǔ)骨脂素(PS)-L1-A，化合物(II)FB(-L2-A’)n，其中，一、補(bǔ)骨脂素(PS)-表示4’-胺甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(4’-hydroxymethyl-4，5’，8-trimethyl補(bǔ)骨脂素(PS)oralen或4’-aminomethyltrioxalen，簡(jiǎn)寫(xiě)補(bǔ)骨脂素(PS))；二、A-和A’-是指任何一對(duì)具有某種化學(xué)反應(yīng)或相互作用特異性探針?lè)肿咏宇^，它們可以是下列情況之一(1)化學(xué)反應(yīng)特異性功能團(tuán)對(duì)；(2)免疫反應(yīng)對(duì)；(3)其它形式的特異性分子識(shí)別相互作用對(duì)；三、-L1-和-L2-表示水溶性連接臂，如PEG、肽鏈、碳水化合物鏈等；四、FB表示聚苯乙烯熒光微球，其表面修飾有可以與化合物(I)中的探針?lè)肿咏宇^A-特異性反應(yīng)的功能團(tuán)或作用對(duì)A’-。
以下通過(guò)若干實(shí)施例就各種不同情景組合進(jìn)行闡述。
實(shí)例一 用表面抗生物素蛋白標(biāo)記的熒光微球的標(biāo)記法借助于生物素的特異性分子識(shí)別能力，將生物素與補(bǔ)骨脂素(PS)通過(guò)連接臂合成為生物素化的分子，簡(jiǎn)稱BPEOP。從而達(dá)到用生物素標(biāo)記已經(jīng)雜交成雙鏈的核酸分子的目的，同時(shí)又利用補(bǔ)骨脂素(PS)加固了雜交雙鏈的結(jié)合強(qiáng)度。BPEOP作為No.3溶液中的核心成分，通過(guò)光化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)對(duì)雙鏈核酸進(jìn)行標(biāo)記。之后，選用有市售的抗生物素蛋白化的高分子(如聚苯乙烯等)熒光微球(SIGMA公司，分子探針(Molecular Probes)公司等生產(chǎn)的FluoroSpheres)作為聚苯乙烯熒光微球和No.4溶液中的核心成分。
可以直接購(gòu)買(mǎi)有市售的BPEOP產(chǎn)品(+)-生物素-PEO4-補(bǔ)骨脂素C33H44N4SO10；Mr＝688.79；mp 98-100 實(shí)例二 用補(bǔ)骨脂素-生物素進(jìn)行標(biāo)記利用Schleicher & Scheull公司生產(chǎn)的補(bǔ)骨脂素-生物素(美國(guó)專利U.S.Patent#4,599,303)進(jìn)行標(biāo)記。過(guò)程如下(1)將基因芯片雜交室在90攝氏度下溫育10分鐘，(2)在基因芯片雜交室雜交后，快速降溫至-20～0攝氏度以冰鎮(zhèn)之，2～5分鐘之后，開(kāi)始時(shí)以3ml/min的流速泵入補(bǔ)骨脂素-生物素探針溶液，約30秒之后以0.06～1ml/min的流速泵入，并在冰鎮(zhèn)條件下持續(xù)接受輻照1～60分鐘；(3)將溫度設(shè)置為室溫，終止輻照，以1～10000ml/min的流速泵入正丁醇的dH2O飽和溶液10秒到30分鐘，之后泵入乙醚的dH2O飽和溶液；(4)室溫下，以0.1～5000ml/min的流速泵入表面抗生物素蛋白修飾的熒光微球(SIGMA公司或Molecular Probes公司產(chǎn)品)的標(biāo)記溶液10～30000秒；(5)室溫下以ml/min的流速持續(xù)1～1000秒泵入dH2O洗脫液。
實(shí)例三 用表面生物素化的熒光微球標(biāo)記法用有市售的表面生物素化的熒光微球(Molecular Probes公司的FluoroSpheres)進(jìn)行標(biāo)記。此時(shí)，合成連接臂的一端是抗生物素蛋白，另一端是補(bǔ)骨脂素(PS)。
實(shí)例四 巰基標(biāo)記法
巰基特異性反應(yīng)功能團(tuán)有馬來(lái)酰亞胺。合成核酸探針時(shí)，用(離子化的)親水連接臂(如人工合成多肽鏈，聚乙二醇(PEG)等)將補(bǔ)骨脂素與巰基或馬來(lái)酰亞胺連接起來(lái)，形成“探頭-連接臂-接頭A”模式的鏈狀分子。
索 引1.Ramsay G，et al.DNA ChipState-of-the-art.Nature Biotechnology16(1)40-44，19982.Chee M，Yang R，Hubbel，et al.Accessing genetic information with high-density DNA arrays.Science 274(5287)610-613，19963.http//www.affymetrix.com4.Yershov K，et al.DNA Analysis and Diagnosis on Oligonucleotide Chi補(bǔ)骨脂素(PS).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(10)4913-4918，19965.http//www.genomicsolutions.com6.http//www.incyte.com7.http//www.chinagenenet.com8.Christine D，et al.DNA Microarray in drug discovery and development.Nature GeneticsSupplement.21(1)48-50，19999.Duggan D J.Nature Genetics Supplement，21(1)，42-47，1999.
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有關(guān)說(shuō)明書(shū)附圖的圖面說(shuō)明附圖1、HCL儀控制原理示意圖附圖2、基因芯片雜交室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖附圖3、基因芯片雜交室在HCL儀中的裝載示意圖附圖4、SPR信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)原理示意圖
權(quán)利要求
1.一種基因芯片雜交信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)，它是在基因芯片經(jīng)過(guò)雜交過(guò)程之后，利用化合物(I)作為互補(bǔ)配對(duì)的核酸雜交雙鏈特異性探針?lè)肿?，而利用化合?II)作為聚苯乙烯熒光微球?qū)B接有探針?lè)肿拥碾s交雙鏈核酸進(jìn)行標(biāo)記，化合物(I)結(jié)構(gòu)特征為補(bǔ)骨脂素-L1-A，化合物(II)結(jié)構(gòu)特征為FB(-L2-A’)n，其中，A-和A’-是指任何一對(duì)具有某種化學(xué)反應(yīng)或相互作用特異性探針?lè)肿咏宇^，它們可以是下列情況之一(1)巰基和馬來(lái)酰亞胺基；(2)生物素和抗生物素蛋白，-L1-為PEO，-L2-表示水溶性連接臂，F(xiàn)B表示聚苯乙烯熒光微球，其表面修飾有可以與化合物(I)中的探針?lè)肿咏宇^A-特異性反應(yīng)的功能團(tuán)或作用對(duì)A’-，利用化合物(I)處理基因芯片上雜交雙鏈核酸的方法特征為在雜交過(guò)程完成后，在-50～100攝氏度的溫度條件下將含有化合物(I)濃度為0.001mM～10M的溶液導(dǎo)入基因芯片雜交室2中持續(xù)時(shí)間為20個(gè)小時(shí)以內(nèi)，在紫外光照下發(fā)生該化合物在核酸雙鏈中的鏈間共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)其與雙鏈核酸的特異性共價(jià)連接，利用化合物(II)進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記的方法特征為在化合物(I)與雙鏈核酸實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接之后，導(dǎo)入含有化合物(II)的溶液，持續(xù)1～100000秒時(shí)間，然后對(duì)非特異性吸附進(jìn)行洗脫。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1制作的基因芯片信號(hào)標(biāo)記和放大試劑盒，即HCL試劑盒19，包含了基因芯片處理各過(guò)程所需要的全部生化試劑，含有如下組分化合物(I)，化合物(II)。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2制作的主要從事基因芯片的雜交、標(biāo)記、洗脫等分子生物學(xué)過(guò)程處理的HCL儀，主要由單片機(jī)14自動(dòng)控制系統(tǒng)和各執(zhí)行器件構(gòu)成，其中溫度自動(dòng)控制依靠單片機(jī)14的模擬量控制和半導(dǎo)體制冷器5等執(zhí)行器件構(gòu)成，對(duì)流體自動(dòng)給排系統(tǒng)中各泵、閥門(mén)等以及紫外燈1的控制依靠開(kāi)關(guān)量控制，其原理是根據(jù)基因芯片所必須經(jīng)過(guò)的雜交、光交聯(lián)反應(yīng)、標(biāo)記、洗脫等過(guò)程，程序性地對(duì)基因芯片雜交室中的基因芯片進(jìn)行加熱到某一溫度，并恒溫控制某時(shí)間長(zhǎng)度、制冷至某一溫度并恒溫、輸送不同溶液、紫外燈照射等。
4.一種基因芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)，它是利用激光表面等離激元共振(SPR)技術(shù)，屏蔽激發(fā)光和背景光對(duì)信號(hào)的干擾的，在用于點(diǎn)制基因的基因芯片玻片26表面分別鍍上鉻、銀和石英，之后經(jīng)硅烷化、功能團(tuán)表面修飾，用以點(diǎn)制基因芯片，在信號(hào)檢測(cè)時(shí)，平行偏振激發(fā)光經(jīng)平面棱鏡47與光學(xué)匹配液48從基因芯片的背面入射，借助臨界角伺服系統(tǒng)42調(diào)整托著基因芯片雜交室2并固定有平面棱鏡47的托架49的角度直至能量計(jì)38檢測(cè)到的反射光達(dá)到極小值并固定于該角度，從而使激發(fā)光束與基因芯片成SPR臨界角入射，致使在基因芯片正面產(chǎn)生表面等離激元TM波，由該波激發(fā)基因芯片表面已標(biāo)記的信號(hào)載體，從而產(chǎn)生熒光或相應(yīng)的光學(xué)信號(hào)，利用透鏡成像系統(tǒng)33將信號(hào)傳送至CCD32并被轉(zhuǎn)換成可以被計(jì)算機(jī)20分析的數(shù)碼信息。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4制作的SPR-CCD信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)有SPR信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)和CCD信號(hào)采集及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等部分，其中SPR信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)由激光18等激發(fā)光源、平行光管或準(zhǔn)直頭等、偏振鏡46、擴(kuò)束鏡37、臨界角伺服系統(tǒng)42、步進(jìn)馬達(dá)16、基因芯片雜交室2、單片機(jī)43等器件組成，其特征是，激發(fā)光源18、平行光管、擴(kuò)束鏡37等的角度在設(shè)計(jì)和制造時(shí)位置與角度在整個(gè)儀器中是固定的，用戶將基因芯片雜交室2放置時(shí)，其與激發(fā)光平行光束所成的角度通常不是臨界角，此時(shí)主要依靠臨界角伺服系統(tǒng)42通過(guò)步進(jìn)馬達(dá)16等執(zhí)行器件通過(guò)求極值的方式自動(dòng)調(diào)整基因芯片雜交室2的角度，使入射角達(dá)到SPR臨界角，從而在基因芯片正面產(chǎn)生表面等離激元TM波，即表面等離子體共振波，在基因芯片正面，我們以此表面等離子體共振波為二次激發(fā)光源激發(fā)基因芯片上的基因標(biāo)記物---高荷信號(hào)載體，從而產(chǎn)生基因芯片表面近距離倏逝的激發(fā)場(chǎng)，在此激發(fā)場(chǎng)中的信號(hào)載體受到激發(fā)后產(chǎn)生的熒光信號(hào)，被光學(xué)成像系統(tǒng)將這些信號(hào)聚焦并投影在CCD芯片上，從而實(shí)現(xiàn)由光學(xué)影象到數(shù)碼信息的轉(zhuǎn)換，最后，再由計(jì)算機(jī)對(duì)這些數(shù)碼信息進(jìn)行處理和分析，由于作為激發(fā)光源的表面等離激元是在離表面納米到微米尺寸內(nèi)作用的倏逝場(chǎng)，無(wú)法有效進(jìn)入成像系統(tǒng)中成為背景噪音，而其激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)卻可以遠(yuǎn)離基因芯片表面而到達(dá)成像系統(tǒng)，所以激發(fā)光噪音可以有效屏蔽，SPR信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)和CCD信號(hào)采集系統(tǒng)二者相互且各自皆為光學(xué)密閉系統(tǒng)，即，以基因芯片雜交室2及其托架平臺(tái)49為分界線的SPR信號(hào)激發(fā)室44(處于基因芯片反面一側(cè)，即基因芯片未點(diǎn)制基因方陣的一側(cè))和CCD信號(hào)采集室45(基因芯片正面一側(cè)，即基因芯片點(diǎn)制基因方陣的一側(cè))在物理空間上二者之間是光學(xué)隔離的，即在儀器設(shè)計(jì)和制造中，二者各自為光學(xué)密閉且隔離空間，SPR信號(hào)激發(fā)室44中的背景光和激發(fā)光無(wú)法通過(guò)散射、反射、折射等各種途徑泄露到CCD信號(hào)采集室45中，從而不對(duì)基因芯片正面SPR激發(fā)所產(chǎn)生的信號(hào)造成噪音干擾。
6.一種基因芯片交變電場(chǎng)泳滲溶液體系操縱技術(shù)，它是根據(jù)帶電離子和高離子強(qiáng)度溶液在電場(chǎng)中可以進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)的原理，通過(guò)在基因芯片雜交室周?chē)┘咏蛔冸妶?chǎng)從而促使其中的溶液或離子進(jìn)行所要求的定向運(yùn)動(dòng)，有利于提高雜交、標(biāo)記甚至洗脫過(guò)程的效率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的技術(shù)制作成的基因芯片泳滲溶液體系操縱系統(tǒng)，它含有基因芯片雜交室2中的PCB芯23、交變電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)電路----單片機(jī)、功率放大集成電路及接線端子等組成部分，其特征是，在基因芯片雜交室2中基因芯片雜交區(qū)設(shè)置一個(gè)框形PCB芯23，其厚度由雜交腔的大小決定，沿框形結(jié)構(gòu)的內(nèi)壁上設(shè)置有若干數(shù)目縱向分立的鍍金電極，它們通過(guò)PCB芯23的上下兩個(gè)表面上的鍍金導(dǎo)線通向兩旁外壁的兩排接口電極，PCB芯23內(nèi)壁上的鍍金電極與外壁上的接口電極一一對(duì)應(yīng)，通過(guò)PCB芯23的上下表面上的鍍金導(dǎo)線相連，電極數(shù)目取決于交變電場(chǎng)調(diào)控的需要，PCB芯23制造按照電子線路印制板PCB的專用Protel設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)和蝕刻生產(chǎn)工藝生產(chǎn)，PCB芯23框形結(jié)構(gòu)中雜交區(qū)的交變電場(chǎng)由單片機(jī)產(chǎn)生交變電壓信號(hào)并經(jīng)功率放大集成電路等電子器件放大產(chǎn)生，最后通過(guò)接線端子傳送至PCB芯23，并最終將交變電場(chǎng)施加到基因芯片表面的雜交區(qū)域。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的要求設(shè)計(jì)而成的基因芯片雜交室2，由塑料上蓋27、不透明塑料基座25、基因芯片26、泳滲PCB芯23等器件構(gòu)成，其中基座25為框形結(jié)構(gòu)，基因芯片玻片正面朝上地鑲嵌于基座25中央，基座25下部框形開(kāi)口大于基因芯片玻片正面的基因點(diǎn)陣區(qū)而小于基因芯片25本身，使得激發(fā)光束經(jīng)折射后仍能充分地覆蓋基因芯片玻片正面的基因點(diǎn)陣區(qū)，同時(shí)又能托住基因芯片玻片，在基因芯片玻片之上放置框形泳滲PCB芯23，后者框內(nèi)壁列有分立的金屬化表面，由PCB加工過(guò)程中形成的金屬化孔通過(guò)后裁制工藝形成，這些框內(nèi)壁的金或銀等金屬化表面通過(guò)蝕刻出來(lái)的金屬鍍層線路與框外壁分立的金屬化表面相連，后者作為泳滲PCB芯23的外接口，與HCL儀的泳滲離子操縱部分相連，整個(gè)泳滲PCB芯23、基因芯片26和基座25部分被一個(gè)塑料上蓋27蓋住，液體進(jìn)出通道設(shè)于塑料上蓋27或基座25之上，而基因芯片雜交室2濕度保持緩沖液存儲(chǔ)小孔29在泳滲PCB芯23上，并由塑料上蓋27相應(yīng)位置的小孔通往外界，該小孔由一個(gè)橡皮小塞封堵其出口，基因芯片自下而上分別由玻片、金屬鉻(1～100鈉米，可以是3鈉米)、銀(或金10～1000鈉米，可以是40、50、75鈉米等)、石英(1～100鈉米，可以是3鈉米或5鈉米)等鍍層構(gòu)成，在石英鍍層表面經(jīng)過(guò)硅烷化、胺基或醛基等表面修飾工藝形成可以直接固化基因分子的基因芯片玻片，再經(jīng)基因芯片點(diǎn)制工藝形成基因芯片26，基因芯片表面也可以僅分別鍍一層鉻和金，無(wú)須鍍一層石英膜，之后直接在金表面固定核酸分子，點(diǎn)制基因芯片。
9.一種基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)分別有主要從事基因芯片在泳滲溶液體系操縱系統(tǒng)作用下進(jìn)行雜交、標(biāo)記、洗脫等分子生物學(xué)過(guò)程高效處理的HCL儀、HCL儀專用的HCL試劑盒19、基因芯片雜交室2和主要從事基因芯片的信號(hào)激發(fā)、產(chǎn)生、采集、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析的SPR-CCD信息檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等幾個(gè)部分。
10.一項(xiàng)關(guān)于權(quán)利要求9中的基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)應(yīng)用的權(quán)利要求，它可以應(yīng)用于下列領(lǐng)域的基因分析各種基因組研究、教學(xué)、藥物篩選基因組研究、各種臨床診斷基因分析、各種工商、醫(yī)療衛(wèi)生用品及環(huán)境檢疫、疫情調(diào)查或普查、各種法學(xué)基因身份鑒定、血液安全檢查、國(guó)防領(lǐng)域的防生物戰(zhàn)劑等。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到基因芯片的雜交，標(biāo)記，洗脫，信號(hào)檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析技術(shù)。本發(fā)明提供一整套通過(guò)聚苯乙烯熒光微球、補(bǔ)骨脂素進(jìn)行的基因芯片雜交信號(hào)的特異性放大標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)可以將基因芯片上的雜交信號(hào)擴(kuò)大幾個(gè)數(shù)量級(jí)以上，從而將雜交核酸的檢測(cè)能力提升到單分子水平。本發(fā)明還提供了一種提高上述各反應(yīng)過(guò)程中溶液和分子運(yùn)動(dòng)操縱效率的泳滲離子及溶液體系操縱技術(shù)以及用于高效屏蔽背景光或激發(fā)光噪音的表面等離子體共振激發(fā)技術(shù)。作為這些技術(shù)的一種最佳應(yīng)用的組合——基因芯片聯(lián)合處理系統(tǒng)有自動(dòng)實(shí)現(xiàn)各反應(yīng)過(guò)程的HCL儀、HCL試劑盒19、基因芯片雜交室2和SPR－CCD信號(hào)檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等幾部分。其優(yōu)勢(shì)在于系統(tǒng)及其運(yùn)行成本都很低、過(guò)程聯(lián)合處理能力較高，操作簡(jiǎn)易，因而為基因芯片在臨床診斷、工商及環(huán)境檢疫、制藥和國(guó)防等領(lǐng)域的普及應(yīng)用提供了可行的技術(shù)條件。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1492051SQ0114265
公開(kāi)日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2002年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者宋克, 宋 克 申請(qǐng)人:宋克, 宋 克