專利名稱：使用密碼子掃描規(guī)則的dna芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA芯片，更具體而言，涉及被設(shè)計用于檢測在整個由本發(fā)明的密碼子掃描規(guī)則確定的待調(diào)查密碼子區(qū)域中發(fā)生的突變的寡核苷酸探針的制備方法、使用由所述方法制備的探針制備DNA芯片的方法、由所述方法制備的DNA芯片和使用所述DNA芯片檢測遺傳突變的方法。
背景技術(shù)：
由于人類基因組計劃正接近完成，生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)——基因，正越來越受到關(guān)注。在所估計的約100,000個人類基因中，約10,000個基因已被識別，其中大多數(shù)與遺傳疾病直接相關(guān)。因此，對于由突變的疾病相關(guān)基因所表達的蛋白的功能失調(diào)所引起的遺傳疾病的研究和所述疾病的診斷方法，受到越來越多的關(guān)注。如果現(xiàn)在可及早識別出遺傳疾病，則能夠避免其發(fā)病，但是，由于缺乏診斷工具和有關(guān)疾病的信息而限制了對該疾病的早期診斷。鑒于以上情況，有必要開發(fā)出解決所述問題的技術(shù)，最近出現(xiàn)的DNA芯片技術(shù)正是對上述問題的解決方法之一。
例如，其中將大量DNA探針固定在固相載體如玻璃的表面上的DNA芯片技術(shù)，由于其在多種條件下具有常規(guī)技術(shù)所不具有的滿足快速和大量分析的要求的優(yōu)點，而正在成為關(guān)注的焦點(參見Shena，M.等，Science，270467-470，1995)。DNA芯片的應(yīng)用范圍分成兩個主要的領(lǐng)域，即對基因表達的分析和對突變例如SNP(單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象)的分析(參見Halushka，M.等，Nature Genetics，22239-247，1999)。當(dāng)前，最普遍用于分析SNP或突變的DNA芯片是稱為GeneChipTM的芯片，其由美國加州的Affymetrix制造(參見www.affymetrix.com)。GeneChipTM是利用用于生產(chǎn)半導(dǎo)體的照相平版印刷法和用于在固相載體上原位合成DNA的固相合成技術(shù)制造的，這些用于制造攜帶超過100,000個DNA探針的DNA芯片的技術(shù)具有以下優(yōu)點，它能以同步方式制備統(tǒng)一量的多種DNA片段。但是，這些照相平版印刷技術(shù)需要使用光掩膜，而這會需要更多的勞動并給制造商帶來高成本。此外，該技術(shù)具有以下缺點在整個制造DNA芯片的過程中需要大量的設(shè)備，使得DNA芯片的制造成本很高；不可能只制備各種所需的探針；和不能將其他探針補充到已制得的芯片中?；谶@些原因，照相平版印刷術(shù)并不適合被選為制造用于選擇性地篩選目的突變的DNA芯片的技術(shù)。
另一方面，用于將預(yù)先合成的感興趣的探針固定在固相載體上的定位技術(shù)，已用于制造DNA芯片。在定位技術(shù)中，固定探針的方法根據(jù)所使用的探針的類型而改變對于利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物作為探針的cDNA芯片，可用化學(xué)反應(yīng)將探針固定在載體上，所述化學(xué)反應(yīng)在PCR產(chǎn)物的胸腺嘧啶基團和固相表面上的聚賴氨酸的氨基基團之間進行(參見Southern E.等，Nature Genetics，215-9，1999)，但是，對于利用DNA片段為探針的DNA芯片，上述化學(xué)反應(yīng)不能用于固定探針，因為DNA片段的長度短(約20nt)。由于存在上述問題，目前只有由照相平版印刷術(shù)制造的、其中探針在固相載體上原位合成的DNA芯片得以商品化，而通過將DNA片段定位到尼龍膜或包被有聚合物凝膠的玻璃上而制得的DNA芯片未得以商品化。因此，在本領(lǐng)域中急切需要的是開發(fā)出在不使用昂貴的照相平版印刷技術(shù)來固定DNA探針的情況下能用于診斷突變的DNA芯片。
迄今為止，已報道了兩種針對檢測突變所需的DNA探針的設(shè)計的方法(參見Hacia，J.D.等，Nature Genetics，2142-47，1999)，一個是信號規(guī)則的獲得，其中對所有可能的突變制備了互補探針，另一個是信號規(guī)則的丟失，其中通過靶DNA節(jié)段的掃描檢測一個核苷酸在某時與某一長度的寡核苷酸探針的互補結(jié)合。這些規(guī)則不用于檢測所選突變，而用于通過利用大量的由照相平版印刷術(shù)制造的探針分析整個核苷酸序列來篩選突變。
信號規(guī)則的獲得即為，被發(fā)現(xiàn)的是只針對與被調(diào)查區(qū)域的序列完美匹配的探針的信號，且針對每一突變位置制備了插入有所有可能的核苷酸(A、G、T和C)的DNA探針。因此，可制備所有可能數(shù)目的與靶DNA節(jié)段互補且在特定位置上存在替換、插入和缺失的序列變化的寡核苷酸探針。目前，盡管使用此方法所設(shè)計的探針進行的核苷酸序列分析顯示出高于90％的準確度，但存在以下問題，即很難排除在插入突變情況下的堿基對錯配，以及因在雜交反應(yīng)中不可避免地發(fā)生錯配而實際上不可能在不對雜交和洗滌條件進行優(yōu)化的情況下檢測和分析突變。
信號規(guī)則的丟失即為，檢測到因被調(diào)查DNA和探針之間的堿基對錯配而導(dǎo)致的雜交信號丟失，且其特征在于探針的重疊，所述探針是以統(tǒng)一長度制備的且一次只有一核苷酸改變。當(dāng)使用信號規(guī)則的丟失時，相對于野生型靶DNA，雜合突變將顯示出50％的信號強度丟失，純合突變將顯示出100％的信號強度丟失。通過使用信號規(guī)則的丟失，可在許多重疊的探針中發(fā)現(xiàn)互補結(jié)合的丟失，從而能保真地檢測突變。但是，信號分析的丟失具有以下缺點，即突變不可識別，和必須通過后續(xù)對在特征丟失周圍的區(qū)域測序來確定突變的特性。同樣，此方法中的另一局限在于，為了區(qū)分純合突變和雜合突變，應(yīng)保持固定探針的量，而這只可通過昂貴的照相平版印刷技術(shù)達到。
因此，為了解決上述問題，需要開發(fā)出能以準確和經(jīng)濟的方式識別突變的DNA芯片。
發(fā)明概述本發(fā)明人開發(fā)出了能以準確和經(jīng)濟的方式識別突變的DNA芯片，由此，將含有待識別的突變的一組三個連續(xù)核苷酸選作待調(diào)查突變密碼子，基于被用于選擇待調(diào)查密碼子的密碼子篩選規(guī)則來制備探針，利用用于將所述探針固定在目的位置上的定位技術(shù)和胺-醛反應(yīng)來制備DNA芯片，并且，他們已發(fā)現(xiàn)可以以準確又經(jīng)濟的方式利用由所述方法制備的DNA芯片來識別突變。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供利用可識別遺傳突變的密碼子篩選規(guī)則來制備探針的方法。
本發(fā)明的第二個目的是提供利用由所述方法制備的探針來制備DNA芯片的方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供由所述方法制備的DNA芯片。
本發(fā)明的第四個目的是提供利用所述DNA芯片檢測遺傳突變的方法。
附圖簡述基于以下描述和附圖，本發(fā)明的上述和其他目的和特征將變得很明顯，其中

圖1是固定有12種探針的DNA芯片的圖示，所述探針各自針對14個待調(diào)查區(qū)域。
圖2a是顯示在進行結(jié)合和洗滌處理之前的DNA芯片的照片。
圖2b是顯示在進行結(jié)合和洗滌處理之后的DNA芯片的照片。
圖3a是顯示對正常個體突變進行分析的圖。
圖3b是顯示對威爾遜病患者突變進行分析的圖。
圖4a是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片對經(jīng)常在韓國人群中的威爾遜病患者中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖。
圖4b是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片對經(jīng)常在西方人群中的威爾遜病患者中和在磷酸結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖。
圖4c是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片對在ATP結(jié)合域中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖。
圖4d是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片對在鉸鏈域中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖。
圖5是顯示對患者DNA中的Arg778Leu突變進行分析的圖。
圖6是顯示對經(jīng)多重PCR擴增的來自正常個體的DNA進行分析的圖。
圖7a是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片對患者DNA中的Ala874Val突變進行分析的圖。
圖7b是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片對患者DNA中的Leu1083Phe突變進行分析的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明人通過利用定位技術(shù)將使用密碼子掃描規(guī)則設(shè)計并制備的探針固定在固相表面上，制備了DNA芯片。密碼子掃描規(guī)則的優(yōu)點在于，具有獲得信號規(guī)則和丟失信號規(guī)則的雙重優(yōu)點以彌補在用各種規(guī)則設(shè)計的探針中所發(fā)現(xiàn)的問題。使用所述規(guī)則制備探針的方法包括以下步驟選擇待調(diào)查突變密碼子；和制備探針，其應(yīng)確保待調(diào)查突變密碼子位于寡核苷酸探針最中心的位置，所述寡核苷酸探針由至少7個核苷酸組成，其余的序列與正常個體中的保持相同，并且，使胺基團與探針的3’末端連接。
制備本發(fā)明探針的方法在以下步驟中進一步說明。步驟1選擇待調(diào)查突變密碼子將在特定遺傳疾病患者中發(fā)現(xiàn)的突變密碼子選作待調(diào)查突變密碼子當(dāng)選擇了在特定遺傳疾病患者中發(fā)現(xiàn)的待調(diào)查密碼子時，如果在基因中發(fā)生突變，則將含有已變核苷酸序列的突變密碼子選作待調(diào)查突變密碼子，如果氨基酸改變，則將編碼突變氨基酸的密碼子選作待調(diào)查突變密碼子，從而對一種特定遺傳疾病產(chǎn)生N個突變密碼子，其中N是特定遺傳疾病中突變密碼子的自然數(shù)。步驟2制備探針制備探針，其方法應(yīng)確保待調(diào)查突變密碼子位于寡核苷酸探針最中心的位置，所述寡核苷酸探針由至少7個核苷酸組成，其余的序列與正常個體中的保持相同，并且，胺基團與探針的3’末端連接其中，在上面選擇的N個待調(diào)查密碼子中，一個特定密碼子位于寡核苷酸探針最中心的位置，所述寡核苷酸探針由至少7個核苷酸組成，且其余的序列與正常個體中的保持相同，即，以以下方式設(shè)計一組共4個探針，即各探針在所述待調(diào)查密碼子的第一個核苷酸的位置上具有A、G、T或C，且密碼子的其余2個核苷酸與正常個體中的保持相同，以以下方式設(shè)計另一組共4個探針，即各探針在所述待調(diào)查密碼子的第二個核苷酸的位置上具有A、G、T或C，且密碼子的其余2個核苷酸與正常個體中的保持相同，以以下方式設(shè)計另一組共4個探針，即各探針在所述待調(diào)查密碼子的第三個核苷酸的位置上具有A、G、T或C，且密碼子的其余2個核苷酸與正常個體中的保持相同，最終，得到12種針對待調(diào)查突變密碼子的探針。
利用以上方法，制造可準確檢測和識別突變的DNA芯片是可能的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，通過使用由至少7個核苷酸組成并使待調(diào)查靶核苷酸位于最中心位置的寡核苷酸，可完成對雜交特異性的最佳識別。
此外，通過使用本發(fā)明的密碼子規(guī)則，可設(shè)計出針對多種遺傳疾病的DNA探針，具體而言，通過針對多(D)種遺傳疾病重復(fù)上述步驟，可設(shè)計出總共12N·D個探針。
制備本發(fā)明DNA芯片的方法包括，利用定位技術(shù)將上面制備的探針固定在固相表面上的步驟將上面制備的與胺相連的探針溶解在1-7X、優(yōu)選2-5X、更優(yōu)選3X SSC(0.45M NaCl、15mM C6H5Na3O7，pH7.0)的緩沖溶液中，然后用微排列儀將之定位到醛衍生化的固相表面上，接著經(jīng)胺-醛反應(yīng)將探針固定在固相表面上。其中，用于固定探針的固相材料優(yōu)選包括但不限于玻璃板，探針的濃度優(yōu)選10pmol/μl或更高，更優(yōu)選50pmol/μl或更高，最優(yōu)選100pmol/μl或更高，探針中胺基團與醛衍生化固相表面的結(jié)合反應(yīng)的條件為，濕度70-90％，優(yōu)選80％，時間4-8小時，優(yōu)選5-7小時，最優(yōu)選6小時。
應(yīng)用本發(fā)明的DNA芯片檢測遺傳突變的方法包括以下步驟使用待調(diào)查DNA和用熒光物質(zhì)標記的引物進行PCR，以獲得用熒光物質(zhì)標記的樣品DNA；在10-37℃下使樣品DNA與DNA芯片結(jié)合3-13小時，然后洗滌DNA芯片；以及測量在經(jīng)洗滌的DNA芯片上殘留的熒光信號。其中，樣品DNA與DNA芯片的結(jié)合在以下條件下完成3-10X結(jié)合緩沖液(SSPE0.15M NaCl、10mM NaH2PO4·H2O、1mMEDTA，pH 7.4)，溫度10-37℃、優(yōu)選20-30℃、最優(yōu)選35℃，時間6-10小時、最優(yōu)選8小時或更長。DNA芯片優(yōu)選依次用第一洗滌溶液(3XSSPE)洗滌5分鐘，用第二洗滌溶液(2X SSPE)洗滌5分鐘。
由于可通過增加DNA芯片的集成化而將本發(fā)明的DNA芯片制成能成功地平行識別超過10000種所選突變，因此，它可用于診斷所有類型的遺傳突變相關(guān)性疾病，和識別SNP等突變。此外，通過分析被調(diào)查密碼子周圍的區(qū)域，可避免在對結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理時因堿基對錯配而出現(xiàn)差錯，所述堿基對錯配在使用常規(guī)規(guī)則設(shè)計的DNA探針時發(fā)生。此外，針對純合突變只檢測到突變信號，對雜合突變則同時檢測到正常和突變信號，這就有可能準確地檢測和識別突變，例如將純合突變和雜合突變區(qū)分開。
作為本發(fā)明的例子，按照上述步驟制造了用于診斷屬于遺傳疾病的威爾遜病的DNA芯片制備DNA探針以調(diào)查編碼威爾遜病患者中突變氨基酸的遺傳密碼子。威爾遜病是一種眾所周知的遺傳障礙，由針對銅轉(zhuǎn)運蛋白的基因的突變引起，特征為肝中銅的細胞內(nèi)積聚和后續(xù)的肝和神經(jīng)異常。迄今為止，對威爾遜等遺傳疾病的診斷一直如下進行用各外顯子特異性PCR標記物擴增基因(參見Tumer，Z.等，Am.J.Hum.Genet.，6063-71，1997)，隨后分析核苷酸序列以和公開的突變數(shù)據(jù)庫進行比較，基本上需要進行用于制備外顯子DNA和用于其測序的非常耗時又昂貴的PCR步驟，并從整個序列中識別出每一個突變。
本發(fā)明人基于密碼子篩選規(guī)則制備了DNA芯片用于診斷威爾遜病，并檢查了相對于復(fù)雜又昂貴的常規(guī)診斷方法，本發(fā)明方法是否能方便、簡單、準確且經(jīng)濟地利用DNA芯片對威爾遜病進行診斷首先，選擇編碼在威爾遜病患者中發(fā)現(xiàn)的已變氨基酸的遺傳密碼子作為待調(diào)查突變密碼子，并基于本發(fā)明的密碼子篩選規(guī)則來制備DNA探針。通過定位以及胺和醛間的結(jié)合反應(yīng)，將探針固定在玻璃板上，以制造用于診斷威爾遜病的DNA芯片。然后，通過使用多重PCR制備被調(diào)查DNA區(qū)域。然后，基于對用來自正常個體的DNA獲得的結(jié)果進行分析的方針，成功地識別出來自患者DNA。此外，本發(fā)明人制備了可識別16種突變的DNA芯片，所述16種突變包括通過向先前制造的DNA芯片再補充2種探針而在韓國患者中發(fā)現(xiàn)的2種其他突變，并且發(fā)現(xiàn)所述DNA芯片可成功地用于識別威爾遜病中的遺傳突變，這證明DNA芯片可用于針對多種遺傳疾病。
因此可預(yù)期，制備本發(fā)明DNA芯片的方法和經(jīng)定位的探針固定技術(shù)可用于診斷多種遺傳突變相關(guān)性疾病，平行診斷多種遺傳疾病，和識別與突變相關(guān)的威爾遜病。
在以下實施例中對本發(fā)明進行進一步說明，這些實施例不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解，通過使用密碼子篩選規(guī)則制備的用于診斷遺傳疾病的DNA芯片處于本發(fā)明的范圍中。實施例1選擇待調(diào)查突變?yōu)榱酥圃煊糜趯σ鹜栠d病的突變進行診斷的DNA芯片，選擇待調(diào)查突變。為了成功診斷威爾遜病，從NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)聯(lián)合基因數(shù)據(jù)庫、GenBank和OMIN(Online Medelian Inheritance inMan)獲得有關(guān)于ATP7B蛋白的核苷酸和氨基酸序列的信息，所述ATP7B蛋白是導(dǎo)致威爾遜病的物質(zhì)，并獲得有關(guān)于疾病的等位基因變體的信息。此外，基于上面得到的氨基酸序列信息和得自公開文獻(參見Kim，E.K.，博士論文，KAIST，1999)的報告，檢查ATP7B的功能性基元。蛋白的功能性基元是一種代表蛋白特定功能的短鏈氨基酸序列，在ATP7B中已發(fā)現(xiàn)了以下功能性基元在蛋白N末端一側(cè)的銅結(jié)合性基元GMTCXXC、與TGES/A氨基酸序列同源的轉(zhuǎn)導(dǎo)域、陽離子通道基元CPC、磷酸結(jié)構(gòu)域DKTGT、在蛋白C末端一側(cè)的ATP結(jié)合域TGDN和鉸鏈區(qū)MXGDXNDX，其中X指任何氨基酸，而非特定氨基酸。根據(jù)HGMD(人類基因突變數(shù)據(jù)庫)，已知威爾遜病是由12種變異的ATP7B蛋白引起的，所述變異的ATP7B蛋白由12種基因編碼，并在功能上很重要的結(jié)構(gòu)域中發(fā)生替換突變，所述功能上很重要的結(jié)構(gòu)域包括磷酸結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，在12種蛋白中發(fā)現(xiàn)的突變之中，已報道Asn1270在韓國威爾遜病患者中發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明人將導(dǎo)致14種變異蛋白的14種替換突變選作待調(diào)查突變，包括代表韓國患者中的威爾遜病等位基因中的37.5％的Arg778Leu(參見Kim，E.K.等，Hum.Mutat.，11275-278，1998)和在西方人群中的患者中發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)大的出現(xiàn)頻率的His1069Gln(參見Payne，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9510854-10859，1998)。實施例2通過PCR擴增被調(diào)查區(qū)為了分析上述14種突變，分別制備了4對PCR引物。為了擴增在韓國患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的778Arg區(qū)(91bp)，設(shè)計了引物15’-GCCCTGTGACATTCTTCGA-3’(SEQ ID NO1)和引物25’-GCTGCTGTTACCTTTGCCA-3’(SEQ ID NO2)。將熒光素亞磷酰胺(phosphoamidite)(F，Molecular Dynamics，CA，USA)連接到探針互補鏈的5’-末端的羥基上。為了擴增均位于同一外顯子(173bp)中的在西方患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的1069His區(qū)和磷酸結(jié)構(gòu)域，使用引物35’-GATGTTTGACAAGACTGGCA-3’(SEQ ID NO3)和引物45’-CCTCTTTACAGTATTTGGTGA-3’(SEQ ID NO4)。對ATP結(jié)合域(128bp)進行PCR，使用引物55’-CAATCGCAGACGCTGTCAA-3’(SEQID NO5)和引物65’-CTGTACCTGGGTGGCAATA-3’(SEQ ID NO6)，對鉸鏈區(qū)進行PCR，使用引物75’-TAAAGGGAAGAAAGTCGCCA-3’(SEQ ID NO7)和引物85’-GCTGCCTCGATGGCCACA-3’(SEQ ID NO8)。PCR中使用超過100ng的來自血液樣品的DNA作為模板，總體積為50μl，條件如下96℃變性8分鐘，共1個循環(huán)；92℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸30秒，共30個循環(huán)；加72℃延伸7分鐘，共1個循環(huán)。
為了避免引物二聚，在可能的情況下，將與DNA聚合酶結(jié)合的引物3’-末端統(tǒng)一設(shè)計成腺嘌呤，并將所有引物設(shè)計成在約58℃退火，從而有可能同時擴增所有的4種模板。實施例3制備用于識別突變的探針為了識別上述14種替換突變，使用上述密碼子篩選規(guī)則制備探針即，為了分析導(dǎo)致一種氨基酸替換的核苷酸序列變異，將包括限定一個氨基酸的3個核苷酸的一個密碼子選作待調(diào)查密碼子。并且，為了調(diào)查各所選密碼子，對密碼子的每一個核苷酸設(shè)計了一組共4種15聚體-探針，從而使15聚體-探針最中心的位置即第8位被A、G、T或C替換，而探針中的其他序列保持不變，最終得到12種探針用于分析一種氨基酸突變。
對探針進行設(shè)計，從而將探針N-1(野生型密碼子的第1個核苷酸)、探針N-5(野生型密碼子的第2個核苷酸)和N-9(野生型密碼子的第3個核苷酸)定為參照(對照)探針，其中這些探針中的核苷酸序列與野生型密碼子互補，其中N指待調(diào)查氨基酸的編號(自然數(shù)1-14)，將該策略用于所有的待調(diào)查氨基酸。例如，在Arg778(命名為氨基酸1)的情況下，設(shè)計出探針1-1(C位于探針最中心位置的第8位)、1-5(G)和1-9(G)，以檢測正常密碼子的核苷酸序列，而用上述參照探針，Arg778Leu突變不能給出任何信號，它只和具有與CTG互補的序列的探針1-8雜交。
利用上述相同的方法，針對His1069(氨基酸2)、Gly1035(氨基酸3)、Arg1038(氨基酸4)、Arg1041(氨基酸5)、Gly1213(氨基酸6)、Val1216(氨基酸7)、Thr1220(氨基酸8)、Asp1222(氨基酸9)、Gly1266(氨基酸10)、Asp1267(氨基酸11)、Asn1270(氨基酸12)、Pro1273(氨基酸13)和Ala1278(氨基酸14)設(shè)計探針，在調(diào)查上述各氨基酸的探針中，2-10(His1069Gln)、3-8(Gly1035Val)、4-6(Arg1038Lys)、5-4(Arg1041Trp)、6-8(Gly1213Val)、7-2(Val1216Met)、8-8(Thr1220Met)、9-4(Asp1222Tyr)、10-2(Gly1266Arg)、10-8(Gly1266Val)、11-6(Asp1267Ala)、12-7(Asn1270Ser)、13-8(Pro1273Leu)和14-8(Ala1278Val)是用于檢測突變的探針。在使用Aminolinker柱(Cmachem，Glasgow，Scotland)合成上述探針的過程中，將具有胺殘基的核苷酸用作3’-末端的第一個核苷酸。實施例4固定DNA探針為了將在實施例3中制備的探針固定到玻璃板上，在3XSSC(0.45M NaCl、15mM C6H5Na3O7，pH 7.0)的緩沖條件下，利用微排列儀將探針定位到(參見Yoon，S.H.等，J.Microbiol.Biotechnol.，10(1)21-26，2000)用醛衍生化的玻璃板(CEL Associates，Inc.，Houston，Texas，USA)上，然后在超過80％濕度的條件下進行胺-醛結(jié)合反應(yīng)2小時，接著溫育6小時。在此，將參照探針(對照)以10μM的濃度固定，將用于檢測突變的探針以100μM的濃度固定(參見圖1)。為了簡便地測量信號，用熒光素亞磷酰胺標記各探針的5’末端。圖1是固定有針對所述14個待詢密碼子的14組探針的DNA芯片的圖示，每組探針中有12個探針(每一個密碼子12個探針)，其中在0.8cm2的面積上在預(yù)計位置上有序地裝有共288個探針，包括針對突變序列的168個探針和針對參照序列的120個探針。在此例中，暗區(qū)代表針對正常核苷酸序列的探針，C代表對照探針。
為了評價探針在玻璃板上的固定程度，進行雜交和洗滌。在37℃，將不包括熒光素標記DNA的芯片在10μl的6X結(jié)合緩沖液(SSPE0.15M NaCl、10mM NaH2PO4·H2O、1mM EDTA，pH 7.4)中溫育12小時，然后依次用3X SSPE洗滌5分鐘，2X SSPE洗滌5分鐘，1X SSPE洗滌5分鐘，然后使用ScanArray5000(GSI Lumonics Inc.，Bedford，MA，USA)檢測剩余的探針(參見圖2a和2b)。圖2a是顯示結(jié)合和洗滌處理前的DNA芯片的照片，圖2b顯示上述處理后的DNA芯片的照片，通過用剩余的對照探針進行判斷，已發(fā)現(xiàn)，在結(jié)合和洗滌之后，在DNA上保留了其數(shù)量足以給出有意義結(jié)果的探針。實施例5使用報告體DNA片段評價DNA芯片的官能度為了評價上面制備的DNA芯片的官能度和為了優(yōu)化雜交條件，制備了可與固定探針互補結(jié)合的報告體DNA片段。選擇在韓國威爾遜病患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的Arg778Leu突變包括在突變報告體DNA片段中，然后，分別制備了正常個體的報告體和突變患者的報告體。正常個體的報告體的核苷酸序列是5’-CAGCCACCGGCCCAGG-3’(SEQ IDNO9)，威爾遜病患者的報告體的核苷酸序列是5’-CCAGCCACAGGCCCAGG-3’(SEQ ID NO10)，其中用熒光素亞磷酰胺標記了所有報告體的5’-末端以給出熒光信號。
分別在室溫、30℃和37℃下，將含上面制備的0.1μM各報告體DNA片段的10ml 3X、4X、5X、6X和7XSSPE與上面制造的DNA芯片一起溫育4小時，以使其互補結(jié)合，然后用3X SSPE洗滌5分鐘，2X SSPE洗滌5分鐘，1X SSPE洗滌5分鐘，用ScanArray5000測量信號的強度(參見圖3a和3b)。圖3a是顯示對正常個體突變進行分析的圖，圖3b是顯示對威爾遜病患者突變進行分析的圖。如圖3a所示，代表正常密碼子的探針1-1、1-5和1-9正如所料給出雜交信號，當(dāng)用QuantArray(GSI Lumonics Inc.，Bedford，MA，USA)分析信號強度時，這三個探針還顯示出比其他探針更強的信號。如圖3所示，突變報告體只在代表突變密碼子的探針1-8的情況下產(chǎn)生信號。從這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6X SSPE和0℃的條件下，可獲得最強的信號強度。實施例6使用單鏈PCR分析來自正常個體的DNA和建立結(jié)果分析指南利用單鏈PCR分別擴增正常個體的14個被調(diào)查區(qū)，然后使用上面制造的DNA芯片分析突變。在兩種引物存在下，PCR擴增被調(diào)查區(qū)的DNA片段，然后將PCR產(chǎn)物作為模板用于另一PCR，其中使用帶有熒光標記的一個引物以獲得熒光標記DNA。將本發(fā)明的DNA芯片與含有1μl上面得到的單鏈PCR產(chǎn)物的10μl 6X SSPE在30℃溫育4小時，以誘發(fā)雜交，然后用3X SSPE洗滌5分鐘，用2X SSPE洗滌5分鐘。使用ScanArray5000測量信號(參見圖4a、4b、4c和4d)。圖4a是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片(探針1)對經(jīng)常在韓國人群中的威爾遜病患者中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖，圖4b是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片(探針2至5)對經(jīng)常在西方人群中的威爾遜病患者中和在磷酸結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖，圖4c是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片(探針6至9)對在ATP結(jié)合域中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖，圖4d是顯示使用本發(fā)明的DNA芯片(探針10至14)對在鉸鏈域中發(fā)現(xiàn)的突變進行分析的圖。如圖4a-4b所示，在誘發(fā)各被調(diào)查區(qū)與各種探針互補結(jié)合后，在778Arg(探針1)、1069His(探針2)、1038Arg(探針4)、1041Arg(探針5)、1213Gly(探針6)、1216Val(探針7)、1220Thr(探針8)、1222Asp(探針9)、1270Asn(探針12)、1273Pro(探針13)和1278Ala(探針14)的情況下，來自正常個體的DNA顯示出陽性信號，表明被調(diào)查DNA是正常的。
基于上述結(jié)果，確定在含有正常氨基酸密碼子的至少兩種探針中顯示出最強信號的情況是“正常的”，確定在全部探針(12個探針對1個氨基酸)中含有突變密碼子的探針顯示出最強信號的情況是“突變”，確定同時顯示正常信號和突變信號的情況是“雜合突變”，確定不顯示正常信號而顯示突變信號的情況是“純合突變”。實施例7使用單鏈PCR分析來自威爾遜病患者的DNA利用單鏈PCR擴增來自威爾遜病患者的DNA的14個被調(diào)查區(qū)，然后使用本發(fā)明的DNA芯片進行分析(參見圖5)。圖5是顯示對患者DNA中的Arg778Leu(探針1)突變進行分析的圖。在誘發(fā)各被調(diào)查區(qū)與各探針的互補結(jié)合之后，在經(jīng)常在韓國患者中發(fā)現(xiàn)的Arg778Leu中檢測到替換突變，并發(fā)現(xiàn)突變是雜合突變，其中一個染色體攜帶正常序列而另一個攜帶突變序列。假設(shè)該患者DNA除Arg778Leu以外的其他被調(diào)查區(qū)是正常的，在基于這種假設(shè)進行的分析中，1069His(探針2)、1038Arg(探針4)、1041Arg(探針5)、1213Gly(探針6)、1216Val(探針7)、1220Thr(探針8)、1222Asp(探針9)、1270Asn(探針12)、1273Pro(探針13)和1278Ala(探針14)顯示出“正常的”結(jié)果。
因此，用所述方法制造的DNA芯片可用于檢測威爾遜病患者的DNA中的突變。實施例8使用多重PCR分析來自正常個體的DNA利用實施例2中所述的多重PCR擴增來自正常個體的DNA的14個被調(diào)查區(qū)，然后使用本發(fā)明的DNA芯片進行分析。即，制備含有1μl多重PCR產(chǎn)物的10μl 6X SSPE，在98℃熱處理5分鐘以制備DNA單鏈，在冰浴上冷卻1分鐘，然后在30℃與本發(fā)明的DNA芯片退火至少8小時，接著用3X SSPE洗滌5分鐘，用2X SSPE洗滌5分鐘，使用ScanArray5000進行分析(參見圖6)。圖6是顯示對經(jīng)多重PCR擴增的來自正常個體的DNA進行分析的圖。在14種突變中，探針1、3、4、6、7和12顯示出正常的結(jié)果，由此，通過使用本實施例確定的條件，可簡便地同時平行分析大量不同的被調(diào)查區(qū)，且通過使用一個DNA芯片可對除威爾遜病以外的其他遺傳疾病進行診斷。實施例9通過補充探針來制造DNA芯片用于診斷韓國人群中的威爾遜病為了更準確地診斷威爾遜病和發(fā)現(xiàn)將更多探針補充到DNA芯片中的可能性(其正是本發(fā)明DNA芯片獨特的優(yōu)點)，又制備了針對突變Ala874Val(氨基酸15)和針對Leu1083Phe(氨基酸16)的探針，這些突變是在威爾遜病患者中發(fā)現(xiàn)的另一些突變。通過使用與用于先前探針制備的規(guī)則相同的規(guī)則，制備了所述的兩個探針，并制造了檢測16種突變的新DNA芯片，從而用探針16-8可對Ala874Val突變檢測到突變信號，用探針17-4可對Leu1083Phe突變檢測到突變信號。
制備了其他引物，以獲得含有被調(diào)查突變區(qū)的2個DNA片段。使用引物95’-CTACGTCTAGGAGAAGCCA-3’(SEQ ID NO11)和引物105’-GAGCACAGAGCCATGTGCA-3’(SEQ ID NO12)通過PCR擴增含有Ala874Val突變的區(qū)域，使用引物115’-CTTTCACTTCACCCCTCT-3’(SEQ ID NO13)和引物125’-TGCCTGGAAGTCCGTGCA-3’(SEQ ID NO14)通過PCR擴增含有Leu1083Phe突變的區(qū)域。對PCR產(chǎn)物進行單鏈PCR以制備單鏈DNA，并對其與DNA芯片上的探針的特異性雜交進行評價(參見圖7a和7b)。圖7a是顯示使用本實施例中制造的DNA芯片對患者DNA中的Ala874Val突變進行分析的圖，圖7b是顯示使用本實施例中制造的DNA芯片對患者DNA中的Leu1083Phe突變進行分析的圖。如圖7a所示，成功地測定了患者的Ala874Val突變?yōu)殡s合突變，如圖7b所示，成功地測定了另一患者的Leu1083Phe突變也為雜合突變。
如上述結(jié)果所示，每當(dāng)揭示了引起威爾遜病的其他突變，就可將更多的待調(diào)查突變的探針加到本發(fā)明的DNA芯片上，并且已發(fā)現(xiàn)，通過將針對威爾遜病和針對其他遺傳疾病的探針加到本發(fā)明的DNA芯片上，制造出用于同時診斷多種遺傳疾病的DNA芯片是可能的。實施例10將DNA芯片應(yīng)用于未知患者從不知是正常而是患病的兩韓國人(患者A和患者B)中取得血液樣品，使用本發(fā)明的DNA芯片針對遺傳疾病分析該血液樣品。將實施例9中制造的DNA芯片用于診斷未知患者，揭示出患者A不具有所有16個氨基酸的任何突變，患者B具有Arg778Leu和Ala874Val的雜合突變。為了確定上述方法的可靠性，對患者DNA的被調(diào)查區(qū)進行常規(guī)核苷酸測序，從而證實患者A是正常個體，且患者B是威爾遜病患者。由此發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明的DNA芯片，可成功識別威爾遜病患者DNA中的突變。
正如上面清楚地說明和證明的，本發(fā)明提供了被設(shè)計用于檢測在整個密碼子掃描規(guī)則確定的待調(diào)查密碼子區(qū)域中發(fā)生的突變的寡核苷酸探針的制備方法、使用由所述方法制備的探針制備DNA芯片的方法、由所述方法制備的DNA芯片和使用所述DNA芯片檢測遺傳突變的方法。使用密碼子掃描規(guī)則制備探針的方法包括以下步驟選擇待調(diào)查突變密碼子；和制備探針，其應(yīng)確保待調(diào)查突變密碼子位于由至少7個核苷酸組成的寡核苷酸探針最中心的位置，其余的序列與正常個體中的保持相同，并且，將胺基團與探針的3’末端連接。制備本發(fā)明DNA芯片的方法包括利用定位技術(shù)將上面制備的探針固定在固相表面上的步驟，使用所述DNA芯片檢測遺傳突變的方法包括以下步驟使熒光標記的樣品與DNA芯片反應(yīng)，洗滌，并測量在洗滌后的DNA芯片上保留的熒光信號。通過使用本發(fā)明的DNA芯片，可避免在對結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理時因堿基對錯配而出現(xiàn)差錯，所述堿基對錯配在使用常規(guī)規(guī)則設(shè)計的DNA探針時發(fā)生，可將純合突變與雜合突變區(qū)分開，可以快速又準確的方式檢測到并識別出引起各種遺傳疾病的突變，并且，可將使用密碼子掃描規(guī)則的DNA芯片用于診斷所有遺傳突變相關(guān)性疾病和識別SNP等突變。
序列表<110> 韓國科學(xué)技術(shù)院(KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)<120> 使用密碼子掃描規(guī)則的DNA芯片<160> 14<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物1<400> 1gccctgtgac attcttcga 19<210> 2<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物2<400> 2gctgctgtta cctttgcca 19<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物3<400> 3gatgtttgac aagactggca 20<210> 4<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物4<400> 4cctctttaca gtatttggtga21<210> 5<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物5<400> 5caatcgcaga cgctgtcaa 19<210> 6<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物6<400> 6ctgtacctgg gtggcaata 19<210> 7<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物7<400> 7taaagggaag aaagtcgcca 20<210> 8<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物8<400> 8gctgcctcga tggccaca 18<210> 9<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 報告基因<400> 9cagccaccgg cccagg16<210> 10<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 報告基因<400> 10ccagccacag gcccagg 17<210> 11<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物9<400> 11ctacgtctag gagaagcca 19<210> 12<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物10<400> 12gagcacagag ccatgtgca 19<210> 13<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物11<400> 13ctttcacttc acccctct 18<210> 14<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物12<400> 14tgcctggaag tccgtgca 18
權(quán)利要求
1.使用密碼子掃描規(guī)則的寡核苷酸探針的制備方法，包括以下步驟(i)選擇待調(diào)查突變密碼子；和(ii)制備探針，其應(yīng)確保待調(diào)查突變密碼子位于由至少7個核苷酸組成的所述寡核苷酸探針最中心的位置，其余的序列與正常個體中的保持相同，并且，將胺基團與探針的3’末端連接。
2.權(quán)利要求1的制備寡核苷酸探針的方法，其中，以以下方式設(shè)計一組共4個探針，即各探針在所述待調(diào)查密碼子的第一個核苷酸的位置上具有A、G、T或C，且所述密碼子的其余2個核苷酸與正常個體中的保持相同，再以以下方式設(shè)計另一組共4個探針，即各探針在所述待調(diào)查密碼子的第二個核苷酸的位置上具有A、G、T或C，且密碼子的其余2個核苷酸與正常個體中的保持相同，再以以下方式設(shè)計另一組共4個探針，即各探針在所述待調(diào)查密碼子的第三個核苷酸的位置上具有A、G、T或C，且密碼子的其余2個核苷酸與正常個體中的保持相同，最終，得到12種針對待調(diào)查突變密碼子的探針。
3.制備DNA芯片的方法，包括將按權(quán)利要求1的方法制備的探針定位到醛包被的固相表面上的步驟，以將所述探針固定到固相表面上。
4.權(quán)利要求3的制備DNA芯片的方法，其中所述固定通過探針中的胺基團與包被在固相表面上的醛的結(jié)合反應(yīng)來完成。
5.權(quán)利要求4的制備DNA芯片的方法，其中所述結(jié)合反應(yīng)在70-90％濕度下進行4-8小時。
6.權(quán)利要求3的制備DNA芯片的方法，其中所述固相材料是玻璃板。
7.一種DNA芯片，其是通過權(quán)利要求3的方法制備的。
8.使用權(quán)利要求7的DNA芯片檢測遺傳突變的方法，包括以下步驟(i)使用待調(diào)查DNA和用熒光物質(zhì)標記的引物進行PCR，以獲得用熒光物質(zhì)標記的樣品DNA；(ii)在10-37℃下使樣品DNA與DNA芯片結(jié)合3-13小時，然后洗滌DNA芯片；和，(iii)測量在經(jīng)洗滌的DNA芯片上殘留的熒光信號。
9.權(quán)利要求8的使用DNA芯片檢測遺傳突變的方法，其中，所述的樣品DNA與DNA芯片的結(jié)合在3-10X結(jié)合緩沖液(SSPE0.15MNaCl、10mM NaH2PO4·H2O、1mM EDTA，pH7.4)的條件下進行。
10.權(quán)利要求8的使用DNA芯片檢測遺傳突變的方法，其中，所述DNA芯片用第一洗滌溶液(0.45M NaCl、30mM NaH2PO4·H2O、3mM EDTA，pH7.4)洗滌5分鐘，再用第二洗滌溶液(0.3M NaCl、20mMNaH2PO4·H2O、2mM EDTA，pH7.4)洗滌5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測突變的寡核苷酸探針的制備方法、制備DNA芯片的方法、所制備的DNA芯片和使用所述芯片檢測遺傳突變的方法。制備本發(fā)明探針的方法包括:選擇待調(diào)查突變密碼子;和制備探針,以確保待調(diào)查突變密碼子位于寡核苷酸探針最中心的位置,其余的序列與正常個體中的保持相同,并且,胺基團與探針的3’末端連接。制備DNA芯片的方法包括將所述探針固定在固相表面上的步驟。通過本發(fā)明,可避免在對結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理時出現(xiàn)的差錯,可將純合突變與雜合突變區(qū)分開,可以快速準確地檢測并識別出各種突變,并且,可用于診斷遺傳突變相關(guān)性疾病和識別SNP等突變。
文檔編號C12N15/09GK1357637SQ0114113
公開日2002年7月10日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月29日
發(fā)明者李相燁, 崔鐘吉 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院