專利名稱：新的多種保健功能免疫牛奶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多功能防病免疫牛奶食品和聯(lián)合免疫方法。用亞單位疫苗、特殊培養(yǎng)的致病菌經(jīng)滅活后接種奶牛，獲特異的致病菌牛奶抗體。所。
所選致病菌為大量流行的慢性胃病、胃癌、牙齦炎、牙周炎、牙齲病、咽喉炎、口臭、痤瘡。本方法獲抗體特異性好、效價高、易推廣。該免疫奶品尤其適合老幼。
盡管有大量的抗生素用來對付人類感染，但是，現(xiàn)在仍然存在許多慢性感染疾病和不適，正在折磨著大量人群。
目前我國的人均患齲率為40％，其中兒童患齲率為80％，青年人患齲率為60-70％，老年人患齲率為52％。我國人口的牙齦炎和牙周炎患病率為70％，慢性咽喉炎癥也非常普遍。現(xiàn)代研究證明，慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等主要與幽門螺桿菌感染有關，胃癌、胃淋巴瘤是第一個經(jīng)證實為與細菌感染有關的腫瘤。這種細菌感染就是毒力幽門螺桿菌感染。咽喉炎和上感、口臭、痤瘡更是常見病。這些疾病嚴重影響個體飲食能力繼而妨害健康和勞動力。這些疾病單靠門診治療難以完成，應找出預防控制的有效措施。研究發(fā)現(xiàn)，這些多發(fā)病都屬細菌感染性疾病。正常情況下口腔和消化道存在一些常在菌，而有的疾病致病菌也是常在菌，在健康狀態(tài)時各微生物在種類和數(shù)量上構成一定的生理組合。當菌群失調(diào)時某種致病性較強的病菌過度繁衍引起疾病，或細菌異位感染引起疾病。長期使用廣譜抗菌素和化學合成藥在清除致病菌同時將破壞正常的微生態(tài)平衡。迄今尚無對這些致病菌有專一選擇性的藥物。
免疫學方法由于具有極高的特異性，目前廣泛應用于細菌學的檢測。在防治疾病方面有破傷風的防治等。上述的一些疾病都屬粘膜感染，免疫學方法用于這些疾病的防治有一定的有利條件。關于免疫防病的研究已有近40年歷史。迄今的研究結果認為，被動免疫方法比較安全，優(yōu)于主動免疫。被動免疫是直接應用特異性抗體以中和及對抗特異性致病菌的致病作用。由于可能避免主動免疫某些不能預料的副作用，如不會激發(fā)系統(tǒng)免疫反應，不會因系統(tǒng)運用引起心臟交叉反應，因此易為人們所接受并日益受到關注。從作用效果來講，多克隆抗體優(yōu)于單克隆抗體。如Michalek等(1987)首先嘗試了用牛奶中的多抗免疫防齲研究。用變鏈菌4種血清型全菌抗原免疫奶牛，將獲得含特異性抗變鏈菌抗體的牛奶喂養(yǎng)定菌鼠，結果顯示，實驗組動物變鏈菌粘附水平、菌斑指數(shù)及齲齒活性均顯著性降低。關于被動免疫的防齲機制，目前推測單抗和多抗可能是通過影響細菌表面的理化特性如電荷、表面自由能、疏水性等，在體內(nèi)則可能起調(diào)理作用并對細菌的粘附產(chǎn)生影響。但Van Raamsdonk等(1996)研究發(fā)現(xiàn)，單抗對變鏈菌表面特性的影響不及多抗，且體外研究表明，單抗作用于變鏈菌，不能象多抗那樣刺激多形核白細胞對其吞噬和殺傷作用。目前大量生產(chǎn)單抗用于普通口服液有一定困難。
慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤等主要與幽門螺桿菌感染有關?？漳c彎曲菌主要寄生于家畜家禽腸道和糞便中、牛奶和水中。人體腸道感染上以后，會生腹瀉病。齲病主要和初始菌為變鏈菌。該菌最先粘集在牙面或牙溝，分解蔗糖產(chǎn)生葡聚糖，再粘集細菌成菌斑，分泌乳酸腐蝕牙質成洞。齲病患者變鏈菌過分繁殖。牙周病例如牙周炎、牙齦炎的主要致病菌為牙齦卟啉菌、核梭桿菌、粘性放線菌、伴放線放線桿菌、內(nèi)氏放線菌等。他們釋放毒力因子致炎。齲洞和牙周炎可導致牙髓炎并且發(fā)展成菌血癥甚至條件致病菌性心內(nèi)膜炎。口臭是人體在繁忙、勞累、患病、免疫力低下時口腔常在的產(chǎn)硫胺菌例如幽門螺桿菌、核梭桿菌、牙齦卟啉菌等過分繁殖所引起。痤瘡是大部分年輕人的苦惱。尤其在南方。最近研究發(fā)現(xiàn)，主要是面部皮脂腺管滋生痤瘡丙酸菌，分泌脂酶分解皮脂，產(chǎn)生丙酸刺激管口增生狹窄和炎細胞發(fā)炎所致。這些主要是一些兼性厭氧菌。繼發(fā)表皮葡萄球菌甚至金黃色葡萄球菌繁殖和感染會加重病情。咽喉炎和上感混合感染中主要是鏈球菌、肺炎球菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌，皆產(chǎn)生毒素。以上細菌常對抗生素耐藥且反復感染。開發(fā)特異抗體有利于防治這類疾病。這些菌體聯(lián)合作疫苗的特異抗菌牛奶尚未見生產(chǎn)。
牛奶日常生活用量巨大，且抗體活性在牛奶中容易保存，因此牛奶是以抗體為主的疾病防治保健制劑的理想載體。由于上述疾病發(fā)病率很高，商品的應用有巨大的市場。到目前為止，尚未見有關使用上述感染特異菌株和亞單位作聯(lián)合疫苗生產(chǎn)防多種慢性病和不適的免疫牛奶的報道。
多種病原體、多種抗原混合刺激，相互間可能出現(xiàn)干擾，彼此影響效價的提高。
齲病致病菌變鏈菌的菌體作抗原免疫奶牛獲得抗變鏈菌抗體的牛奶，因疑產(chǎn)生風濕因子，至今未應用于防齲病。生產(chǎn)不摻雜人體心臟共同抗原的變鏈菌體表面抗原亞單位疫苗可生產(chǎn)無風濕因子的牛奶。亞單位疫苗作免疫原，存在難以提高效價，獲得有生產(chǎn)價值的奶品的技術困難。
菌體與亞單位疫苗聯(lián)合應用會產(chǎn)生相互間干擾。要探索上述疫苗配伍的接種方法。
本發(fā)明就是克服上述技術困難和攻克上述難題，研制、開發(fā)有生產(chǎn)價值的多合一的疾病防治保健牛奶。
實施要點一，聯(lián)合抗原疫苗的制備(一)抗原菌株選擇本地流行毒力株，以國際標準毒力株作對照，對照株用括號括起。
1，菌株和抗原的分類(1)齲病相關的菌株和抗原①變形鏈球菌(S.mutans Ingbritt)表面蛋白和葡糖基轉移酶②遠緣鏈球菌(S.sobriuns 6715)表面蛋白和葡糖基轉移酶培養(yǎng)細菌，生化方法分離提純表面蛋白和葡糖基轉移酶。③粘性放線菌(A.viscosus ATCC 19246)(2)牙周病相關①核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum ATCC 25286)②牙齦卟啉菌(Porphyromonas gingivalis ATCC 33277)③粘性放線菌(Actinomyces viscosus ATCC 19246)④伴放線放線桿菌桿菌(Actinobacillus actinomycetemitans Y4(3)口臭相關①幽門螺桿菌(Helicobacter pylori ATCC 11639)②核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum ATCC 25286)③牙齦卟啉菌(Porphyromonas gingivalis ATCC 33277)(4)胃腸病相關①幽門螺桿菌(Hp)(Helicobacter pylori NCTC 11637)②幽門螺桿菌(Helicobacter pyloti NCTC 11639)③幽門螺桿菌Helicobacter pylori*④空腸彎曲桿菌(5)咽喉炎相關①肺炎球菌Staphylococcus pneumoniae*②表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis*③金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aures ATCC 14458)(6)面部粉刺相關①粉刺丙酸桿菌(Propionibacterium acne NCTC 65102)②表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis*③金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aures ATCC 14458)*為本地流行臨床分類鑒定菌株，上海第二醫(yī)科大學微生物教研室
(二)細菌培養(yǎng)和菌苗制備采用胰蛋白酶消化大豆培養(yǎng)基(Tryptic Soy Broth，TSB)用于細菌活化和增菌。TSA培養(yǎng)基(Tryptic Soy Agar，TSA)用于細菌純分。厭氧培養(yǎng)基用于專性厭氧細菌培養(yǎng)。微量生化管有甘露醇、山梨醇、棉子糖、七葉苷，精氨酸等，用于細菌鑒定。保存之菌接種于相應培養(yǎng)基培養(yǎng)復蘇活化，厭氧培養(yǎng)18小時(90％N2 5％CO2 37℃)和2-3天(專性厭氧菌)。分別挑取單個典型菌落劃線接種于TSA平板，厭氧培養(yǎng)48小時后，作進一步生理生化鑒定。經(jīng)生化鑒定后接種于相應瓊脂平板。挑取瓊脂表面的單個菌落混懸于相應液體培養(yǎng)基中(1個1mm菌落/ml)培養(yǎng)，培養(yǎng)相應時間后使菌液濃度呈105-6CFU/ml。離心(3000g×30′)。收集細菌，用含0.15M NaCl的0.01M pH6.0的磷酸鈉緩沖液洗三次。收集到的細菌以無菌注射用水配制成濃度為3×108個菌/ml的菌液。15磅15分鐘使菌體失活，-20℃?zhèn)溆谩Ａ硪环椒ㄊ?，細菌?jīng)0.5％甲醛滅活后，用含0.15M NaCl的0.01M pH6.0的磷酸鈉緩沖液洗三次。以無菌注射用水配制成濃度為3×108個菌/ml的菌液，等份分裝后存-20℃?zhèn)溆谩?br> 流行株分離鑒定全部用特異引物用PCR方法作基因型鑒定。
Hp分離取人胃癌粘膜涂皿，在含有多粘菌素2500u/L、萬古霉素10mg/L、5mg/L的血瓊脂板上選株。
葡萄球菌和肺炎鏈球菌分離病人膿皰瘡膿液涂皿，在普通瓊脂板上選株。形態(tài)學鑒定后，觸酶反應區(qū)別葡萄球菌與鏈球菌，血漿凝固酶陽性選出金葡菌，新生霉素陽性陽性選出表皮葡萄球菌。Optochin敏感試驗選出肺炎鏈球菌。
痤瘡丙酸菌分離青春痘病人的痤瘡膿液涂皿，在厭氧瓊脂板上選株。形態(tài)學鑒定后，脂酶反應選出。
核梭桿菌、牙齦卟啉菌、粘性放線菌、伴放線放線桿菌桿菌分離牙齦炎患者牙菌斑、齦下菌斑涂皿，厭氧培養(yǎng)18小時(90％N2 5％CO2 37℃)或2-3天(專性厭氧菌)。分別挑取單個典型菌落劃線接種于TSA平板，厭氧培養(yǎng)48小時后，作進一步生理生化鑒定。
(三)變形鏈球菌和遠緣鏈球菌表面蛋白和葡萄糖基轉移酶(GTF)提純抗原和亞單位疫苗制備選用國際標準菌株變鏈菌族變鏈菌S.mutans Ingbritt、遠緣鏈球菌S.sobrinus6715為操作菌株。采用5％蔗糖代替葡萄糖的胰蛋白酶消化大豆培養(yǎng)基(TSB)，微需氧培養(yǎng)18小時(90％N2，5％CO2，37℃)，離心(3000g×30’)。菌液中加硫酸銨達60％飽和度，4℃過夜。離心(9000g×40’，4℃)沉淀物為GTF粗提物。表面蛋白以8Mol尿素沉淀得粗提物。以0.01M PBS pH6.04℃透析，12小時換一次液體，透析至無銨離子檢出為止。聚乙二醇(分子量22000)濃縮至1.5mg pr/ml。變形鏈球菌和遠緣鏈球菌表面蛋白和葡糖基轉移酶(GTF)進一步純化，以Sepharose 6B裝柱1.6×85cm，粗提物1.5mg pr/ml，5ml/次上樣。以0.01MPBS pH6.0平衡洗脫。8ml/h，5ml/管，用Somagyi法收集含GTF組分。透析，濃縮，凍干。
純度測定(1)蛋白凝膠分離電泳(SDSPAGE)測定制備12％分離膠、5％濃縮膠，還原法100毫安電流電泳3小時。考馬氏蘭染色，表面蛋白、GTF分別見190KD、160KD、150KD、50KD左右四條蛋白條帶。鄰近上樣孔中加上蛋白分子標尺、未純化的變鏈菌、遠緣鏈球菌菌體蛋白，后二者分別為八條和九條主要蛋白條帶。
弗氏完全佐劑石臘油8ml，羊毛脂4ml，卡介苗(100mg/ml)4ml。首先將石臘油和羊毛脂混合經(jīng)15磅20分鐘消毒。然后在無菌下加入卡介苗并研磨成乳劑，研磨必需充分。弗氏不完全佐劑石臘油10ml，羊毛脂5ml，研磨后消毒。制備20％吐溫 取吐溫80(Tween 80)1g加0.01M PBS 50ml混合。制備牛血清白蛋白(BSA)(10 mg/mL)取BSA50mg加PBS5ml混合。
取凍于表面蛋白和GTF 12mg以0.01M PBS pH6.0配成1mg/ml、0.15mg/ml，濾菌。加等量弗氏完全佐劑混合，制成乳膠為漿狀多價亞單位疫苗。
接種時，聯(lián)合應用多菌體滅活疫苗和漿狀多價亞單位疫苗抗原疫苗，按以下方法制備抗體牛奶。
二，抗體奶的制備(一)奶牛選擇選用青中年產(chǎn)奶母牛，要求健壯、產(chǎn)奶量中等，且參加制奶業(yè)普通防疫。
(二)牧場管理(1)有自然疫源隔離地理環(huán)境和設施；(2)大氣和飲水用水無環(huán)境污染；(3)飼料來源充分且無污染；(4)冬暖夏涼的牛舍；(5)勤打掃和沖洗；有生物性滅害措施，(6)有科研設施和場地；(7)記錄完整。
(三)免疫試劑和接種1，表面蛋白和葡糖基轉移酶(GTF)牛奶乳清抗體的制備取漿狀亞單位疫苗如下應用第一次注射，牛背部多點每只注入5ml乳膠液。80-200μg/頭；于15天后，第二次注射同上；在首次注射一個月以后第三次注射，乳膠液5ml靜脈注射；末次注射后一周-十天采血和奶測效價。
2，其它各種全菌牛奶乳清抗體的制備滅活菌體配成2×105個菌/ml、2×106個菌/ml、3×108個菌/ml的菌液。奶牛免疫方法均為肌肉注射。
第一次注射每只每菌注入0.5ml，隔兩周后第二次注射。隔一周后第三次注射。隔一周后第四次注射。每次注射后采奶測效價。此為一個接種周期。中止一到二個月后，可再次加強接種一個周期。末次注射后一周至十天采血和奶測效價。三個周期后檢測證實接種無效的奶牛出生產(chǎn)線。以后可同上注射或淋巴結注射，或靜脈注射。
3，注射量取漿狀亞單位疫苗中，每種抗原每次應用范圍在50～200微克之間，菌苗每種菌體每次應用范圍在1*105～1*109CFU/ml之間。
每一周期注射后第七到第十二天獲取原始免疫牛奶。
(四)牛奶乳清抗體收集每周采一次牛奶，約500毫升，加萬分之二疊氮鈉防腐。室溫放置1-2小時后，置4℃離心1000轉/分共一小時后，取中層，加鹽酸調(diào)酸堿度為4.6，沉淀酪蛋白，4℃離心1000轉/分共一小時后，取乳清加NaOH調(diào)PH達7.4后無菌分裝，置-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br> (五)效價測定(1)表面蛋白和GTF牛奶乳清抗體效價測定采用免疫雙擴散法。取GTF以0.01M PBS pH6.0配成100g/ml，取2ml。牛奶乳清抗體1ml，兩倍稀釋5次。用生理鹽水配制1％瓊脂糖，加上萬分之二疊氮鈉防腐。澆板，打洞。加入樣品后37℃孵育18小時，肉眼觀察是否有沉淀線。
(2)全菌牛奶乳清抗體效價測定采用試管凝集法。牛奶乳清抗體連續(xù)雙倍稀釋。將各種全菌細胞以生理鹽水稀釋至3×105個/ml。等體積乳清和菌液混合，肉眼觀察凝集結果。
(3)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)(間接發(fā))測定各抗原包被酶標板測定孔，洗板、封閉再封閉后，加倍稀釋的免疫奶和對照奶點樣溫育，加標記的抗牛二抗，顯色，酶標儀測OD值。
判定效價＝免疫奶OD/對照奶OD；效價大于1.6以上為免疫成奶。
三，農(nóng)場免疫牛奶的采運稀配、滅菌、封裝常規(guī)消毒液預洗奶頭后，機擠免疫奶于罐中，紗布過濾雜質后裝冷運車送待加工。經(jīng)與非免疫奶稀配、均質后按常規(guī)超高溫瞬時滅菌，封袋或罐裝。稀配比例為1份免疫奶配10、100、1000、10000份非免疫奶。
本發(fā)明所生產(chǎn)的多功能免疫牛奶的好處有如下幾點1，所用菌種采用國際標準毒株和本地流行毒株，特異針對性強。
2，抗牙病，尤其是防治齲病，還能防治牙周炎，也就降低了牙髓炎敗血癥和心內(nèi)膜炎的發(fā)生可能性。奶抗體直接殺滅相關致病菌變鏈菌、牙齦卟啉菌、核梭桿菌、粘性放線菌、伴放線放線桿菌、內(nèi)氏放線菌并且清除毒力因子、中和毒素。
3，抗炎性和癌性胃腸病例如慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤相關幽門螺桿菌。本發(fā)明所產(chǎn)生的牛奶抗體可廣泛中和及有效清除病因菌本身和游離的毒素，故有防治作用。對其他胃病也有預防和減輕癥狀的作用。
4，抗咽炎上感致病菌例如鏈球菌、肺炎球菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。
5，抗面部或體部痤瘡致病菌例如痤瘡丙酸菌和游離脂酶、鏈球菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。
6，消口臭，本發(fā)明所生產(chǎn)的牛奶抗體能消除產(chǎn)硫化物的口臭菌例如幽門螺桿菌、核梭桿菌、牙齦卟啉菌。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗有如下幾點優(yōu)點1，多種菌種滅活組合配用，互相加強免疫刺激效果；2，聯(lián)合疫苗中使用的變鏈菌表面蛋白和毒力因子亞單位疫苗，是不摻雜人體心臟共同抗原的變鏈菌體表面抗原亞單位疫苗，可生產(chǎn)無風濕因子的牛奶。因為避免了全菌疫苗運用產(chǎn)生引起人體心臟交叉反應的風濕因子的缺點；3，使用有超抗原的金葡菌獲得特異抗膿皮病免疫奶且加強免疫刺激；本發(fā)明的接種法有如下幾點優(yōu)點1，實施方便；2，較易獲得穩(wěn)定高產(chǎn)免疫牛奶。
實施例一1，制備疫苗 取菌種劃線培養(yǎng)，挑取瓊脂表面的單個菌落混懸培養(yǎng)，使菌液濃度呈105-6CFU/ml。離心收集細菌，用磷酸鈉緩沖液洗三次。收集的細菌以無菌注射用水配制成濃度為3×108個菌/ml的菌液。15磅15分鐘使菌體失活，分裝成份，存于-20℃?zhèn)溆?。變形鏈球菌和遠緣鏈球菌表面蛋白和葡糖基轉移酶(GTF)純化、洗脫、收集、透析、濃縮、凍干、純度測定后，取凍干表面蛋白和GTF 12mg以0.01M PBS pH6.0配成1mg/ml，濾菌。加等量弗氏完全佐劑或不完全佐劑混合，制成乳膠為漿狀多價亞單位疫苗。接種時，聯(lián)合應用多菌體滅活疫苗和漿狀多價亞單位疫苗抗原疫苗，制備抗體牛奶。
2，接種 取漿狀亞單位疫苗如下應用，第一次注射，牛背部多點每只注入5ml乳膠液。95μg/頭；于15天后，第二次注射同上；在首次注射一個月以后第三次注射，乳膠液5ml靜脈注射；末次注射后一周-十天采血和奶測效價。
菌苗肌肉注射。第一次注射每只每菌注入0.5ml，共4.5ml。隔兩周后第二次注射每只注入4.5ml。隔一周后第三次注射每只注入4.5ml。隔一周后第四次注射每只注入4.5ml。隔一周后第五次注射4.5ml/只。隔一周后第六次注射4.5ml/只。第七，八次注射同上，每次注射后連續(xù)4天采奶測效價。
3，牛奶乳清收集效價測定每周采一次牛奶，約500毫升，加萬分之二疊氮鈉防腐。室溫放置1-2小時后，置4℃離心1000轉/分共一小時后，取中層，調(diào)酸堿度沉淀酪蛋白，4℃離心1000轉/分共一小時后，取乳清調(diào)回酸堿度無菌分裝，置-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。表面蛋白和GTF牛奶乳清抗體效價測定采用免疫雙擴散法。取GTF以0.01M PBSpH6.0配成100g/ml，取2ml。取牛奶乳清的抗體1ml，兩倍稀釋5次。用生理鹽水配制1％瓊脂糖，加上萬分之二疊氮鈉防腐。澆板，打洞。加入樣品后37℃孵育18小時，肉眼觀察沉淀線明顯。全菌牛奶乳清抗體效價測定采用試管凝集法。牛奶乳清抗體連續(xù)雙倍稀釋。將各種全菌細胞以生理鹽水稀釋至3×105個/ml。等體積乳清和菌液混合，肉眼觀察凝集明顯。間接法ELISA測定各抗原包被酶標板測定孔，洗板、封閉再封閉后，加倍稀釋的免疫奶和對照奶點樣溫育，加標記的抗牛二抗，顯色，酶標儀測OD值。判定效價＝免疫奶OD值/對照奶OD值；效價大于1.6以上為免疫成功。效價結果變形鏈球菌S.mutans NCTC Ingbritt表面蛋白抗體效價為1∶16。遠緣鏈球菌S.sobriuns ATCC 6715 GTF抗體效價為GTF免疫1∶8。各種細菌的兔血清抗體對特異抗原菌效價結果①粘性放線菌Actinomyces viscosus ATCC 19246為1∶16、1∶8。②核梭桿菌Fusobacterium nucleatum ATCC 25286為1∶8。③伴放線放線桿菌桿菌Actinobacillus actinomycetemitans Y4為1∶16、1∶4。④幽門螺桿菌Helicobacter pylori ATCC 11639為1∶16、1∶8。⑤牙齦卟啉菌Porphyromonas gingivalis ATCC 33277為1∶8。⑥肺炎球菌Staphylococcus pneumoniae為1∶16。⑦表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis為1∶8。⑧金黃色葡萄球菌Staphylococcus aures ATCC14458為1∶4、1∶8。⑨粉刺丙酸桿菌Propionibacterium acne NCTC 65102為1∶32。
頭胎、分娩前二到三月開始接種以及初乳的各菌體抗體效價更高。
3，成品生產(chǎn)按照免疫程序建立免疫牛，在抗體峰值日常規(guī)消毒液預洗奶頭后，裝上擠奶機，抽免疫奶于罐中，紗布過濾雜質后，裝冷運車送與非免疫奶稀配。按牛奶抗體的效價定稀配比例，分別定為1份免疫奶配10、100、1000、10000份非免疫奶。最后均質，超高溫瞬時滅菌，罐裝上市。
權利要求
1，一種多功能防病免疫牛奶食品，其特征為含有抗慢性胃炎和胃十二指腸潰瘍、胃癌病原體幽門螺旋桿菌特異的中和作用的人體保護性抗體，還含有多種對牙周炎病原體、牙齲病、咽喉炎、口臭、痤瘡病原體特異中和作用的人體保護性抗體。
2，依據(jù)權利要求1所述的多功能免疫牛奶，其特征在于應用十三種毒力致病細菌和二種毒力致病細菌亞單位蛋白疫苗組成的聯(lián)合疫苗反復接種刺激產(chǎn)生的牛奶；
3，依據(jù)權利要求2所述的多功能免疫牛奶，其特征在于是選用特異針對性強的國際標準毒株和本地流行毒株，經(jīng)特殊培養(yǎng)的致病菌經(jīng)滅活后接種奶牛，獲特異的致病菌抗體牛奶。
4，依據(jù)權利要求2所述的多功能免疫牛奶，選用特異針對性強的國際標準毒株和本地流行毒株，同期接種經(jīng)純化制得不含人體心臟共同抗原的多價亞單位疫苗，系統(tǒng)免疫獲得的抗體牛奶。
5，依據(jù)權利要求2所述的多功能免疫牛奶，其特點是應用一種聯(lián)合免疫方法，聯(lián)合應用水溶性滅活菌苗和分別純化后的脂溶多價亞單位疫苗，依如下方法分部注射后獲取牛奶。注射時間第一次注射15天后第二次注射；在首次注射三周后第三次注射，首次注射四周后末次注射，末次注射后一周至十天采血和奶測效價。為一個接種周期。中止一到二個月后，可再次加強接種一個周期。三個周期后檢測證實接種無效的奶牛出生產(chǎn)線。注射部位取漿狀亞單位疫苗，第一次于牛背部多點注射；菌苗肌肉注射。以后可同上注射或淋巴結注射，或靜脈注射。注射量取漿狀亞單位疫苗中，每種抗原每次應用范圍在80～200微克之間，菌苗每種菌體每次應用范圍在1*105～1*109CFU/ml之間。每一周期注射后第七到第十二天獲取原始免疫牛奶。
6，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是于上市牛奶按比例配伍后制取的多功能免疫牛奶。
7，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是不稀釋而上市的多功能免疫牛奶。
8，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是原始多功能免疫牛奶與未免疫奶的為稀釋比為1∶0.5的配比所獲得的多功能免疫牛奶。
9，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是原始多功能免疫牛奶與未免疫奶的為稀釋比為1∶1的配比所獲得的多功能免疫牛奶。
10，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是原始多功能免疫牛奶與未免疫牛奶的為稀釋比為1∶10的配比所獲得的多功能免疫牛奶。
11，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是原始多功能免疫牛奶與未免疫牛奶的為稀釋比為1∶100的配比所獲得的多功能免疫牛奶。
12，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是原始多功能免疫牛奶與未免疫牛奶的為稀釋比為1∶1000的配比所獲得的多功能免疫牛奶。
13，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶，其特征是原始多功能免疫牛奶與未免疫牛奶的為稀釋比為1∶10000的配比所獲得的多功能免疫牛奶。
14，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治牙齦炎、牙周炎的漱口液、口服液。
15，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治口臭的口服液。
16，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治痤瘡的口服液。
17，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治痤瘡的洗面液體。
18，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治痤瘡或用于預防膿皰瘡、癤腫病、毛囊炎的身體洗浴和外用液體。
19，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治慢性胃病、胃癌、牙齦炎、牙周炎、牙齲病、咽喉炎、口臭、痤瘡、腹瀉病的活體體腔沖洗液體。
20，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治空腸彎曲菌性腹瀉病的口服液。
21，依據(jù)權利要求5所述的多功能免疫牛奶制成防治慢性胃炎、胃潰瘍、十二指潰瘍病、胃癌、胃淋巴瘤病的口服液。
22，依據(jù)權利要求6所述的多功能免疫牛奶疫方法免制成的乳清抗體和血抗體，添加于藥品和食品、用品中用于防治慢性胃病、胃癌、牙齦炎、牙周炎、牙齲病、咽喉炎、口臭、痤瘡、腹瀉病，或用于預防膿皰瘡、癤腫病、毛囊炎。
23，依據(jù)權利要求2所述的多功能免疫牛奶，其特征是使用的聯(lián)合疫苗中變形鏈球菌和遠緣鏈球菌表面蛋白和葡萄糖基轉移酶(GTF)提純抗原和亞單位疫苗按照如下方法所制備從國際標準菌株變鏈菌族變鏈菌S.mutans Ingbritt、遠緣鏈球菌S.sobrinus 6715制取GTF和表面蛋白粗提物。5％蔗糖代替葡萄糖的胰蛋白酶消化大豆培養(yǎng)基(TSB)，微需氧培養(yǎng)。制取GTF，沉淀用硫酸銨達60％飽和度。表面蛋白以8Mol尿素沉淀得粗提物。透析、濃縮后，以Sepharose 6B過柱純化，收集含GTF組分。再透析，濃縮，凍干。測純度后，取表面蛋白和GTF 12mg以0.01M PBS pH6.0分別配成1mg/ml、0.15mg/ml，濾菌。加等量弗氏完全佐劑研磨后消毒，加20％吐溫、牛血清白蛋白(BSA)混合。制成乳膠為漿狀多價亞單位疫苗。
24，依據(jù)權利要求2所述的多功能免疫牛奶，其特征是使用的聯(lián)合疫苗中的多菌體復合疫苗按下述方法制取采用胰蛋白酶消化大豆培養(yǎng)基(Tryptic Soy Broth，TSB)用于細菌活化和增菌。TSA培養(yǎng)基(Tryptic Soy Agar，TSA)用于細菌純分。厭氧培養(yǎng)基用于專性厭氧細菌培養(yǎng)。細菌接種于相應培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)18小時(90％N2 5％CO2 37℃)和2-3天(專性厭氧菌)。分別挑取單個典型菌落劃線接種于TSA平板，厭氧培養(yǎng)48小時后，經(jīng)生化鑒定后接種于相應瓊脂平板。挑取瓊脂表面的單個菌落混懸于相應液體培養(yǎng)基中(1個1mm菌落/ml)培養(yǎng)后使菌液濃度呈105-6CFU/ml。離心(3000g×30′)。收集細菌，用含0.15M NaCl的0.01M pH6.0的磷酸鈉緩沖液洗三次。收集到的細菌以無菌注射用水配制成濃度為3×108個菌/ml的菌液。15磅15分鐘使菌體失活，-20℃?zhèn)溆谩Ａ硪环椒ㄊ?，細菌?jīng)0.5％甲醛滅活后，用含0.15M NaCl的0.01M pH6.0的磷酸鈉緩沖液洗三次。以無菌注射用水配制成濃度分別為2×105個菌/ml、2×106個菌/ml、3×108個菌/ml的菌液，等份分裝后存-20℃?zhèn)溆谩?br> 25，依據(jù)權利要求2所述的多功能免疫牛奶，其特征是使用的聯(lián)合疫苗中含有金黃葡萄球菌菌體，從而利用超抗原刺激多價高濃度抗體牛奶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多功能防病免疫牛奶食品和聯(lián)合免疫方法。用亞單位疫苗、特殊培養(yǎng)的致病菌經(jīng)滅活后接種奶牛，獲特異的致病菌牛奶抗體。所選菌種為大量流行的慢性胃病、胃癌、牙齦炎、牙周炎、牙齲病、咽喉炎、口臭、痤瘡、腹瀉等致病菌。本方法獲抗體特異性好、效價高、易推廣。該免疫奶品尤其適合老幼病弱人群。
文檔編號A23C9/152GK1398531SQ0112632
公開日2003年2月26日 申請日期2001年7月24日 優(yōu)先權日2001年7月24日
發(fā)明者張良平, 李鳴宇, 陳常慶, 董鴻金 申請人:上海登美生物科技有限公司