專利名稱：兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因及其所編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中的一類新的兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因及其所編碼的蛋白質(zhì)。
植物通過(guò)感受環(huán)境及內(nèi)部因子(如各種逆境，植物激素等)并作出反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)和發(fā)育，盡管在生理生化水平上對(duì)這些反應(yīng)已有許多研究，但植物感受和傳遞這些信號(hào)的機(jī)制仍不清楚。最新研究表明，植物某些信號(hào)傳遞過(guò)程可能與細(xì)菌的兩組分信號(hào)傳遞系統(tǒng)相似。
在細(xì)菌中，兩組分信號(hào)傳遞系統(tǒng)參與許多適應(yīng)性行為的信號(hào)傳遞過(guò)程，典型的兩組分信號(hào)系統(tǒng)包含2個(gè)蛋白質(zhì)組分，一個(gè)是感受器(sensor)，通常位于細(xì)胞質(zhì)膜，以監(jiān)測(cè)環(huán)境變化的參數(shù)，另一個(gè)是位于胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)器(response regulator)用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)或傳遞來(lái)自感受器的信號(hào)。除此之外，還有一小類屬于“二合一”的兩組分信號(hào)系統(tǒng)，即“感受器”和“反應(yīng)調(diào)節(jié)器”合二而一，處于同一個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)。
在植物中已從擬南薺菜和蕃茄中分離到“二合一”兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因，它們參與乙烯信號(hào)傳遞或植物細(xì)胞分裂素信號(hào)傳遞。但這種兩組分信號(hào)系統(tǒng)沒(méi)有被認(rèn)為是受干旱、鹽堿、傷害誘導(dǎo)(Chang,C.,The ethylene signal transduction pathway inArabidopsis:an emerging paradign？Trends Biochem.Sci.,1996,21:129；Chang,C.,Kwok,S.F.,Bleecker,A.B.等，Arabidopsis ethylene-response gene ETR1:similarity of product to two-component regulators,Science,1993,262:539)。
本發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了一種新的植物“二合一”兩組分信號(hào)系統(tǒng)蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的表達(dá)受傷害(切割)、鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)，它在植物中為乙烯受體，但不受乙烯誘導(dǎo)。
所述的蛋白質(zhì)可以是來(lái)自自煙草，擬南薺、大豆、茅草或水稻的兩組分信號(hào)系統(tǒng)蛋白質(zhì)。最好是來(lái)自Nicotiana tabacum var.Xanthi煙草的兩組分信號(hào)系統(tǒng)蛋白質(zhì)。一種這種蛋白質(zhì)的核苷酸序列如


圖1所示。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的植物“二合一”兩組分信號(hào)系統(tǒng)蛋白質(zhì)，其表達(dá)受傷害(切割)、鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)，從而為植物性狀改良基因工程提供目的基因和調(diào)控元件。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼兩組分信號(hào)系統(tǒng)的核苷酸序列，這種序列中的一種如
圖1所示。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培育耐鹽，耐干旱植物品種的方法，包括將編碼本發(fā)明的兩組分信號(hào)系統(tǒng)的基因?qū)胫参锛?xì)胞并使其表達(dá)的步驟。
在本發(fā)明的方法中，可將NTHK1以有義或反義形式或點(diǎn)突變的形式連接35S啟動(dòng)子或Ubiquitin啟動(dòng)子，后面連上Nos尾，轉(zhuǎn)入到植物表達(dá)載體如pBIN系列中，然后將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌如LBA4404中，再通過(guò)葉盤(pán)法，愈傷組織或真空抽濾法將農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，受到侵染的外植體或愈傷組織經(jīng)培養(yǎng)，可再生出小苗，小苗經(jīng)篩選(對(duì)pBIN系列用卡那霉素)后可確知是否為轉(zhuǎn)基因植株。用真空法可對(duì)擬南芥植株(花期)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到的種子經(jīng)抗菌素篩選后可得到轉(zhuǎn)基因植株。另外也可用基因槍法將目的基因NTHK1的表達(dá)載體轟擊植物愈傷組織，經(jīng)培養(yǎng)，再生和篩選后可得到轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)各種轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，這樣就可獲得耐旱耐鹽的新品系。本方法可用于對(duì)各種糧食作物(如水稻、小麥、玉米、大豆等)和蔬菜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，可獲得抗旱抗鹽抗逆的新品系。
實(shí)驗(yàn)例實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明人利用煙草(Nicotiana tobacum var.Xanthi)為材料，以PCR技術(shù)從花芽cDNA1鏈擴(kuò)增了NTHK1基因片段，PCR擴(kuò)增條件為94℃,1分鐘；56℃,1.5分鐘；72℃,2分鐘；共40個(gè)循環(huán)，所用的5’端引物為5’-ATTGAGAG(G/A)TACAAGAAAGC-3’,3’端引物為5’-CTG(G/A)AGAGC(C/G)GTTTG(A/G)TC-3’，擴(kuò)增的cDNA片段克隆于載體SK+中。
采用Amersham的DNA測(cè)序試劑盒在ABI373型自動(dòng)測(cè)序儀(PE公司)上測(cè)定了克隆片段的DNA序列，表明該片段含448堿基對(duì)(bp)，其5’端編碼110個(gè)氨基酸，終止密碼子后有約100bp的3’端非翻譯區(qū)。構(gòu)建煙草花芽cDNA文庫(kù)，以此片段為探針，篩選得到十幾個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)檢測(cè)挑取插入片段最大的克隆，進(jìn)行序列分析，表明該克隆包含上述片段，是一段完整的cDNA(
圖1)。
用BLAST(GAPPED)程序?qū)ι鲜鯿DNA編碼的氨基酸序列與其它兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因產(chǎn)物的氨基酸序列作了比較，示于圖2，與之比較的幾種氨基酸序列中NTETR1為煙草中的乙烯受體類似物(accession No.AF022727),SHK為蘭細(xì)菌中負(fù)責(zé)信號(hào)傳遞的兩組分系統(tǒng)組氨酸激酶序列(accession No.D90910)；RcsC為大腸桿菌K-12調(diào)節(jié)莢膜多糖合成的蛋白(accession no.P14376)；Sln1為出芽酵母中感受滲透壓變化的組氨酸激酶。由圖2可見(jiàn)，與其它兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因產(chǎn)物比較，在該序列中磷酸化受體部位的氨基酸如天冬氨酸及組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的組氨酸均極保守，因此將該基因命名為NTHK1(Nicotiana tobacum histidine kinase-like)。實(shí)驗(yàn)例2關(guān)于NTHK1的特性NTHK1的表達(dá)受傷害(切割)誘導(dǎo)將煙草葉片剪至2-3cm2，浸入0.5×MS培養(yǎng)基(pH5.8)中，振蕩5,10,15,30,60,180及480分鐘，以未處理葉片為對(duì)照，對(duì)樣品的RNA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR分析，圖3說(shuō)明在15分鐘后NTHK1的轉(zhuǎn)錄水平即有明顯升高，至60分鐘達(dá)到最高值，說(shuō)明NTHK1基因的表達(dá)受傷害誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)例3NTHK1基因受鹽脅迫誘導(dǎo)分別將五葉期的煙草澆以0,100,200,400mM NaCl,24小時(shí)后以競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR分析測(cè)定NTHK1的轉(zhuǎn)錄，圖4說(shuō)明在鹽脅迫下，NTHK1基因轉(zhuǎn)錄有明顯增加，說(shuō)明此基因受鹽脅迫誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)例4NTHK1基因受干旱誘導(dǎo)五葉期煙草分別放入0,5,10,20％PEG(聚乙三醇6000)中24小時(shí)后以NTHK1為探針對(duì)樣品的RNA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR分析，表明，在5％,10％,20％PEG脅迫下NTHK1轉(zhuǎn)錄上升，說(shuō)明干旱能誘導(dǎo)NTHK1基因表達(dá)(圖4)。實(shí)驗(yàn)例5乙烯對(duì)NTHK1的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響將剪切的煙草葉片(2-3cm2)在含0,0.00393,0.0393,0.393,3.93,39.3mM的乙烯利溶液中搖動(dòng)30分鐘后對(duì)樣品的RNA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR，結(jié)果表明乙烯利對(duì)傷害誘導(dǎo)的NTHK1轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響(圖5)。實(shí)驗(yàn)例6NTHK1基因廣泛存在于植物中提取擬南薺菜、大豆、水稻等植物基因組DNA，用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。在每一基因組DNA中均有擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明NTHK1廣泛存在于植物中(圖6)。
本發(fā)明中克隆的兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因NTHK1具有“二合一”兩組分信號(hào)系統(tǒng)的特征與已知此類基因編碼的氨基酸序列相似性為30-50％，并且其受傷害(切割)、鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)及不受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的特性與已知的不同，因此，界定NTHK1為一個(gè)新的兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因。
權(quán)利要求
1．一種存在于植物中的兩組份信號(hào)系統(tǒng)蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)的表達(dá)受傷害(切割)、鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)，它在植物中為乙烯受體，但不受乙烯誘導(dǎo)。
2．按照權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，它來(lái)自煙草，擬南薺、大豆、茅草或水稻。
3．按照權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，它來(lái)自Nicotiana tabacum var.Xanthi煙草。
4．按照權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，它具有如下的氨基酸序列1 MLRTLALALL ISAFLVSLSA ADNGFPRCNC DDEGFWSIER ILECQRISDL51 FIAIAYFSIP IELLYFVSCS NFPFKWVLFQ FIAFIVLCGM THLLNFWTYY101 GQHPFQLMLA LTIFKVLTAL VSFATAITLI TLFPMLLKIK VREFMLKKKT151 WDLGREVGLI KQQKEAGWHV RMLTQEIRKS LDRHTILYTT LVELAKTLDL201 HNCAIWKPNE NKTEMNLIHE LKGRSFSSMY NLPIPTSDPD VREIKESDGV251 KLLDAYSPLA AASSGGSSEP GAVAAIRMPM LKVSNFKGGT PELVPECYAI301 LVLVLPGEQG RSWSNQEIEI VRVVADQVAV ALSHAAVLEE SQHMRETLEE351 QNRALQQAKQ DALRASQARN AFQMVMSHGL RRPMHSILGL LSLLQDDNMG401 IEQRLLVDAM AKTSSVVSTL INDVMDTSTK DNSRFPLEMR HFQLHSMIKE451 AACLAKCLCA HRGYNISIEV DKSLPNYVMG DERRVFQVIL HMVGNLLKDP501 NGGCLTFRVL PESARREGID GAWKTRRSHS SLENVYIRFE VGSSNNHSQP551 EGITSTLPHC CETRRSREVE ERLSFSVCRK LVQLMQGDIW VVPNPEGFDQ601 SMTVILGFQL RPSIAVGIPE YGESSDHSHP HSLLQGVNVL LADYDDVNRA651 VTRKLLEKLG CTVSAVSSGH DCLGALGPAV SSFQIVLLDL HLPDLDGFEV701 TMRIREFRSR NWPLIVGFAS ADEDVSGRCL QIGMNGIIRK PVLLPGIADE751 LQRVLLQASI IT
5．一種編碼權(quán)利要求1至4中所述的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
6．按照權(quán)利要求5所述的核苷酸序列，它具有如下的序列1 ATGTTAAGGA CATTAGCATT AGCTTTGTTA ATTTCGGCAT TCCTTGTTTC51CTTATCCGCT GCTGATAATG GTTTCCCTCG TTGTAACTGT GATGATGAAG101 GATTTTGGAG CATTGAGCGT ATCTTAGAGT GCCAAAGAAT CAGTGATTTA151 TTTATTGCGA TAGCCTATTT TTCCATCCCA ATTGAGCTCC TTTACTTCGT201 AAGCTGTTCC AACTTTCCAT TCAAATGGGT GCTCTTCCAA TTTATTGCAT251 TCATTGTTCT GTGTGGGATG ACTCATTTGC TCAATTTCTG GACTTACTAT301 GGCCAACACC CATTTCAGCT TATGCTTGCT CTAACCATTT TTAAAGTCCT351 CACTGCACTA GTATCCTTTG CCACTGCTAT AACCCTTATC ACCCTCTTTC401 CTATGCTGCT CAAAATCAAA GTGAGGGAGT TTATGCTGAA AAAGAAAACT451 TGGGATCTTG GTAGAGAAGT TGGATTAATA AAGCAGCAAA AGGAAGCTGG501 ATGGCATGTC CGGATGCTTA CACAGGAGAT TCGAAAGTCA CTTGATCGTC551 ATACAATACT ATACACTACT CTGGTGGAGT TAGCAAAGAC ACTGGATTTG601 CATAATTGTG CTATTTGGAA GCCCAATGAG AATAAAACTG AGATGAACCT651 AATTCATGAG CTGAAAGGAA GAAGCTTTTC TAGTATGTAT AATTTACCTA701 TCCCGACAAG TGATCCAGAT GTAAGGGAGA TTAAGGAGAG TGATGGAGTA751 AAGTTACTTG ATGCCTACTC CCCACTTGCT GCTGCGAGTA GTGGAGGGAG801 TAGTGAACCA GGAGCTGTGG CTGCAATTAG GATGCCAATG CTGAAGGTGT851 CGAACTTCAA AGGTGGAACT CCTGAACTTG TCCCAGAATG TTATGCCATA901 CTGGTGTTGG TTCTTCCTGG TGAACAAGGT AGATCTTGGA GCAACCAGGA951 AATTGAGATA GTCAGGGTAG TGGCTGATCA GGTTGCTGTG GCTCTGTCCC1001 ATGCTGCAGT TCTTGAAGAG TCTCAGCATA TGAGAGAAAC ATTGGAGGAG1051 CAAAATCGAG CTCTGCAACA AGCGAAGCAG GATGCACTTA GGGCGAGTCA1101 AGCTAGGAAT GCATTTCAGA TGGTTATGAG CCATGGGTTG AGAAGACCCA1151 TGCACTCAAT TTTGGGTCTT CTCTCCTTGT TGCAAGATGA TAACATGGGT1201 ATTGAGCAGC GGCTTCTTGT AGATGCAATG GCTAAAACCA GCAGTGTTGT1251 ATCAACCCTA ATAAATGATG TGATGGATAC TTCGACAAAG GACAATAGTA1301 GATTTCCTTT GGAGATGAGG CATTTTCAGC TACATTCCAT GATAAAAGAA1351 GCTGCTTGTC TTGCCAAGTG TTTGTGTGCT CATAGGGGTT ACAATATTTC1401 CATCGAGGTT GACAAATCTT TGCCAAATTA TGTCATGGGT GATGAAAGAA1451 GAGTTTTTCA AGTTATTCTT CATATGGTTG GGAATCTTTT GAAGGACCCC1501 AATGGAGGTT GTCTTACATT TAGAGTTCTC CCAGAAAGTG CAAGAAGGGA1551 AGGCATCGAC GGAGCTTGGA AGACAAGGAG ATCACACTCA TCTCTTGAAA1601 ATGTCTATAT CAGGTTTGAA GTTGGGTCAA GCAATAATCA TTCTCAGCCA1651 GAGGGCATAA CATCCACATT GCCACATTGT TGTGAAACAC GCCGCAGTAG1701 GGAAGTGGAG GAAAGGTTGA GCTTTTCTGT GTGCAGAAAG CTGGTTCAGT1751 TGATGCAAGG AGACATCTGG GTAGTCCCAA ATCCAGAAGG TTTTGATCAA1801 AGCATGACTG TCATTCTTGG GTTTCAACTG CGGCCATCAA TTGCCGTAGG1851 CATTCCTGAA TATGGAGAAT CTTCTGATCA CTCGCATCCA CACTCACTCC1901 TCCAGGGGGT TAATGTTCTC TTAGCAGATT ATGATGATGT GAATAGAGCT1951 GTAACAAGGA AGCTACTTGA AAAATTAGGA TGCACTGTTT CTGCAGTTTC2001 ATCGGGACAC GACTGTCTTG GTGCTCTTGG TCCTGCTGTA TCTTCATTCC2051 AAATTGTCCT TTTGGATCTT CACCTGCCTG ATTTAGACGG CTTCGAAGTA2101 ACCATGAGAA TTCGGGAGTT TCGTAGCCGC AACTGGCCAT TGATCGTTGG2151 TTTTGCATCC GCTGATGAAG ATGTTAGTGG AAGATGCCTG CAGATTGGAA2201 TGAATGGAAT TATTCGTAAG CCGGTGCTAC TGCCTGGAAT TGCTGATGAG2251 CTTCAAAGGG TCCTTCTACA GGCAAGCATA ATCACGTGA
7．一種培育作物改良品種的方法，包括將權(quán)利要求5所述的核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并使其表達(dá)的步驟。
8．一種培育作物改良品種的方法，包括將權(quán)利要求6所述的核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并使其表達(dá)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種存在于植物中的兩組分信號(hào)系統(tǒng)基因NTHK1以及所編碼的蛋白質(zhì)。該基因在植物中受傷害(切割)、鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)的特點(diǎn),它在植物中為乙烯受體,但不受乙烯誘導(dǎo)。本發(fā)明還公開(kāi)了一種利用這種基因進(jìn)行作物品種改良的方法。
文檔編號(hào)A01H1/06GK1288951SQ9911909
公開(kāi)日2001年3月28日 申請(qǐng)日期1999年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月16日
發(fā)明者張勁松, 陳受宜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所