專利名稱：辣根過氧化物酶標記核酸探針雜交的標本前處理液及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種辣根過氧化物酶標記核酸探針雜交的標本前處理液及其應用。
目前，全球結(jié)核病的流行呈現(xiàn)大回升的趨勢，在我國結(jié)核病仍然是傳染病第一號殺手。在結(jié)核病實驗室傳統(tǒng)檢測方法中，抗酸染色鏡檢陽性率僅為30％左右；結(jié)核菌素皮試陽性率75％，但假陽性問題嚴重；培養(yǎng)結(jié)果雖然可靠，但結(jié)核桿菌生長極其緩慢，需培養(yǎng)3-8周。
顯然，傳統(tǒng)上用培養(yǎng)方法檢測和鑒定致病細菌，是一項耗時的工作，近年來以PCR或核酸探針雜交為代表的基因檢測技術開始應用。
前者是最敏感的分子生物學檢測方法，但其假陽性和假陰性問題限制了它的應用。而核酸探針非常特異，但其敏感性不理想，難以用于臨床標本的檢測。對于雜交方法，標本的前處理(酸抽提)方法對結(jié)果的影響較大。雜交方法檢測的對象是標本中的核酸，后者可以從血液，唾液，痰，尿，糞便，鼻咽分泌物及其它來源的臨床標本中制備。傳統(tǒng)的核酸提取方法系以有機溶劑(酚和氯仿)對核酸和蛋白質(zhì)的不同變性作用為基礎，其步驟煩瑣，核酸的損失率高，用于基因診斷尤其是核酸探針雜交時，對臨床標本的檢出率不高。故建立一種兼?zhèn)涓呙舾行院透咛禺愋缘暮怂崽结槞z測方法已成當務之急。
本發(fā)明的目的是提供一種辣根過氧化物酶標記核酸探針雜交的標本前處理液，及利用它處理標本，并雜交檢測基因，該方法在保持核酸探針高特異性的前提下，大幅度提高現(xiàn)有核酸探針雜交技術的敏感性，而且快速，簡便。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設計方案這種辣根過氧化物酶標記核酸探針雜的交標本前處理液，它包括初處理液和裂解液，所述的初處理液為NaOH溶液，其濃度為2-6mol/L，所述的裂解液包括NP40(即Nonidet P40)，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，該裂解液中各組成部分的濃度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20mmol/L、PH＝7.0-8.0，NaCl 5.0-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L。
一種利用權利要求1所述標本前處理液檢測標本基因的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)以初處理液、裂解液處理標本，初處理液為NaOH溶液，濃度為2-6 mol/L，裂解液為NP40，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，該裂解液中各組成部分的濃度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20 mmol/L pH＝7.0-8.0，NaCl50-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L，(2)DNA探針的合成，(3)探針標記辣根過氧化物酶，(4)核酸探針點雜交反應，(a)將前處理的標本固定在硝酸纖維素膜上，(b)預雜交、雜交，(c)雜交膜洗滌，(5)雜交后信號的檢測，利用辣根過氧化物酶催化的反應。
標本前處理液使用方法包括下面5個步驟1、取標本，加1至2倍體積的初處理液，置室溫液化20-40分鐘；2、把標本置于70-90℃的水浴中孵育1小時；3、把標本以12000rpm離心15分鐘，棄上清；4、把離心沉淀物與100μl裂解液混合，置于60℃水浴中孵育1小時，然后置于90-96℃水浴中孵育15分鐘；5、以8000rpm離心5分鐘，取上清液備用。
要求核酸探針的堿基序列對于待檢測的對象(致病菌，病毒等)是特異的。核酸探針可以是寡核苷酸探針，或是較長鏈的核酸探針。核酸探針通過引物合成，PCR技術或分子克隆得到。核酸探針以辣根過氧化物酶直接標記或者間接標記，直接標記是以辣根過氧化物酶直接連接在核酸探針的末端，而間接標記是先把生物素連接在探針的末端，然后再與辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素偶聯(lián)在一起。
本發(fā)明采用了一種前處理液，無需PCR，僅以DNA探針直接雜交，繼以辣根過氧化物酶催化的反應，有化學發(fā)光自顯影檢測方法，獲得了高靈敏度(與PCR相當)和高特異性，而且操作簡便，成本低廉，用途廣泛。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1結(jié)核桿菌臨床痰標本的收集83例臨床標本中，36例結(jié)核病人痰涂片陽性標本，32例結(jié)核病人痰涂片陰性標本和18例非結(jié)核標本來自解放軍三零九醫(yī)院結(jié)核科和北京醫(yī)院呼吸內(nèi)科。
痰標本的前處理取標本0.1ml，加入0.2ml的初處理液(4mol/1 NaoH)，室溫液化30分鐘，將標本置于90℃的水浴中孵育小時，將標本以12000rpm離心15分鐘，棄上清，將離心沉淀物與100μl裂解液混合，置于60℃水浴中，孵育1小時，然后置于92-96℃水浴中孵育15分鐘，以8000rpm離心5分鐘，取上清液備用(裂解液組分為NP40 (重量百分)0.5％，Tris-HCl 10mmol/LpH7.6，NaCl 150mmol/L.MgCl21.0 mmol/L)。
核酸探針點雜交反應雜交所用的結(jié)核桿菌核酸探針探針特征生物素標記188bpDNA探針的基因序列位于結(jié)核桿菌的多拷貝的IS6110插入序列，為結(jié)核桿菌所特有。本探針通過PCR擴增反應合成，擴增的引物序列分別為15’-GAACGGCTGATGACCAAACT-3’，引物序列25’-ACGTAGGCGAACCCTGCCCA-3’。
188bpDNA探針的PCR合成擴增過程中，以長鏈生物素修飾的dUTP(Bio-15-dUTP)部分代替dTTP摻入到擴增混合物中，得到標記率5％左右的探針。188bp片段位于結(jié)核桿菌IS6110序列的317bp靶DNA片段的中間(以下簡稱188bp探針)。Bio-15-dUTPdTTP(1∶3)混合物代替純dTTP，以純化的317bpPCR擴增產(chǎn)物為靶DNA片段進行PCR擴增，擴增程序為94℃，1min；65℃，1min；72℃，40s；28個循環(huán)，72℃，最后延伸8min。把PCR產(chǎn)物純化或不經(jīng)純化直接用于核酸雜交反應。
結(jié)核桿菌標本的點雜交反應過程結(jié)核桿菌標本核酸的斑點印跡用15SSC浸泡硝酸纖維素膜15分鐘，晾干，然后以微量取樣器取經(jīng)過標本前處理液處理的標本2μl點到硝酸纖維素膜上，晾干，于2mol/L NaOH溶液中5min變性，15×SSC中置15min中和，85℃烘1hr。這樣標本核酸就固定到硝酸纖維素膜上。
結(jié)核桿菌標本的預雜交和雜交把固定有標本核酸的硝酸纖維素膜與預雜交液(含有0.08％十二烷基肌氨酸鈉，0.016％SDS，4×SSC，5×Denhardt’s，和0.1mg/ml鮭精DNA(用前10min沸水浴變性，然后5min冰水浴處理)一起在68℃水浴中孵育1小時。然后再置于雜交液(含80至160ng/ml濃度188bp核酸探針的預雜交液)中以68℃水浴孵育1小時。
雜交液制備取PCR合成的雙鏈188bp DNA探針，經(jīng)10min沸水浴，5min冰水浴處理后溶于預雜交液。
雜交膜的洗滌把雜交后的硝酸纖維素膜于2×SSC/0.1％SDS中室溫孵育5min，2次；再于0.1×SSC/0.1％SDS中68℃水浴15min，2次；最后于0.01×SSC/0.1％SDS中室溫孵育8min，2次。
雜交信號的檢測偶聯(lián)反應(即標記在探針上的生物素與辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素的結(jié)合反應)把洗滌后的雜交膜封閉于含0.6％Tween-20，0.05％TritonX-100和3％BSA的緩沖液1中(0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mol/L NaCl，2mmol/L MgCl2)中，室溫孵育1hr；再于含4μg/ml鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(SA-HRP偶合物)0.03％Tween20，0.05％Triton X-100的緩沖液I中，室溫孵育1hr；再用含0.03％Tween20，0.05％Triton X-100的緩沖液中室溫孵育5min，5次；最后在緩沖液II(即溶液0.1 mol/L Tris-HCl pH9.5 0.5mol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，Tween-20)和2×SSC中室溫分別溫育10min，2次。
以辣根過氧化物酶催化化學發(fā)光反應對雜交探針信號的檢測在硝酸纖維素膜上與標本核酸雜交后的核酸探針已被連接上了辣根過氧化物酶，只要再加入此酶的底物-如化學發(fā)光底物或顯色底物即可產(chǎn)生信號。當產(chǎn)生化學發(fā)光信號時，可以用化學發(fā)光儀或化學發(fā)光自顯影技術記錄信號。
化學發(fā)光自顯影技術不需要任何儀器，因此簡便而易推廣。它的步驟如下先將結(jié)合有辣根過氧化物酶的硝酸纖維素膜浸于2×SSC中，室溫孵育5min，2次；再用濾紙將膜稍吸干后放在保鮮膜上；然后將兩種化學發(fā)光底物液(增敏化學發(fā)光液YH-1000購自北醫(yī)大人民醫(yī)院)等體積混合，在暗室內(nèi)加在硝酸纖維素膜上，反應1min；最后，吸去多余發(fā)光液，保鮮膜包好發(fā)光硝酸纖維素膜，放入X光片夾中，加X光片，合夾。曝光1hr以上，用D-72顯影液顯影，定影。
檢測結(jié)果的敏感性將結(jié)核桿菌菌懸液依次作3.0×108，6.0×107，1.2×107，2.4×106，0.5×106，1.0×105，2.0×104，4.0×103個菌/ml稀釋，以簡易的標本處理方法處理后各取2μl點膜，然后用188bpDNA探針雜交和化學發(fā)光自顯影檢測。結(jié)果顯示本法能夠檢測到200個菌。
檢測結(jié)果的特異性
20種分枝桿菌標準株來自中國藥品生物制品檢定所，9所非分枝桿菌來自中科院微生物研究所。分枝桿菌包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胃分枝桿菌、蘇如分枝桿菌、偶然分枝桿菌，付偶然分枝桿菌、海魚分枝桿菌、龜分枝桿菌，龜分枝桿菌膿腫種，母牛分枝桿菌，不產(chǎn)色分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、次要分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌。非分枝桿菌包括肺炎桿菌、甲鏈桿菌、金黃色葡萄球菌假白喉桿菌、克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌，大腸埃希菌和卡他球菌等。將受試分枝桿菌接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)2-3周；將非分枝桿菌在血瓊脂培養(yǎng)其上，37℃，培養(yǎng)過夜，對20種分枝桿菌和9種非分枝桿菌檢測時發(fā)現(xiàn)只有結(jié)核桿菌呈陽性。
臨床結(jié)核標本的檢測陽性率對83例臨床標本以前處理液處理后，各取2μl點膜，然后用188bp DNA探針雜交和化學發(fā)光自顯影檢測。可以看到188bp探針雜交檢測圖片陽性標本和陰性標本的檢測率為100％和65.6％(21/32)，非結(jié)核標本的檢出率為0％。
權利要求
1.一種辣根過氧化物酶標記核酸探針雜交的標本前處理液，其特征在于它包括初處理液和裂解液，所述的初處理液為NaOH溶液，其濃度為2-6mol/L，所述的裂解液包括NP40，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，該裂解液中各組成部分的濃度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20mmol/L、PH＝7.0-8.0，NaCl 50-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L。
2.一種利用權利要求1所述標本前處理液檢測標本基因的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)以初處理液、裂解液處理標本，初處理液為NaOH溶液，濃度為2-6mol/L，裂解液為NP40，Tris-HCl，NaCl，MgCl2，該裂解液中各組成部分的濃度是NP40 0.1-2.0％，Tris-HCl 2-20 mmol/L pH＝7.0-8.0，NaCl50-200mmol/L，MgCl20.5-4.0mmol/L，(2)DNA探針的合成，(3)探針標記辣根過氧化物酶，(4)核酸探針點雜交反應，(a)將前處理的標本固定在硝酸纖維素膜上，(b)預雜交、雜交，(c)雜交膜洗滌，(5)雜交后信號的檢測，利用辣根過氧化物酶催化的反應。
3.根據(jù)權利要求2所述的利用標本前處理液檢測標本基因的方法，其特征在于所述的雜交后信號的檢測系利用辣根過氧化物酶催化化學發(fā)光來檢測。
4.根據(jù)權利要求2，3所述的利用標本前處理液檢測標本基因的方法，其特征在于所述的以初處理液，裂解液、處理標本的方法是(1)取標本，加入1-2倍體積的初處理液，置室溫液化20-40分鐘；(2)將標本置于70-90℃的水浴中孵育1小時；(3)把標本以12000rpm離心15分鐘，棄上清；(4)把離心沉淀物與100μl裂解液混合，置于60℃水浴中孵育1小時，然后置于90-96℃水浴中孵育15分鐘；(5)以8000rpm離心5分鐘，取上清液備用。
5.根據(jù)權利要求4所述的利用標本前處理液檢測標本基因的方法，其特征在于所述的探針為結(jié)核桿菌核酸探針，生物標記的188bpDNA探針的基因序列位于結(jié)核桿菌的多拷貝的IS6110插入序列為結(jié)核桿菌所特有，擴增引物為5’-GAACGGCTGATGACCAAACT-3’，5’-ACGTAGGCGAACCCTGCCCA-3’。
6.根據(jù)權利要求4所述的利用標本前處理液檢測標本基因的方法，其特征在于所述的在硝酸纖維素膜上與標本核酸雜交后的核酸探針被連接上了辣根過氧化物酶，將該膜浸于2×SSC中，室溫孵育5min，2次；再用濾紙將膜吸干后放在保鮮膜上；然后將兩種化學發(fā)光底物等體積混合，在暗室內(nèi)加在硝酸纖維素膜上反應1min，移去多余發(fā)光液，用保鮮膜包好發(fā)光硝酸纖維素膜，放入X光片夾中，加入X光片，曝光、顯影、定影。
全文摘要
一種辣根過氧化物酶標記核酸探針雜交的標本前處理液,它包括初處理液和裂解液,所述的初處理液為NaOH溶液,其濃度為2－6mol/L,所述的裂解液包括NP40,Tris－HCl,NaCl,MgCl
文檔編號C12Q1/68GK1344809SQ00129710
公開日2002年4月17日 申請日期2000年9月29日 優(yōu)先權日2000年9月29日
發(fā)明者楊樹德, 楊華衛(wèi) 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院