專利名稱：生物芯片檢測(cè)中的分子放大的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片(或稱DNA芯片、基因芯片)，特別是一種在生物芯片檢測(cè)過程中雜交信號(hào)分子放大技術(shù)。
生物芯片是20世紀(jì)90年代的重大生物新技術(shù)，是微電子與生物技術(shù)的交叉成果。生物芯片的檢測(cè)以物理學(xué)的熒光檢測(cè)為主。至今已有兩種類型1、點(diǎn)掃描的共聚焦(Confocal)型檢測(cè)儀；2、基于電荷藕合檢測(cè)器(CCD)的成像型檢測(cè)儀，例如“SHLI Ⅱ型生物芯片檢測(cè)儀。
目前，應(yīng)用DNA芯片來檢測(cè)DNA樣品是先將樣品單鏈DNA用熒光標(biāo)記，再將熒光標(biāo)記的單鏈樣品DNA加入到已經(jīng)制作好的DNA芯片中，使它們充分相互接觸反應(yīng)即雜交反應(yīng)。根據(jù)堿基配對(duì)原理，在一定的條件下，與DNA芯片上已知核苷酸陣列完全配對(duì)的熒光標(biāo)記樣品DNA就被固定在芯片一定的位置上，而不配對(duì)的單鏈樣品DNA會(huì)被沖洗掉。通過Confocal檢測(cè)芯片上熒光的位置和強(qiáng)度可獲得樣品DNA的生物信息。此方法的特點(diǎn)是可得到高清晰度的DNA芯片掃描圖象，但其最大的不足是其昂貴的儀器價(jià)格，使它不能在研究所和醫(yī)院中廣泛推廣，這就是前者的問題。后者較便宜，易于推廣，但是對(duì)某些應(yīng)用，靈敏度尚嫌不足，雖然對(duì)互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)微陣列芯片靈敏度尚可，而對(duì)疾病診斷等DNA芯片則嫌不夠。
本發(fā)明的目的就是為了克服上述困難，利用價(jià)廉的生物芯片檢測(cè)儀同樣可獲得高清晰度的DNA芯片雜交信號(hào)圖象，提出了一種生物芯片雜交信號(hào)分子放大技術(shù)。
本發(fā)明的實(shí)質(zhì)就是把DNA雜交信號(hào)分子放大機(jī)制引入DNA芯片的檢測(cè)系統(tǒng)中，并利用我們已申請(qǐng)的前專利“生物芯片檢測(cè)儀”(專利申請(qǐng)?zhí)枮?9240088.0)進(jìn)行檢測(cè)，即可獲得高清晰的DNA芯片雜交信號(hào)熒光圖象。
本發(fā)明的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，包括將樣品單鏈DNA加入到DNA芯片中進(jìn)行雜交反應(yīng)，清洗和檢測(cè)，其特點(diǎn)是所說的樣品單鏈DNA加入到DNA芯片中要通過雜交前方法或雜交后方法，將熒光微球特異地連接到DNA芯片上雜交的雙鏈DAN上。
生物分子熒光信號(hào)放大目前有三種方法可供選用，即生物素——親和素系統(tǒng)、酶系統(tǒng)和熒光微球系統(tǒng)。
在DNA芯片檢測(cè)中較簡(jiǎn)單方便的是通過雜交前方法或雜交后方法將熒光微球特異性地連接到DNA芯片上雜交雙鏈DNA上。
所說的“雜交前”方法就是(1)先對(duì)樣品單鏈DNA進(jìn)行處理，使其帶有活性基因。
(2)與DNA芯片雜交。
(3)清洗后再將帶有活性基團(tuán)的熒光微球與已雜交的DNA芯片上相對(duì)應(yīng)的活性基團(tuán)作用(生物素——親和素相互作用、氨基與羧基以及醛基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)等)，從而將熒光微球連接到雜交的DNA雙鏈上而完成DNA芯片雜交熒光信號(hào)的分子放大。
所說的對(duì)樣品單鏈DNA進(jìn)行處理的方法已有很多成熟方法可供采用，包括生物素化、氨基化、或地高辛化等。
例如生物素化的雜交前方法的步驟(1)先對(duì)樣品單鏈DNA進(jìn)行生物素化處理，使其帶有生物素(活性基團(tuán))；(2)與DNA芯片雜交；(3)清洗；
(4)將帶有親和素(活性基團(tuán))的熒光微球與已雜交的DNA芯片上相對(duì)對(duì)應(yīng)的生物素(活性基團(tuán))作用，將熒光微球連接到DNA雙鏈上。
對(duì)樣品單鏈的生物素化又有兩種方法(1)酶法，可用末端轉(zhuǎn)移酶經(jīng)末端轉(zhuǎn)移或DNA聚合酶經(jīng)隨機(jī)引物法或缺口平移法而生物素化。(2)化學(xué)法，如補(bǔ)骨脂素-生物素法、光生物素法等。利用已有的商業(yè)化補(bǔ)骨脂素-生物素試劑盒(補(bǔ)骨脂素-biotinlabelingkit)，可通過紫外照射將補(bǔ)骨脂素-生物素與樣品單鏈DNA連接，或通過光生物素經(jīng)可見光照射10分鐘而生物素化。
對(duì)樣品單鏈DNA氨基化利用末端標(biāo)記法將8-氨基己烷-三磷酸脫氧腺嘌呤核苷酸標(biāo)記到DNA探針的3’末端，或通過對(duì)胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘌呤溴化后再二氨基己烷替換而氨基化樣品單鏈DNA。
對(duì)樣品單鏈DNA地高辛化的雜交前方法是(1)先對(duì)樣品單鏈DNA進(jìn)行地高辛化處理，(2)與DNA芯片雜交；(3)清洗；(4)將帶有地高辛抗體的熒光微球連接到雜交的雙鏈DNA上。
所說的雜交后方法就是在雜交后利用特異性的DNA雙鏈嵌入試劑嵌入到已雜交的DNA雙鏈內(nèi)，再利用嵌入試劑的活性基團(tuán)與熒光微球上相對(duì)應(yīng)的活性基團(tuán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)雜交信號(hào)分子放大。
所說的雜交后方法的步驟如下(1)樣品單鏈DNA與DNA芯片雜交；(2)雜交后利用含有游離伯氨基的補(bǔ)骨脂素衍生物(例如4’-氨丁基4,5’,8-三甲基-補(bǔ)骨脂素)特異性地嵌入到已雜交的DNA雙鏈內(nèi)；(3)沖洗掉少量的與單鏈DNA非共價(jià)結(jié)合的補(bǔ)骨脂素衍生物；(4)用365納米波長(zhǎng)的紫外光照射后，補(bǔ)骨脂素衍生物可與DNA雜交雙鏈形成牢固的共價(jià)鏈結(jié)合；
(5)補(bǔ)骨脂素衍生物又可通過連接劑二硫雙(N-羥基-琥珀酰亞胺丙酸)酯連接含有活性基團(tuán)的熒光微球，或通過與N-羥基-琥珀酰亞胺氨基己酸酯連接的生物素共價(jià)交聯(lián)后再與帶親和素的熒光微球連接，或直接與帶有活性羧基的熒光微球連接。
由于本發(fā)明將熒光微球特異性地連接到DNA芯片上已雜交的雙鏈DNA上，熒光微球中連接有許許多多的熒光分子，也就是說，在這里，我們用一個(gè)熒光微球取代了傳統(tǒng)方法中DNA芯片上的一個(gè)或幾個(gè)熒光分子，增加了單位面積上的雜交雙鏈的熒光分子數(shù)。這樣，當(dāng)用熒光微球標(biāo)記雜交雙鏈DNA分子時(shí)就達(dá)到了信號(hào)放大的作用，提高了檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，它也能夠彌補(bǔ)雜交效率低等原因造成的對(duì)熒光檢測(cè)靈敏度的影響，使得共聚焦顯微鏡等檢測(cè)DNA芯片的技術(shù)更加完善。這種帶熒光分子信號(hào)放大的DNA芯片檢測(cè)技術(shù)不僅適用于低、中密度的DNA芯片的檢測(cè)，也有望適用于高密度DNA芯片的檢測(cè)。從而使其以價(jià)廉物美及高靈敏度的特點(diǎn)取代或部分取代目前共聚焦顯微鏡檢測(cè)DNA芯片的技術(shù)。因此本發(fā)明具有廣泛的使用價(jià)值。
本發(fā)明與生物芯片檢測(cè)儀聯(lián)合應(yīng)用，即可滿足高分辨率和高靈敏的需要，又符合便宜實(shí)用的要求。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1——雜交前方法之一(樣品單鏈DNA生物素化)的實(shí)驗(yàn)步驟(1)將樣品單鏈DNA(探針)進(jìn)行生物素化處理，使其帶上生物素基團(tuán)(生物素化包括酶法和化學(xué)法)。
(2)將帶有生物素標(biāo)記的單鏈樣品DNA與DNA芯片雜交，雜交后的DNA芯片與帶有親和素的熒光微球在含3％牛血清白蛋白的沖洗液中作用10-30分鐘后，沖洗液沖洗3次，每次5分鐘，吹干后檢測(cè)。
其中生物素沖洗液的配方是50mmol三羥甲基氨基甲烷(Tris),pH7.4；200mmol氯化鈉；0.3％特威恩-20(去污劑Tween-20的商品名)；0.01硫硫汞。
實(shí)施例2——雜交前方法之二(樣品單鏈DNA氨基化)的實(shí)驗(yàn)步驟(1)通過末端標(biāo)記法將DNA探針氨基化后，使其3’末端帶上氨基，或通過溴化以及二氨基己烷替換方法氨基化探針。
(2)將帶有氨基標(biāo)記的單鏈樣品DNA與DNA芯片雜交，洗去未雜交樣品DNA后，DNA芯片再分別與活化的羧基標(biāo)記或醛基硫酸酯化標(biāo)記的熒光微球反應(yīng)，或與N-羥基丁二酰胺-長(zhǎng)鏈生物素反應(yīng)接上生物素后，與親和素標(biāo)記的熒光小球連接，沖洗液沖洗，吹干后檢測(cè)。
實(shí)施例3——雜交前方法之三(樣品單鏈地高辛化)的實(shí)驗(yàn)步驟(1)經(jīng)反應(yīng)將地高辛連接到DNA樣品單鏈上；(2)樣品與DNA芯片雜交；(3)清洗未雜交DNA樣品單鏈；(4)將帶有地高辛抗體的熒光微球與DNA芯片反應(yīng)；(5)洗去未反應(yīng)的熒光微球；(6)檢測(cè)DNA芯片。
實(shí)施例4——雜交后方法之一的實(shí)驗(yàn)步驟(1)樣品單鏈DNA與DNA芯片雜交；(2)洗去未雜交者；(3)將補(bǔ)骨脂素衍生物(例如4’-氨丁基4,5’,8-三甲基-補(bǔ)骨脂素)加入已雜交的DNA芯片；(4)用異戊醇洗去未嵌入到雙鏈DNA的補(bǔ)骨脂素衍生物；(5)365納米(nm)紫外光照射45分鐘；(6)在暗室中加入氨基反應(yīng)試劑二硫雙(N-羥基-琥珀酰亞胺丙酸)酯(簡(jiǎn)稱DTSP)反應(yīng)兩小時(shí)，與補(bǔ)骨脂素衍生物共價(jià)連接；(7)在暗室中用100％乙醇清洗；
(8)加入帶氨基的熒光微球反應(yīng)2小時(shí)；(9)乙醇清洗；(10)吹干后檢測(cè)。
實(shí)施例5——雜交后方法之二的實(shí)驗(yàn)步驟步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同上；(6)在暗室中加入N-羥基丁二酰胺-長(zhǎng)鏈生物素反應(yīng)2小時(shí)，與補(bǔ)骨脂素衍生物共價(jià)連接；(7)乙醇清洗；(8)加入帶親和素的熒光微球反應(yīng)10分鐘；(9)用生物素沖洗液沖洗3次，每次5分鐘；(10)吹干后檢測(cè)。
實(shí)施例6——雜交后方法之三的實(shí)驗(yàn)步驟步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)同上；(6)加入帶活化羧基的熒光微球中反應(yīng)1小時(shí)，即不通過連接劑直接使游離氨基與帶活性羧基的熒光微球連接；(7)乙醇清洗；(8)吹干后檢測(cè)。
上述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到了發(fā)明目的，即大大提高了DNA芯片檢測(cè)的靈敏度，與生物芯片檢測(cè)儀聯(lián)合使用，即可滿足高靈敏度的需要，使生物芯片的檢測(cè)技術(shù)可在研究所、醫(yī)院或其他需要的單位廣泛使用，如果用于共聚焦顯微鏡檢測(cè)，將使其更加完善。
權(quán)利要求
1.一種用于生物芯片檢測(cè)的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，包括將樣品單鏈DNA加入到DNA芯片中進(jìn)行雜交反應(yīng)，清洗和檢測(cè)，其特征在于所說的樣品單鏈DNA加入到DNA芯片中要通過雜交前方法或雜交后方法，將熒光微球特異地連接到DNA芯片上雜交的雙鏈DAN上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，其特征在于所說的雜交前方法的主要步驟是(1)先對(duì)樣品單鏈DNA進(jìn)行處理，使其帶有活性基團(tuán)；(2)與DNA芯片雜交；(3)用沖洗液沖洗；(4)將帶有相應(yīng)活性基團(tuán)的熒光微球與已雜交的DNA芯片上活性基團(tuán)作用，將熒光微球連接到DNA雙鏈上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，其特征在于所說的處理是生物素化處理，使樣品單鏈DNA帶有生物素活性基團(tuán)，將帶有親和素的熒光微球與已雜交的DNA芯片上相對(duì)應(yīng)的生物素作用，將熒光微球連接到DNA雙鏈上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，其特征在于所說的處理是氨基化，使樣品單鏈DNA帶有氨基活性基團(tuán)，將帶有羧基活性基團(tuán)的熒光微球與已雜交的DNA芯片上相對(duì)應(yīng)的氨基作用，將熒光微球連接到DNA雙鏈上。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，其特征在于所說的處理是地高辛化，再將帶有地高辛抗體的熒光微球連接到已雜交的雙鏈DNA上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片雜交信號(hào)分子放大，其特征在于所說的雜交后方法的步驟如下(1)樣品單鏈DNA與DNA芯片雜交；(2)雜交后利用含有游離伯氨基的補(bǔ)骨脂素衍生物特異性地嵌入到已雜交的DNA雙鏈內(nèi)；(3)沖洗掉少量的與單鏈DNA非共價(jià)結(jié)合的補(bǔ)骨脂素衍生物；(4)用365納米波長(zhǎng)的紫外光照射后，補(bǔ)骨脂素衍生物可與DNA雜交雙鏈形成牢固的共價(jià)鏈結(jié)合；(5)補(bǔ)骨脂素衍生物又可通過連接劑二硫雙(N-羥基-琥珀酰亞胺丙酸)酯連接含有活性基團(tuán)的熒光微球，或通過與N-羥基-琥珀酰亞胺氨基己酸酯連接的生物素共價(jià)交聯(lián)后再與帶親和素的熒光微球連接，或直接與帶有活性羧基的熒光微球連接。
全文摘要
一種用于生物芯片檢測(cè)的生物芯片雜交信號(hào)分子放大技術(shù),主要是通過雜交前方法或雜交后方法將熒光微球特異地連接到DNA芯片雜交的雙鏈DNA上,實(shí)現(xiàn)DNA芯片雜交熒光信號(hào)分子放大,它大大地提高了DNA芯片的檢測(cè)的靈敏度,使生物芯片檢測(cè)技術(shù)可以廣泛地推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1313404SQ0011198
公開日2001年9月19日 申請(qǐng)日期2000年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月10日
發(fā)明者李民乾, 李賓, 周志東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所