用于植物材料體外微繁殖的方法和用于大規(guī)模和大批量生產(chǎn)準備用于田間開發(fā)的植物的 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于植物材料體外微繁殖的方法，該方法包括由植物繁殖體發(fā)育的嫩枝的增殖和伸長的步驟。本發(fā)明還包括用于通過“體外”生物工廠大規(guī)模生產(chǎn)準備用于田間開發(fā)的作為常規(guī)無性系花園的替代品的無性系幼苗的方法。
【專利說明】
用于植物材料體外微繁殖的方法和用于大規(guī)模和大批量生產(chǎn) 準備用于田間開發(fā)的植物的無性系幼苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及用于大規(guī)模和大批量生產(chǎn)木本樹種(arboreal species)特別是桉屬 的無性系植物的方法，由此發(fā)生在體外條件下體外進行的營養(yǎng)繁殖的步驟，從而最大化地 獲得木本樹種的健康的和有活力的微扦插苗(microestacas)，而使間歇浸沒方案中微繁殖 階段的玻璃質(zhì)化速率最小化。
【背景技術(shù)】
[0002] 微繁殖由用作幼苗形成基礎(chǔ)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)組成，是一種在減少的空間內(nèi)大 量繁殖植物的實用、安全以及快速的方法。常規(guī)地，通過半固體體系，典型地在有瓊脂的膠 凝培養(yǎng)基中進行微繁殖。然而，這仍然是昂貴的實踐，給利用設(shè)備和具有有助于大規(guī)模操作 中生產(chǎn)植物和降低高成本勞動力的稱為生物反應(yīng)器的設(shè)備的新技術(shù)留下了空間。
[0003] 生物反應(yīng)器是用于在間歇或永久浸沒方案中栽培幼苗以獲得植物的裝置。生物反 應(yīng)器由用于最優(yōu)管理關(guān)鍵生長因素以使生物反應(yīng)最大化的一套具有隔室和配件的容器組 成。通過該設(shè)備，可通過使用液體營養(yǎng)培養(yǎng)基，在容器內(nèi)注入和交換氣體，例如富含二氧化 碳的空氣，以及對種植條件和過程自動化的更好生理控制來獲得較高增殖速率的培養(yǎng)。有 可隨培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基、浸沒類型（間歇的或永久的）以及它們的功能性而變化的各種類型 的生物反應(yīng)器。巴西最有名的間歇浸沒系統(tǒng)是RITA? (間歇自動化浸沒容器-例如由法國 農(nóng)業(yè)發(fā)展研究中心（CIRAD-Fran?a )創(chuàng)建的）和BIT? (間歇浸沒生物反應(yīng)器-例如由巴 西農(nóng)業(yè)研究公司-遺傳資源與生物技術(shù)中心(Embrapa-Cenargen)創(chuàng)建的）。
[0004] 由于微繁殖技術(shù)的潛力，對現(xiàn)有技術(shù)所證明的該技術(shù)的興趣日益增長。例如，文獻 W0 2012/061950描述了用于南極植物物種的微繁殖的方法和生物反應(yīng)器，其中該方法的特 點是使用了用于所述植物物種發(fā)育的營養(yǎng)培養(yǎng)基和適當(dāng)條件，以及另外使用了用于提供生 產(chǎn)醫(yī)學(xué)和化妝用途的有價值代謝物的UV輻射和溫度控制的方案。
[0005] 文獻W0 2012/156440描述了植物物種的微繁殖的間歇浸沒系統(tǒng)和方法，其特點是 為繁殖體的發(fā)育提供了適當(dāng)?shù)臈l件，諸如照明、溫度和浸沒系統(tǒng)，依據(jù)正在發(fā)育的植物物 種，浸沒系統(tǒng)的間隔范圍為每天1次至10次，浸沒時間為1分鐘至2分鐘或3分鐘至4分鐘。
[0006] Watt (參見Watt，MP "用于植物微繁殖的間歇浸沒系統(tǒng)（TIS)技術(shù)的情況（The status of temporary immersion system(TIS)technology for plant micropropagation) ·"非洲生物技術(shù)雜志（African Journal of Biotechnology) ,Vol. 11 (76)，p. 14025-14035,09/20/2012)提供了對植物的微繁殖的回顧，特別是關(guān)于降低引用為 主要因素的玻璃質(zhì)化、縮短浸沒時間以及增加靜止期(兩次連續(xù)浸沒之間的時間）的建議。
[0007] Gonzal ez (參見Gonzalez，R .等人"由間歇浸沒系統(tǒng)進行藍桉的體外增殖 (Multiplication in vitro of Eucalyptus globulus by temporal immersion system 體外樹林(B〇SqUe)32(2) :147-154,2011)報道了影響通過間歇浸沒進行藍桉的體外增 殖的階段的因素并得出結(jié)論，當(dāng)使用1分鐘至2分鐘的浸泡時間和12小時的浸沒頻率(靜止 期)時，該木本樹種微扦插苗的增殖速率顯著增加。這些作者還得出結(jié)論，玻璃質(zhì)化(hiper-hidricidade)隨營養(yǎng)素和蔗糖的濃度增加。
[0008] Oliveira(參見Oliveira ML，"間歇浸沒生物反應(yīng)器中巨桉X尾葉桉的無性系的 微繁殖（MicropropagagSode clones de Eucalyptus grandis x E. urophy 1 la em biorreatores deimefsao teraporaria.) ·碩士畢業(yè)論文（Dissertaqaode Tese de Mestrado.)維索薩聯(lián)邦大學(xué)(Universidade Federal deVi(；〇sa.)2011)報道了對兩種桉屬 物種的體外微繁殖的研究，得出結(jié)論，當(dāng)使用間歇浸沒技術(shù)時，繁殖體發(fā)育中的玻璃質(zhì)化的 發(fā)生率很高。作者還得出結(jié)論，"需要在作物管理階段調(diào)整增殖和伸長以獲得具有較大活力 的嫩枝，能在體外條件中生根以使該技術(shù)是大規(guī)?？尚械?。
[0009] 前述現(xiàn)有技術(shù)示出雖然植物的體外微繁殖技術(shù)已有很大進步，玻璃質(zhì)化問題仍有 待解決，且同時使用適當(dāng)?shù)臈l件獲得植物特別是木本樹種、更特別地是桉屬物種的無性系 幼苗使得能大規(guī)模和大批量生產(chǎn)所述無性系幼苗并實現(xiàn)健康和有活力的植物的商業(yè)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明涉及使用植物材料的體外微繁殖技術(shù)獲得無性系植物幼苗，特別是木本樹 種的、尤其是桉屬物種的無性系植物幼苗，包括準備用于商業(yè)化的幼苗的增殖、伸長、生根、 馴化以及生長和馴化的步驟。
[0011] 在第一實施方案中，本發(fā)明涉及用于植物材料的體外微繁殖，特別是木本樹種的、 尤其是來自桉屬物種的植物材料的體外微繁殖的方法，包括通過間歇浸沒方法增殖和伸長 由植物繁殖體發(fā)育的嫩枝的步驟，如下：（a)在嫩枝的增殖步驟中，將待繁殖材料置于第一 容器(營養(yǎng)繁殖容器）中的適當(dāng)支持物上，并在來自第二容器(液體培養(yǎng)基的貯藏容器)的液 體營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行間歇浸沒管理，所述管理包括浸沒和靜止的交替期，浸沒時間優(yōu)選為 至少1分鐘，優(yōu)選為至多3分鐘，更優(yōu)選為1分鐘至2分鐘，靜止期優(yōu)選為至少2小時，優(yōu)選為至 多4小時，更優(yōu)選為2小時至3小時；（b)在嫩枝伸長的步驟中，優(yōu)選地使用步驟(a)的相同營 養(yǎng)培養(yǎng)基對繁殖材料進行間歇浸沒管理，所述管理包括浸沒和靜止的交替期，浸沒時間優(yōu) 選為至少20秒，優(yōu)選為至多60秒，更優(yōu)選為20秒至30秒，靜止期優(yōu)選為至少4小時，優(yōu)選為至 多6小時，更優(yōu)選為4小時至5小時;所述方法的特點在于該事實，即在所述伸長步驟中，分別 與增殖步驟中的浸沒期和靜止期相比，所述浸沒期顯著較短，且所述靜止期較長。
[0012] 在第二實施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)準備用于田間開發(fā)的無性系植物幼苗的 方法，包括步驟：（i)對植物繁殖體進行體外間歇浸沒的營養(yǎng)繁殖條件，包括以下階段：（a) 嫩枝增殖，其中待展開在適當(dāng)?shù)闹С治锷系牟牧媳恢糜诘谝蝗萜?微繁殖容器）中，且對所 述材料在來自第二容器(液體培養(yǎng)基貯藏容器)的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行間歇浸沒管理，所 述管理包括浸沒和靜止的交替期，浸沒時間優(yōu)選為至少1分鐘，優(yōu)選為至多3分鐘，更優(yōu)選為 1分鐘至2分鐘，靜止期優(yōu)選為至少2小時，優(yōu)選為至多4小時，更優(yōu)選為2小時至3小時；（b)嫩 枝伸長，其中優(yōu)選地使用步驟(a)的相同營養(yǎng)培養(yǎng)基對材料進行間歇浸沒管理，所述管理包 括靜止和浸沒的交替期，浸沒時間優(yōu)選為至少20秒，優(yōu)選為至多60秒，更優(yōu)選為20秒至30 秒，靜止期優(yōu)選為至少4小時，優(yōu)選為至多6小時，更優(yōu)選為4小時至5小時；（ii)步驟⑴中獲 得的多芽在適于維持植物膨壓和降低蒸發(fā)需要的容器和條件中的生根和馴化；以及（iii) 步驟(ii)中獲得的微扦插苗的生長和馴化。
【附圖說明】
[0013] 圖1說明了本發(fā)明的方法，示出各步驟的材料的微繁殖和微扦插。
[0014] 圖2示出了間歇浸沒方案中在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中的體外微繁殖步驟。
[0015] 圖3示出無性系幼苗大規(guī)模和大批量地從正確克隆選擇到市場推廣的發(fā)展階段。
【具體實施方式】
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 間歇浸沒生物反應(yīng)器中無性系木本樹種如桉屬的微扦插苗的大規(guī)模和高生產(chǎn)力 的生產(chǎn)系統(tǒng)的主要目標(biāo)是通過植物生物工廠逐漸取代經(jīng)營性林業(yè)苗圃的傳統(tǒng)無性系花園， 目的是生產(chǎn)用于隨后在特定溫室(鐘形玻璃蓋(estufins))中的生根和馴化的工業(yè)微型粧。
[0018] 在生物反應(yīng)器中，可通過連續(xù)使用液體營養(yǎng)培養(yǎng)基，輔以在植物容器內(nèi)注入空氣 和富集二氧化碳以及用發(fā)光二極管燈進行光合有效輻射而獲得較高速率的增殖和作物生 長。因此，嫩枝和生物質(zhì)的生產(chǎn)管理通過關(guān)鍵生長因素的自動化操控而最佳地優(yōu)化，使得能 對培養(yǎng)條件進行更好的生理控制。
[0019] 該技術(shù)中尋求的是將玻璃質(zhì)化最小化，玻璃質(zhì)化會引起對通過間歇浸沒方法獲得 的無性系幼苗的干擾和退化，以及同時保留該技術(shù)在生產(chǎn)成本和所生產(chǎn)的幼苗的健康/活 力方面的優(yōu)勢。本發(fā)明的發(fā)明人迎接了該挑戰(zhàn)，該發(fā)明人己創(chuàng)建了一種方法，其中材料在營 養(yǎng)繁殖中的浸沒和靜止的交替期在嫩枝的繁殖和伸長階段中是不同的。該過程使得能降低 無性系植物幼苗，特別是木本樹種、以及最優(yōu)選地是桉屬物種，的玻璃質(zhì)化和使其生產(chǎn)最大 化。圖1中，這兩個階段表示為實驗室中的活動，其中微繁殖即包括增殖和伸長階段的步驟 一般要約45天的時間。
[0020] 本發(fā)明的方法已被定制成滿足用于木本樹種特別是桉屬的營養(yǎng)繁殖的生理需要， 允許植物集中和準確的發(fā)育，分化從而得到所生產(chǎn)嫩枝的最佳質(zhì)量標(biāo)準和一致性以及活 力，提供微扦插苗的較好生根以及之后用于大規(guī)模工作用途的無性系幼苗的更好的馴化和 早期產(chǎn)量。
[0021] 除了提供用于生產(chǎn)無性系變化的周期時間降低33%之外，本發(fā)明的方法還允許獲 得比生產(chǎn)來自商用苗圃的幼苗的傳統(tǒng)方法大至少30倍的生產(chǎn)率。另外，本發(fā)明的方法在苗 圃中的運營性部署使人力降低以及無性系花園的構(gòu)建成本降低。
[0022]其中本發(fā)明的方法解決了以下問題：
[0023] -在降低運營成本和生產(chǎn)周期的情況下，大規(guī)模和大批量地生產(chǎn)質(zhì)量均勻的無性 系幼苗，以獲得木本植物例如桉屬的營養(yǎng)繁殖的最大效率和生產(chǎn)周期。
[0024] -降低與外植體的玻璃質(zhì)化（即通常稱為植物玻璃化的現(xiàn)象)有關(guān)的生理異常和 紊亂。氣體交換管理是本發(fā)明的優(yōu)點之一，該管理優(yōu)選地在BIT型的生物反應(yīng)器中進行，但 也可在另一種類型如RITA的生物反應(yīng)器中進行，這實際上消除了這些生物問題。
[0025] -降低了與包含運營過程中無性系花園（jardins clonais)的勞工降低有關(guān)的桉 屬無性系幼苗的生產(chǎn)成本。
[0026] 一間歇浸沒生物反應(yīng)器中進行的營養(yǎng)繁殖中植物基質(zhì)和微型粧的生理品質(zhì)模式 的一致性，與從環(huán)境條件不一致的無性系花園中生長的植物獲得的植物和扦插苗 (estacas)的一致性的缺乏相反。
[0027] 一生物反應(yīng)器中體外營養(yǎng)繁殖克服了包括桉屬、頑拗性植物(recalcitrantes)的 木本樹種的物種和無性系的營養(yǎng)繁殖的困難，允許使用不能由常規(guī)手段產(chǎn)生的新的或更有 生產(chǎn)力的無性系。
[0028] -無性系清選（limpeza clonal)，通過在不會與其他克隆體混合的情況下獲得沒 有致病微生物的植物和作物的基質(zhì)以及還有單一克隆的具有高遺傳穩(wěn)定性的培養(yǎng)物。
[0029] -除了所選擇無性系和基質(zhì)的復(fù)壯之外，還通過優(yōu)良無性系的繁殖加速育種程 序，目的是在較少時間內(nèi)和減小的空間內(nèi)產(chǎn)生較大的數(shù)量的幼苗。
[0030] 重要的是要注意，使用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的芽(或微繁殖的產(chǎn)物）用于特定容 器(其可以是管、塞、泡沫塑料托盤或其他容器）中的直接播種替代了來自已知的無性系花 園(無性系迷你園或無性系微型園）嫩枝供應(yīng)至市場。這是本發(fā)明的微繁殖方法中使用的技 術(shù)的一大優(yōu)勢，且另一個優(yōu)勢是隨著桉屬的生產(chǎn)，在數(shù)量和質(zhì)量方面呈現(xiàn)出無以倫比的回 饋，這與無性系花園中使用的技術(shù)是不可比的。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的生物反應(yīng)器中營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的說明
[0032] 生物反應(yīng)器中植物生長和發(fā)育的整個過程中，可以使用兩種基本培養(yǎng)基，如下所 示。根據(jù)培養(yǎng)需要和生理階段，根據(jù)本發(fā)明將這些培養(yǎng)基化學(xué)改性以照料特定的無性系。該 培養(yǎng)基補充有生長植物調(diào)節(jié)劑(行1：〇1^6〖1113(1〇^8)，培育芽增殖、嫩枝伸長和微扦插苗體 外生根的預(yù)誘導(dǎo)。
[0033]生長調(diào)節(jié)劑濃聚物類型以及其管理生物反應(yīng)器工藝的用途是本領(lǐng)域中常用的那 些，同時適當(dāng)適應(yīng)優(yōu)選包括木本樹種以及更優(yōu)選地桉屬的用于繁殖的所需物種的培養(yǎng)。 [0034]表1:液體營養(yǎng)培養(yǎng)基型JADS(參見Correia，D. 1993. "在液體和固體培養(yǎng)基中桉屬 的體外增殖中芽的生長和發(fā)育（Crescimento e desenvolvimento de gemas na multipiict^aode eucalipto in vitro em meio de culturaliquido e S0lid〇) ·"林業(yè) 科學(xué)碩士學(xué)位論文（Di.S.sert%E〇:de Mestrado emCi^nciasFlorestais)，路易斯德凱農(nóng) 學(xué)院（Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz)，皮拉西卡巴（Piracicaba))
[0035]
[0山6」 表2:淞體宮喬培喬.MS型（參見Murashige，T·&Skoog，K· 1962 ·用t煙皁組織培喬 物快速生長和生物測定的改進培養(yǎng)基（A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures·)植物生理學(xué)（Physiologia Plantarum) 15: 473-497)
[0037]
[0038] 微扦插苗在生物可降解塞中的種植
[0039] 如圖1所示，將伸長的嫩枝從實驗室轉(zhuǎn)移至進行生根和馴化階段的命名為鐘形玻 璃蓋(Estufim)的受控環(huán)境。要這么做，將嫩枝分離并將每個個體置于含有固體培養(yǎng)基的容 器中，這類容器置于托盤中或在架上。有用于無性系幼苗生根的一些特定類型的容器，如以 下所記載的類型。
[0040] 種植容器和托盤:
[0041 ] Ellepot EP：由丹麥公司Ellegaard?:生產(chǎn)的可降解塑料管，包含：白色聚酯或纖 維膜和具有圓柱形狀的孔;容量:85cc和110cc;尺寸:30 X 100mm和40 X 100mm。
[0042] Jiffy Pellet:由挪威公司Jiffy?:生產(chǎn)的生物可降解塑料管，包含有椰子纖維和 水蘚泥炭的可膨脹插入物，圓柱形;容量:85cc和110cc;尺寸:30 X 100mm和36 X 100mm。
[0043] Care-Free?型泥炭顆?？膳蛎浧?尺寸：30 X100和36 X100,干燥和壓制的水蘚 泥炭、珍珠巖和礦物添加物的組合，涂覆有滲透膜和生物可降解PLA，由挪威公司Jiffy?的 加拿大分部生產(chǎn)。
[0044] Air-Trav? 托盤 117:打算作為用于 CareFree? Jif f y-Pe 11 ets 30 X 100mm和 390父590111111(2301〇112)的支架，具有117個單元，且平均面積為19.6〇11 2/單元，對于占用率為 100%的托盤(處理T-l)。
[0045] Air-Tray?托盤64:打算作為用于CareFree?Jiffy-Pellets 36 X 100mm和380 父380_(1444〇112)的支架，具有64個單元，且平均面積為22.5〇11 2/單元，對于占用率為100% 的托盤(處理T-2)。
[0046] 托盤中顆粒合理配置之后，它們必須放置成它們的底部（基部）與純水的淺層接 觸，使得托盤中的顆粒未覆蓋(或漂浮)在水中。這是顆粒膨脹的過程，在這種情況下，該過 程通過毛細管作用使它們"再水化"。重要的是要注意，顆粒的基部應(yīng)保持與水的該層接觸， 直到完全膨脹。如果水深減?。ㄓ捎陬w粒的吸收），則必須更換水。不必擔(dān)心"過量水"。該操 作僅花費幾分鐘。如果有人想使膨脹過程加速，則其可利用約45°C的熱水。在這種情況下， 有必要提前使顆粒膨脹數(shù)分鐘，從而使得開始接受微扦插苗之前它們的溫度接近室溫。 [0047]微繁殖的桉屬幼苗的馴化技術(shù)
[0048] 一般而言，在微繁殖的桉屬植物種群中，很可能小亞種群將由于微繁殖中生物反 應(yīng)器和其他燒瓶內(nèi)的條件不平衡而呈現(xiàn)出解剖學(xué)、形態(tài)學(xué)以及生理學(xué)的異常。所有這些變 化都與用于微扦插苗生根和之后的幼苗馴化的過程的不適當(dāng)條件相關(guān)，并因此降低了幼苗 的存活率和質(zhì)量。
[0049] 應(yīng)用馴化技術(shù)的目的是提供體外（生物反應(yīng)器)和外部(苗圃）環(huán)境之間過渡中的 較好分等級（gradua?S〇)。這些技術(shù)中，我們強調(diào)利用霧霧系統(tǒng)（systemas de mist e fog)，有助于維持植物活力和降低蒸發(fā)需要。遮陰幫助降低來自外部環(huán)境的高水平的亮度， 且也幫助降低馴化中植物的溫度和壓力。
[0050] 可替換地，其他產(chǎn)品和保護的環(huán)境可用在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的微扦插苗的種植 中。所用的產(chǎn)品包括用于種植在木質(zhì)纖維容器中的由生物可降解聚合物穩(wěn)定的底質(zhì) (substratos)，和椰子纖維以及水蘚泥炭（turfa de Sphagnum)。這些容器用作壓制的顆粒 且當(dāng)水化時是可膨脹的。
[0051 ] 有霧和鐘形玻璃蓋的栽培系統(tǒng)
[0052] 該系統(tǒng)生成有直徑小于15微米的極小水滴的霧，用特定噴嘴或超聲噴霧器在鐘形 玻璃蓋環(huán)境內(nèi)將該水滴霧化，生成超薄(<5μπι)干霧。這些液滴如此小，以致它們保持懸浮在 空氣中，直至蒸發(fā)，有助于增加濕度和溫度降低，且同時避免葉濕潤。這些懸浮中的水滴能 維持兩個葉表面上非常薄的水汽膜，這保持幼苗吸脹(torgiadas )和溫度可控。
[0053] 霧系統(tǒng)與鐘形玻璃蓋結(jié)構(gòu)一起使用，該結(jié)構(gòu)優(yōu)選為特別設(shè)計用于桉屬生根和馴化 的結(jié)構(gòu)。該鐘形玻璃蓋由迷你溫室或正常溫室內(nèi)的拱形大棚（sobre-n'ineis)的組裝體組 成，保持懸在圓形桌上。鐘形玻璃蓋中幼苗的生長和發(fā)育期間，利用地下灌溉系統(tǒng)（流動 的），這使生物可降解塞的基部間歇浸沒在用于向植物供應(yīng)營養(yǎng)素的水或營養(yǎng)溶液中，而無 需濕潤幼苗的地上部分。
[0054] 生物可降解塞中微扦插苗移植技術(shù)
[0055]生物可降解容器內(nèi)生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的微扦插苗的種植體系包括選擇有滿意質(zhì) 量的標(biāo)準微扦插苗和將微扦插苗的基部插入袋子或之前水化的壓制顆粒(塞），如上所描述 的。
[0056] · Jiffy再水化和膨脹階段：
[0057] 一將顆粒置于托盤之后，它們必須放置成在室溫下它們的底部(基部）與純水的淺 層接觸，使得在種植微扦插苗之前托盤中的顆粒未覆蓋(或漂浮)在水中，直至完全膨脹。 [0058] 一僅通過毛細管作用而不通過它們在水中的浸沒完成顆粒的再水化。重要的是要 注意，顆粒的基部應(yīng)保持與水層接觸，直至它們完全膨脹。如果水位降低（由于顆粒的吸 收），則必須更換水。不必擔(dān)心過量水。該操作僅花費幾分鐘。
[0059] 一如果有人想使膨脹過程加速，則其可利用加熱至約45°C的水。在這種情況下，有 必要提前使顆粒膨脹數(shù)分鐘，從而使得種植期間開始接受微扦插苗之前它們的溫度接近室 溫。
[0060] 通過非限制性實施例，提供了關(guān)于可用于進行生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的微型粧的種植 的技術(shù)的一些信息。
[0061] ?塞和托盤的技術(shù)規(guī)格(PLA網(wǎng)=生物可降解的玉米淀粉樹脂）
[0062]
[0063] ?幼苗托盤的空間管理：
[0064]
[0065] ?灌溉管理：
[0066] 一灌溉用水深度的應(yīng)用應(yīng)調(diào)整以達到每種底質(zhì)的田間持水量，特別是生根(CV)和 馴化(CA)階段時，其中E11印ot和Jiffy必須是未經(jīng)水飽和的。
[0067]-在溫室中，灌溉管理應(yīng)產(chǎn)生持續(xù)時間短的灌溉間隔和灌溉之間的間隔，例如，灌 溉之間每10-15分鐘6秒的持續(xù)時間，以在不出現(xiàn)底質(zhì)的灌溉的情況下提高相對濕度的水 平。
[0068] 一在馴化中，灌溉管理應(yīng)允許Ellepot和Jiffy的底質(zhì)完全濕潤，而不會引起其的 過度和飽和。例如，遮陽網(wǎng)型的遮陰必須僅在當(dāng)天的最熱的一段時間例如上午11點至下午2 點保持延長。
[0069] -相反，在生長(PC)和硬化（Rustifica?3o)(PR)階段，由于對較大水深的需要， Ellepot和Jiffy應(yīng)是幾乎飽和的，以彌補來自容器、根系吸收和葉片蒸騰的蒸發(fā)損失。
[0070] 一另外，在生長和硬化梯田中，Ellepot和Jiffy的灌溉推薦使用用于均勻濕潤整 個底質(zhì)的灌溉桿或噴頭。
[0071] ?底質(zhì)濕度的監(jiān)測：
[0072] 一Ellepot和Jiffy容器中的生根和幼苗生長過程期間，必須監(jiān)測底質(zhì)的含水量， 以建議灌溉變化(持續(xù)時間和間隔)使得底質(zhì)含量保持在田間持水量的理想范圍內(nèi)。
[0073] -這些瞬時實時的底質(zhì)水分測量必須利用便攜式水分測定儀+電導(dǎo)率+溫度，例如 AT商標(biāo)(Delta-T brand)模型濕度傳感器(model WET Sensor)來進行。該設(shè)備必須在實驗 室中校準以用于用在測試中的底質(zhì)。
[0074] 一該濕度傳感器必須插到Ellepot和Jiffy內(nèi)的至少兩個位置(深度）中，因為僅傳 感器的尖部能準確地記錄根圍區(qū)域中的值。在CV中，該位置應(yīng)是淺的（2-3cm)，在CA中，該位 置應(yīng)在中間（3-6cm)，以及在PC位置中，其應(yīng)在底部(7-9cm) 〇
[0075] -在一次測量與另一次之間，必須等待一段時間（10-15秒）用于濕底質(zhì)中的傳感 器穩(wěn)定。在相同Ellepot或Jiffy中，第一測量必須在較低濕度時進行，第二測量必須在較高 濕度時進行。
[0076] -我們建議以下范圍的水分用于測試中的底質(zhì)，用濕度傳感器測量，如下所示：
[0077]
[0078] 實施例
[0079]實施例1 一獲得桉屬無性系幼苗
[0080]本發(fā)明的用于在生物反應(yīng)器中通過間歇浸沒技術(shù)獲得桉屬無性系幼苗方法包括 以下步驟：
[0081 ]步驟1 一在將植物浸沒于培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器內(nèi)部隔室氣氛的氣體交換之間的間 隔期間，植物材料保持靜止。將培養(yǎng)基儲存在外容器(下)和內(nèi)隔室(上面的）中的外植體中。 該有效光合輻射生物反應(yīng)器由有藍色、紅色和白色顏色的LED燈的管狀固定裝置組成。 [0082]步驟2-通過在一定范圍預(yù)設(shè)時間和持續(xù)時間的定時器啟動電磁閥。這允許壓縮 空氣進入外容器，增加了外隔室（下）內(nèi)的壓力，使得液體培養(yǎng)基通過容器之間的連接通道 轉(zhuǎn)移到植物的內(nèi)室(上）中，并接觸到培養(yǎng)物的基部。間歇浸沒的管理隨桉屬無性系的類型 以及隨培養(yǎng)階段而變化。在嫩枝的增殖階段中，間歇浸沒以及持續(xù)1-2分鐘的浸沒之間用2-3小時。在嫩枝伸長階段時，間歇浸沒以及持續(xù)20-30秒的浸沒之間用4-5小時。
[0083]步驟3-浸沒期之后，關(guān)閉電磁閥，且培養(yǎng)基通過重力經(jīng)排出管(drenos)回到外殼 體中。在此階段時，發(fā)生與注入分配植物材料的內(nèi)容器的壓縮空氣的交換。該氣體交換(空 氣和二氧化碳）由通過定時器控制的電磁閥驅(qū)動。
[0084]步驟4 一隨著以每分鐘1.3升的流率在植物材料生長的內(nèi)容器中注入特定濃度的 C02，發(fā)生氣體交換，以提高作物的光合和生產(chǎn)能力，流量為每秒500微摩爾C02，濃度為每摩 爾空氣800-1000摩爾的C〇2。該氣體交換也通過定時器控制的電磁閥驅(qū)動。
[0085] PAR輻射一在整個生產(chǎn)周期中，我們使用光合有效輻射(PAR)，其對應(yīng)用于作物生 長和發(fā)育的400nm至700nm的范圍。在該情況中，使用具有發(fā)光二極管(LED)的電燈代替生物 工廠中采用的傳統(tǒng)熒光燈。植物主要吸收紅光范圍（600nm至700nm)和藍光(400nm至500nm) 中的光譜，因此，控制照明管理以提供分別用于增殖和伸長的3/1(紅光/藍光)至2/1(紅光/ 藍光）的比率。根據(jù)培養(yǎng)的生理階段，PAR的強度也不同。典型地，在增殖階段，使用20-30μ mol/m2/s，和在伸長階段，使用 4〇-60ymol/m2/s。
[0086] 該說明書中提到的所有出版物和專利申請都表明本實用新型涉及的本領(lǐng)域技術(shù) 人員的水平。所有出版物和專利申請都通過引用并入本文中，其參考程度如同各單個出版 物或?qū)＠暾埜髯跃唧w地和個別地表明被并入的一樣，以便參考。
[0087] 盡管已描述了某些實施方式，但是它們僅是以示例性方式示出，而不意圖限制本 實用新型的范圍。所附權(quán)利要求和該說明書中它們的等同方案被認為涵蓋了在本實用新型 的范圍和精神內(nèi)的這類形式或改進。
【主權(quán)項】
1. 用于植物材料體外微繁殖的方法，所述方法包括通過間歇浸沒方法增殖和伸長由植 物幼苗發(fā)育的嫩枝的步驟，所述步驟包括： (a) 在所述嫩枝的增殖步驟中，將待繁殖材料鋪展在第一容器（營養(yǎng)繁殖容器）中的適 當(dāng)支持物上，并在來自第二容器(液體培養(yǎng)基的貯藏容器)的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行間歇浸 沒管理，所述管理包括浸沒和靜止的交替期； (b) 在所述嫩枝伸長的步驟中，優(yōu)選地使用步驟(a)的相同營養(yǎng)培養(yǎng)基對所述繁殖材料 進行間歇浸沒管理，所述管理包括浸沒和靜止的交替期，其中所述方法在所述步驟(b)(伸 長）中，分別與(增殖的）步驟(a)中的浸沒期和靜止期相比，所述浸沒期顯著較短，且所述靜 止期較長。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物材料是木本植物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述木本植物是桉屬物種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中，所述浸沒期為至少1分鐘，且所述靜 止期為至少2小時。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述浸沒期最大為3分鐘，且所述靜止期至多為4小 時。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項所述的方法，其中所述浸沒期為1分鐘至2分鐘，且所述 靜止期為2小時至3小時。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中，所述浸沒期為至少20秒，且所述靜止 期為至少4小時。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述浸沒期最大為60秒，且所述靜止期至多為6小 時。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8中任一項所述的方法，其中所述浸沒期為20秒至30秒，且所述靜 止期為4小時至5小時。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物材料的體外微繁殖在BIT型的生物反應(yīng) 器中進行。11. 用于大規(guī)模和大批量生產(chǎn)準備用于田間開發(fā)的無性系植物幼苗的方法，所述方法 包括以下步驟：（i)通過如權(quán)利要求1-10所限定的方法進行植物材料的營養(yǎng)繁殖；（ii)允許 步驟(i)中獲得的伸長的嫩枝在適用于維持植物膨壓和降低蒸發(fā)需要的條件的容器中生根 和馴化；以及(iii)使步驟(ii)中獲得的微扦插苗能生長和馴化，直到所述無性系幼苗的大 小適用于轉(zhuǎn)移至田間。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(ii)在潮濕環(huán)境中進行，其中水蒸汽液 滴如此小，以致能保持懸浮在空氣中直至蒸發(fā)，同時避免葉面濕潤。
【文檔編號】A01H4/00GK105939598SQ201480071933
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年10月30日
【發(fā)明人】R·M·彭切爾, J·P·D·雷斯, M·L·D·奧利韋拉
【申請人】非布利亞塞魯羅斯股份公司