一種提高裂腹魚雄性四倍體育成率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高裂腹魚雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：他莫昔芬抑制劑配備、他莫昔芬注射液的配制、注射處理母本、冷休克+靜水壓處理、雌激素抑制劑溶液的配制、雌激素抑制劑溶液浸泡、孵化器中正常孵化；從而獲得裂腹魚雄性四倍體純系。通過此方法，可獲得100%的裂腹魚雄性四倍體純系，不僅有效提高了裂腹魚的四倍體育成率，而且提高了孵化率和出苗率，相比雜交而言，更能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍體魚系。
【專利說明】
一種提高裂腹魚雄性四倍體育成率的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及裂腹魚的四倍體繁育方法，具體涉及一種提高裂腹魚雄性四倍體育成 率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 裂腹魚，體延長，略側(cè)扁或近似圓筒形，身被細鱗或裸露，但在肛門和臀鰭的兩側(cè) 各有1列特化的大型臀鰭，在兩列臀鰭之間的腹中線上形成1條裂縫。三倍體裂腹魚的不育 特征，使其在生長速度、抗逆性、抗病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢。現(xiàn)有技術(shù) 中，不育三倍體裂腹魚是通過四倍體魚與二倍體魚倍間雜交獲得，但要獲得98%以上的三倍 體魚，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體魚系。
[0003] 在魚類遺傳育種中，通常利用冷/熱休克，或通過雜交等方法抑制受精卵的第一次 有絲分裂或直接異源染色體加倍，制備出同源或異源四倍體魚，其中冷休克一般是與靜水 壓處理一起，難以獲得較高純度的四倍體系，而熱休克的方式雖然易于操作，同樣，難以獲 得純度高的四倍體系;而雜交的方法雖然純度高，但成功率低、周期長。此外，上述這些方法 制備的四倍體魚，有些可育、有些又不可育，同時也可能存在基因混雜現(xiàn)象（異源四倍體）， 容易造成生物危險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定的提高裂腹魚 雄性四倍體育成率的方法。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種提高裂腹魚雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50~100mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到250~500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用;催產(chǎn) 劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用〇. 9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素 的劑量為5-10 IU/g; (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為70~160yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1~l.〇°C的冷水 中，靜水壓壓力為250~340Kg/cm 2,持續(xù)時間為3~5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為250~310mg/l，睪 酮的濃度為40~130mg/l; (6)取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%裂腹魚雄性四倍體純系。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA復(fù)制和促雄性的 雙重作用的同時，將受精卵第一次卵裂時間延遲3-5min，并提高所有受精卵第一次卵裂的 同步程度(可達99%)，為操作下一步提供時間保障和奠定染色體加倍基礎(chǔ);2、在受精卵一次 卵裂采用冷休克與較低的靜水壓（低于常用的350kg/cm 2)，以及較短的處理時間（低于 5min)，不僅有效降低對受精卵的影響，提高受精卵的成活率，而且進一步強化四倍體的轉(zhuǎn) 化率;3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強化與保證雄性轉(zhuǎn)化率。因而通過此方法，可獲得 100%的裂腹魚雄性四倍體純系，不僅有效提高了裂腹魚的四倍體育成率，而且提高了孵化 率和出苗率，相比雜交而言，更能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍體魚系。
【具體實施方式】
[0007] 現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。
[0008] 實施例一 裂腹魚雄性四倍體純系快速育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為l〇〇mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到250ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的濃度約為〇.4mg/ml，待用； (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為70yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為〇°C的冷水中，靜水 壓壓力為280Kg/cm 2,持續(xù)時間為5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為270mg/l，睪酮的濃度為 70mg/l； (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%裂腹魚雄性四倍體純系。
[0009] 實施例二 裂腹魚雄性四倍體純系快速育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的濃度為〇. lmg/ml，待用； (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為160yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1°C的冷水中，靜水 壓壓力為250Kg/cm 2,持續(xù)時間為3min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為310mg/l，睪酮的濃度為 130mg/l； (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡l〇s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%裂腹魚雄性四倍體純系。
[0010] 上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任 意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式 及結(jié)果統(tǒng)計。
[0011] 附:裂腹魚雄性四倍體育成結(jié)果統(tǒng)計
注:上述結(jié)果是在注射液中他莫昔芬的濃度為o.lmg/ml的條件下常溫浸泡10S，靜水壓 處理3分鐘所取得的結(jié)果。
【主權(quán)項】
1. 一種提高裂腹魚雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50~100mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到250~500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用;催產(chǎn) 劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用〇. 9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素 的劑量為5-10 IU/g; (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為70~160yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1~l.〇°C的冷水 中，靜水壓壓力為250~340Kg/cm 2,持續(xù)時間為3~5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為250~310mg/l，睪 酮的濃度為40~130mg/l; (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%裂腹魚雄性四倍體純系。
【文檔編號】A01K61/00GK105994080SQ201610497926
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊品紅, 王文彬, 石彭靈
【申請人】湖南文理學(xué)院