專利名稱：籃霉菌木聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型木聚糖酶，比如來自籃霉菌屬(Talaromyces)的木聚糖酶，以及它們用于降解纖維素中的木聚糖的用途。發(fā)現(xiàn)這些木聚糖酶可以用于焙烤中、動物飼料中(提高飼料轉(zhuǎn)化)和造紙中。
植物半纖維素包括木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖和木糖葡聚糖。木聚糖(CAS注冊號9014-63-5)由β-1，4-連接D-吡喃木糖基(xylopyranosyl)單元的主鏈組成，任選的被測鏈比如阿拉伯糖和/或葡糖醛酸殘基取代。其結(jié)構(gòu)是→4)-β-D-Xylp-(1→4)-β-D-Xylp(2←1A)-(1→4)-β-D-Xylp-(1→4)-β-D-Xylp(3←1B)-(1→(Xylp＝吡喃木糖基單元；A＝α-(4-O)-甲基-(D-吡喃葡糖醛酸基)單體，有時(shí)是乙酰基；B＝α-(L-呋喃阿拉伯糖基)單體，有時(shí)是乙?；?。
木聚糖可能占陸生植物干重的30％多。因此，木聚糖是自然來源材料的重要組分，所述材料用于焙烤工業(yè)，提高動物飼料轉(zhuǎn)化和造紙過程這一系列工業(yè)工藝中。
單子葉植物(例如谷類和草類)和雙子葉植物(例如三葉草、油菜和大豆)之間，植物的果實(shí)部分和營養(yǎng)部分有根本性不同。單子葉植物的特性在于具有阿拉伯木聚糖復(fù)合物為主要的半纖維素主鏈，雙子葉植物的半纖維素主要結(jié)構(gòu)是木糖葡聚糖復(fù)合物。在雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)其果膠濃度比單子葉植物的高。果實(shí)一般多含有胃蛋白酶類物質(zhì)，但是其纖維素類物質(zhì)相對比較低。
纖維素降解酶被用于處理食物中的植物材料，也用于飼料應(yīng)用或者食物或飼料添加劑，因?yàn)樗軌蜃饔糜谥饕参锛?xì)胞壁取代物。
工業(yè)上可獲得的大多數(shù)纖維素降解酶是相對低分子量的木聚糖酶，并在高溫度下有中等穩(wěn)定性。然而，對于特定的應(yīng)用，使用具有相當(dāng)高耐熱性的木聚糖酶比較有利。如果木聚糖酶用作動物飼料添加劑，優(yōu)選高耐熱性，因?yàn)閯游镲暳项w粒化時(shí)會采用高溫條件。
因此，本發(fā)明提供了(分離的)β-木聚糖酶多肽，其包含(i)SEQ ID No2的氨基酸序列；或(ii)能夠切割β-D-木聚糖的(i)的變體；或(iii)能夠切割β-D-木聚糖的(i)或(ii)的片段。
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)方面，提供了多核苷酸，其包含(a)SEQ ID No1的核酸序列，或編碼本發(fā)明的多肽的序列；(b)與(a)定義的序列互補(bǔ)或可雜交的序列；(c)(a)或(b)的序列的片段；(d)具有與(a)、(b)或(c)定義的序列至少60％同一性的序列；或(e)(a)到(d)定義的任一序列的遺傳密碼簡并性序列。
本發(fā)明也提供了-包含本發(fā)明的多核苷酸，并能夠表達(dá)本發(fā)明多肽的(例如表達(dá))載體；
-包含本發(fā)明的載體的細(xì)胞系；-生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，該方法包含在適于表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞系，如果需要，分離多肽；-降解β-D-木聚糖的方法，該方法包含把本發(fā)明的多肽與含有β-D-木聚糖的材料相接觸；和-鑒定調(diào)節(jié)木聚糖酶活性的化合物的方法，該方法包含把本發(fā)明的多肽與測試化合物在β-D-木聚糖存在下相接觸，并監(jiān)測或探測任何調(diào)節(jié)活性。序列簡述SEQ ID No1是編碼本發(fā)明中來自Talaromyces emersonii的木聚糖酶的DNA序列；SEQ ID No2是木聚糖酶的氨基酸序列；和SEQ ID No3和4是可與SEQ ID No1雜交的人工合成的PCR引物。發(fā)明詳述A，多核苷酸本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸(例如分離的和/或純化的)。因此本發(fā)明提供了編碼木聚糖酶的多核苷酸，該木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID No2所示(比如氨基酸23到408的成熟序列)。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼與SEQ ID No2所示氨基酸序列有顯著氨基酸序列同源性的多肽的多核苷酸。也包括多核苷酸，其選擇自(a)包含SEQ ID No1所示的核苷酸序列(例如核苷酸69-1224)，或其互補(bǔ)序列的多核苷酸；(b)包含能夠與SEQ ID No1所示的核苷酸序列(比如選擇性)雜交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；(c)包含能夠與SEQ ID No1所示的核苷酸的互補(bǔ)序列(比如選擇性)雜交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；和/或(d)包含與(a)、(b)或(c)定義的多核苷酸有遺傳密碼簡并性的多核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明也包括選自下述的多核苷酸(a)編碼具有木聚糖酶活性的多肽，其多核苷酸是(1)SEQ ID No1的編碼序列(例如核苷酸69-1224)；(2)可選擇性與(1)定義的序列的互補(bǔ)序列雜交的序列；或(3)(1)或(2)定義的序列的遺傳密碼簡并性序列；或(b)是(a)定義的多核苷酸的互補(bǔ)序列。
除非正文需要，否則上面提及SEQ ID No1時(shí)也可以用成熟編碼序列(多核苷酸69到1224)來代替。可雜交序列名詞“能夠雜交”是指本發(fā)明的目標(biāo)多核苷酸能夠與用作探針的核酸(例如SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或它的片段或它的互補(bǔ)序列)雜交，其雜交水平顯著高于背景。本發(fā)明也包括編碼木聚糖酶或它的變體的核苷酸序列，也包括與此處序列互補(bǔ)的核苷酸序列。核苷酸序列可能是RNA或DNA，因而包括基因組DNA、合成的DNA或cDNA。優(yōu)選核苷酸序列是DNA序列，更優(yōu)選cDNA序列。通常本發(fā)明的多核苷酸包含連續(xù)核苷酸序列，它能在選擇性條件下與SEQ ID No1的編碼序列(例如成熟)或其互補(bǔ)序列雜交。這些核苷酸可以依據(jù)本領(lǐng)域所周知的方法合成1。
本發(fā)明的多核苷酸能夠與SEQ ID No1的編碼序列或(例如成熟)編碼序列的互補(bǔ)序列雜交，其雜交水平顯著高于背景。發(fā)生背景雜交可能是例如因?yàn)閏DNA文庫中存在的其他cDNA。信號水平(例如本發(fā)明的多核苷酸和編碼序列或編碼序列的互補(bǔ)序列的相互作用產(chǎn)生的)通常是至少10倍，優(yōu)選至少100倍于其他多核苷酸和SEQ ID No1的(例如成熟)編碼序列之間相互作用的強(qiáng)度。作用強(qiáng)度可以通過例如用放射性例如32P標(biāo)記探針。選擇性雜交通常可以用低嚴(yán)格性(0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，約40℃)，中嚴(yán)格性(例如，0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，約50℃)或高嚴(yán)格性(例如，0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，約60℃)來進(jìn)行。雜交可以采用任何本領(lǐng)域周知的適當(dāng)條件，作為指導(dǎo)，低嚴(yán)格性可以是在55℃使用2X SSC緩沖液，中嚴(yán)格性可以是在60℃使用0.5到1.0X SSC緩沖液，高嚴(yán)格性可以是在60℃或更高溫度(例如68℃)使用0.1或0.2X SSC緩沖液，它們?nèi)亢?.5％的SDS。修飾本發(fā)明的多核苷酸可能包含DNA或RNA。它們可能是單鏈或雙鏈。它們也可能是在其中含有一個(gè)或多個(gè)合成的或修飾過的核苷酸的多核苷酸。本領(lǐng)域周知的有許多不同類型的多核苷酸修飾。這些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主鏈和/或，在分子的3’端和/或5’端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。為了本發(fā)明的目的，此處要理解描述的多核苷酸可能用本領(lǐng)域的任何可以得到的技術(shù)進(jìn)行修飾。
應(yīng)當(dāng)理解，熟練技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)取代核苷酸，而不影響本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的序列，以反映任何特定宿主生物體(例如待在其中表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主)的密碼子用法。
SEQ ID No1的(例如成熟)編碼序列可以用核苷酸取代修飾，例如從1，2，或3到10，25，50或100個(gè)取代。多核苷酸可以變通地或另外還被一種或多種插入和/或刪除和/或一端或兩端的延伸所修飾。修飾的多核苷酸一般編碼具有木聚糖酶活性的多肽?？梢赃M(jìn)行簡并性取代和/或翻譯后相對于后文多肽產(chǎn)生保守性氨基酸取代的取代。同源物能夠與SEQ ID No1的DNA編碼序列(或核苷酸69-1224)選擇性雜交(如其互補(bǔ)物)的核苷酸序列，可能與SEQ ID No1的編碼序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性(或同源性)。這可能是至少20個(gè)核苷酸的區(qū)域，優(yōu)選至少30或60，例如至少100，至少200，更優(yōu)選至少300個(gè)連續(xù)核苷酸或最適宜地SEQ ID No1的全長。
任何聯(lián)合上面提到的同源程度和最小尺寸可以用于定義本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選比較嚴(yán)格的組合(例如在較長范圍有較高同源性)。因而，例如，在25個(gè)核苷酸長度、優(yōu)選30個(gè)核苷酸的長度上有至少80％或90％的同源性的多核苷酸構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，在40個(gè)核苷酸長度上有至少90％的同源性的多核苷酸也構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
多核苷酸(或蛋白質(zhì))序列的同源性一般是例如在至少20，25，30，100個(gè)或更多連續(xù)核苷酸(或氨基酸)的區(qū)域上有至少70％同源性，優(yōu)選至少80，90％、95％、97％或99％的同源性。同源性可以基于氨基酸同一性(有時(shí)指“嚴(yán)格同源性”)進(jìn)行計(jì)算。
例如UWGCG軟件包提供了BESTFIT程序，可以用來計(jì)算同源性(例如在它的默認(rèn)設(shè)置下使用5)。PILEUP和BLAST算法可以用來計(jì)算同源性或排布序列(比如例如在它們的默認(rèn)設(shè)置下鑒定等價(jià)或相應(yīng)序列6，7)。
執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。這個(gè)算法涉及首先鑒定高得分序列配對(high scoring sequence pair，HSPS)，這通過鑒定查詢序列中長度W的序列在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的序列比對時(shí)匹配或符合一些正-數(shù)值閾得分T的短序列而進(jìn)行。T是附近序列初始得分閾值6，7。這些附近序列起始命中(hit)可以用于尋找含有它們的HSPs的起點(diǎn)。命中序列向兩個(gè)方向延伸，直到累積比對得分不再增加。下述情況下命中序列的延伸在某一個(gè)方向終止累積比對評分從它的最大得分?jǐn)?shù)下降量X；累積比對評分達(dá)到0或更低(由于累積一種或多種負(fù)-得分殘基比對所致)；或到達(dá)了該序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下列默認(rèn)值序列長度(W)是11，BLOSUM62計(jì)分矩陣8比對(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝4，并且比較兩條鏈。
使用BLAST算法統(tǒng)計(jì)分析兩個(gè)序列之間的相似性9。BLAST算法提供的一種相似性度量是最小和概率(smallest sum probability，P(N))，它提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率的指標(biāo)。例如，如果比較第一個(gè)序列和第二個(gè)序列的最小和概率大約小于1，優(yōu)選大約小于0.1，更優(yōu)選少于約0.01，最優(yōu)選少于約0.001，就視作一個(gè)序列與另一個(gè)序列相似。引物和探針本發(fā)明的多核苷酸包括并可以用作引物，例如PCR引物、用于其它擴(kuò)增反應(yīng)的引物、探針，或可將多核苷酸克隆進(jìn)載體。這些引物、探針和其他片段是至少或多達(dá)20、25、30或40，例如至少25、30或40個(gè)核苷酸長度。它們一般可多達(dá)30、40、50、60、70、100、150、200或300個(gè)核苷酸長度，或(甚至少至5或10個(gè)核苷酸)比SEQ ID No.1的(例如成熟)編碼序列短的數(shù)目。
一般情況下，引物用合成的方法生產(chǎn)，涉及逐步地一次一個(gè)核苷酸合成期望的核酸序列。采用自動化的此技術(shù)在本領(lǐng)域很容易獲得。本發(fā)明的引物的實(shí)例如SEQ ID No.3和4所示。
較長的多核苷酸一般用重組方式合成，例如采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)。這將涉及制備待克隆木聚糖酶區(qū)域的一對引物(例如大約15到30個(gè)核苷酸)，使引物和來自目標(biāo)(例如酵母、細(xì)菌、植物、原核或真菌的，優(yōu)選籃霉菌菌株)細(xì)胞的mRNA或cDNA相接觸，在可擴(kuò)增期望區(qū)域的條件下執(zhí)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離擴(kuò)增片段(例如用瓊脂糖凝膠純化反應(yīng)混合物)，回收擴(kuò)增的DNA。引物設(shè)計(jì)為含有適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R別位點(diǎn)，因而可以把擴(kuò)增的DNA克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)目寺≥d體中。
這些技術(shù)可以用來獲得此處所述的木聚糖酶序列的全部或部分。SEQ ID No.1相應(yīng)的染色體組克隆或含有例如內(nèi)含子和啟動子區(qū)域的木聚糖酶基因也包括在本發(fā)明中，也可以用相似的方式(例如重組方式、PCR和克隆技術(shù))從真菌、酵母、細(xì)菌、植物或原核的基因組DNA中獲得。
多核苷酸或引物可以攜帶可檢測標(biāo)記，例如放射性活性或非放射性活性標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括放射性同位素比如32P或35S，酶標(biāo)記，或其他蛋白質(zhì)標(biāo)記比如生物素。這些標(biāo)記可以加入到本發(fā)明的多核苷酸或引物中，然后可以用本身所知的技術(shù)檢測。
多核苷酸，無論是標(biāo)記的或是未標(biāo)記的，均可以用在基于核酸的測試中，對(例如真菌)樣品中的木聚糖酶或它的變體進(jìn)行檢測或測序。這些檢測測試一般包括使(懷疑)含有DNA的(例如真菌)樣品在雜交條件下與本發(fā)明的探針或引物相接觸，并檢測探針和樣品中的核酸形成的任何雙鏈形式。這些檢測可以用一些技術(shù)獲得，比如PCR或把探針固定在固相支持物上，去除樣品中不能和探針雜交的核酸，接著檢測與探針雜交的核酸。另外，樣品核酸可以被固定在固相支持物上，并檢測結(jié)合到支持物上的探針的量。
本發(fā)明的探針可以容易地以測試試劑盒形式包裝在適當(dāng)容器中。在這些試劑盒中，，若其中試劑盒的設(shè)計(jì)處理模式需要這種結(jié)合則探針可以結(jié)合到固相支持物上。試劑盒也包含適當(dāng)?shù)奶幚泶龣z測樣品的試劑、使樣品中的核酸與探針雜交的試劑、對照試劑和說明書等。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸可以自與所述多肽相同的生物體中獲得，比如籃霉菌屬真菌。
本發(fā)明的多核苷酸也包括SEQ ID No.1的具有木聚糖酶活性的序列的變體。變體可以通過添加、取代和/或刪除形成，并可能具有切割β-D-木聚糖聚合物的能力。多核苷酸的生產(chǎn)與SEQ ID No.1(例如其成熟編碼序列)沒有100％同一性，但屬于本發(fā)明范圍的多核苷酸可以通過多種方法獲得。此處描述的木聚糖酶序列變體可能例如通過篩選由多種生物體，例如本發(fā)明的多肽的來源生物體構(gòu)建的染色體DNA文庫而獲得。另外，其他真菌、植物或原核木聚糖酶同源物也可以獲得，這些同源物和它的片段一般能夠與SEQ ID No.1雜交。這些序列可以通過篩選其它物種的cDNA文庫或基因組DNA文庫，用探針在中等到高等嚴(yán)格性條件(如前面所述)下篩選這些文庫而獲得，所述探針含有SEQ ID No.1的全部或部分序列。含有SEQ IDNo.1的全部或部分序列的核酸探針可以用于探測來自其他物種比如本發(fā)明多肽的來源物種的cDNA文庫。
物種同源物也可能用設(shè)計(jì)針對變體和同源物內(nèi)編碼保守氨基酸序列的序列的引物，使用簡并性PCR獲得。引物可包含一種或多種簡并性位置，并可以在比利用針對已知序列的單序列引物克隆序列時(shí)嚴(yán)格性更低的條件下使用。
或者，這些多核苷酸可以通過對木聚糖酶序列或它的變體進(jìn)行定點(diǎn)誘變而獲得。這在下述情況下可能非常有用，其中例如需要用沉默密碼子改變來針對待在其中表達(dá)多核苷酸序列的特定宿主細(xì)胞進(jìn)行偏愛密碼子優(yōu)化。為了引入限制性酶切位點(diǎn)，或改變多核苷酸編碼多肽的性質(zhì)或功能，其他序列改變也可能是合乎要求的。
本發(fā)明包括雙鏈多核苷酸，其包含本發(fā)明的多核苷酸和它的互補(bǔ)鏈。
本發(fā)明也提供編碼下面所述的本發(fā)明多肽的多核苷酸。因?yàn)檫@些多核苷酸是本發(fā)明的多肽重組生產(chǎn)非常有用的序列，他們不需要能夠與SEQ ID No.1的序列雜交，當(dāng)然能夠雜交一般是比較理想的。否則，如果必需，這些多核苷酸能夠以上面所述的方法標(biāo)記、使用和制備。DNA片段可以用特異引物通過PCR技術(shù)制備33，34。B，多肽本發(fā)明涉及(例如(基本上)純化的和/或分離的)木聚糖酶和它的變體。本發(fā)明的多肽可能基本上由SEQ ID No.2的氨基酸序列，或其部分(比如23位到408位的成熟序列)，或其變體組成。多肽也可能由上面所述的本發(fā)明的多核苷酸編碼。除非正文需要，否則SEQ ID No.2可以只用成熟序列(殘基Ala23到Leu408)來代替表示。
本發(fā)明的多肽可能對阿拉伯木聚糖和芳基-β-D-木糖苷具有活性(比如有阿拉伯木聚糖酶和木糖苷酶活性)。
本發(fā)明的多肽可能是分離的或基本上純化的形式。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明多肽可以與不會影響多肽預(yù)期的使用和/或功能的載體或稀釋劑混合，這仍然可以稱為基本分離的。本發(fā)明的多肽一般包含以制劑中多肽的重量計(jì)百分比濃度大于20％，例如大于30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％的多肽。它們是相對純的組合物對于一些用途，多肽在組合物中的量可以為10％、5％、2％。1％或甚至小于0.5％?？梢杂贸Ｒ?guī)方法純化和/或合成蛋白質(zhì)1。對于一些配方(例如非藥物用途)多肽的存在量可能很少，例如從0.01到10％，比如從0.1到5％，或2％或甚至從0.2到1％。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽可以從擁有編碼具有木聚糖酶活性的酶的基因的微生物中獲得。更優(yōu)選的微生物是真菌，任選絲狀真菌。優(yōu)選的微生物是籃霉菌屬，比如Talaromyces emersonii(例如CBS 393.64或814.70)?；钚员景l(fā)明的多肽可能具有一種或多種下面的性質(zhì)，即就是(1)具有β-D-木聚糖酶活性；(2)最佳pH范圍為pH2-6的，比如pH3-5，最理想是pH3.5-5.0；(3)最佳溫度為50℃到95℃，比如70到90℃，最理想是75到85℃；(4)分子量(去糖基化的)為30到50kDa，優(yōu)選35到45kDa，最理想40到44kDa，或(糖基化)形式分子量為50到75kDa，優(yōu)選從55到70kDa，最理想是從60到66kDa；和/或(5)等電點(diǎn)為3.0到3.6的。
該多肽具有EC.3.2.1.8的活性。優(yōu)選地，多肽來自家族10(以前的F-型)。
“木聚糖酶活性”定義為切割纖維素或β-D-木聚糖聚合物(例如在植物例如燕麥或大麥中存在的)的能力。因此，活性容許切割β-D-木聚糖，比如在鄰近的吡喃木糖基末端和/或非末端單元之間的切割。優(yōu)選切割發(fā)生在[吡喃木糖基(1-4)吡喃木糖基]的連接鍵。多肽可能優(yōu)選在兩個(gè)鄰近的(例如非取代的)單元之間切割。因此它可具有內(nèi)切酶活性(例如內(nèi)切木聚糖酶)。底物聚合物可能有或可能沒有被取代。它也可具有外切酶活性(即木聚糖外切酶)，比如末端吡喃木糖基單元的切割。優(yōu)選多肽沒有葡聚糖酶活性。
本發(fā)明的多肽也對阿拉伯木聚糖有活性(或顯示活性)。阿拉伯木聚糖是木聚糖的一部分，在木糖主鏈的C-2或C-3或兩者上連接有L-阿拉伯糖-呋喃基側(cè)鏈。阿拉伯木聚糖具有CAS注冊號98513-12-3。它的結(jié)構(gòu)可以為(1→4)-β-D-木聚糖，連有三個(gè)α-L-阿拉伯糖支鏈。這種類型的木聚糖正常情況下發(fā)現(xiàn)存在于斯佩爾特燕麥(oat spelt)木聚糖中。
這個(gè)活性是水解未處理的阿拉伯木聚糖的能力。這意味著阿拉伯木聚糖沒有進(jìn)行處理或修飾過，例如沒有用阿拉伯呋喃糖苷酶處理過。這個(gè)酶能夠去除阿拉伯糖側(cè)鏈。本發(fā)明的多肽能夠水解(切除)沒有預(yù)先用阿拉伯呋喃糖苷酶處理過的阿拉伯木聚糖。
阿拉伯木聚糖發(fā)現(xiàn)于斯佩爾特燕麥中，在本說明書中，所述多肽的活性(EXU，以及PAHBAH活性)活性用來自小麥粉的阿拉伯木聚糖來測試(阿拉伯糖∶木糖的比例為41∶59)。阿拉伯木聚糖(作為底物)的測試在后面的實(shí)施例中進(jìn)行描述。
本發(fā)明的多肽也可具有木糖苷酶活性，例如能夠水解取代的(例如芳基)-β-D-木糖苷(也稱為木糖吡喃糖苷)。例如，他們能夠水解4-甲基傘形基-β-D-木糖吡喃糖苷(CAS注冊號6734-33-4，可來自Sigma化學(xué)公司)。這個(gè)活性是釋放底物上的熒光標(biāo)記物的能力。它也可以水解(活性作用于)5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-木糖吡喃糖苷(CAS注冊號207606-55-1)。兼具作用于阿拉伯木聚糖和芳基-β-D-木糖苷雙方的活性是不尋常的36，37，這是具有木聚糖酶活性的新型多肽的活性聯(lián)合。變體和同源物本發(fā)明的多肽可包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或基本上同源的序列，或這兩個(gè)序列之一的片段，而且具有木聚糖酶活性。一般，如SEQ ID No.2所示天然產(chǎn)生的氨基酸序列是優(yōu)選的。
尤其是，本發(fā)明的多肽包含a.SEQ ID No.2(殘基23到408)的(成熟)多肽序列或SEQ IDNo.2的全部序列。
b.其天然產(chǎn)生的變體或物種同源物；或c.與(a)或(b)相比具有至少70、至少75、至少80、至少90、至少95、至少98、或至少99％的序列同一性的蛋白質(zhì)。
變體可能是天然產(chǎn)生的，例如在真菌、細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞中存在的，并以與SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)基本上相同的方式起作用(例如具有木聚糖酶活性)的多肽。相似地，蛋白質(zhì)的物種同源物是在另一個(gè)物種內(nèi)天然產(chǎn)生的具有木聚糖酶活性的相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。變體包括等位基因變體，其來自與本發(fā)明多肽相同的菌株或來自不同的菌株，但是來自相同的屬，或來自相同的種。
變體和物種同源物可以依照此處描述用于SEQ ID No.2的多肽生產(chǎn)的程序并在適當(dāng)來源的細(xì)胞上執(zhí)行這些程序(例如細(xì)菌、酵母、真菌和植物細(xì)胞)而獲得。它也可能用上面定義的探針來探測酵母、細(xì)菌、真菌或植物細(xì)胞的文庫，以獲得包括變體或物種同源物的克隆?？寺】梢杂贸Ｒ?guī)技術(shù)操作生成本發(fā)明的多肽，然后可以用本領(lǐng)域周知的重組或合成技術(shù)生產(chǎn)。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選地與SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)具有至少70％序列同一性，更優(yōu)選至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性(在例如至少40、60、100、150、200、300或400個(gè)連續(xù)氨基酸的區(qū)域上或SEQ ID No.2的全長上)。
SEQ ID No.2的多肽和變體和物種同源物的序列可以被修飾以提供本發(fā)明的多肽?？梢援a(chǎn)生氨基酸取代，例如從1、2或3到10、20、30、50或100個(gè)取代。相同數(shù)目的刪除或插入也可以制成。這些改變可以位于對多肽的功能很關(guān)鍵的區(qū)域之外，因而可能仍產(chǎn)生有活性的酶。修飾過的多肽通常保持了木聚糖酶活性。
本發(fā)明的多肽包括上面提到的全長多肽和它的變體的片段，包括SEQ ID No.2所示的序列的片段。這些片段典型性保留了木聚糖酶活性。片段可能至少50、60、70、80、100、150、200或250個(gè)氨基酸長度或全長序列(SEQ ID No.2所示)減去這些數(shù)目的長度。片段或變體包含或代表了β-D-木聚糖結(jié)合區(qū)域或β-D-木聚糖切割區(qū)域。
雖然通常他們用下面所述的重組方法生產(chǎn)，但是如果必需，也可以用合成方法生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。他們可能被修飾，例如加入組氨酸殘基或T7標(biāo)簽，有助于他們的鑒定或純化，或加入信號肽序列來促進(jìn)他們從細(xì)胞內(nèi)分泌。
名詞“變體”是指具有與木聚糖酶同樣的基本性質(zhì)或基本生物學(xué)功能的多肽，包括等位基因變體。木聚糖酶的基本性質(zhì)是它是一種能夠切割β-D-木聚糖內(nèi)的1→4連接鍵的酶。具有與木聚糖酶相同的基本性質(zhì)的多肽可以用后面描述的纖維素降解實(shí)驗(yàn)來鑒定。
SEQ ID No.2的變體也包括與SEQ ID No.2不同、但不必衍生自天然發(fā)生的木聚糖酶蛋白質(zhì)的序列。這些變體可能描述成與SEQ ID No.2的同源性百分比或序列中的取代數(shù)目?；蛘撸凅w可能由能與SEQ IDNo.1雜交的多核苷酸編碼。
變體可以與SEQ ID No.1的變體相同的方式定義。因而這些變體可能包含衍生自籃霉菌屬其他菌株的不同序列。其他變體可以自其他籃霉菌屬菌株中通過尋找木聚糖酶活性、用與前面相同的方法克隆和測序而進(jìn)行鑒定。變體可能包括在蛋白質(zhì)序列內(nèi)刪除、修飾或添加單個(gè)氨基酸或氨基酸組，只要該肽維持木聚糖酶的基本生物學(xué)功能即可。
保守取代可以例如依據(jù)下面的表格制備。在第二欄同一區(qū)塊內(nèi)的氨基酸、優(yōu)選地在第三欄同一行可能相互取代。優(yōu)選取代不影響多肽的折疊或活性。
修飾本發(fā)明的多肽可能被化學(xué)修飾，例如翻譯后修飾。例如，他們可能被糖基化(一次或多次，被相同或不同的糖)或包含修飾的氨基酸殘基。他們也可能被組氨酸殘基(有助于他們的純化)的加入或被信號肽序列(促進(jìn)插入細(xì)胞膜)的加入而修飾。多肽可能有一種或多種(N)氨基端或(C)羧基末端延伸，比如氨基端甲硫氨酸殘基，多達(dá)大約20到25個(gè)殘基的小連接肽，或有助于純化的(小)延伸，比如多聚組氨酸或T7標(biāo)簽，抗原決定簇或(例如麥芽糖)結(jié)合域14(例如在C-末端)。這些延伸可能通過或可能沒有通過連接物添加。
本發(fā)明的多肽可能用顯色標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。顯色標(biāo)簽可能是任何適當(dāng)?shù)目梢蕴綔y多肽的標(biāo)簽。適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽包括放射性同位素，例如125I、35S、酶、抗體、多核苷酸和連接物比如生物素。
多肽可能被修飾以包括非天然產(chǎn)生的氨基酸或增加多肽的穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或肽用合成方式生產(chǎn)時(shí)，這些氨基酸可以在生產(chǎn)中引入。蛋白質(zhì)或肽也可能用合成或重組生產(chǎn)的方式進(jìn)行修飾。
本發(fā)明的多肽也可能包含(一種或多種)D-氨基酸或用其生產(chǎn)。在這些情況下，氨基酸殘基可能用本申請中所述的常規(guī)的N到C序列方法連接。
大量的側(cè)鏈修飾是本領(lǐng)域公知的，并可以對本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的側(cè)鏈進(jìn)行這樣的修飾。這些修飾包括，例如通過與醛反應(yīng)、隨之用NaBH4還原而進(jìn)行的還原性烷基化修飾，甲基乙酰亞胺酯的脒基化或乙酸酐的?；?。
本發(fā)明提供的序列也可被用作構(gòu)建“第二代”酶的起始材料?！暗诙蹦揪厶敲缚赡苁且延没蛘T變技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變)改變酶，它的性質(zhì)不同于那些野生型或重組木聚糖酶，比如用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的酶。例如，其最適溫度或pH、比活性、底物親和性或熱穩(wěn)定性，可能進(jìn)行改變從而更加適合在定義的過程中使用。
對本發(fā)明的木聚糖酶活性重要、因此優(yōu)選對它進(jìn)行取代的氨基酸，可以用本領(lǐng)域周知的方法鑒定，比如定點(diǎn)誘變或丙氨酸-掃描誘變10。在后一個(gè)的技術(shù)中，在分子的每個(gè)殘基都引入突變，對所得突變分子進(jìn)行生物活性(例如木聚糖酶活性)測試，以鑒定分子活性的關(guān)鍵氨基酸殘基。酶-底物相互作用位點(diǎn)也可以用晶體結(jié)構(gòu)的分析來確定，確定晶體結(jié)構(gòu)的技術(shù)比如核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記11，12，13或分子模建(modelling)。
使用酵母和真菌宿主細(xì)胞預(yù)計(jì)可提供對本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物賦予最適宜生物活性所必需的翻譯后修飾(例如蛋白水解加工、肉豆蔻酰化、糖基化、截短，和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)。
本發(fā)明的多肽可以處于其中天然細(xì)胞環(huán)境之外的形式提供。因此，它們可以是如上所述基本上分離的或純化的，或者處于自然界中并不存在它們的細(xì)胞內(nèi)，例如其它真菌物種、動物、酵母或細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。C，重組體方面本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，包括克隆和表達(dá)載體，以及在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中例如在本發(fā)明的多肽進(jìn)行表達(dá)的條件下生長、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染這些載體的方法。也提供了包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸是宿主細(xì)胞基因組異源的。名詞“異源的”通常與宿主細(xì)胞有關(guān)，意味著多核苷酸不在宿主細(xì)胞基因組內(nèi)自然產(chǎn)生，或多肽不在該細(xì)胞內(nèi)天然產(chǎn)生。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，例如克魯維酵母屬(Kluyveromyces)或酵母屬(Saccharomyces)酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞，例如曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸可以引入到重組的可復(fù)制的載體中，例如克隆或表達(dá)載體。載體可能用來在相容性宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因而，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多核苷酸的方法，包括把本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入可復(fù)制載體中，把載體導(dǎo)入相容性宿主細(xì)胞，和在使載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。載體可以從宿主細(xì)胞中回收。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞在下面與表達(dá)載體一起進(jìn)行描述。載體本發(fā)明的多核苷酸可以插入表達(dá)盒中。插入了本發(fā)明的表達(dá)盒或多核苷酸的載體，可能是可以方便的執(zhí)行重組DNA步驟的任何載體，載體的選擇將常常依賴于要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因而，載體可能是自主復(fù)制載體，例如以染色體外形式存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體可能是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)能整合到宿主細(xì)胞基因組中并與它所整合的染色體一起復(fù)制的載體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸在載體內(nèi)可操作性連接了能夠提供宿主細(xì)胞對編碼序列的表達(dá)的調(diào)控序列，即載體是表達(dá)載體。名詞“可操作性連接”是指并置位置，其中描述的組分處于能以預(yù)期的方式發(fā)揮功能的關(guān)系。調(diào)控序列比如啟動子、增強(qiáng)子或其他表達(dá)調(diào)控信號“可操作性連接”編碼序列是指它們所處的位置能使得在與控制序列相容的條件下進(jìn)行編碼序列的表達(dá)，或它們協(xié)同地發(fā)揮預(yù)定功能，例如轉(zhuǎn)錄起始于啟動子，并通過編碼多肽的DNA序列。
載體可能是質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體，通常提供復(fù)制起點(diǎn)，任選地多核苷酸表達(dá)的啟動子，任選地啟動子的增強(qiáng)子和/或調(diào)控子。終止子序列可能存在，例如多聚腺苷酸化序列。載體可能含有一種或多種可選擇標(biāo)記基因，例如，氨芐青霉素抗性基因(在細(xì)菌質(zhì)粒的實(shí)例中)或新霉素抗性基因(哺乳類載體中)。載體可能用于體外，例如RNA的生產(chǎn)或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。他們可能包含兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸，例如為了進(jìn)行過量表達(dá)。
編碼多肽的DNA序列優(yōu)選地被導(dǎo)入適當(dāng)宿主，作為表達(dá)盒(或構(gòu)建體)的一部分，其中DNA序列可操作性連接能夠指導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)該DNA序列表達(dá)的表達(dá)信號。為了把表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主，可采用技術(shù)人員公知的容易獲得的轉(zhuǎn)化步驟3，4。表達(dá)構(gòu)建體可能作為攜帶選擇標(biāo)記的載體的部分用于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或表達(dá)構(gòu)建體可能作為單獨(dú)分子與攜帶選擇標(biāo)記的載體一起進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。載體可能包含一種或多種選擇標(biāo)記基因。
優(yōu)選的選擇標(biāo)記15，16包括但并不限于可補(bǔ)充宿主細(xì)胞的某種缺陷或獲得某種藥物抗性的標(biāo)記物。他們包括例如可用于多數(shù)絲狀真菌和酵母的轉(zhuǎn)化的通用性標(biāo)記基因，比如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或來自構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)的cDNA)，或提供針對抗生素比如G418、潮霉素、博萊霉素、卡那霉素、腐草霉素、苯菌靈抗性(benA)的抗性基因。或者，可以用特定選擇標(biāo)記物，比如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，它需要相應(yīng)突變宿主菌株例如URA3(來自釀酒酵母或其他酵母的類似基因)，pyrG或pyrA(來自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)，argB(來自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記在表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入后從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中刪除，從而獲得能夠產(chǎn)生不含選擇標(biāo)記基因的多肽的被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
其他標(biāo)記物包括ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸-脫羧酶(pvrA)、細(xì)菌G418抗性基因(這也可能用于酵母，但不用于真菌)、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)、新霉素抗性基因(芽孢桿菌)和編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大腸桿菌uidA基因。載體可能用于體外，例如RNA的生產(chǎn)或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
對多數(shù)絲狀真菌和酵母，為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，載體或表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地整合到宿主細(xì)胞基因組中。然而，對于某些酵母，也可以用適當(dāng)?shù)挠坞x體型載體，其中可摻入表達(dá)構(gòu)建體以穩(wěn)定和高水平表達(dá)，其例子包括分別衍生自酵母屬和克魯維酵母屬的2μ和pKD1質(zhì)粒的載體，或含有AMA序列(例如來自曲霉(Aspergillus)的AMA13，20)的載體。若表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，則構(gòu)建體或者在基因組隨機(jī)位點(diǎn)整合，或者用同源重組在預(yù)定目標(biāo)位點(diǎn)整合，其中目標(biāo)位點(diǎn)優(yōu)選包含高表達(dá)基因。高表達(dá)基因是mRNA能占到總細(xì)胞mRNA至少0.01％(w/w)的基因(例如在誘導(dǎo)條件下)，或者，基因產(chǎn)物可能達(dá)到全部細(xì)胞蛋白質(zhì)的至少0.2％(w/w)的基因，或在分泌基因產(chǎn)物的例子中，是分泌水平可達(dá)到至少0.05克/升的基因。下面提供了大量高表達(dá)基因的適當(dāng)?shù)睦印?br> 用于指定的宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)構(gòu)建體可能包含下面的元件，從5’端到3’端相互可操作性連續(xù)連接編碼第一個(gè)發(fā)明多肽的序列的編碼鏈(1)能夠指導(dǎo)在指定的宿主細(xì)胞中編碼該多肽的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的啟動子序列；(2)任選地，能夠指導(dǎo)從指定的宿主細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌多肽的信號序列；(3)編碼成熟、優(yōu)選活性形式多肽的DNA序列；也優(yōu)選地(4)能夠終止編碼該多肽的DNA序列下游的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(終止子)。
編碼多肽的DNA序列下游可能是3’非翻譯區(qū)，其中含有一種或多種轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(例如終止子)。終止子起點(diǎn)不是很關(guān)鍵。終止子可能例如是編碼多肽的DNA序列天然的。然而，優(yōu)選地酵母終止子用于酵母宿主細(xì)胞，絲狀真菌終止子用于絲狀真菌宿主細(xì)胞中。更優(yōu)選地，終止子是宿主細(xì)胞(其中待表達(dá)編碼多肽的DNA序列)內(nèi)源的。
增強(qiáng)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)可能也可通過選擇異源調(diào)控區(qū)，例如啟動子、分泌引導(dǎo)區(qū)和/或終止區(qū)域來達(dá)到，這些區(qū)域可用來提高目的多肽從表達(dá)宿主中的表達(dá)以及分泌水平(若期望的話)，和/或提供本發(fā)明的多肽表達(dá)的誘導(dǎo)控制。
除了編碼本發(fā)明的多肽的基因天然的啟動子，其他啟動子可能用于指導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的多肽。啟動子的選擇依據(jù)是在期望的表達(dá)宿主中指導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的多肽的效率。
啟動子/增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控信號可能選擇成與表達(dá)載體的宿主細(xì)胞相兼容。例如可使用原核啟動子，尤其適用于大腸桿菌株的啟動子。當(dāng)在哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，可使用哺乳類啟動子。組織特異性啟動子，例如肝細(xì)胞特異性啟動子，也可使用。病毒啟動子也可使用，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒長末端重復(fù)序列(Moloney murineleukaemia Virus long terminal repeat，MMLV LTR)、勞氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus，RSV)長末端重復(fù)序列啟動子、SV40(例如大T抗原)啟動子、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)IE啟動子、單純皰疹病毒(herpes simplex virus)啟動子或腺病毒啟動子，HSV啟動子比如HSV IE啟動子，或HPV啟動子，尤其HPV上游調(diào)控區(qū)(upstream regulatory region，URR)。酵母啟動子包括啤酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH啟動子，粟酒裂殖酵母(S.pombe)nmt 1和adh啟動子。哺乳類啟動子包括金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子和β-肌動蛋白啟動子，前者可應(yīng)答重金屬如鎘而被誘導(dǎo)，。組織特異性啟動子尤其內(nèi)皮或神經(jīng)細(xì)胞特異性啟動子(例如DDAHI和DDAHII啟動子)是尤其優(yōu)選的。
可使用能夠在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的多種啟動子15，16。優(yōu)選啟動子序列是衍生自上面所定義的高表達(dá)基因。優(yōu)選衍生本發(fā)明的啟動子和/或包含在優(yōu)選的預(yù)定靶位點(diǎn)、用于整合表達(dá)構(gòu)建體的高表達(dá)基因的實(shí)例，包括但不限于編碼糖酵解酶比如丙糖磷酸異構(gòu)酶(triose-phosphate isomerases，TPI)，甘油醛-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenases，GAPDH)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinases，PGK)，丙酮酸激酶(pyruvate kinases，PYK或PKI)，乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenases，ADH)的基因，也包括編碼淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、乙醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白質(zhì)的基因。適當(dāng)高表達(dá)基因的特定例子包括例如來自克魯維酵母(Kluyveromyces sp.)的LAC4基因、來自漢遜酵母(Hansenula)和畢氏酵母(Pichia)的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)，來自黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉TAKA-淀粉酶基因，構(gòu)巢曲霉gpdA基因和半知菌木霉(T.reesei)的纖維二糖水解酶基因。
強(qiáng)組成性和/或誘導(dǎo)性啟動子中優(yōu)選用于真菌表達(dá)宿主15，16，35中的例子是可得自編碼木聚糖酶(xlnA)、肌醇六磷酸酶(phytase)、ATP合成酶、亞基9(oliC)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、乙醇脫氫酶(AdhA)、α-淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG來自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)的真菌基因的啟動子。
強(qiáng)酵母啟動子的例子是可從乙醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因中獲得的啟動子。
強(qiáng)細(xì)菌啟動子的例子有α-淀粉酶和SPo2啟動子，以及來自細(xì)胞外蛋白酶基因的啟動子。
編碼木聚糖酶的基因的天然啟動子可能用另外一種受到不同調(diào)控的啟動子替換。
植物細(xì)胞適合的啟動子包括胭脂堿合成酶(nos)、章魚堿合成酶(ocs)、甘露堿合成酶(mas)、核酮糖小亞基(rubisco ssu)、組蛋白、水稻肌動蛋白、菜豆球蛋白、花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaic virus，CMV)35S和19S和環(huán)病毒(circovirus)啟動子。所有這些啟動子都是本領(lǐng)域容易獲得的。
載體可能進(jìn)一步包括產(chǎn)生RNA的多核苷酸側(cè)翼的序列，其中包含與真核基因組序列、優(yōu)選哺乳類基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。這將容許本發(fā)明的多核苷酸通過同源重組的方式導(dǎo)入真核細(xì)胞或病毒的基因組。尤其，包含側(cè)翼為病毒序列的表達(dá)盒的質(zhì)粒載體能夠用于制備適于把本發(fā)明的多核苷酸投遞給哺乳類細(xì)胞的病毒載體。其他適當(dāng)病毒載體的例子包括單純皰疹病毒載體18，19和逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒(lentivirus)、腺病毒、腺伴隨病毒和HPV病毒(比如HPV-16或HPV-18)。使用這些病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例如可能用來穩(wěn)定性整合產(chǎn)生反義RNA的多核苷酸進(jìn)入宿主基因組。相反，復(fù)制缺陷的腺病毒載體可處于游離體狀態(tài)，因而容許瞬時(shí)表達(dá)。
載體可能包含定向在反義方向的本發(fā)明的多核苷酸，提供反義RNA的生產(chǎn)。如果需要，這可能用來減少多肽的表達(dá)。宿主細(xì)胞和表達(dá)在下一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備依據(jù)本發(fā)明的多肽的方法，它包含在可提供編碼多肽的編碼序列的表達(dá)(如由載體表達(dá))的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(例如用上面所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，和任選的回收表達(dá)的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可以摻入到重組的可復(fù)制載體中，例如表達(dá)載體中。載體可能用于在相容性宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因而在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制造本發(fā)明的多核苷酸的方法，包括把本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入可復(fù)制載體，把載體導(dǎo)入相容性宿主細(xì)胞，和在使載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。載體可以從宿主細(xì)胞中回收。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌比如大腸桿菌、酵母、哺乳類細(xì)胞系和其他真核細(xì)胞系，例如昆蟲細(xì)胞比如SF9細(xì)胞和(例如絲狀)真菌細(xì)胞。
優(yōu)選地多肽以分泌蛋白質(zhì)形式生產(chǎn)，在這種情況下，在表達(dá)構(gòu)建體中編碼多肽成熟形式的DNA序列可操作性連接編碼信號序列的DNA序列上。優(yōu)選地信號序列是編碼多肽的DNA序列天然(同源)的?；蛘?，信號序列是編碼多肽的DNA序列外來的(異源的)，其中信號序列優(yōu)選地是表達(dá)DNA序列的宿主細(xì)胞內(nèi)源的。用于酵母宿主細(xì)胞的適當(dāng)信號序列的例子是來自酵母α-因子基因的信號序列。相似地，來自絲狀真菌宿主細(xì)胞的適當(dāng)信號序列的例子是，例如來自絲狀真菌淀粉葡萄糖苷酶(AP)基因的信號序列，例如黑曲霉glaA基因。這可能與淀粉葡萄糖苷酶(也叫做(葡萄糖)淀粉酶)啟動子本身，以及與其他啟動子聯(lián)合使用。雜合信號序列也可能用在本發(fā)明中。
優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列是來自真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA的18和24個(gè)氨基酸變型(例如來自曲霉))、α-因子基因(酵母例如酵母屬和克魯維酵母屬)或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌)的序列。
載體可能如上面所描述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以提供本發(fā)明的多肽的表達(dá)。這種方法可能包含在適于載體表達(dá)所述多肽編碼序列的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
因而，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用或包含本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地多核苷酸攜帶于復(fù)制和表達(dá)多核苷酸的載體中。選擇與該載體相兼容的細(xì)胞，可能是例如原核(例如細(xì)菌)、真菌、酵母或植物細(xì)胞。
也可能選擇異源宿主，其中生產(chǎn)的本發(fā)明的多肽基本上不含其他纖維素降解酶。這可能通過選擇正常不能產(chǎn)生這些酶的宿主比如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)來獲得。
本發(fā)明包含以重組表達(dá)編碼該多肽的DNA序列的方式生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。為了此目的，本發(fā)明的DNA序列可用于基因擴(kuò)增和/或表達(dá)信號的交換，比如啟動子、分泌信號序列，以便在適當(dāng)?shù)耐椿虍愒此拗骷?xì)胞中經(jīng)濟(jì)化生產(chǎn)多肽。同源宿主細(xì)胞是與從中衍生DNA序列的物種相同的物種或變種的宿主細(xì)胞。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞優(yōu)選的是原核微生物比如細(xì)菌，或更優(yōu)選的真核微生物，例如真菌，比如酵母或絲狀真菌，或植物細(xì)胞。一般，與真菌細(xì)胞相比優(yōu)選酵母細(xì)胞，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀撞僮?。然而，一些蛋白質(zhì)不是從酵母中分泌不佳，就是在某些情況下不能正確加工(例如酵母中的高糖基化)。在這些例子中，應(yīng)該選擇真菌宿主生物。
宿主細(xì)胞可能過量表達(dá)多肽，工程化過量表達(dá)的技術(shù)是眾所周知的3。宿主可能因此有兩個(gè)或多個(gè)編碼多核苷酸拷貝(因此載體可能相應(yīng)的具有兩個(gè)或多個(gè)拷貝)。
來自芽孢桿菌屬的細(xì)菌非常適合于作為異源宿主，因?yàn)樗鼈兡軌蚍置诘鞍踪|(zhì)到培養(yǎng)基中。其他適于作宿主的細(xì)菌來自鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌株。優(yōu)選的表達(dá)編碼所述多肽的DNA序列的酵母宿主細(xì)胞來自酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢氏酵母屬(Pichia)、Yarrowia和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。更優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞可選擇自包含物種釀酒酵母、乳酸克魯維酵母(也稱作馬克斯克魯維酵母乳酸變種(Kluyveromyces marxianus var.lactis))、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、Yarrowia lipolytica和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的組。
然而，最優(yōu)選的是(例如絲狀)真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞選自包含曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、鐮孢屬(Fusarium)、Disporotrichum、青霉屬(Penicillium)、枝頂孢屬(Acremonium)、脈孢菌屬(Neurospora)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、毀絲霉屬(Myceliophtora)、側(cè)孢屬(Sporotrichum)、梭孢殼屬(Thielavia)和籃霉菌屬(Talaromyces)的組。更優(yōu)選絲狀真菌宿主細(xì)胞選自物種米曲霉、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)，或來自物種黑曲霉23。這些包括但不限于黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、構(gòu)巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉和無花果曲霉(Aspergillus ficuum)，進(jìn)一步包含物種Trichoderma reesei、禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa)、嗜熱毀絲霉(Myceliophtora thermophilum)、Sporotrichumcellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum和Thielaviaterrestris。本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的表達(dá)宿主的例子是真菌比如曲霉24，25和木霉；細(xì)菌比如芽孢桿菌26，27，例如枯草芽孢桿菌、地衣型芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、假單胞菌；酵母比如克魯維酵母28，例如乳酸克魯維酵母29和酵母菌，例如釀酒酵母。
依據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞，因此本發(fā)明延伸到轉(zhuǎn)基因生物體，比如含有一種或多種本發(fā)明的細(xì)胞的植物和它的部分。細(xì)胞可能異源表達(dá)本發(fā)明的多肽，或異源含有一種或多種本發(fā)明的多核苷酸。因此，轉(zhuǎn)基因(或基因修飾)植物的基因組內(nèi)可能插入(例如穩(wěn)定地)了編碼一種或多種本發(fā)明的多肽的編碼序列。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以采用已知的技術(shù)，例如用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti或Ri質(zhì)粒。因而，質(zhì)粒(或載體)可含有感染植物必需的序列，并且可能采用Ti和/或Ri質(zhì)粒的衍生物。
或者，可直接感染植物的一部分，比如葉、根或莖。在這個(gè)技術(shù)中，要進(jìn)行感染的植物可通過，例如用刀片切植物或用針刺植物或用研磨劑摩擦植物而造成創(chuàng)傷。接著用土壤桿菌接種傷口。然后可將植物或植物部分在適當(dāng)培養(yǎng)基上生長，使之發(fā)育為成熟植物?？梢杂靡阎募夹g(shù)使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為基因修飾的植物，例如通過用抗生素選擇轉(zhuǎn)化的幼芽，并在含有合適營養(yǎng)物、植物激素等17的培養(yǎng)基上對這些幼芽進(jìn)行次培養(yǎng)。培養(yǎng)宿主細(xì)胞和重組生產(chǎn)本發(fā)明也包括已經(jīng)修飾而表達(dá)木聚糖酶或其變體的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括瞬時(shí)的，或優(yōu)選穩(wěn)定的高等真核細(xì)胞系，比如哺乳類細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，低等真核細(xì)胞，比如酵母和(例如絲狀)真菌細(xì)胞或原核細(xì)胞比如細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可能在細(xì)胞系或在膜上瞬時(shí)表達(dá)，比如例如在桿狀病毒(baculovirus)表達(dá)系統(tǒng)中。這些適于表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
依據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多肽可以通過在常規(guī)營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物表達(dá)宿主而有效生產(chǎn)，該宿主已轉(zhuǎn)化有一種或多種本發(fā)明的多核苷酸。
依據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可能用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)。對每一種啟動子和宿主細(xì)胞的組合，有助于表達(dá)編碼多肽的DNA序列的培養(yǎng)條件是可以獲得的。到達(dá)期望的細(xì)胞密度或多肽水平之后，停止培養(yǎng)，采用已知的方法回收多肽。
發(fā)酵培養(yǎng)基可能包含已知培養(yǎng)基，其含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)、有機(jī)氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨等)和無機(jī)營養(yǎng)源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等)。任選地，可能包括誘導(dǎo)物(例如纖維素、果膠、麥芽糖、麥芽糊精或木糖聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan))。
合適培養(yǎng)基的選擇可能基于表達(dá)宿主的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建體調(diào)控的需要。這些培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。如果需要，培養(yǎng)基可能含有有助于轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主優(yōu)于潛在的其它污染微生物而生長的其它組分。
發(fā)酵可能在0.5到30天的期間內(nèi)執(zhí)行。它可能是批量、持續(xù)或補(bǔ)料-分批過程，適于在溫度范圍0到45℃，在例如pH2到10之間進(jìn)行。優(yōu)選的發(fā)酵條件是溫度在20到37℃之間，和/或pH在3到9之間。合適條件的選擇通常基于表達(dá)宿主和所表達(dá)蛋白質(zhì)的選擇。
如果需要，發(fā)酵后用離心或過濾的方式從發(fā)酵肉湯種去除細(xì)胞。發(fā)酵終止后或去除細(xì)胞后，可能獲得本發(fā)明的多肽，如果需要，用常規(guī)方法純化和分離。D，木聚糖酶的應(yīng)用和處理植物或含纖維素(例如木聚糖)材料的方法具有木聚糖酶活性的本發(fā)明的多肽可用于處理真菌或植物材料，包括植物漿和植物提取物。例如它們可能用于處理谷物、蔬菜、水果或他們的提取物。本發(fā)明的多肽可方便地與適當(dāng)?shù)?固體或液體)載體或稀釋液(包括緩沖液)相混合，以生產(chǎn)組合物或酶制劑。多肽可能與載體混合或附著其上，例如固定在固相載體上。因而，在更深一步方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的多肽的組合物。這可能是以適合于包裝、運(yùn)輸和/或儲存的形式，優(yōu)選地在保留木聚糖酶活性的形式。組合物可能是糊狀、液體、乳液、粉末、片狀、顆粒狀、丸狀或其他擠出物形式。
組合物可能進(jìn)一步包含其它成分，比如一種或多種酶，例如果膠酶，包括內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(endo-arabinanase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalaturonase)、纖維素酶、(其他)木聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶(galacturonase)、甘露聚糖酶(mannanase)和/或木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)。多肽一般穩(wěn)定地配制成液體或干燥形式。典型地，產(chǎn)品被制成組合物，其中任選地包括例如穩(wěn)定緩沖液和/或防腐劑。組合物可能也包括能夠消化植物材料或纖維素的其他酶，例如其他纖維素酶，例如(β-D)葡聚糖酶。對于某些特定用途，優(yōu)選把酶固定于固體基質(zhì)或摻入到固體載體顆粒上或之中。組合物可能也包括多種其他植物材料降解酶，例如纖維素酶和其他果膠酶。
因此本發(fā)明的多肽和組合物可用于處理植物材料以降解或修飾植物或真菌材料的細(xì)胞壁的纖維素成分的方法中。因而在更深一步方面，本發(fā)明提供了降解或修飾植物細(xì)胞的方法，該方法包含把植物或真菌細(xì)胞與本發(fā)明的多肽或組合物相接觸。
本發(fā)明也提供處理植物材料的方法，該方法包含把植物材料與本發(fā)明的多肽或組合物相接觸，以降解或修飾(植物)材料中的纖維素。優(yōu)選植物材料是植物漿或植物提取物，比如汁液。
尤其，降解優(yōu)選包含植物細(xì)胞壁中纖維素組分的木聚糖亞單元的切割。植物材料優(yōu)選谷類、蔬菜、水果或者蔬菜的或水果的漿或提取物。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過把植物材料與本發(fā)明的多肽或組合物相接觸可得到的經(jīng)加工的植物材料。
本發(fā)明也提供減少植物提取物粘性的方法，該方法包含在有效降解植物提取物所含的纖維素(或木聚糖)的量下，使植物提取物與本發(fā)明的多肽或組合物相接觸。
植物和含有纖維素的材料包括植物漿，植物的部分和植物提取物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，植物材料的提取物是可通過提取(機(jī)械和/或化學(xué)法)、加工或其它分離技術(shù)而自植物材料中衍生的任何物質(zhì)。提取物可能是汁液、花蜜、堿或其濃縮物。植物材料可能包含或源自蔬菜，例如胡蘿卜、芹菜、洋蔥、豆類或豆科植物(大豆、黃豆、豌豆)或水果，例如梨果或種子水果(蘋果、梨、溫柏等)、葡萄、番茄、柑橘(橙子、檸檬、酸橙、橘子)、瓜、李子、櫻桃、紅醋栗、紅漿果、紅莓、草莓、越桔、菠蘿和其他熱帶水果，樹木和其部分(例如松樹的花粉)，或谷類(燕麥、大麥、小麥、玉米、水稻)。(要水解的)材料可能是農(nóng)業(yè)殘?jiān)?，比如制糖甜菜漿、玉米碎塊、小麥麥桿、(地上的)堅(jiān)果殼或可重復(fù)利用的材料，例如(廢)紙。
本發(fā)明的多肽因此可能用于處理植物材料，包括植物漿和植物提取物。他們可能也用于處理液體或固體食品或可食用的食物配料，或用于提取咖啡、植物油、淀粉或用作食物增稠劑。
典型地，本發(fā)明的多肽作為如上面所述的組合物/酶制劑使用。組合物一般加入通過例如機(jī)械處理比如壓榨或研磨植物材料而獲得的植物漿中。組合物與植物的孵育一般進(jìn)行10分鐘到5小時(shí)，比如30分鐘到2小時(shí)，優(yōu)選大約1小時(shí)。處理溫度優(yōu)選10-55℃，例如從15到25℃，任選大約20℃，每噸待處理材料可能用10到300克，優(yōu)選30-70克，任選大約50克酶。所有使用的酶或他們的組合物可能按順序加入或同時(shí)加入到植物漿中。依賴于酶制劑的組分，植物材料可能首先需浸軟(例如作成泥)或液化。使用本發(fā)明的多肽可以提高工藝參數(shù)比如提取產(chǎn)量，提取物粘度和/或提取物質(zhì)量。
另外，或除了上面的之外，本發(fā)明的多肽可能加入通過壓榨或液化植物漿獲得的粗制汁液中。處理粗制汁液可采用處理植物漿相同的劑量、溫度和維持時(shí)間進(jìn)行。同樣，可能包括前面討論過的其他酶。典型孵育條件在前面一段中有描述。一旦粗制汁液用本發(fā)明的多肽孵育之后，接著離心汁液或(超濾)過濾生產(chǎn)最終產(chǎn)物。
用本發(fā)明的多肽處理之后，(終)產(chǎn)物可進(jìn)行熱處理，例如在可以部分或全部滅活本發(fā)明的多肽的條件下在100℃維持1分鐘到1小時(shí)。
含有本發(fā)明多肽的組合物也可用于水果或蔬菜濃湯的制備中。
本發(fā)明的多肽也可用于釀造、制酒、蒸餾或烘烤中。因此，它可能用于制備含酒精飲料比如酒和啤酒。例如，它可能提高(啤酒、麥芽汁或酒的)過濾性或澄清度。蛋白質(zhì)可能有助于從肉湯或培養(yǎng)基中去除溶解的有機(jī)物，例如在其中有機(jī)來源的蒸餾殘?jiān)镛D(zhuǎn)化成微生物的生物質(zhì)時(shí)即如此。木聚糖酶能夠改善例如通過液化(如用α-淀粉酶)而由谷物生產(chǎn)的葡萄糖糖漿的過濾性和/或減少粘性。
在烘烤中，多肽能改善面團(tuán)結(jié)構(gòu)，改變它的粘性或柔軟性，提高面包體積和/或面包屑結(jié)構(gòu)或給予更好的結(jié)構(gòu)性質(zhì)比如裂口、碎片或碎屑質(zhì)量?？赡芤詣┝繌?00到3000，比如從150到2000，任選從200到1600 EXU/千克面粉加入多肽。
由于他們的木聚糖酶活性，本發(fā)明多肽可用在大量工業(yè)領(lǐng)域中。這些可能包括不僅有乙醇的生產(chǎn)，而且有生物甲烷化中、加工面包中和烘烤中、牙齒衛(wèi)生中(例如牙科用或口服組合物)、處理或制造皮革中、造紙中、藥物中、茶中、紡織品制備或處理中和廢物處理中。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是包含多肽的食物或糧食，比如酒精飲料、面包、面團(tuán)或茶。多肽可能配制成用于任何這些用途的適當(dāng)組合物。多肽可能存在于水性組合物(例如熱水)中，優(yōu)選其中具有一種或多種殺真菌劑，以處理植物材料(例如球莖)，尤其是控制寄生昆蟲、螨蟲和線蟲。因?yàn)楸景l(fā)明的多肽能夠降解木聚糖，故可將他們加入食物或糧食(例如被人消費(fèi))中。本發(fā)明也包括藥物組合物和獸用組合物，其中包含本發(fā)明的多肽和制藥或獸醫(yī)可接受的載體。
本發(fā)明的多肽可能也顯示有抗真菌活性。他們可能能夠降解真菌細(xì)胞壁，因而可能用于降解真菌細(xì)胞壁，以打開細(xì)胞壁。這可能釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。用這樣的方法，多肽可能用于制備酵母和/或真菌提取物。E，動物飼料本發(fā)明另外涉及糧食或底物飼料組合物或添加劑，其中包含一種或多種本發(fā)明的多肽。多肽以與天然濃度不同的濃度存在于飼料中。優(yōu)選量為每千克飼料0.6到35mg，比如1.5到15mg，優(yōu)選3到15mg。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的多肽存在于飼料中的量為從1000到50000 EXU/千克飼料，比如從2500到25000 EXU/千克，任選從5000到20000 EXU/千克。
本發(fā)明也涉及制備動物飼料組合物的方法，該方法包含將本發(fā)明的多肽加入至一種或多種可食用飼料物質(zhì)或配料(其中適當(dāng)?shù)匕揪厶?。多肽可能與飼料物質(zhì)或配料分別加入動物飼料組合物中，并單獨(dú)地或聯(lián)合其他飼料添加物。多肽可能是飼料物質(zhì)或配料之一的內(nèi)在部分。
本發(fā)明的多肽也可能加入到富含纖維素的動物飼料中，以提高植物細(xì)胞壁的分解，從而提高動物對植物營養(yǎng)物的利用。如果優(yōu)選預(yù)先浸泡的或濕的食物，本發(fā)明的多肽可能加入飼料或青貯飼料中。在有利的方面，本發(fā)明的多肽可能在體內(nèi)繼續(xù)降解飼料中的纖維素。本發(fā)明基于真菌的多肽尤其一般具有低最佳pH，能夠在諸如動物胃部的酸性環(huán)境內(nèi)釋放重要營養(yǎng)物。然而，本發(fā)明也涵蓋包含一種或多種本發(fā)明多肽的(例如動物)飼料或糧食。
本發(fā)明的多肽可能也用于由大豆生產(chǎn)牛奶代用品(替代品)的過程中。人和動物都可以消費(fèi)這些牛奶代用品。制備這些牛奶代用品中的典型問題是大豆?jié){的高粘度，結(jié)果需要不太理想地將漿體稀釋到干物質(zhì)占10到15％的濃度。含有本發(fā)明的多肽的酶制劑可能加入漿液中，或在處理過程中加入，以便能夠在干物質(zhì)高濃度下(通常40到50％)操作。在從例如大豆中制備口味好的產(chǎn)品時(shí)也可使用所述酶。
組合物可能另外包含(尤其當(dāng)配制用于動物飼料中時(shí))一種或多種離子載體、氧化劑、表面活性劑、瘤胃保護(hù)性氨基酸、酶增強(qiáng)劑或可以在飼養(yǎng)動物胃腸道中天然產(chǎn)生的酶。
當(dāng)加入反芻動物或單胃動物(例如家禽或豬)的飼料(包括青貯飼料)中時(shí)，飼料可能包含谷類比如大麥、小麥、玉米、黑麥或燕麥或谷類副產(chǎn)品比如小麥麩皮糠或玉米麩皮糠，或其他植物材料比如黃豆和其他豆類。酶可能顯著性提高植物細(xì)胞壁的破壞，使動物更好利用植物營養(yǎng)物。其結(jié)果可能提高生長速率和/或飼料轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的多肽可能加入飼料中(直接或作為添加物或配料)或加入處理過的飼料配料(例如纖維素/木聚糖)來替代。
該蛋白質(zhì)可能減少(含有木聚糖)飼料的粘度該蛋白質(zhì)可能在體內(nèi)繼續(xù)水解木聚糖。本發(fā)明的蛋白質(zhì)尤其適用于動物飼料中，因?yàn)樗麄冊趶?qiáng)酸性條件下比如在動物胃中仍然有活性。
尤其優(yōu)選(外源)添加修飾過的木聚糖酶的方法，是以轉(zhuǎn)基因植物材料和/或(例如轉(zhuǎn)基因)種子形式加入本發(fā)明的多肽。因而，多肽可能通過異源基因表達(dá)來合成，例如可將編碼期望的酶的基因克隆到植物表達(dá)載體中，在適當(dāng)植物表達(dá)信號，例如組織特異性啟動子，比如種子特異性啟動子的控制下表達(dá)。包含編碼多肽的基因的表達(dá)載體，隨后被轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用于再生成完整植物。因而培養(yǎng)和收獲得到的轉(zhuǎn)基因植物，這些植物的包含異源(相對該植物)多肽的部分可本身或在進(jìn)一步處理之后包括在一種組合物中。(轉(zhuǎn)基因)植物中酶(異源)表達(dá)的一般方法，包括酶在種子中特異性表達(dá)酶的方法，都是眾所周知的30。異源多肽可包含在轉(zhuǎn)基因植物種子中，或包含在植物其他部分中，比如根、莖、葉、木質(zhì)部、花、樹皮和/或果實(shí)中。植物可能是單子葉植物或雙子葉植物。適當(dāng)?shù)闹参锇ü阮?，比如燕麥、大麥、小麥、玉米和水稻。?yōu)選本發(fā)明的多核苷酸穩(wěn)定性摻入植物基因組中。
以轉(zhuǎn)基因植物材料例如轉(zhuǎn)基因種子的形式加入多肽可能需要處理植物材料，以致該酶可供利用，或至少提高其可用性。這些處理技術(shù)可能包括多種機(jī)械(例如粉碎和/或研磨)技術(shù)或熱機(jī)械處理比如擠壓或膨脹。
本發(fā)明也涉及促進(jìn)單胃和/或非反芻動物生長和/或飼料轉(zhuǎn)換的方法，該方法包含用本發(fā)明的多肽飼養(yǎng)動物。適當(dāng)?shù)膭游锇ㄞr(nóng)場、單胃和/或非反芻動物比如豬(或小豬)、家禽(比如小雞、火雞)、牛犢或小牛或水生(例如海洋)動物(例如魚)。纖維素降解酶測試方法在本發(fā)明中也包括使用根據(jù)本發(fā)明的多肽篩選能夠作為可調(diào)節(jié)木聚糖酶的激動劑或拮抗劑起作用的化合物。在通常情況下，這些篩選方法可能涉及使本發(fā)明的多肽接觸測試化合物，接著測量活性，或把本發(fā)明的多肽與測試物進(jìn)行孵育，接著探測對木聚糖酶活性的任何調(diào)節(jié)。與本發(fā)明的多肽結(jié)合的試劑也可以用結(jié)合測試方法鑒定。
調(diào)控物活性可通過使表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞接觸測試物質(zhì)并監(jiān)測多肽調(diào)節(jié)的效果而進(jìn)行測定。細(xì)胞可能在體外表達(dá)多肽，優(yōu)選地，測試使用表達(dá)重組多肽的細(xì)胞在體外執(zhí)行。
測試和此處描述的底物容許鑒定和證實(shí)木聚糖酶活性。這些測試可用來探測其他纖維素降解酶，例如具有木聚糖酶活性的那些。這個(gè)測試中所用的底物可包含木聚糖。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及鑒定或探測能夠降解纖維素的多肽的測試法。其活性可能是木聚糖酶，或可能是果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、酯酶、纖維素酶、木糖葡聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶。這個(gè)測試可能包含(a)提供適當(dāng)?shù)牡孜?如上述)作為候選化合物(通常是多肽)的底物；和(b)使底物與候選化合物接觸，并探測是否有任何木聚糖酶活性產(chǎn)物的生成。
上面的測試可用來鑒定木聚糖酶活性的調(diào)控物。這些化合物可能減少水果的軟化，從而可使水果有更好的香味和顏色，并且有更長的儲存和/或運(yùn)輸期限。因而這些測試可用來鑒定可能用于抑制水果軟化的本發(fā)明多肽的抑制物。
本發(fā)明的一個(gè)方面優(yōu)選的特征和性質(zhì)，加以必要的變更后適用于另一個(gè)方面。
本發(fā)明將參考下面的實(shí)施例來進(jìn)行描述，它們僅僅對本發(fā)明進(jìn)行了闡述，而沒有進(jìn)行限制。
DNA標(biāo)記和雜交依據(jù)ECLTM直接核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(AmershamLIFE SCIENCE公司，Little Chalfont，英國)或依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的放射性標(biāo)記技術(shù)1進(jìn)行操作。實(shí)施例1從T.emersonii中分離RNA和cDNA的合成在木聚糖誘導(dǎo)條件下，發(fā)酵T.emersonii菌株CBS 393.64。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用Miracloth過濾袋過濾獲得菌絲體(mycelium)和培養(yǎng)物上清液。菌絲體用去礦物質(zhì)水充分洗滌，用紙條擠壓去除過多的水。來自選定時(shí)間點(diǎn)(基于培養(yǎng)上清液中纖維素酶的測定)的菌絲體在液氮中立即冷凍，用研缽和缽杵研成細(xì)小的粉末。將得到的粉末轉(zhuǎn)移至無菌的50毫升管中，稱重每1-1.2克研碎的菌絲體，加入10毫升TRIzol試劑(Gibco/BRL)(每管最大加25毫升)。菌絲體粉末經(jīng)劇烈混合(渦漩振蕩1分鐘)、隨后室溫孵育5分鐘(不時(shí)進(jìn)行混合)而立即溶解。加入0.2(原始TRIzol)倍體積的異丙醇(即對于開始使用的每10毫升TRIzol，用2毫升)，渦漩振蕩，室溫保持10分鐘。之后，混合物在4℃6000g離心30分鐘。轉(zhuǎn)移上部的水相到一個(gè)新管中，加入(原始TRIzol)0.5倍體積的異丙醇(即對于開始使用的每10毫升TRIzol，用5毫升)沉淀總RNA。室溫沉淀10分鐘之后，6000g離心30分鐘獲得RNA。去除上清液后，用1倍體積70％乙醇漂洗RNA沉淀。去除乙醇之后，風(fēng)干RNA沉淀。干燥的RNA沉淀溶解于3毫升GTS(100mMTris-Cl，pH7.5，4M硫代氰酸胍，0.5％月桂基肌氨酸鈉)緩沖液中。用10微升的RNA溶液確定核酸的質(zhì)量和濃度1，3。
進(jìn)行Northern分析3并進(jìn)一步純化分離到的RNA。mRNA的分離采用PHARMACIA純化試劑盒(目錄號27-9258-02)的改動后方法(使用引力流代替離心)3。cDNA的合成使用了STRATAGENE cDNA合成試劑盒，基本按照說明進(jìn)行，只是使用上面描述過的針對pGBFIN載體的主要改動優(yōu)化3。
合成的cDNA量用TCA沉淀法進(jìn)行估計(jì)，隨后通過堿性瓊脂糖凝膠電泳分析3。實(shí)施例2來自T.emersonii mRNA的cDNA文庫的制備實(shí)施例1中獲得的cDNA文庫進(jìn)行鈍化，連接銜接頭，用限制性酶消化3。
cDNA克隆進(jìn)入表達(dá)載體pGBFIN-113需要在cDNA的5’端有EcoRI位點(diǎn)，3’端有XhoI位點(diǎn)。因此，第一條鏈引發(fā)寡核苷酸和所用的銜接頭序列(Pharmacia)選擇成適合表達(dá)載體的先決條件。
獲得的cDNA用SEPHAROSE CL-2B基質(zhì)進(jìn)行大小分級分離，在其中單個(gè)獲得的庫的大小可以通過不變性凝膠電泳進(jìn)行分析3。cDNA的兩個(gè)庫，分別通過切下0.5kb和1.0kb獲得，選擇用于在pGBFIN-11中構(gòu)建cDNA文庫。對于pGBFIN-11，制備得到完全雙酶切(EcoRI-XhoI)的pGBFIN-11載體庫(背景連接＜1％)。將選擇的cDNA庫連接進(jìn)入pGBFIN-11載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌XLI0-Gold細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生兩個(gè)基本cDNA文庫。兩個(gè)庫的轉(zhuǎn)化頻率都＞1.0×106。
從兩個(gè)大腸桿菌cDNA文庫的一部分中，隨機(jī)選擇克隆，分離質(zhì)粒DNA。對此質(zhì)粒DNA的分析顯示，cDNA文庫具有插入片段的百分比在90和95％之間。
此外，從文庫的一部分中進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)印，產(chǎn)生的濾膜隨后與T.emersonii gpdA基因雜交，此基因編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因。下一步，分離質(zhì)粒DNA，限制性分析顯示所有質(zhì)粒含有正確方向的單個(gè)插入片段。對含有T.emersonii gpdA基因的質(zhì)粒內(nèi)的cDNA的5’端測序顯示＞85％是全長。實(shí)施例3表達(dá)文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)入黑曲霉自大腸桿菌cDNA文庫如前面所述分離DNA。全部質(zhì)粒DNA在37℃用NotI消化4小時(shí)，去除大腸桿菌來源的質(zhì)粒序列。純化之后，將DNA溶解于無菌的去礦物質(zhì)水中。
多個(gè)黑曲霉DS2978轉(zhuǎn)化中，每次轉(zhuǎn)化使用1.5×107到3.0×107個(gè)原生質(zhì)體，10微克質(zhì)粒DNA進(jìn)行3。通過在含有乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，選擇轉(zhuǎn)化體中amdS選擇標(biāo)記的存在。由于整合片段中同時(shí)存在amdS選擇標(biāo)記和cDNA表達(dá)盒二者，因此在乙酰胺上生長表明存在cDNA表達(dá)盒。
30℃孵育大約7-10天后，純化10000個(gè)轉(zhuǎn)化體將黑曲霉轉(zhuǎn)化體采用機(jī)械手(FlexysTM菌落自動取樣器)電轉(zhuǎn)化板轉(zhuǎn)移至96孔MTP主培養(yǎng)板(Master Plate，MPs)上，其中每孔含有150微升固體選擇性培養(yǎng)基(SM)(每1000毫升0.52克KCl，1.52克K2HPO4，0.52克MgSO4，20克葡萄糖，1克乙酰胺，0.1M MES緩沖液，15克瓊脂，1毫升痕量元素溶液(每升含有2.2克ZnSO4/7H2O，1.1克H3BO3，0.5克FeSO4/7H2O，0.17克CoCl2/6H2O，0.16克CuSO4/5H2O，0.15克NaMoO4/2H2O，5.0克EDTA，pH6.5)，pH5.5)。轉(zhuǎn)化體在選擇性培養(yǎng)基上34℃生長5天。因此產(chǎn)生的MPs用于接種MTPs，進(jìn)行生長和隨后酶檢測，備份cDNA文庫的培養(yǎng)板(BPs)-80℃保存。實(shí)施例4T.emersonii表達(dá)文庫的分析已經(jīng)生長5天的MPs用作復(fù)制模板，復(fù)制到新鮮選擇性培養(yǎng)基(SM)板上，該板上含有0.075％的AZCL-木聚糖(每升含有0.52克KCl，1.52克K2HPO4，0.52克MgSO4，20克葡萄糖，1克乙酰胺，0.1MMES緩沖液，15克瓊脂，1毫升痕量元素溶液(每升含有2.2克ZnSO4/7H2O，1.1克H3BO3，0.5克FeSO4/7H2O，0.17克CoCl2/6H2O，0.16克CuSO4/5H2O，0.15克NaMoO4/2H2O，5.0克EDTA，pH6.5)，pH5.5，0.75克AZCL-木聚糖(Megazyme，澳大利亞))。
一旦接種，即將培養(yǎng)板在34℃孵育48小時(shí)，接著65℃孵育6小時(shí)。培養(yǎng)板在高溫孵育之前和之后進(jìn)行計(jì)數(shù)。顯示木聚糖酶活性的陽性克隆呈現(xiàn)藍(lán)色擴(kuò)散暈。
將此第一次篩選得到的陽性木聚糖酶克隆重新接種于新鮮選擇性培養(yǎng)基上，34℃生長5天。將由此獲得的模板復(fù)制到選擇性培養(yǎng)基和含有0.075％(w/v)AZCL-木聚糖(Megazyme)的選擇性培養(yǎng)基上。AZCL-木聚糖培養(yǎng)板如上面所述進(jìn)行處理。
選擇性培養(yǎng)板在34℃孵育48小時(shí)，隨后用含燕麥木聚糖(5克瓊脂糖，0.5克燕麥木聚糖(Sigma refX0627)預(yù)先溶于1升50mM磷酸緩沖液(pH7))的上層瓊脂裝滿。一旦上層瓊脂凝固后，將培養(yǎng)板在65℃孵育4小時(shí)。為了使活性容易觀測，用Congo紅溶液(10克Congo紅溶于1升pH7.0的磷酸緩沖液)染色培養(yǎng)板15分鐘。棄染色液，用1M NaCl漂洗培養(yǎng)板。這個(gè)漂洗步驟需要重復(fù)兩次。陽性克隆在(Congo)紅背景上顯現(xiàn)出白色清亮?xí)?。最后，鑒定得到9個(gè)陽性木聚糖酶克隆。
將產(chǎn)生木聚糖酶的曲霉轉(zhuǎn)化體(用木聚糖酶培養(yǎng)板測試鑒定)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵3。發(fā)酵5天后取培養(yǎng)基樣品，如下分析其木聚糖酶活性。
上清液(如果需要，預(yù)先稀釋)用0.25M pH4.5乙酸鈉緩沖液稀釋5倍。將20微升稀釋的上清液轉(zhuǎn)入微量滴定盤，加入50微升底物(4％(w/v)Remazol Brilliant Blue RBB-木聚糖(70℃溶解于去礦物質(zhì)水中))，用加樣器上下吹吸而徹底混和。反應(yīng)混合物室溫孵育30分鐘。加入200微升96％乙醇，室溫孵育10分鐘，以終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，微量滴定板用Beckman GPK離心機(jī)2500rpm室溫離心10分鐘。將100微升上清轉(zhuǎn)入新的微量滴定盤，用分光光度計(jì)Anthosreader(Proton and Wilton)測定620nm藍(lán)光的吸收。比活性用標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算，其使用溶于0.25M pH4.5乙酸鈉緩沖液中的木聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)品制得。實(shí)施例5陽性轉(zhuǎn)化體的遺傳分析將實(shí)施例4鑒定的陽性(再次證實(shí))轉(zhuǎn)化體在液體培養(yǎng)基中生長，收獲菌絲體，從絲狀真菌中采用Puregene分離系統(tǒng)(Biozym B.V.)分離總(染色體)DNA。DNA分離和純化依據(jù)說明書進(jìn)行操作，但是有細(xì)微改動蛋白質(zhì)沉淀步驟3和4重復(fù)一次。
染色體DNA用于PCR反應(yīng)中作模板，引物使用12207(SEQ ID No.4)和11937(SEQ ID No.3)，以擴(kuò)增整合入染色體DNA內(nèi)的表達(dá)盒中的插入序列。
對轉(zhuǎn)化體直接進(jìn)行的PCR按照已知方法4修正后進(jìn)行，只是獲得的菌絲體隨后用濃度為5毫克/毫升的GlucanexTM(Novo Nordisk)處理而不是用NOVOzyme處理。
PCR反應(yīng)中含有eLONGaseTMB緩沖液(Life Technologies，Breda，荷蘭)，dNTP(各200μM)，1微升eLONGaseTM酶混合物EnzymeMix，1-5微升模板，各種寡核苷酸10-30pmol，總體積50微升。寡核苷酸的最優(yōu)用量針對所購買的每一批次經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定。一般使用10-30pmol。反應(yīng)按下面的循環(huán)條件執(zhí)行94℃1×(2分鐘)，35×(94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃6分鐘)，1×(72℃7分鐘)。將樣品加載在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。
將因而獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)入大腸桿菌pcr2.1克隆載體(Invitrogen，根據(jù)說明書操作)，結(jié)果得到質(zhì)粒pGBXEA-1。含有質(zhì)粒pGBXEA-1的大腸桿菌菌株存放于真菌菌種保藏中心(Centraal Bureauvoor Schimmelcultures)，Baarn，荷蘭，其保藏號為CBS 102183。
對亞克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。所得的編碼區(qū)域的核苷酸序列在SEQ ID No.1中描述，依據(jù)其推斷出的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。此蛋白質(zhì)命名為XEA。實(shí)施例6Talaroymyces emersonii木聚糖酶的性質(zhì)確定本發(fā)明中的內(nèi)切木聚糖酶活性單元(Endo Xylanase Unit，EXU)的定義木聚糖酶活性單元定義為在測試條件下每分鐘可以釋放4.53微摩爾還原糖(測量為木糖等價(jià)物)的酶(來自黑曲霉的endoI，內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶31)的用量。測試條件包含5毫克/毫升來自小麥粉的阿拉伯糖木聚糖(Megazyme，澳大利亞，2/11 Ponderosa Parade，Warriewood NSW 2102)溶于100mM檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5)，溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。加入1M NaOH終止反應(yīng)。使樣品與Fe-III-六氰化物在沸水中孵育15分鐘后進(jìn)行420nm比色測定。把1.17克KFe(CN)和19.5克無水碳酸鈉溶于1升水中，制成六氰合鐵(hexacyanoferrate)試劑。粘度測試除了上面的木聚糖酶絕對活性確定方法之外，也使用相對活性方法其中測定加入一定量的酶之后小麥阿拉伯糖木聚糖(Megazyme，澳大利亞，2/11 Ponderosa Parade，Warriewood NSW 2102)溶液的粘度。小麥阿拉伯糖木聚糖溶于0.425M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5)中，至濃度達(dá)到8.3毫克/毫升。底物于55℃孵育10分鐘。隨后加入少量酶(范圍為0.01-0.05單元/毫升)，開始反應(yīng)。反應(yīng)60分鐘之后，參考與已知EXU活性的黑曲霉內(nèi)切木聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)31孵育時(shí)的數(shù)值確定樣品的粘度。標(biāo)準(zhǔn)品的EXU絕對活性用上面所述的使用Fe-III-六氰化物的還原糖方法來確定。使用Haake下降小球粘度計(jì)手動確定粘度。還原糖活性分析根據(jù)XPU定義的酶活性的確定通過用4-羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)檢測還原糖而進(jìn)行。一個(gè)XPU活性定義為，pH5.0，60℃15分鐘內(nèi)，從小麥阿拉伯糖木聚糖上每分鐘釋放1微摩爾還原糖所需要的酶量，其中使用D(+)木糖的校正曲線。這是已知的試驗(yàn)32，并改進(jìn)了PAHBAH試劑如下0.05M檸檬酸三鈉，0.1M Na2SO3，0.02M CaCl2，0.5M NaOH和0.1M對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)。最終的pH是12。在堿性溶液中含有PAHBAH、室溫儲存的該試劑當(dāng)天之內(nèi)使用。420nm處測定吸收。加入100微升0.1M檸檬酸鈉緩沖液替代酶溶液來制備空白。用溶于0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)的400微升0.35％小麥阿拉伯糖木聚糖(Megazyme)混和100微升(稀釋的)酶溶液，由此測試木聚糖酶活性。具有底物的Eppendorf杯預(yù)先60℃孵育5分鐘。加入酶溶液開始反應(yīng)。15分鐘后加入1.0毫升PAHBAH-試劑終止反應(yīng)。Eppendorf杯100℃加熱5分鐘，之后在冰內(nèi)冷卻。樣品在適宜速度下離心，以離下任何固體材料，例如Beckman Microfuge E全速離心1分鐘。在420nm測量吸收。通過加入100微升替代酶溶液來制備空白。測量范圍是0.01-0.1XPU/毫升。木聚糖酶的純化向43毫升無細(xì)胞的肉湯中加入10.45克硫酸銨，用Aktaexplorer 100(Pharmacia Biotech)Column走Ethyl SepharoseTM柱介質(zhì)為15 ETH Source(code 17-0146-01，Pharmacia Biotech)(柱子參數(shù)為，直徑D＝1.6cm，長度1＝4.8cm，體積V＝9.6ml)。柱子用100mM醋酸鈉和40％飽和硫酸銨pH5.0平衡。洗脫使用線性梯度，在20個(gè)柱體積內(nèi)達(dá)到100mM醋酸鈉(pH5.0)。級分大小5毫升。流速10毫升/分鐘。監(jiān)測波長280，254，214nm。測定各級分的木聚糖酶，用HPLC-大小排阻層析(Size Exclusion Chromatography，SEC)進(jìn)行分析。
將最純的木聚糖酶級分按照后面的條件加入Sephacryl S200柱。儀器為Akta explorer 100(Pharmacia Biotech)。柱子HiPrep16/60 Sephacryl S200 HR(Pharmacia Biotech)。平衡和洗脫使用100mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)。流速1毫升/分鐘。級分大小4毫升。監(jiān)測波長280，254，214nm。洗脫級分的純度用HPLC-SEC、SDS-PAGE和自然PAGE進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度通過測量OD280測定。來自T.emersonii的(成熟)木聚糖酶含有11個(gè)色氨酸殘基(位置72，108，115，121，148，300，302，308，322，377和385)和23個(gè)酪氨酸殘基(位置36，51，109，141，146，161，167，169，174，192，193，196，200，218，281，306，316，326，332，348，395，403和404)。計(jì)算出的摩爾消光系數(shù)為89530M-1·cm-1。分子量為41637克/摩爾。1毫克/毫升XEA的OD280為2.15。來自T.emersonii的木聚糖酶(XEA)的比活性使用還原糖PAHBAH方法在40℃和60℃確定比活性。XEA在這兩個(gè)溫度的比活性分別是150XPU和500XPU。蛋白質(zhì)濃度用OD280分析來確定。
N-末端序列發(fā)現(xiàn)純化的成熟XEA的N-末端氨基酸序列是Ala-Gly-Leu-Asn-Thr-Ala(成熟序列中的第一個(gè)Ala殘基是SEQ.ID.No.2中的Ala23)。等電點(diǎn)(Iso-Electric Point，IEP)儀器Phast系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)，IEF 3-9 Phastgel(Pharmacia Biotech)。凝膠電泳，(考馬斯，Coomassie)染色根據(jù)制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)Phast系統(tǒng)操作程序。用Phastgel IEF 3-9等電聚焦確定出的IEP為大約3.3。分子量使用Phast系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)，Phastgel(PharmaciaBiotech)，SDS-緩沖液條/天然-緩沖液條(Pharmacia Biotech)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
樣品處理將1倍體積緩沖液(500mM Tris-HCl pH6.8，10％SDS，0.1％溴酚藍(lán))與4倍體積樣品混合，煮沸3分鐘。凝膠電泳和染色(考馬斯染色或銀染)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Phast系統(tǒng)方法進(jìn)行。用分子量標(biāo)準(zhǔn)(Pharmacia)測定出SDS-PAGE上的分子量為大約63千道爾頓(kD)?；诎被峤M成計(jì)算出的分子量是41637道爾頓。
此外，使用凝膠過濾分子量標(biāo)準(zhǔn)(BIORAD，目錄號151-1901)經(jīng)凝膠滲透色譜法測定分子量。經(jīng)高效-SEC測定的分子量為42kD。(HP-SEC使用TSK G3000SW(目錄號05103，Toso Haas)柱進(jìn)行。樣品室溫下用0.1M磷酸鈉(pH7.0)以1毫升/分鐘洗脫。在280nm進(jìn)行檢測。)SDS-PAGE中觀察到的高分子量可能是估計(jì)過度。它可能是木聚糖酶糖基化引起的。去糖基化將5微升純化酶(約5毫克/毫升)與20微升0.5％SDS和25微升1％巰基乙醇混合?；旌衔镏蠓?分鐘。冷卻后，加入20微升N-糖苷酶F(500單元/毫升)和20微升溶于磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中的3％Triton X-100。接著37℃孵育過夜，用SDS-PAGE分析去糖基化。氨基酸序列暗示存在2個(gè)糖基化位點(diǎn)(Asn56和Asn123，見SEQ ID No.2)SDS-PAGE顯示經(jīng)N-糖苷酶F處理的木聚糖酶遷移得更遠(yuǎn)，分子量低于未處理或預(yù)先處理(用SDS和β-巰基乙醇煮沸)的木聚糖酶。因此，SDS-PAGE中觀察到的令人驚訝的高分子量可能是糖基化引起的。pH和溫度曲線在不同pH和溫度分析無細(xì)胞肉湯的木聚糖酶活性。用PAHBAH還原糖方法，在pH4下的不同溫度(見表1A)或者在60℃下的不同pH(見表1B)，分析木聚糖酶活性。表1A顯示，XEA的最優(yōu)溫度是80℃左右。表1B顯示，XEA的最優(yōu)pH是pH4和pH5之間(這兒有兩欄數(shù)字，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩次)。表1A木聚糖酶溫度依賴性
表1BpH依賴性
熱穩(wěn)定性差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimetic，DSC)分析解折疊溫度XEA的解折疊溫度(unfolding temperature)用DSC確定。所用的測量方法采用醋酸鈉緩沖液(pH 5)，2-4毫克/毫升，加熱速率2.5℃/分鐘。發(fā)現(xiàn)XEA的解折疊溫度(Td)是80.1℃。T50的測量T50是孵育20分鐘后殘留50％活性時(shí)的溫度，因而是熱穩(wěn)定性的一個(gè)度量參數(shù)。T50孵育按下面進(jìn)行。稀釋木聚糖酶樣品，以致最終木聚糖酶濃度在PAHBAH測試(XPU單元)的測量范圍之內(nèi)。接著用0.1M醋酸鈉緩沖液(pH5)(其中含有1毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)以防止特異性吸附和在管子表面變性)進(jìn)行稀釋。緩沖液在60，70，80，85和90℃用熱混合儀(thermomixer)預(yù)熱5分鐘，之后加入木聚糖酶。樣品加熱20分鐘，冰內(nèi)冷卻。用PAHBAH測試測量活性。
表2中顯示了在給定溫度下，20分鐘孵育后殘留活性占未孵育對照的百分比。從此表可以得出T50它是82℃。表2XEA木聚糖酶的熱穩(wěn)定性
另外，在EDTA存在的情況下，在不同pH測定T50值。結(jié)果如表3所示。
表3確定pH和金屬離子對XEA穩(wěn)定性的影響。(1pH7和8低溫度區(qū)數(shù)據(jù)點(diǎn)太少)XEA在pH4到pH5之間最穩(wěn)定。低于pH3.5和高于pH5.5，其熱穩(wěn)定性開始下降，但是仍然好于大多數(shù)現(xiàn)在已知的真菌木聚糖酶。EDTA的存在不影響T50。這意味著XEA的穩(wěn)定性不依賴于可以和EDTA絡(luò)合的陽性金屬離子。實(shí)施例7動物飼料中使用籃霉菌木聚糖酶(XEA)
用雄性肉仔雞(Cobb)進(jìn)行一個(gè)試驗(yàn)。它們1到5天齡時(shí)養(yǎng)在雞圈中，喂以市售肉仔雞開始飼料(broiler-starter feed)。5天齡時(shí)，基于它們各自的體重，把動物隨機(jī)分成54籠。從5到19天齡開始，每籠有15只肉仔雞。19天齡時(shí)，每籠動物數(shù)目減少為12只。分配6籠用做一組。因?yàn)樵囼?yàn)單元是籠，這意味著每組有6次重復(fù)。
這些籠中使用三列籠系統(tǒng)(cage sytem)，配置了人工加熱、照明和通風(fēng)。每籠底板面積為0.98平方米，是金屬絲制成的底板。房間照明為24小時(shí)/每天，但是光密度在試驗(yàn)過程中逐漸降低。溫度也逐漸降低從第一周的28℃到最后一周的23℃。試驗(yàn)中的濕度保持在大約60％。按照正常接種疫苗程序給動物接種以抗傳染性支氣管炎和新城疫疾病。
這個(gè)試驗(yàn)中包括9組。對基于小麥的食譜(見表4)，沒有加入任何酶(對照)，或加入大約相當(dāng)于2500，5000，10000或25000 EXU/千克飼料的籃霉菌內(nèi)切木聚糖酶(XEA)或黑曲霉內(nèi)切木聚糖酶(EndoI，一種內(nèi)切-1，4-β-內(nèi)切木聚糖酶31，購買自DSM N.V.，AgriIngredients，Delft，荷蘭)作為對照。將酶加入預(yù)先混合成預(yù)混物的顆粒狀產(chǎn)品形式的飼料中。動物可以隨意食用飼料顆粒。在顆?；^程中，顆粒的溫度不超過大約70℃。水也是自由供給的。
確定5-19天齡和5-33天齡時(shí)期的體重增量(Body Weight gain，BWG)和飼料轉(zhuǎn)化率(feed conversion rate，F(xiàn)CR)。表4飼料組成和主要營養(yǎng)物含量
*食譜所含的維生素和痕量金屬水平是荷蘭的正常水平。食譜中沒有加入抗生素生長促進(jìn)劑和球蟲抑制劑(coccidiostat)。
表5所示的本試驗(yàn)的結(jié)果顯示了兩個(gè)時(shí)期肉仔雞的平均體重增量和飼料轉(zhuǎn)化率。酶加入量以活性單元(EXU)顯示。由于體重增量增加，飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)降低，因?yàn)轱暳限D(zhuǎn)化率是生長所需飼料的量(g)。表5
使用含有所述酶的食譜，生長和飼料轉(zhuǎn)化率都顯著性(P＜0.05)提高，14天實(shí)驗(yàn)期之后和全部實(shí)驗(yàn)期之后都如此。不同劑量觀察到少許不同，但是XEA酶和市售酶一樣好，甚至更好。實(shí)施例8Talaroymyces emersonii內(nèi)切木聚糖酶(XEA)在烘烤中的性能用標(biāo)準(zhǔn)烘烤方法制備模制面包，方法如下混合3500克小麥面粉(80％Kolibri和20％Ibis小麥面粉(Menaba，荷蘭)的混合物，大約21℃)、77克壓縮(Konings)酵母、70克鹽、25ppm抗壞血酸、10ppm 真菌α-淀粉酶 FermizymeTMP200(DSM N.V，BakeryIngredients，Delft，荷蘭)和不同量的內(nèi)切木聚糖酶XEA酶和2030毫升水(8-15℃)，用螺旋混合器(Hobart)混合2分鐘(速度1)和6分鐘(速度2)，使用125Wh(Watt-hours，瓦-小時(shí))能量。面團(tuán)溫度是28℃。面團(tuán)的切削性由合格的面包師手工分析。
混合面團(tuán)后立即切成6塊，每個(gè)875克，揉圓之后，在發(fā)酵室中34℃和85％RH(相對濕度)醒面35分鐘。此階段末期將面團(tuán)定形和模制(panned)，隨后在發(fā)酵室中38℃和87％RH(相對濕度)醒面75分鐘。之后，完全醒面的面團(tuán)在電爐中210℃烘烤30分鐘。冷卻至室溫之后，面包塊體積用油菜籽替換法確定。在密閉聚乙烯袋中室溫儲存16-24小時(shí)之后，由合格的面包師估計(jì)面包屑質(zhì)量。結(jié)果如表6所示。表6
面團(tuán)的質(zhì)量非常好。僅僅在XEA內(nèi)切木聚糖酶最高劑量時(shí)，操作面團(tuán)時(shí)有點(diǎn)粘。然而這點(diǎn)粘性并不影響面團(tuán)的切削性。所有含內(nèi)切木聚糖酶XEA的面團(tuán)都非常柔軟，容易操作。
從這些烘烤結(jié)果可以推斷，內(nèi)切木聚糖酶XEA對于提高面包質(zhì)量非常有效，在面包體積和面包屑質(zhì)量兩個(gè)方面均如此。盡管面包體積大，但是面包屑結(jié)構(gòu)仍然非常規(guī)則和細(xì)密。實(shí)施例9和相比較的實(shí)施例10比較Talaroymyces emersonii酶(XEA)和來自黑曲霉的內(nèi)切木聚糖酶在烘烤中的性能在荷蘭模制面包生產(chǎn)中將XEA的烘烤表現(xiàn)與目前使用的來自黑曲霉的真菌內(nèi)切木聚糖酶進(jìn)行比較。這個(gè)黑曲霉內(nèi)切木聚糖酶以其純的市售形式提供，即FermizymeTMHSP6000。FermizymeTMHSP是制作面包的好酶，但是它會增加面包粘度，而且不能總是充分增加面包的體積。
精確重復(fù)了實(shí)施例7的步驟，只是內(nèi)切木聚糖酶酶XEA和FermizymeTMHSP6000使用不同的用量。
結(jié)果如表7所示。表7
#面包體積太大，因而形成了蘑菇形狀面包。
從結(jié)果可以明顯看出，內(nèi)切木聚糖酶XEA不增加面包的粘性，而提高面包體積的程度比FermizymeTMHSP的要大。此外，當(dāng)用XEA替換FermizymeTMHSP時(shí)，達(dá)到相同面包體積時(shí)，每千克面粉所需要的內(nèi)切木聚糖酶單元更少。相同體積時(shí)斷裂和撕碎質(zhì)量也相似。加入EXA所獲得的面包屑結(jié)構(gòu)至少和FermizymeTMHSP所獲得的一樣好。
總體上，內(nèi)切木聚糖酶XEA解決了一些使用FermizymeTMHSP時(shí)遇到的面團(tuán)和面包制作的問題。面團(tuán)沒有變粘，獲得的面包體積更大，而且即使體積比較大，面包屑結(jié)構(gòu)仍然非常規(guī)則和細(xì)密。實(shí)施例11顆?；€(wěn)定性試驗(yàn)將玉米淀粉(4543克)置入ErwekaTMZ-揉面團(tuán)機(jī)中。接著在混合的同時(shí)將1069克含有本發(fā)明木聚糖酶的發(fā)酵液超濾物(批號XEA 502-8m，其具有43553 EXU/克和6.7％干物質(zhì))加入淀粉中，得到含有大約15000EXU/克的濕混合物(干燥至94％干物質(zhì)時(shí))。加入液體之后，再持續(xù)混合10分鐘。
混合物在真空干燥室(40℃)中干燥12小時(shí)至94.5％干物質(zhì)。接著用ErwekaTM Freewitt磨粉機(jī)把它磨細(xì)通過1毫米篩子。這就是實(shí)施例11A。
使用LyxasanTMBatch OP0036(含有了可以從DSM N.V，AgriIngredients，Delft，荷蘭購買的內(nèi)切-1，4-β-內(nèi)切木聚糖酶31)重復(fù)相同操作。向5885克淀粉中，加入具有42550EXU/克和3.7％干物質(zhì)的1984克超濾物(ultrafiltrate，UF)。此混合物干燥至94％干物質(zhì)，與實(shí)施例11A同樣磨細(xì)。(這構(gòu)成了比較實(shí)施例11B)第三個(gè)例子是商業(yè)包裝產(chǎn)品叫做Biofeed Wheat CT，它可以從丹麥的Novo Nordisk購買。它含有一種來自Thermomyces lanuginosis的G-型木聚糖酶，有脂肪包覆層。(比較實(shí)施例11C)所有三個(gè)樣品都在顆?；囼?yàn)中三個(gè)不同溫度進(jìn)行測試。對于一種動物飼料(組成如下面表8所示)，酶混合物以兩個(gè)不同濃度0.24％(11A)和0.1％(11B，11C)加入。混合后，飼料在容器中用蒸氣加熱至65℃、75℃或85℃，隨后通過65毫米厚的上面有5毫米直徑孔的印模進(jìn)行顆?；Ａ⒓蠢鋮s。接著測量顆粒中的殘留活性，穩(wěn)定性測試結(jié)果如表9所示。表8動物飼料組分
表9酶的顆粒化(pelleting)穩(wěn)定性
正如可以看到的，本發(fā)明的XEA蛋白質(zhì)在高溫度(85℃)下的穩(wěn)定性比目前市場上產(chǎn)品的穩(wěn)定性好得多。實(shí)施例12對芳基-β-D-木糖苷的活性使用兩種底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃木糖苷(CAS注冊號207606-55-1，也稱作X-b-D-xyl)和4-傘形基(umbelliferyl)-β-D-吡喃木糖苷(CAS注冊號6734-33-4，也稱作4-MU-b-D-xyl)，以篩選木糖苷酶活性。將它們直接加入培養(yǎng)基中。含有文庫的菌株在96孔板上培養(yǎng)。這樣主板(master plate)可以在檢測培養(yǎng)基上容易的復(fù)制。文庫生長于選擇性培養(yǎng)基上(0.52克/升KCl，1.52克/升K2HPO4，0.52克/升MgSO4，2％葡萄糖，10mM乙酰胺，1/1000痕量元素(2.2克ZnSO4/7H2O，1.1克H3BO3，0.5克FeSO4/7H2O，0.17克CoCl2/6H2O，0.16克CuSO4/5H2O，0.15克NaMoO4/2H2O，5.0克EDTA，pH用KOH調(diào)整為6.5，用0.45微米濾膜過濾除菌)，用KOH調(diào)pH(10N調(diào)到pH6))，另含有X-b-D-xyl或4-MU-b-D-xyl(濃度分別為200毫克/升和150毫克/升)。X-b-D-xyl事先溶解在小體積二甲基甲酰胺(dimethylformamid，DMF)中。培養(yǎng)板在33℃孵育48小時(shí)，接著65℃孵育6小時(shí)。培養(yǎng)板在65℃孵育6小時(shí)之前和之后進(jìn)行評分。X-xyl培養(yǎng)板的分析直接基于存在(或不存在)青綠色藍(lán)色暈(turquoise blue halo)而進(jìn)行。4-MU-xyl板上的木糖苷酶活性的檢測采用把培養(yǎng)板置于310nm波長紫外光之下進(jìn)行。陽性克隆顯示為被藍(lán)色熒光暈(bluefluorescent halo)環(huán)繞。
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1.一種木聚糖酶多肽，其包含(i)來自SEQ ID No.2的氨基酸23到408的氨基酸序列；或(ii)能夠切割木聚糖的(i)的變體；或(iii)能夠切割木聚糖的(i)或(ii)的片段。
2.權(quán)利要求1的一種多肽，其中變體(ii)與SEQ ID No.2的氨基酸23到408的氨基酸序列有至少70％或80％相同，和/或(iii)的片段有至少150個(gè)氨基酸的長度。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其可切割β-D-木聚糖中的(1→4)連接鍵或相鄰吡喃木糖基單元。
4.具有阿拉伯木聚糖酶和木糖苷酶活性的多肽。
5.任何一個(gè)上述權(quán)利要求的多肽，其可獲得自(a)真菌；或(b)籃霉菌屬(Talaromyces)的生物體，任選Talaromycesemersonii的生物體。
6.一種多核苷酸，其包含(a)SEQ ID No.1的核酸序列或編碼任何上述權(quán)利要求的多肽的序列；(b)與(a)中所定義序列互補(bǔ)的或可雜交的序列；(c)(a)或(b)中序列的至少100個(gè)核苷酸長的片段；(d)與(a)、(b)或(c)中定義的序列至少70％相同的序列；或(e)(a)到(d)定義的任一序列的遺傳密碼簡并性序列。
7.權(quán)利要求6的序列，其中(b)中的雜交在嚴(yán)格性條件進(jìn)行，(c)中的片段是至少200個(gè)堿基長和/或(d)中的相同性是至少80％。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸，其包含(a)編碼具有木聚糖酶活性的多肽的序列，它是(1)SEQ ID No.1的核苷酸69到1224的編碼序列；(2)可與(1)定義的序列的互補(bǔ)序列選擇性雜交的序列；或(3)(1)或(2)定義的序列的遺傳密碼簡并性序列；或(b)與(a)中定義的多核苷酸互補(bǔ)的序列。
9.權(quán)利要求6到8中任何一項(xiàng)的多核苷酸，它是DNA序列。
10.包含權(quán)利要求6到9中任何一項(xiàng)的多核苷酸序列的載體。
11.權(quán)利要求10的載體，它是表達(dá)載體，比如其中權(quán)利要求9的DNA序列可操作性連接了調(diào)控序列。
12.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求6到9中任何一項(xiàng)的多核苷酸作為異源序列。
13.一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽作為異源蛋白質(zhì)。
14.一種宿主細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求8的DNA序列或權(quán)利要求10的載體。
15.生產(chǎn)權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽的方法，該方法包含在提供多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12到14中任何一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞。
16.含有權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽的組合物。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中進(jìn)一步包含具有纖維素酶、內(nèi)切阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽。
18.處理植物或含木聚糖材料的方法，該方法包含使所述材料接觸權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或者權(quán)利要求16或17的組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的處理包含降解、水解或修飾材料中的木聚糖或者降解或修飾植物細(xì)胞壁。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中的處理包含切割吡喃木糖基或β-D-木聚糖亞單元和/或所述材料包含植物、植物漿、植物提取物或可食用糧食或成分。
21.一種加工過的材料，其可通過將植物或含木聚糖材料接觸權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽或者權(quán)利要求16或17的組合物而獲得，或由權(quán)利要求18到20中任何一項(xiàng)的方法產(chǎn)生。
22.權(quán)利要求18到22中任何一項(xiàng)的方法，其能夠減少材料的粘度，降解或水解材料中含有的木聚糖，或者改善材料的澄清度或過濾性。
23.權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽或者權(quán)利要求16或17的組合物的應(yīng)用，其用于處理植物材料的方法中，提高含木聚糖液體的過濾性和/或減少其粘度，提高含酒精液體(例如啤酒，酒)或水果或蔬菜汁的過濾性或使其澄清，水解農(nóng)業(yè)殘留物，用于再循環(huán)材料(例如包含紙)在造紙中用于增稠糧食和/或提取期望的材料(例如咖啡、植物油、淀粉)，加工植物漿、汁液或提取物，增加面包體積、面包質(zhì)量或減少面團(tuán)粘性。
24.一種(動物)飼料、食物或糧食，其包含權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽。
25.權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的多肽應(yīng)用于釀造、啤酒或酒制造、蒸餾、再循環(huán)、生物甲烷化、口腔衛(wèi)生、皮革處理、造紙、水果或蔬菜汁或提取物處理、紡織品處理或制造、烘烤或制作面包、處理花苞、制備食物或食品或動物飼料中。
26.權(quán)利要求24的食物或糧食，它是含酒精啤酒、面包、面團(tuán)或茶。
27.轉(zhuǎn)基因生物體，比如植物或其部分，其中包含權(quán)利要求12到14中任何一項(xiàng)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有木聚糖(內(nèi)切)酶活性的新型多肽，可以降解摻雜纖維素的提取物和植物材料。此多肽能夠切割β－D－木聚糖內(nèi)部相鄰吡喃木糖基單元之間的(1－4)鍵。本發(fā)明提供了此多肽的氨基酸序列和編碼DNA序列，所述多肽可用于處理可食用食品和動物飼料中的纖維素。該多肽兼具有阿拉伯木聚糖酶和木糖苷酶活性。
文檔編號C12N15/09GK1454259SQ00819966
公開日2003年11月5日 申請日期2000年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月21日
發(fā)明者J·P·T·W·范德哈姆比爾格斯, J-M·范德蘭, J-M·G·達(dá)蘭 申請人:Dsm公司