專利名稱：通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來修飾海藻糖－6－磷酸水平從而調(diào)節(jié)代謝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
糖酵解是文獻(xiàn)生化細(xì)節(jié)中最早描述的代謝過程之一。雖然生物中大致的碳水化合物流動是已知的并且所有糖酵解途徑的酶已經(jīng)闡明，但是通過刺激糖酵解來決定代謝誘導(dǎo)的信號還不清楚。已經(jīng)提出了多個假說，特別是基于酵母中情況的假說，但是沒有一個得到毫無疑問地證實。
對碳水化合物分配方向的影響不僅直接影響細(xì)胞糖酵解和碳水化合物貯存的過程，而且也可以用于影響次級或衍生過程如細(xì)胞分裂、生物量產(chǎn)生和貯存化合物的積累，由此決定生長和產(chǎn)量。
尤其在植物中，組織特性通常直接受碳水化合物存在的影響，并且控制碳水化合物的分配可帶來實質(zhì)不同。
植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量依賴于該植物在光合作用過程中可從CO2固定得到的能量。
光合作用主要發(fā)生于葉片并且以更低的程度發(fā)生于莖中，而其它植物器官如根、種子或塊莖基本上對光同化過程不起作用。這些組織的生長和營養(yǎng)完全依賴于光合作用活性器官。那么這就意味著存在源自光合作用的產(chǎn)物(總稱為“光合產(chǎn)物”)向植物無光合作用活性部分的流動。
將光合作用活性部分命名為“源”并且將其定義為光合產(chǎn)物的凈輸出者。將光合作用無活性的部分命名為“庫” 并且將其定義為光合產(chǎn)物的凈輸入者。
一般認(rèn)為植物中光合作用的效率以及碳水化合物的分配均是至關(guān)重要的。新的正在發(fā)育的組織如新葉片或其它部分如根和種子完全依賴于源中的光合作用。影響碳水化合物分配的可能性將對植物表型如其重量、節(jié)間距、葉片的大小和形狀以及根系的大小和結(jié)構(gòu)有重要影響。
此外，光同化作用產(chǎn)物的分布對植物生物量和產(chǎn)物的產(chǎn)量極為重要。一個實例是上個世紀(jì)對小麥的開發(fā)。其光合能力沒有顯著改變但小麥谷物的產(chǎn)量大大增加，即收獲指數(shù)(可收獲生物量/總生物量)增加。根本原因是通過常規(guī)育種改變了庫-到-源的比例，使得可收獲的庫即種子部分增加。然而，調(diào)節(jié)同化作用產(chǎn)物分布以及隨后庫與源形成的機(jī)制仍不清楚。據(jù)認(rèn)為此機(jī)制在碳水化合物代謝途徑及其調(diào)節(jié)的某些環(huán)節(jié)起作用。在最近的研究中，越來越明確己糖激酶在代謝物信號形成和代謝流控制中起主要作用。已經(jīng)提出調(diào)節(jié)己糖激酶活性的眾多機(jī)制(Gram等，(1994)，植物細(xì)胞6761；Jang & Sheen(1994)，植物細(xì)胞61665；Rose等，歐洲生化雜志199，511-518，1991；Blazquez等，(1993)，F(xiàn)EBS329，51；Koch，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(1996)47，509；Jang等，(1997)，植物細(xì)胞9，5)。已提出的酵母中己糖激酶調(diào)節(jié)的這些理論之一提到海藻糖及其相關(guān)單糖(Thevelein & Hohmann(1995)，TIBS 20，3)。然而，難以看到這將是普遍的機(jī)制，因為據(jù)信海藻糖合成只限于某些物種。WO 97/42326表明同時在海藻糖合成途徑中的磷酸海藻糖合酶和磷酸海藻糖磷酸酶在轉(zhuǎn)化入植物時可誘導(dǎo)代謝變化。在該申請中顯示，細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸水平被認(rèn)為是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。
仍然存在了解其它機(jī)制的需要，這些機(jī)制可影響海藻糖-6-磷酸并且因此可指導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞、組織和器官的發(fā)育和/或組成的變化。發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過抑制內(nèi)源海藻糖水平來修飾體內(nèi)細(xì)胞、組織或器官的發(fā)育和/或組成的方法。這些方法部分是通過抑制內(nèi)源海藻糖水平來抑制細(xì)胞糖酵解方向中碳流的方法、通過抑制內(nèi)源海藻糖水平刺激光合作用的方法、通過抑制內(nèi)源海藻糖水平刺激庫相關(guān)活性的方法、通過抑制內(nèi)源海藻糖水平來抑制細(xì)胞或組織生長的方法、通過抑制內(nèi)源海藻糖水平而防止冷凍甜化的方法、通過抑制內(nèi)源海藻糖水平來抑制收獲后甜菜中轉(zhuǎn)化酶的方法、通過抑制內(nèi)源海藻糖水平誘導(dǎo)抽苔的方法和通過抑制內(nèi)源海藻糖水平增加植物產(chǎn)量的方法?？梢栽O(shè)想對內(nèi)源海藻糖水平的抑制效應(yīng)是由細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸水平的增加引起。因此，本發(fā)明也提供通過抑制內(nèi)源海藻糖水平來增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸有效來源的方法。
對內(nèi)源海藻糖水平的抑制是在海藻糖酶抑制劑存在的情況下培養(yǎng)或生長所述細(xì)胞、組織、器官或植物的結(jié)果。該抑制劑可以是以適于所述細(xì)胞、組織、器官或植株吸收的形式的有效霉素A，優(yōu)選地其中水溶液中有效霉素A濃度為100nM到10mM，更優(yōu)選地0.1到1mM。另一選擇是使用以適于所述細(xì)胞、組織、器官或植株吸收的形式的86kD美洲大蠊(periplaneta americana)蛋白作為內(nèi)源海藻糖水平的抑制劑。
提供帶有海藻糖抑制劑遺傳信息的細(xì)胞、組織、器官或植株也是本發(fā)明的一部分。這可通過用編碼美洲大蠊(periplaneta americana)86kD蛋白的基因轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)。選擇性地，用能表達(dá)與編碼內(nèi)源海藻糖酶的基因所產(chǎn)生的RNA至少部分互補(bǔ)的RNA的DNA序列轉(zhuǎn)化或者用編碼海藻糖酶的DNA序列轉(zhuǎn)化，該序列與編碼內(nèi)源海藻糖酶的DNA序列一致。
具體地，編碼內(nèi)源海藻糖酶的DNA序列選自包括編碼SEQ ID NO4蛋白的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO6蛋白的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO8蛋白的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO10蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列組，更具體地，編碼內(nèi)源海藻糖酶的DNA序列選自包括SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO5中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO7中所示的核苷酸序列和SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列的核苷酸序列組。定義- 己糖激酶活性是存在于催化己糖轉(zhuǎn)化為己糖-6-磷酸的反應(yīng)的細(xì)胞中的酶活性。己糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖或任何其它C6糖。已認(rèn)識到存在多種同功酶，它們都可能在所述生化反應(yīng)中起部分作用。由于催化此反應(yīng)，己糖激酶成為己糖(葡萄糖)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵酶。
- 己糖信號是細(xì)胞感受己糖(葡萄糖)有效來源的調(diào)節(jié)機(jī)制。
- 糖酵解是將葡萄糖轉(zhuǎn)化成丙酮酸并同時產(chǎn)生ATP的反應(yīng)系列。
- 源物質(zhì)的貯存為一個這樣的過程，其中原始產(chǎn)物葡萄糖代謝成適于在細(xì)胞或特定組織中貯存的分子形式。這些形式可以為歧化形式(divers)。在植物界中貯存最可能以碳水化合物和多聚碳水化合物形式發(fā)生如淀粉、果聚糖和纖維素，或者作為更簡單的單糖或雙糖如果糖、蔗糖和麥芽糖；以油的形式如花生油或油酸油以及以蛋白形式如cruciferin、napin和油籽油菜種子中的貯存蛋白。在動物細(xì)胞中也形成多聚碳水化合物如糖元形成，并且將大量富含能量的碳化合物轉(zhuǎn)化為脂肪和脂類。
- 生物量為生物物質(zhì)的總量。附圖描述


圖1.帶有新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)作為選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒pVDH275的圖示，NPTII側(cè)翼為35S花椰菜花葉病毒啟動子(P35S)和終止子(T35S)；包含豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動子(pPCpea)和胭脂氨酸合酶終止子(Tnos)的表達(dá)元件盒；右端(RB)和左端(LB)T-DNA邊界序列和細(xì)菌卡拿霉素抗性(KanR)標(biāo)記基因。
圖2.在pMOG1027(35S as-海藻糖酶)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株塊莖中海藻糖的積累。
圖3.22株獨(dú)立野生型馬鈴薯(S.tuberosum)克隆的塊莖產(chǎn)量。
圖4.與野生型馬鈴薯株系相比，pMOG1027(35S as-海藻糖酶)和pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的塊莖產(chǎn)量。
圖5.與野生型馬鈴薯株系相比，pMOG1027(35S as-海藻糖酶)和pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的淀粉含量。所有所示株系的序列與圖4相同。
圖6.與野生型馬鈴薯株系相比，pMOG1028(35S as-海藻糖酶)和pMOG1028(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的產(chǎn)量。
圖7.與圖6中所示的野生型馬鈴薯株系相比，pMOG1092(PC as-海藻糖酶)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的產(chǎn)量。
圖8.與圖6中所示的野生型馬鈴薯株系相比，pMOG1130(PC as-海藻糖酶PC TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的產(chǎn)量。發(fā)明詳述現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來修飾體內(nèi)細(xì)胞、組織和器官的發(fā)育和/或組成從而誘導(dǎo)導(dǎo)致海藻糖形成的合成途徑中的變化是可能的。對內(nèi)源海藻糖酶水平的抑制優(yōu)選地通過使用產(chǎn)生與內(nèi)源海藻糖酶mRNA反義的mRNA的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞來實施。海藻糖酶的抑制導(dǎo)致糖酵解方向中碳流的抑制、光合作用的刺激作用、庫相關(guān)活性的刺激作用和能源貯存的增加。
本發(fā)明也提供了修飾植物中源-庫關(guān)系和能源分配的能力。植物的完整碳機(jī)制包括源組織中的同化物產(chǎn)量和源組織中的利用可以得到修飾，這可導(dǎo)致收獲產(chǎn)品生物量產(chǎn)率的增加。用這種方法，可以實現(xiàn)增加產(chǎn)量以及提高收獲指數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的可能。源組織中的這些改變可通過例如增加光合產(chǎn)物輸出而導(dǎo)致庫組織中的變化。相反，庫組織中的變化可導(dǎo)致源組織中的變化。
在生物細(xì)胞器、組織或其它部分中的特異性表達(dá)使上述的基本效應(yīng)針對特定局部應(yīng)用。此特異性表達(dá)可通過將海藻糖酶反義基因置于特異性啟動子控制下來實現(xiàn)。
通過使用特異性啟動子，建立時間差異也是可能的。為了此目的，可使用在植株部分器官發(fā)生的某一階段特異性有活性的啟動子。用這種方式，首先影響將要發(fā)育的器官的量并且然后使這些器官充滿貯存物質(zhì)如淀粉、油或蛋白是可能的。
選擇性地，可以使用可誘導(dǎo)的啟動子以選擇性啟閉本發(fā)明基因的表達(dá)。誘導(dǎo)可通過例如病原體、逆境、化學(xué)或光/黑暗刺激來實現(xiàn)。
本發(fā)明涉及代謝可通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平進(jìn)行體內(nèi)修飾這樣一發(fā)現(xiàn)。
這些修飾最可能通過改變T-6-P水平，繼而影響己糖激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能來建立。已經(jīng)證明經(jīng)過反應(yīng)形成葡萄糖-6-磷酸的己糖激酶的流量增加(即葡萄糖量的增加)抑制植物中的光合活性。此外，經(jīng)過己糖激酶的流量增加將不僅刺激糖酵解，而且刺激細(xì)胞分裂活性。碳代謝海藻糖-6-磷酸調(diào)節(jié)的理論在正常植物細(xì)胞中，碳水化合物的形成發(fā)生于光合作用過程中，其中固定CO2并還原成磷酸化己糖且以蔗糖為終產(chǎn)物。通常將此蔗糖從細(xì)胞運(yùn)出至其它細(xì)胞或組織，這些細(xì)胞或組織通過吸收此蔗糖可利用碳水化合物作為結(jié)構(gòu)物質(zhì)用于其代謝或能夠貯存碳水化合物如淀粉。在這方面，在植株中，能光合作用并且因此產(chǎn)生光合產(chǎn)物的細(xì)胞命名為源，而消耗或貯存碳水化合物的細(xì)胞稱為庫。
在動物和大多數(shù)微生物細(xì)胞中無光合作用發(fā)生，并且碳水化合物不得不通過從糖類直接吸收(例如酵母和其它微生物)或通過消化碳水化合物(動物)從外部來源獲取。在這些生物中碳水化合物運(yùn)輸通常以葡萄糖形式進(jìn)行，葡萄糖被主動運(yùn)送通過細(xì)胞膜。
進(jìn)入細(xì)胞后，代謝途徑中的一個起始步驟是己糖激酶催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。已經(jīng)證實，在植物中由己糖激酶(HXK)磷酸化的糖類控制參與光合作用的基因的表達(dá)(Jang & Sheen(1994)，植物細(xì)胞，6，1665)。因此，已經(jīng)提出HXK可能具有雙重作用并且并作用為碳水化合物介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵感受器和信號介質(zhì)。據(jù)信該調(diào)節(jié)一般向細(xì)胞發(fā)出有關(guān)起始產(chǎn)物即葡萄糖的有效來源信號。通過導(dǎo)入影響T-6-P水平的TPS和TPP觀察到類似效應(yīng)。此外，已經(jīng)證明體外T-6-P水平影響己糖激酶活性。通過增加T-6-P水平使細(xì)胞接受碳水化合物輸入不足的信號。相反，T-6-P水平的下降導(dǎo)致有足夠葡萄糖的信號，從而引起光合作用的負(fù)調(diào)節(jié)它發(fā)出信號即糖酵解的底物和隨后供應(yīng)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂過程的能量可以充足地得到。認(rèn)為該信號是由經(jīng)過己糖激酶的流量增加激發(fā)的(Van Oosten，1996年4月19日在RijksUniversiteit的公開報告)。
己糖激酶在植物中發(fā)信號可通過調(diào)節(jié)海藻糖-6-磷酸水平而加以調(diào)節(jié)的理論將意味著所有植物需要能產(chǎn)生和分解信號分子海藻糖-6-磷酸的酶系統(tǒng)存在。盡管海藻糖常見于多種真菌、細(xì)菌、酵母和藻類以及一些無脊椎動物，但是僅僅發(fā)現(xiàn)很有限范圍的維管植物能合成該糖(Elbein(1974)，碳水化合物化學(xué)與生物化學(xué)進(jìn)展30，227)。一個至今仍未理解的現(xiàn)象是盡管明顯缺乏海藻糖合成酶，但看來所有植物含有海藻糖酶，即能將海藻糖分解為2個葡萄糖分子的酶。
通過此處列出的使用海藻糖酶抑制劑如有效霉素A的實驗或用反義海藻糖酶轉(zhuǎn)化的實驗獲得了海藻糖代謝途徑存在的間接證據(jù)。
這些數(shù)據(jù)表明，與目前觀念相反，大多數(shù)植物的確含有編碼使它們能合成T-6-P的磷酸海藻糖合酶的基因。如通過表達(dá)TPS的植物中海藻糖的積累所證實的，植物也含有特異性或非特異性磷酸酶，能使T-6-P脫磷酸成為海藻糖。在所有植物中海藻糖酶的存在可能是為了實現(xiàn)海藻糖的更新。
在酵母中，葡萄糖誘導(dǎo)的信號的主要作用是將代謝從糖異生/呼吸模式轉(zhuǎn)變成發(fā)酵模式。多個信號通路參與此現(xiàn)象(Thevelein和Hohamann，(1995)TIBS 20，3)。除了己糖激酶信號的可能作用外，已證明葡萄糖活化RAS-環(huán)AMP(cAMP)通路。葡萄糖對RAS-cAMP通路的活化需要葡萄糖磷酸化，但無須進(jìn)一步的葡萄糖代謝。到目前為止，已證明此通路活化海藻糖酶和6-磷酸果糖-2-激酶(繼而刺激糖酵解)，而果糖-1，6-二磷酸酶受cAMP依賴性蛋白磷酸化的抑制(繼而抑制葡糖異生作用)。因此可以設(shè)想該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其可帶來的代謝效應(yīng)平行作用于已表明受海藻糖-6-磷酸水平影響的己糖激酶信號通路。
在植物中，通過表達(dá)TPP酶(或抑制TPS酶)降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸濃度而產(chǎn)生的“大量”信號將對所有細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)出信號以增加糖酵解碳流并且抑制光合作用。這方面內(nèi)容詳細(xì)顯示于WO 97/42326中，其中例如實驗2中描述表達(dá)TPP酶的轉(zhuǎn)基因煙草植物具有增加的葉片大小、增加的分枝和葉綠素含量的下降。然而，由于此“大量”信號在缺乏充足葡萄糖供應(yīng)時產(chǎn)生，故細(xì)胞中的碳水化合物庫迅速耗竭。
因此，假設(shè)人為的“大量”信號繼續(xù)維持，那么碳水化合物的減少將最終限制生長和細(xì)胞分裂，即細(xì)胞將用光其所有貯存的碳水化合物并將處于“饑餓”狀態(tài)。因此，形成具有較低量貯存碳水化合物的葉片。另一方面，表達(dá)帶有編碼增加T-6-P細(xì)胞內(nèi)含量的TPS的基因的構(gòu)建體的植物表現(xiàn)葉片大小減小，同時葉片也變?yōu)楦畹木G色，并且含有增加量的葉綠素。
如本發(fā)明中所述，表達(dá)as-海藻糖酶的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)類似現(xiàn)象如墨綠色葉片、增加的產(chǎn)量，正如表達(dá)TPS基因時所觀察到的情況。抑制內(nèi)源海藻糖酶水平將終止海藻糖的降解，并且由于海藻糖濃度的增加，TPP酶可能受到抑制，從而導(dǎo)致T-6-P水平的增加。這將解釋為何抑制海藻糖酶具有與TPS過量表達(dá)相似的效應(yīng)。而且看來as-海藻糖酶在雙構(gòu)建體中的表達(dá)增強(qiáng)了TPS表達(dá)所引起的效應(yīng)。已經(jīng)證明海藻糖酶活性存在于例如植物、昆蟲、動物、真菌和細(xì)菌中，但是海藻糖僅僅在有限數(shù)目的物種中積累。
到目前為止，盡管海藻糖酶存在于幾乎所有植物種類中，但是其在植物中的作用仍然是未知的。已提出它參與植物病原體相互作用和/或植物防御反應(yīng)。我們分離了馬鈴薯海藻糖酶基因并證明對馬鈴薯葉片和塊莖組織中海藻糖酶活性的抑制導(dǎo)致塊莖產(chǎn)量的增加。as-海藻糖酶在番茄中的果實特異性表達(dá)與TPS表達(dá)一起明顯改變果實發(fā)育。
海藻糖酶的抑制基本上可以用2種方式進(jìn)行通過外源施用海藻糖酶抑制劑和通過內(nèi)源產(chǎn)生海藻糖酶抑制劑，例如通過用編碼海藻糖酶抑制劑的DNA序列轉(zhuǎn)化植物。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方案，將海藻糖酶抑制劑外源施用給植物系統(tǒng)?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明所述的方法的海藻糖酶抑制劑實例有小單胞菌菌株SANK62390產(chǎn)生的trehazolin(Ando等，1991，抗生素雜志44，1165-1168)、Validoxylamine A，B，G、D-gluco-DihydrovalidoxylamineA、L-ido-Dihydrovalidoxylamin A、Deoxynojirimycin(Kameda等，1987，抗生素雜志40(4)，563-565)、5epi-trehazolin(Trehalostatin)(Kobayashi Y.等，1994，抗生素雜志47.932-938)、栗籽豆素(castanospermin)(Salleh H.M.& Honek J.F.1990年3月，F(xiàn)EBS 262(2)，359-362)和來自美洲大蠊(Periplaneta americana)的86kD蛋白(Hayakawa等，1989，生物化學(xué)雜志264(27)，16165-16169)。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的海藻糖酶抑制劑是有效霉素A(1，5，6-三脫氧-3-o-β-吡喃葡糖基-5-(羥甲基)-1-[[4，5，6-三羥基-3-(羥薄荷基)-2-環(huán)己烯-1-基]氨基]-D-手-肌醇)。用有效霉素A抑制愈傷組織勻漿物和各種被子植物懸浮培養(yǎng)物中海藻糖酶的活性由Kendall等，于1990年公開于植物化學(xué)29，2525-2582中。
將海藻糖酶抑制劑以適于植物、植物部分或植物細(xì)胞培養(yǎng)物吸收的形式施用給植物、植物部分或植物細(xì)胞培養(yǎng)物。一般地海藻糖酶抑制劑是以100nM到10mM之間、優(yōu)選地0.1到1mM之間活性成分的水溶液形式。水溶液可以通過噴灑于葉片、澆灌、將其加入水性培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中而施用給植物或植物部分。有效霉素的另一適當(dāng)制劑為solacol，一種商業(yè)上可得到的農(nóng)業(yè)制劑(Takeda化學(xué)工業(yè)公司，東京)。
選擇性地或者除了用外源施用海藻糖酶抑制劑外，海藻糖酶抑制劑可通過導(dǎo)入編碼此抑制劑的遺傳信息來提供。這種內(nèi)在海藻糖酶抑制劑的一種形式可以由引起RNA合成的遺傳構(gòu)建體組成，其中RNA與編碼海藻糖酶的內(nèi)源RNA充分互補(bǔ)從而與所述內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本相互作用，由此抑制所述轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。這種所謂的“反義方法”在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(特別參見EP 0 240 208A和公開于WO 95/01446中有關(guān)抑制SPS的實施例)。優(yōu)選的是使用同源反義基因，因為這些基因比異源基因更有效。阻斷不必要酶活性合成的另一可選方法是向植物宿主基因組導(dǎo)入存在于宿主植物中的內(nèi)源基因的另一拷貝。通常觀察到這一額外的基因拷貝使內(nèi)源基因沉默此效應(yīng)在文獻(xiàn)中稱為共抑制效應(yīng)或共抑制。增加底物有效來源的方法細(xì)節(jié)在WO 95/01446的實施例中提供，在此引用作為參考。
抑制內(nèi)源海藻糖酶水平的另一種方法是通過突變編碼海藻糖酶的內(nèi)源基因。有效的突變可通過定點(diǎn)誘變導(dǎo)入突變的基因序列來完成(例如在WO 91/02070中所述的)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，尤其是可將植物進(jìn)行遺傳改變從而在植物的特定部分產(chǎn)生和積累上述的反義基因。優(yōu)選的表達(dá)位點(diǎn)為植物的葉片和貯存部分。特別地，馬鈴薯塊莖認(rèn)為是適宜的植物部分。實現(xiàn)馬鈴薯小塊莖和塊莖中選擇性表達(dá)的優(yōu)選啟動子可從馬鈴薯patatin基因開放閱讀框的上游區(qū)域得到。
用于特異性表達(dá)的另一種適宜啟動子是對植物光同化作用部分特異的質(zhì)體藍(lán)素啟動子。此外，可以認(rèn)為植物部分中的特異性表達(dá)可產(chǎn)生對植物生長和繁殖或?qū)λ鲋参锏慕?jīng)濟(jì)使用有利的效應(yīng)。用于此方面的啟動子實例有果實特異性E8-啟動子(EP 0 409 629)和2A11啟動子(vanHaaren和Houck(1993)，植物分子生物學(xué)，221，625)；種子特異性cruciferin啟動子、napin啟動子和ACP啟動子；PAL啟動子；花特異性查爾酮異構(gòu)酶啟動子；葉片特異性SSU啟動子和鐵氧還蛋白啟動子；根特異性TobRb7啟動子，韌皮部特異性RolC啟動子以及分生組織特異性的HMG2啟動子(Enjuto等，(1995)，植物細(xì)胞7，517)和水稻PCNA啟動子(Kosugi等，(1995)，植物雜志7，877)。
本發(fā)明的另一選擇是使用可誘導(dǎo)的啟動子。已知有可以由病原體、逆境、化學(xué)或光/暗刺激誘導(dǎo)的啟動子?？梢韵胂鬄榱苏T導(dǎo)特定的現(xiàn)象如抽芽、抽苔、種子結(jié)實、貯存組織的充實，通過外部刺激誘導(dǎo)本發(fā)明基因活性是有利的。這使植物正常發(fā)育和所需現(xiàn)象可誘導(dǎo)性的優(yōu)勢控制成為可能。適用于這種方案的啟動子有描述于DE 4446342(真菌和生長素可誘導(dǎo)的PRP-1)、WO 96/28561(真菌可誘導(dǎo)的PRP-1)、EP 0 586 612(線蟲可誘導(dǎo)的)、EP 0 712 273(線蟲可誘導(dǎo)的)、WO 96/34949(真菌可誘導(dǎo)的)、PCT/EP96/02437(線蟲可誘導(dǎo)的)、EP 0 330 479(逆境可誘導(dǎo)的)、US 5,510,474(逆境可誘導(dǎo)的)、WO 96/12814(冷凍可誘導(dǎo)的)、EP 0 494 724(四環(huán)素可誘導(dǎo)的)、EP 0 619 844(乙烯可誘導(dǎo)的)、EP 0 337 532(水楊酸可誘導(dǎo)的)、WO 95/24491(硫胺素可誘導(dǎo)的)和WO 92/19724(光可誘導(dǎo)的)的病原體可誘導(dǎo)的啟動子。其它化學(xué)可誘導(dǎo)的啟動子描述于EP 0674 608、EP 637 339、EP 455 667和US 5,364,780中。
宿主細(xì)胞可以是任何己糖激酶信號的改變可以通過T-6-P水平的改變來實現(xiàn)的細(xì)胞。因此，所有真核細(xì)胞可用于本發(fā)明。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，最適于代謝化合物合成的細(xì)胞最適于本發(fā)明。這些生物有植物、動物、酵母、真菌。然而，也見到在特定動物細(xì)胞(如胰臟β細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)中的表達(dá)。
種子植物中優(yōu)選的植物宿主是被子植物，尤其是特別包括茄科作為代表性科的雙子葉植物和特別包括禾本科作為代表性科的單子葉植物。在本發(fā)明上下文中定義的適宜宿主植物包括含有通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平而改變的T-6-P水平的植物(以及所述植物的部分和細(xì)胞)及其子代。根據(jù)本發(fā)明的作物包括有花作物如花椰菜(Brassica oleracea)、洋薊(Cynara scolymus)，插花如康乃馨(dianthus caryophyllus)、玫瑰(Rosa spp)、菊花、矮牽?；?、六出花、幅郎花、唐菖蒲、百合(Lilium spp)、忽布花(humulus lupulus)、花莖甘藍(lán)，盆載植物如杜鵑花、白杜鵑(Azalia)、大麗花、秋海棠、倒掛金鐘、牻牛兒苗等；水果類如蘋果(Malus，例如domesticus)、香蕉(Musa，例如Acuminata)、美洲李(Prunusameriaca)、橄欖(Oliva sativa)、菠蘿(Ananas comosus)、椰子(Cocosnucifera)、芒果(Mangifera indica)、獼猴桃、油梨(Persea americana)、漿果(如currant、茶藨子屬，例如紅核)、李屬植物(如甜李、櫻桃屬，例如avium)、黃瓜屬植物(Cucumis，例如sativus)、葡萄屬(Vitis，例如釀酒葡萄)、檸檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、芥屬(Sinapisalba和Brassica nigra)、堅果(如胡桃Juglans，例如regia；花生Arachishypogeae)、柑橘(Citrus，例如maxima)、桃(Prunus，例如persica)、梨(Pyra，例如Communis)、胡椒(Solanum，例如capsicum)、李(Prunus，例如domestica)、草莓(Fragaria，例如moschata)、番茄(Lycopersicon，例如esculentum)；葉子植物如紫苜蓿(Medicago sativa)、卷心菜(如Brassica oleracea)，菊苣(Cichoreum，例如endivia)、韭菜(Alliumporrum)、萵苣(Lactuca sativa)、菠菜(Spinacia oleraceae)、煙草(Nicotiana tabacum)；草本植物如羊茅、早熟禾、黑麥草(如Lolium perene，Lolium multiflorum和Arrenatherum spp.)、舒適草(amenity grass)、草皮、海藻、菊苣(Cichorium intybus)、茶(Thea sinensis)、旱芹、縐葉歐芹(Petroselinum crispum)、chevil和其它草本植物，根類植物如竹芋(Maranta arundinacea)、甜菜(Beta vulgaris)、胡蘿卜(Daucuscarota)、木薯(Manihot esculenta)、人參(Panax ginseng)、蕪菁(Brassica rapa)、蘿卜(Raphanus sativus)、薯蕷(Dioscoreaesculenta)、番薯(Ipomoea batatas)、芋；種子植物如菜豆(Phaseolusvulgaris)、豌豆(Pisum sativum)、大豆(Glycin max)、小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、矮菜豆和蠶豆(Vicia faba)、棉花(Gossypium spp.)、咖啡(Coffea arabica和C.canephora)；塊莖植物如甘藍(lán)(Brassicaoleraceae)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)；鱗莖植物如洋蔥(Alliumcepa)、亞實基隆蔥、郁金香(Tulipa spp.)、黃水仙(Narcissus spp.)、大蒜(Allium sativum)；莖桿植物如栓皮櫟、甘蔗(Saccharum spp.)、西沙爾麻(Sisal spp.)、亞麻(Linum vulgare)、黃麻；喬木如橡膠樹、櫟樹(Quercus spp.)、山毛櫸(Betula spp.)、赤楊(Alnus spp.)、水曲柳(Acer spp.)、榆樹(Ulmus spp.)、棕櫚樹、蕨類植物、長春藤等。
酵母和真菌或動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可用常規(guī)已知的載體系統(tǒng)如pBluescript、pUC以及病毒載體系統(tǒng)如RSV和SV40通過常規(guī)現(xiàn)有轉(zhuǎn)化技術(shù)來完成。
只要基因在所述植物細(xì)胞中表達(dá)，將基因?qū)胧荏w植物細(xì)胞的方法并非關(guān)鍵。
盡管本發(fā)明的有些實施方案目前是不可實施的，例如因為有些植物種類仍然難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，但是在這些植物種類中實施本發(fā)明僅僅是時間問題而不是原則問題，因為遺傳轉(zhuǎn)化的可行性對于構(gòu)成本發(fā)明實施方案的基礎(chǔ)并無關(guān)系。
對眾多植物種類包括雙子葉以及單子葉植物，植物種類的轉(zhuǎn)化目前是常規(guī)的。原則上，任何轉(zhuǎn)化方法可用于將根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA導(dǎo)入適當(dāng)祖細(xì)胞中。這些方法可適當(dāng)選自對原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens等(1982)，自然296，72；Negrutiu等(1987)，植物分子生物學(xué)8，363，原生質(zhì)體電穿孔(Shillito等(1985)生物/技術(shù)3，1099)，顯微注射入植物材料(Crossway等(1986)，分子和普通遺傳學(xué)202)，對各種植物材料進(jìn)行的(DNA或RNA包被的)粒子轟擊(Klein等，(1987)，自然327，70)，用(非整合型)病毒侵染，通過浸潤成熟植物在植物中進(jìn)行根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移或者轉(zhuǎn)化成熟花粉或小孢子(EP 0 301 316)等。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選方法包括土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。尤其優(yōu)選的是用EP A 120 516和美國專利4,940,838中公開的所謂雙元載體技術(shù)。
雖然單子葉植物被認(rèn)為有些更難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，但是它可以轉(zhuǎn)化并且可以從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或胚胎或其它植物材料再生出可育的轉(zhuǎn)基因植物。目前，優(yōu)選的單子葉植物轉(zhuǎn)化方法是微粒轟擊胚、外植體或懸浮細(xì)胞和直接DNA吸收或(組織電穿孔)(Shimamoto等(1989)，自然338，274-276)。通過微粒轟擊將編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(使除草劑膦絲菌素失活的酶)的吸水鏈霉菌bar基因?qū)胗衩讘腋∨囵B(yǎng)物的胚發(fā)生細(xì)胞可獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株(Gordon-kam(1990)，植物細(xì)胞，2，603)。已有報道將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入其它單子葉作物如小麥和大麥的糊粉原生質(zhì)體中(Lee(1989)，植物分子生物學(xué)13，21)。通過選擇胚發(fā)生愈傷組織建立胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，小麥植株已從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物得到再生(Vasil(1990)生物/技術(shù)8，429)。與這些植物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)結(jié)合使本發(fā)明能應(yīng)用于單子葉植物。
單子葉植物包括商業(yè)上重要的作物如水稻和玉米也可通過土壤桿菌菌株進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移(見WO 94/00977；EP 0 159 418 B1；Gould等(1991)植物生理學(xué)95，426-434)。
已知實際上所有植物可以從培養(yǎng)的細(xì)胞或組織再生。這意味著再生在植物物種與物種間不同，但是一般首先提供轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸浮液或含有轉(zhuǎn)化外植體的培養(yǎng)平板。芽可以直接誘導(dǎo)或者間接通過器官發(fā)生或胚發(fā)生從愈傷組織誘導(dǎo)并且隨后生根。除了選擇性標(biāo)記，培養(yǎng)基將一般含有各種氨基酸和激素如生長激素和細(xì)胞分裂素。將谷氨酸和脯氨酸加入培養(yǎng)基尤其對諸如玉米和紫苜蓿的物種有利。有效的再生將依賴于培養(yǎng)基、基因型和載培史。如果這3個變量得到控制，再生一般是能繁殖和可重復(fù)的。轉(zhuǎn)化基因序列穩(wěn)定摻入轉(zhuǎn)基因植物后，通過有性雜交可將由這些基因賦予的特征轉(zhuǎn)移給其它植株。依據(jù)待雜交的物種，可以使用眾多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任何技術(shù)。
控制植物可表達(dá)基因(包括標(biāo)記基因)表達(dá)的DNA序列如轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、增強(qiáng)子、非轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列等可以來自任何在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因。同時值得注意的是結(jié)合不同啟動子功能部分的雜交啟動子或其合成相等物。除了組成性啟動子外，可誘導(dǎo)啟動子或以其表達(dá)方式如發(fā)育或細(xì)胞特異性受到其它調(diào)節(jié)的啟動子可以用于控制根據(jù)本發(fā)明所述的可表達(dá)基因的表達(dá)。
為了選擇或篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，優(yōu)選的是包含與待轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞的根據(jù)本發(fā)明所述的植物可表達(dá)基因連接的標(biāo)記基因。在植物轉(zhuǎn)化中適當(dāng)標(biāo)記基因的挑選在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。一些常用標(biāo)記基因的實例有賦予對卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(EP-B 131623)、賦予對從谷胱甘肽衍生的除草劑抗性的來自大鼠肝臟的胱光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(EP-A 256 223)、賦予對谷氨酰胺合成酶抑制劑如膦絲菌素過量表達(dá)抗性的谷氨酰胺合成酶基因、賦予對選擇試劑膦絲菌素抗性的綠色產(chǎn)色鏈霉菌乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(EP-A 275 957)、賦予對N-膦酰甲基甘氨酸耐受性的編碼5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因、賦予對Bialaphos抗性的bar基因(例如WO 91/02071)、賦予對cyanamide抗性的cah基因等。只要其與所選植物結(jié)合是有功能的(即有選擇性)，則標(biāo)記的實際挑選并非關(guān)鍵。
標(biāo)記基因和目的基因不一定必須互相連接，因為共轉(zhuǎn)化未連接的基因(美國專利4,399,216)也是植物轉(zhuǎn)化的有效方法。
用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選植物材料，尤其對于雙子葉作物，是容易轉(zhuǎn)化并且具有良好再生能力的葉盤(Horsch等(1985)，科學(xué)227，1229)。
可以設(shè)想在動物或人類中通過抑制受影響細(xì)胞的內(nèi)源海藻糖酶水平可以克服由代謝缺陷造成的疾病。在人類細(xì)胞中，許多腫瘤細(xì)胞增加的葡萄糖消耗很大程度上依賴于己糖激酶的過量表達(dá)(Rempel等(1996)FEBS通訊385，233)?？梢栽O(shè)想葡萄糖進(jìn)入癌細(xì)胞代謝的流量可能受海藻糖-6-磷酸合成酶表達(dá)和抑制內(nèi)源海藻糖酶的影響。同時已證明己糖激酶活化通過cAMP/PKA(蛋白激酶A通路)增強(qiáng)。因此，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失活可能影響葡萄糖的吸收和腫瘤的增殖。已例如在兔腎皮質(zhì)細(xì)胞中證實哺乳動物細(xì)胞中存在能合成海藻糖-6-磷酸和海藻糖以及降解海藻糖的酶活性(Sacktor(1968)美國國家科學(xué)院院報60，1007)。
正如上面已經(jīng)認(rèn)識到的，例如通過導(dǎo)入反義海藻糖酶構(gòu)建體而抑制內(nèi)源海藻糖酶水平也將刺激與導(dǎo)入TPS類似的效應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些效應(yīng)是T-6-P含量的增加，這導(dǎo)致矮化或生長延緩(尤其在TPS高表達(dá)時)、更尖形狀葉片的形成、由于葉綠素增加所致的更深顏色和淀粉含量的增加。此外，使用TPS和as-海藻糖酶的雙構(gòu)建體增強(qiáng)單一構(gòu)建體的效應(yīng)。
T-6-P水平的增加也導(dǎo)致貯存碳水化合物如淀粉和蔗糖的增加。那么這將意味著其中貯存碳水化合物的組織將能夠貯存更多的物質(zhì)。這可通過實施例加以說明，這些實施例表明在植物中形成增加生物量的貯存器官如塊莖和甜菜中增粗的根(蔗糖貯存)。
這些效應(yīng)對其非常有利的作物有馬鈴薯、甜菜、胡蘿卜、菊苣和甘蔗。
在馬鈴薯中其它經(jīng)濟(jì)上重要的效應(yīng)是用編碼TPS基因(產(chǎn)生T-6-P的增加)的DNA序列轉(zhuǎn)化后，已發(fā)現(xiàn)可溶性糖含量下降，即使在低溫條件(4℃)下收獲和貯存塊莖之后也是這樣。雖然一般來說較低溫的貯存對于防止早發(fā)芽是必要的，但是這將導(dǎo)致馬鈴薯過度甜化。還原性糖含量的減少對食品工業(yè)至關(guān)重要，因為甜化的馬鈴薯塊莖材料不適于加工，這是因為還原性糖與氨基酸之間將要發(fā)生Maillard反應(yīng)而導(dǎo)致變褐。
以相同方式，通過用編碼TPS酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化甜菜也可得到對轉(zhuǎn)化酶的抑制。收獲后抑制甜菜中的轉(zhuǎn)化酶活性在經(jīng)濟(jì)上是很重要的。
在果實和種子方面，也可以改變貯存。這不僅導(dǎo)致了增加的貯存能力，而且導(dǎo)致貯存化合物組成的變化。種子產(chǎn)量提高尤為重要的作物有玉米、水稻、谷物、豌豆、油籽油菜、向日葵、大豆和豆科植物。此外，改變貯存的碳水化合物的含量和組成對于所有結(jié)果實的植物是重要的。尤其對于果實來說，貯存產(chǎn)物的組成導(dǎo)致其硬度和堅固性的變化，這對于軟果實如番茄、香蕉、草莓、桃、漿果和葡萄尤為重要。
與所見的T-6-P水平下降的效應(yīng)相反，T-6-P水平的增加降低葉片中蛋白質(zhì)/碳水化合物的比例。此效應(yīng)對葉用作物如飼料草和紫苜蓿至關(guān)重要。此外，雖然葉片具有在舒適草中至關(guān)重要的減少的生物量，但是，更重要的是，它們具有相對增加的能量含量。該特性對于作物如洋蔥、歐洲韭和青貯飼料玉米特別有利。
此外，種子的存活也受細(xì)胞內(nèi)可利用的T-6-P水平的影響。
在植株的一部分較低水平的T-6-P結(jié)合該植株另一部分增加的T-6-P水平可協(xié)同增加上述的效應(yīng)。在發(fā)育過程中通過使用特異性啟動子依次表達(dá)引起所述增加或減少的基因也是可能的。最近，通過將編碼序列置于可誘導(dǎo)啟動子控制之下而誘導(dǎo)任意一個相關(guān)基因的表達(dá)也是可能的?？梢哉J(rèn)為所述應(yīng)用方法的組合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明通過下面實施例得到進(jìn)一步說明。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)這些實施例表示本發(fā)明的具體實施方案，但是應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明也涵蓋這些實施例的變化形式和其它植物或表達(dá)系統(tǒng)的使用。實驗DNA操作所有DNA操作(從大腸桿菌分離DNA、限制性酶切、連接、轉(zhuǎn)化等)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等(1989)分子克隆實驗手冊，第2版。冷泉港實驗室出版社，CSH，紐約)進(jìn)行。菌株在所有實施例中，將大腸桿菌K-12菌株DH5α用于克隆。用于植物轉(zhuǎn)化的根瘤土壤桿菌菌株為EHA 105和MOG 101(Hood等(1993)轉(zhuǎn)基因研究2，208)。土壤桿菌菌株MOG101的構(gòu)建壤桿菌菌株MOG101的構(gòu)建描述于WO 96/21030中。大腸桿菌otsA基因的克隆和pMOG799的構(gòu)建大腸桿菌中海藻糖磷酸合酶(TPS)由位于操縱子otsBA中的otsA基因編碼。otsA基因的克隆與序列測定詳細(xì)描述于WO95/01446的實施例I中，在此引用作為參考。為了實現(xiàn)其在植物細(xì)胞中的表達(dá)，按照在WO95/01446中的實施例I中所述的將此開放閱讀框與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件CaMV35S RNA啟動子、ALMV前導(dǎo)序列的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和nos-基因的轉(zhuǎn)錄終止子連接，得到pMOG799。帶有pMOG799的大腸桿菌菌株樣品已根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1993年8月23日星期一保藏于荷蘭真菌菌種保藏中心，Oosterstraat 1，P.O.Box 273，3740 AG Baarn國際保藏中心賦予的保藏號為CBS 430.93。patatin啟動子的分離/pMOG546的構(gòu)建用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從馬鈴薯(Solanum tuberosum)cv.Bintjie染色體DNA分離patatin啟動子片段。合成與λpat21 patatin基因(Bevan等(1986)核酸研究14，5564)上游區(qū)域序列互補(bǔ)的由下面序列組成的一套寡核苷酸5’AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3’PatB33.2(SEQIDNO1)5’GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC 3’PatATG.2(SEQIDNO2)用從馬鈴薯cv.Bintjie分離的染色體DNA作為模板，用這些引物擴(kuò)增1123bp的DNA片段。擴(kuò)增到的片段表現(xiàn)具有與λpat21 patatin序列的高度相似性并且用EcoRI接頭將其克隆入pUC18載體而得到質(zhì)粒pMOG546。PMOG845的構(gòu)建PMOG845的構(gòu)建描述于WO 96/21030中。PVDH318、質(zhì)體藍(lán)素-TPS的構(gòu)建將質(zhì)粒pMOG798(描述于WO95/01446)用HindIII消化并且與寡核苷酸雙鏈TCV11和TCV12(參見pMOG845的構(gòu)建)連接。將得到的載體用PstI和HindIII消化然后插入PotPiII終止子得到pTCV118。將質(zhì)粒pTCV118用SmaI和HindIII消化得到包含TPS編碼區(qū)和PotPiII終止子的DNA片段。加入BgIII接頭并且將得到的片段插入用BamHI消化的植物雙向表達(dá)載體pVDH275(
圖1)中，得到pVDH318。PVDH275為pMOG23的衍生物(Sijmons等(1990)，生物/技術(shù)8，217)，pMDG23帶有35S CaMV啟動子控制下的NPTII選擇性標(biāo)記和包含豌豆質(zhì)體藍(lán)素(PC)啟動子和nos終止子序列的表達(dá)元件盒。存在于pVDH275中的質(zhì)體藍(lán)素啟動子已經(jīng)由Pwee &Gray(1993)在植物雜志3，437中描述。此啟動子已經(jīng)用PCR擴(kuò)增和含有適當(dāng)克隆位點(diǎn)的引物轉(zhuǎn)移入雙元載體中。其它表達(dá)載體的構(gòu)建與上述載體的構(gòu)建類似，可以制備其中使用不同啟動子與TPS、TPP或海藻糖酶基因結(jié)合并且使用帶有NPTII基因或潮霉素抗性基因作為選擇性標(biāo)記基因的雙元載體的基因構(gòu)建體。帶有HPT選擇性標(biāo)記的雙元載體pMDG22的描述在Goddijn等(1993)植物雜志4，863中給出。三親交配在用含有質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌菌株HB101的三親交配(Ditta等，(1980)美國國家科學(xué)院院報77，7347)中，將雙元載體轉(zhuǎn)移入根瘤土壤桿菌菌株MOG101或EHA105中并用于轉(zhuǎn)化。煙草(Nicotiana tabacum cv.SR1或cv.Samsun NN)的轉(zhuǎn)化通過植物組織和含有所述目的雙元載體的根瘤土壤桿菌菌株MOG101的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化煙草。按照Horsch等(1985)科學(xué)227，1229中所述的用煙草葉片的共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因植株從在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上生長的芽再生、生根并將其轉(zhuǎn)移至土壤中。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化用含有目的雙元載體的土壤桿菌菌株EHA 105轉(zhuǎn)化馬鈴薯(Solanumtuberosum cv.Kardal)。基本培養(yǎng)基為MS30R3培養(yǎng)基，由MS鹽(Murashige和Skoog(1962)植物生理學(xué)14，473)、R3維生素(Ooms等(1987)應(yīng)用遺傳學(xué)理論，73，744)、30g/l蔗糖、0.5g/l MES組成，最終pH為5.8(用KOH調(diào)節(jié))，必要時用8g/l Daichin瓊脂固化。將Solanum tuberosumcv.Kardal的塊莖削皮并且通過在96％乙醇中燃燒5秒鐘對其表面消毒。用無菌水熄滅火焰并且將其切成約2mm厚的薄片。用鉆孔從維管組織切下圓片并且在含有1-5×108個細(xì)菌/ml帶有雙元載體的土壤桿菌EHA105的MS30R3培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。用MS30R3培養(yǎng)基沖洗塊莖片并且將其轉(zhuǎn)移到固化的培養(yǎng)后培養(yǎng)基(PM)上。PM由補(bǔ)加3.5mg/ml玉米素核苷和0.03mg/l吲哚乙酸(IAA)的M30R3培養(yǎng)基組成。2天后，將塊莖片轉(zhuǎn)移到含有200mg/l頭孢噻肟和100mg/l萬古霉素的新鮮PM培養(yǎng)基上。3天后，將塊莖片轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM)上，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基由含有250mg/l羧芐青霉素和100mg/l卡那霉素的PM培養(yǎng)基組成。4-8周后，切下從塊莖片長出的芽并置于生根培養(yǎng)基(含有100mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬古霉素和50mg/l卡那霉素的MS30R3培養(yǎng)基)上。通過分生扦插而純性繁殖幼苗。番茄(Lycopersicon esculentum)的轉(zhuǎn)化番茄轉(zhuǎn)化根據(jù)Van Roekel等(1993)植物細(xì)胞繁殖12，644中所述的進(jìn)行。小塊莖的誘導(dǎo)將帶有輔助分生組織的體外馬鈴薯植物莖段轉(zhuǎn)移到小塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。小塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1×MS鹽，補(bǔ)加R3維生素、0.5g/l MES(最終pH＝5.8，用KOH調(diào)節(jié))、60g/l蔗糖和2.5mg/l細(xì)胞分裂素并以8g/l的Daichin瓊脂固化。于24℃在黑暗中培養(yǎng)3-5周后，形成小塊莖。有效霉素A的分離已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有效霉素A為來自各種來源的海藻糖酶高度特異性抑制劑，(IC50)從10-6M變化到10-10M(Asano等(1987)抗生素雜志40，526；Kameda等，(1987)抗生素雜志40，563)。除了海藻糖酶以外，它不明顯抑制任何α-或β-糖基水解酶活性。按照Kendall等(1990)植物化學(xué)29，2525中所述的從商業(yè)農(nóng)業(yè)制劑Solacol(Takeda化學(xué)公司，東京)分離有效霉素A。該方法包括對3％的Solacol農(nóng)業(yè)制劑進(jìn)行離子交換層析(QAE-Sephadex A-25(Pharmacia)，柱床體積10ml，平衡緩沖液為pH70.2mM的Na-Pi)。將1ml Solacol上樣至層析柱上并且用水洗脫成7個組分，實際上所有的有效霉素A均回收在組分4中?；谟迷摲椒?00％的回收，將有效霉素A的濃度在MS-培養(yǎng)基中調(diào)至1.10-3M，用于海藻糖積累測試。選擇性地，按照Iwasa等(1971)抗生素雜志24，119中所述的，有效霉素A和B可以直接從吸水鏈霉菌var.limoneus純化，在此引入其內(nèi)容作為參考。碳水化合物分析通過陰離子交換層析用脈沖電化學(xué)檢測定量測定碳水化合物。通過用80％EtOH抽提勻漿的冷凍材料而制備提取物。提取后于室溫放置15分鐘，蒸發(fā)可溶性成分并且溶解于蒸餾水中。在裝有4×250mm Dionex35391 carbopac PA-1柱和4×50mm Dionex 40396 carbopac PA-1預(yù)柱的Dionex DX-300液相色譜中分析樣品(25μl)。用100mM NaOH以1ml/min洗脫然后以NaAc梯度洗脫。用脈沖電化學(xué)檢測器(Dionex，PED)測定糖。商業(yè)上可得到的碳水化合物(Sigma)用作標(biāo)準(zhǔn)。海藻糖-6-磷酸的測定將1cm直徑的葉片(3片)冷凍于液氮中并且用金屬棒在1.5ml MeOH(80％ v/v)中勻漿。將樣品于75℃加熱15分鐘并且于SpeedVac中干燥。用450μl水抽提沉淀并且在注射到HPLC上之前保存于冰上。以下面的梯度使用上述的Dionex系統(tǒng)T＝0’-20’用75mM NaOH平衡(整個操作過程維持恒定)，T＝20’為注射時間，T＝40’-50’0-10％ 1M NaAc的線性增加，T＝60’-100’10-50％ 1M NaAc的線性增加，T＝120’為操作結(jié)束。用糖標(biāo)準(zhǔn)液分別比較和計算滯留時間和鑒定到的峰濃度。淀粉分析按照在Aman等，(1994)碳水化合物化學(xué)方法，第X卷(BeMiller等編)，111-115頁中所述的進(jìn)行淀粉分析。表達(dá)分析用Northern印跡分析檢測導(dǎo)入不同植物種類中的基因表達(dá)。實施例1 抑制海藻糖酶活性導(dǎo)致海藻糖的積累制備帶有otsA基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，其中otsA基因由馬鈴薯塊莖特異性patatin啟動子(pMOG845)驅(qū)動。用帶有雙元載體pMOG845的根瘤土壤桿菌EHA105轉(zhuǎn)化馬鈴薯Solamum tuberosum cv.Kardal塊莖片。以與空載體對照相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化頻率獲得轉(zhuǎn)基因。所有得到的植物在表型上不能與野生型植株區(qū)分。在培養(yǎng)于補(bǔ)加10-3M有效霉素A的小塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因和野生型植株莖段上誘導(dǎo)小塊莖。作為對照，在不含有效霉素A的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)小塊莖。與不含有效霉素A的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的小塊莖比較，在含有有效霉素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的小塊莖表現(xiàn)增高的海藻糖水平(表1)，表明存在的海藻糖酶活性正在降解形成的海藻糖。野生型植株中少量海藻糖的存在表明有功能海藻糖合成途徑的存在。
表1.海藻糖(％鮮重)
實施例2 在as-海藻糖酶轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中海藻糖的積累通過用35S CaMV反義海藻糖酶構(gòu)建體(SEQ ID NO3和4；pMOG1027描述于WO 96/21030中)轉(zhuǎn)化野生型馬鈴薯植株而得到內(nèi)源海藻糖生物合成途徑存在的證據(jù)。pMOG1027轉(zhuǎn)基因馬鈴薯芽表現(xiàn)積累高達(dá)0.008％鮮重的海藻糖。通過用海藻糖酶特異性分解積累的海藻糖而證實觀察到的海藻糖峰值的特征。有些pMOG1027轉(zhuǎn)基因株系的塊莖表現(xiàn)積累少量的海藻糖(圖2)表2
實施例3 與分離的馬鈴薯海藻糖酶cDNA同源的EST克隆的鑒定編碼海藻糖酶的馬鈴薯cDNA克隆的分離描述于WO 96/21030中。馬鈴薯海藻糖酶序列與EST序列(表達(dá)序列標(biāo)簽)的比較表明在多種生物中存在高度同源性的基因(見表2)。實施例4 編碼海藻糖酶的煙草cDNA克隆的分離為了能夠研究煙草中海藻糖酶表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)，分離煙草海藻糖酶cDNA。用SMART PCR cDNA構(gòu)建試劑盒(Clontech)在入ZAP中構(gòu)建cDNA文庫。作為起始材料，使用1ug野生型煙草葉片的總RNA。鋪板共106p.f.u并且與馬鈴薯海藻糖酶cDNA雜交。鑒定到5個陽性克隆。在ABLE C/K中體內(nèi)切割這些克隆之一得到帶有約1.3kb插入片段的質(zhì)粒pMOG1261。核酸序列測定揭示具有與馬鈴薯海藻糖酶cDNA序列的高度同源性，證明了此煙草海藻糖酶cDNA(SEQ ID NO5和6，SEQ ID NO7和8)的性質(zhì)。實施例5 TPS和as-海藻糖酶轉(zhuǎn)基因番茄植株的表現(xiàn)用于番茄轉(zhuǎn)化實驗的構(gòu)建體PC-TPC，PC-TPS as-海藻糖酶，E8-TPS，E8 TPS E8 as-海藻糖酶。由質(zhì)體藍(lán)素啟動子和35S啟動子驅(qū)動的TPS基因轉(zhuǎn)基因植株沒有形成小而尖形的葉片，盡管有些嚴(yán)重矮化的植株的確形成小而深綠的葉片。與對照植株相比，PC-TPS和PC-as-海藻糖酶轉(zhuǎn)基因植株的確形成更小更深的綠葉。與在其它作物中對TPS和TPP觀察到的情況(WO 97/42326)類似，35S或PC驅(qū)動的TPS轉(zhuǎn)基因植株的顏色和葉緣不能明確區(qū)分。只有一些帶有在果實特異性E8啟動子控制下的TPS基因的植物產(chǎn)生黃色表皮和不完全成熟。這與大量E8 TPS E8 as-海藻糖酶轉(zhuǎn)基因植株相反，后者產(chǎn)生具有黃色表皮和不完全成熟的異常果實。實施例6 as-海藻糖酶和/或TPS轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的表現(xiàn)構(gòu)建體35S as-海藻糖酶(pMOG1027)和35S as-海藻糖酶PatTPS(pMOG1027(845-11/22/28))通過用帶有35S as-海藻糖酶構(gòu)建體和潮霉素抗性標(biāo)記基因的構(gòu)建體pMOG1027重新轉(zhuǎn)化pat-TPS株系(對卡那霉素有抗性)而產(chǎn)生同時表達(dá)35S as-海藻糖酶和pat-TPS的植株，得到基因型pMOG1027(845-11)、pMOG1027(845-22)和pMOG1027(845-28)。在體外誘導(dǎo)小塊莖并且測定小塊莖的鮮重。對于帶有pMOG1027(pMOG845-11/22/28)的轉(zhuǎn)基因株系，平均鮮重產(chǎn)量增加。從pMOG1027轉(zhuǎn)基因株系獲得的小塊莖鮮重生物量僅略高于野生型對照植物。將得到的植株培養(yǎng)于溫室中并且測定塊莖產(chǎn)量(圖4)。與對照株系相比，35S as-海藻糖酶轉(zhuǎn)基因株系或35S as-海藻糖酶與Pat TPS結(jié)合的轉(zhuǎn)基因株系明顯產(chǎn)生更多的塊莖量。淀粉測定顯示高產(chǎn)量植物株系產(chǎn)生的塊莖的淀粉含量沒有差異(圖5)。大量1027(845-11/22/28)株系從葉片腋芽產(chǎn)生高出土壤的塊莖，表明所用的構(gòu)建體對植株發(fā)育有復(fù)雜的影響。只有35S as-海藻糖酶的轉(zhuǎn)基因植物株系沒有形成高出土壤的塊莖。構(gòu)建體Pat as-海藻糖酶(pMOG1028)和Pat as-海藻糖酶PatTPS(pMOG1028(845-11/22/28))通過用帶有Pat as-海藻糖酶構(gòu)建體和潮霉素抗性標(biāo)記基因的構(gòu)建體pMOG1028重新轉(zhuǎn)化PAT-TPS株系(對卡那霉素有抗性)而產(chǎn)生同時表達(dá)Pat as-海藻糖酶和PAT-TPS的植株，得到基因型pMOG1028(845-11)、pMOG1028(845-22)和pMOG1028(845-28)。將植株培養(yǎng)于溫室中并且測定塊莖產(chǎn)量(圖6)。與對照株系相比，許多pMOG1028轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生明顯更多的塊莖量。Pat TPS和Pat as-海藻糖酶的單個轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)不同的塊莖產(chǎn)量從幾乎沒有產(chǎn)量到與對照株系相當(dāng)或更高的產(chǎn)量(圖6)。構(gòu)建體PC as-海藻糖酶(pMOG1092)將pMOG1092轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)于溫室中并且測定塊莖產(chǎn)量。與對照株系相比，幾個株系形成更深的綠色葉片。與未轉(zhuǎn)基因植株相比，塊莖產(chǎn)量顯著提高(圖7)。構(gòu)建體PC as-海藻糖酶PC-TPS(pMOG1130)將pMOG1130轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)于溫室中并且測定塊莖產(chǎn)量。幾個轉(zhuǎn)基因株系形成小而深綠色葉片并且嚴(yán)重阻礙生長，表明以TPS轉(zhuǎn)化植株時觀察到的表型效應(yīng)比同時表達(dá)as-海藻糖酶基因時更為嚴(yán)重。與對照植株相比，塊莖產(chǎn)量不同，從幾乎無產(chǎn)量到顯著更多的產(chǎn)量(圖8)。實施例7 馬鈴薯海藻糖酶cDNA在煙草(N.tabacum)中的過量表達(dá)構(gòu)建體de35S CaMV海藻糖酶(pMOG1078)pMOG1078轉(zhuǎn)基因的煙草初級轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)與野生型煙草不同的表型，有些轉(zhuǎn)基因植株具有深綠葉片顏色和更厚的葉片(葉片形態(tài)不是尖形)，表明海藻糖酶基因表達(dá)對植物代謝的影響。播種自交初級轉(zhuǎn)化子的種子并且在卡那霉素上選擇。表型在S1代中表現(xiàn)以孟德爾方式分離。有關(guān)pMOG###和pVDH###克隆的目錄1.雙元載體1pMOG23帶有NPTII選擇性標(biāo)記的雙元載體(約10kb)pMOG22pMOG23的衍生物，NPTII-基因由賦予對潮霉素抗性的HPT基因替換pVDH275 從pMOG23衍生的雙元載體，帶有質(zhì)體藍(lán)素啟動子-nos終止子表達(dá)元件盒。pMOG402 pMOG23的衍生物，已修復(fù)NPTII-基因中的點(diǎn)突變，多接頭中不存在KpnI限制性位點(diǎn)pMOG800 pMOG402的衍生物，在多接頭中具有恢復(fù)的KpnI位點(diǎn)2.TPS/TPP表達(dá)構(gòu)建體pMOG 799 35S-TPS-3’nos1pMOG 845 Pat-TPS-3’PotPiIIpMOG 1093質(zhì)體藍(lán)素-TPS-3’nospMOG 1140E8-TPS-3’nos3.海藻糖酶構(gòu)建體pMOG1028 Patatin as-海藻糖酶3’PotPiII，潮霉素抗性基因pMOG1078 de35S CaMV amv前導(dǎo)序列海藻糖酶3’nospMOG1027 具有Hyg標(biāo)記的idempMOG1092 質(zhì)體藍(lán)素-as海藻糖酶-3’nospMOG1130 質(zhì)體藍(lán)素-as海藻糖酶-3’nos質(zhì)體藍(lán)素-TPS-3’nospMOG1153 E8-TPS-3’nos E8-as海藻糖酶-3’PotPiIIpMOG1261 煙草海藻糖酶cDNA片段1除非另有說明，所有構(gòu)建體帶有NPTII選擇性標(biāo)記序列表(1)基本信息(i)申請人(A)名稱MOGEN Internaitonal(B)街道Einsternweg 97(C)城市Leiden(E)國家The netherlands(F)郵政編號(Zip)2333 CB(G)電話31-(71)-5258282(H)傳真31-(71)-5221471(ii)發(fā)明名稱通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來修飾海藻糖-6-磷酸水平從而調(diào)節(jié)代謝(iii)序列數(shù)10(iv)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朩O97/42326(B)遞交日1997年5月2日(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)否(xi)序列描述SEQ ID NO1AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)否(xi)序列描述SEQ ID NO2GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTC 24(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度2207個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA至RNA(iii)假設(shè)否(iii)反義否(vi)來源生物馬鈴薯(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置161..1906(xi)序列描述SEQ ID NO3CTTTTCTGAG TAATAACATA GGCATTGATT TTTTTTCAAT TAATAACACC TGCAAACATT 60CCCATTGCCG GCATTCTCTG TTCTTACAAA AAAAAACATT TTTTTGTTCA CATAAATTAG 120TTATGGCATC AGTATTGAAC CCTTTAACTT GTTATACAAT ATG GGT AAA GCT ATA175Met Gly Lys Ala Ile1 5ATT TTT ATG ATT TTT ACT ATG TCT ATG AAT ATG ATT AAA GCT GAA ACT223Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met Ile Lys Ala Glu Thr10 15 20TGC AAA TCC ATT GAT AAG GGT CCT GTA ATC CCA ACA ACC CCT TTA GTG271Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro Thr Thr Pro Leu Val25 30 35ATT TTT CTT GAA AAA GTT CAA GAA GCT GCT CTT CAA ACT TAT GGC CAT319Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Gly His40 45 50AAA GGG TTT GAT GCT AAA CTG TTT GTT GAT ATG TCA CTG AGA GAG AGT367Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met Ser Leu Arg Glu Ser55 60 65CTT TCA GAA ACA GTT GAA GCT TTT AAT AAG CTT CCA AGA GTT GTG AAT415Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Pro Arg Val Val Asn70 75 80 85GGT TCA ATA TCA AAA AGT GAT TTG GAT GGT TTT ATA GGT AGT TAC TTG463Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe Ile Gly Ser Tyr Leu90 95 100AGT AGT CCT GAT AAG GAT TTG GTT TAT GTT GAG CCT ATG GAT TTT GTG511Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu Pro Met Asp Phe Val105 110 115GCT GAG CCT GAA GGC TTT TTG CCA AAG GTG AAG AAT TCT GAG GTG AGG559Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys Asn Ser Glu Val Arg120 125 130GCA TGG GCA TTG GAG GTG CAT TCA CTT TGG AAG AAT TTA AGT AGG AAA607Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys135140 145GTG GCT GAT CAT GTA TTG GAA AAA CCA GAG TTG TAT ACT TTG CTT CCA655Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro150 155 160 165TTG AAA AAT CCA GTT ATT ATA CCG GGA TCG CGT TTT AAG GAG GTT TAT703Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg Phe Lys Glu Val Tyr170 175 180TAT TGG GAT TCT TAT TGG GTA ATA AGG GGT TTG TTA GCA AGC AAA ATG751Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met185 190 195TAT GAA ACT GCA AAA GGG ATT GTG ACT AAT CTG GTT TCT CTG ATA GAT799Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu Val Ser Leu Ile Asp200 205 210CAA TTT GGT TAT GTT CTT AAC GGT GCA AGA GCA TAC TAC AGT AAC AGA847Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn Arg215 220 225AGT CAG CCT CCT GTC CTG GCC ACG ATG ATT GTT GAC ATA TTC AAT CAG895Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val Asp Ile Phe Asn Gln230 235 240 245ACA GGT GAT TTA AAT TTG GTT AGA AGA TCC CTT CCT GCT TTG CTC AAG943Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys250 255 260GAG AAT CAT TTT TGG AAT TCA GGA ATA CAT AAG GTG ACT ATT CAA GAT991Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys Val Thr Ile Gln Asp265 270 275GCT CAG GGA TCA AAC CAC AGC TTG AGT CGG TAC TAT GCT ATG TGG AAT 1039Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn280 285 290AAG CCC CGT CCA GAA TCG TCA ACT ATA GAC AGT GAA ACA GCT TCC GTA 1087Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Glu Thr Ala Ser Val295 300 305CTC CCA AAT ATA TGT GAA AAA AGA GAA TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA 1135Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser310 315 320 325GCT GCT GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGT TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA 1183Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly330 335 340TCT GAT CTG ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG 1231Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu345 350 355AAT GCA TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTT GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT 1279Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn360 365 370CTT GTT GGA GAA AGT AGC ACG GCT TCA CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA 1327Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe Thr Glu Ala Ala Gln375 380 385AAT AGA CAG AAG GCT ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG 1375Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly390 395 400 405CAA TGG CTT GAT TAC TGG CTT ACC AAC AGC GAC ACA TCT GAG GAT ATT 1423Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp Thr Ser Glu Asp Ile410 415 420TAT AAA TGG GAA GAT TTG CAC CAG AAC AAG AAG TCA TTT GCC TCT AAT 1471Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys Ser Phe Ala Ser Asn425 430 435TTT GTT CCG CTG TGG ACT GAA ATT TCT TGT TCA GAT AAT AAT ATC ACA 1519Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser Asp Asn Asn Ile Thr440 445 450ACT CAG AAA GTA GTT CAA AGT CTC ATG AGC TCG GGC TTG CTT CAG CCT 1567Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Leu Gln Pro455 460 465GCA GGG ATT GCA ATG ACC TTG TCT AAT ACT GGA CAG CAA TGG GAT TTT 1615Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe470 475 480 485CCG AAT GGT TGG CCC CCC CTT CAA CAC ATA ATC ATT GAA GGT CTC TTA 1663Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Leu490 495 500AGG TCT GGA CTA GAA GAG GCA AGA ACC TTA GCA AAA GAC ATT GCT ATT 1711Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala Lys Asp Ile Ala Ile505 510 515CGC TGG TTA AGA ACT AAC TAT GTG ACT TAC AAG AAA ACC GGT GCT ATG 1759Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met520 525 530TAT GAA AAA TAT GAT GTC ACA AAA TGT GGA GCA TAT GGA GGT GGT GGT 1807Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala Tyr Gly Gly Gly Gly535 540 545GAA TAT ATG TCC CAA ACG GGT TTC GGA TGG TCA AAT GGC GTT GTA CTG 1855Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu550 555 560 565GCA CTT CTA GAG GAA TTT GGA TGG CCT GAA GAT TTG AAG ATT GAT TGC 1903Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys570 575 580TAATGAGCAA GTAGAAAAGC CAAATGAAAC ATCATTGAGT TTTATTTTCT TCTTTTGTTA 1963AAATAAGCTG CAATGGTTTG CTGATAGTTT ATGTTTTGTA TTACTATTTC ATAAGGTTTT 2023TGTACCATAT CAAGTGATAT TACCATGAAC TATGTCGTTC GGACTCTTCA AATCGGATTT 2083TGCAAAAATA ATGCAGTTTT GGAGAATCCG ATAACATAGA CCATGTATGG ATCTAAATTG 2143TAAACAGCTT ACTATATTAA GTAAAAGAAA GATGATTCCT CTGCTTTAAA AAAAAAAAAA 2203AAAA 2207(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度581個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Gly Lys Ala Ile Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met1 5 10 15Ile Lys Ala Glu Thr Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro20 25 30Thr Thr Pro Leu Val Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu35 40 45Gln Thr Tyr Gly His Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met50 55 60Ser Leu Arg Glu Ser Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu65 70 75 80Pro Arg Val Val Asn Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe85 90 95Ile Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu100 105 110Pro Met Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys115 120 125Asn Ser Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys130 135 140Asn Leu Ser Arg Lys Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu145 150 155 160Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg165 170 175Phe Lys Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu180 185 190Leu Ala Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu195 200 205Val Ser Leu Ile Asp Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala210 215 220Tyr Tyr Ser Asn Arg Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val225 230 235 240Asp Ile Phe Asn Gln Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu245 250 255Pro Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys260 265 270Val Thr Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr275 280 285Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser290 295 300Glu Thr Ala Ser Val Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr305 310 315 320Arg Glu Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg325 330 335Trp Met Ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile340 345 350Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile355 360 365Ala Phe Leu Ala Asn Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe370 375 380Thr Glu Ala Ala Gln Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp385 390 395 400Asn Ala Glu Met Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp405 410 415Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys420 425 430Ser Phe Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser435 440 445Asp Asn Asn Ile Thr Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser450 455 460Gly Leu Leu Gln Pro Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly465 470 475 480Gln Gln Trp Asp Phe Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile485 490 495Ile Glu Gly Leu Leu Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala500 505 510Lys Asp Ile Ala Ile Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys515 520 525Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala530 535 540Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser545 550 555 560Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp565 570 575Leu Lys Ile Asp Cys580(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度515個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA至RNA(iii)假設(shè)否(iii)反義否(vi)來源生物煙草(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置25..515(xi)序列描述SEQ ID NO5GAATTCGCGG CCCGCGTCGA CTACGGCTGC GAGAAGACGA CAGAAGGGGA T GCT CAG57Ala Gln1GGA TCG AAC CAT AGT TTG AGT CGA TAC TAT GCT ATG TGG AAT GAA CCC105Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Glu Pro5 10 15CGA CCA GAA TCA TCA ACT ATT GAC AGT AAA ACA GCT TCC AAA CTC CCA153Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Lys Thr Ala Ser Lys Leu Pro20 25 30AAC ATC TGT GAA AAA AGA CAA TTT TAT CGC GAC TTG GCA TCA GCG GCA201Asn Ile Cys Glu Lys Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Leu Ala Ser Ala Ala35 40 45 50GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGC TCA AGA TGG ATG AGG AAT GAA CCT GAT249Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asn Glu Pro Asp55 60 65CTC ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT CTG AAT GCA297Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala70 75 80TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTG GAC ATA GCC TTT TTA GCA AAT ACT ATT345Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn Thr Ile85 90 95GGA GAA AGT AGC ACC GTT GCC CGA TTT ACA GAA GCT TCT CAA AAC AGA393Gly Glu Ser Ser Thr Val Ala Arg Phe Thr Glu Ala Ser Gln Asn Arg100 105 110CAA AGG GCC ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCG GAG ATG GGG CAA TGG441Gln Arg Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Ash Ala Glu Met Gly Gln Trp115 120 125 130CTT GAT TAC TGG CTT GGC GAC AGC AAC ACA TCC GAG GAT ATT TAT ATA489Leu Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Ser Asn Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ile135 140 145TGG GAA GAT ATA CAC CAG AAC TCT CT 515Trp Glu Asp Ile His Gln Asn Ser150(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度154個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn1 5 10 15Glu Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Lys Thr Ala Ser Lys20 25 30Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Gln Phe Tyr Arg Asp Leu A la Ser35 40 45Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Arg Asn Glu50 55 60Pro Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu65 70 75 80Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn85 90 95Thr Ile Gly Glu Ser Ser Thr Val Ala Arg Phe Thr Glu Ala Ser Gln100 105 110Asn Arg Gln Arg Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly115 120 125Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Gly Asp Ser Asn Thr Ser Glu Asp Ile130 135 140Tyr Ile Trp Glu Asp Ile His Gln Asn Ser145150(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征
(A)長度580個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA至RNA(iii)假設(shè)否(iii)反義否(vi)來源生物煙草(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵不確切(B)位置13(C)其它信息/備注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵不確切(B)位置23(C)其它信息/備注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵不確切(B)位置219(C)其它信息/備注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵不確切(B)位置387(C)其它信息/備注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵不確切(B)位置459(C)其它信息/備注＝“可以是a，c，g或t”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置3..263(xi)序列描述SEQ ID NO7AG ATC ATT GAA GAT TTC GCG AGA TTT GGA CTA GAA GAG GCA AGA GCC 47Ile Ile Glu Asp Phe Ala Arg Phe Gly Leu Glu Glu Ala Arg Ala1 5 10 15TTA GCT AAC GAC ATT GTT ATC CGA TGG ATA AGA ACT AAC TAT GTA GCT 95Leu Ala Asn Asp Ile Val Ile Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Val Ala20 25 30TAC AAG AAA ACC GGT GCA ATG TAT GAA AAA TAC GAC GTG ACA AAA TGT143Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys35 40 45GGA GCA TAT GGA GAT GGT GGT GTG TAT GCA GCC CAA ACT GGT TTT GGA191Gly Ala Tyr Gly Asp Gly Gly Val Tyr Ala Ala Gln Thr Gly Phe Gly50 55 60TGG ACG AAT GGC GTT GTA CTG GCA CTT ATG GAG G AA TTT GGA TGG CCT239Trp Thr Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Met Glu Glu Phe Gly Trp Pro65 70 75GAA GAC TTG AAG ATT GAC TGC TAC TGAGCAGGCA GAGTAACCAT TCGAGCTGAC293Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys Tyr80 85GAAATTAGAA ATATTATCCG TGAATATATT GAACAATATA ATGGAGAAGT AAAGATTGTA 353AATATTGGCA ATGTACTTTG CGATGATGTT GCTAGTATTC ACAGTTTTGA TAAAGTAATG 413GTGGGTGAAT TAGGAGAAGC TGTAGAGGGG ACAATAAACA TTGCTATGAA TTTGGAATCA 473AATAATGTTG GTGTTGTATT AATTGGCGAA CAACTTCAAT TAAAGTGAAA TTAGAAAAAA 533AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCGGCC GCTCGAATTC CCTCTCT 580(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度87個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Ile Glu Asp Phe Ala Arg Phe Gly Leu Glu Glu Ala Arg Ala Leu1 5 10 15Ala Asn Asp Ile Val Ile Arg Trp Ile Arg Thr Asn Tyr Val Ala Tyr20 25 30Lys Lys Thr Gly Ala Met Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly35 40 45Ala Tyr Gly Asp Gly Gly Val Tyr Ala Ala Gln Thr Gly Phe Gly Trp50 55 60Thr Asn Gly Val Val Leu Ala Leu Met Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu65 70 75 80Asp Leu Lys Ile Asp Cys Tyr85(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度2940個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)否(iii)反義否(vi)原始來源生物擬南芥(vi)直接來源克隆BAC T19F06(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置連接(119..684，801..920，1012..1127，1211..1311，1398..1507，1590..1662，1755..1916，2020..2083，2163..2262，2358..2571，2671..2754)(xi)序列描述SEQ ID NO9CTTATCCTCT TCTCCATTCA ATCTCTTATT CTCTTTTCCT TCCTTCATAT ACCTTAAACA 60GCAACGTTCT CTGTTCTTCT TCTTCTTTTT CTTCCTCTGT TTTTCTTTCA CAACTTCC118ATG TTG GAC TCG GAC ACA GAC ACG GAC TCA GGT CCT GTG GTT GCA ACA166Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr1 5 10 15ACC AAA CTC GTC ACT TTC CTC CAG CGT GTG CAG CAC ACG GCA CTT CGA214Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg20 25 30TCA TAC CCT AAA AAA CAA ACG CCT GAT CCC AAA TCC TAC ATT GAT CTA262Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu35 40 45TCT CTC AAA CGT CCC TAC AGT CTC TCC ACC ATC GAA TCA GCC TTC GAT310Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp50 55 60GAT CTC ACG AGC GAG TCA CAT GAC CAG CCA GTG CCA GTG GAG ACG CTT358Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu65 70 75 80GAA AAG TTC GTC AAG GAA TAT TTT GAC GGT GCA GGG GAG GAT CTG CTG406Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu85 90 95CAC CAC GAA CCA GTA GAT TTC GTC TCA GAT CCC TCC GGC TTC CTC TCC454His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser100 105 110AAC GTG GAG AAC GAA GAA GTC AGA GAA TGG GCG CGT GAG GTA CAC GGT502Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly115 120 125CTT TGG AGA AAT CTG AGC TGC AGA GTC TCT GAC TCA GTA AGA GAG TCT550Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser130 135 140GCC GAC CGG CAC ACG CTT CTA CCG TTG CCG GAA CCG GTT ATC ATT CCC598Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro145 150 155 160GGT TCG AGA TTC AGA GAA GTC TAT TAC TGG GAT TCT TAT TGG GTC ATC AA648Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Lys165 170 175GTAAGTCATT GTTTCCAACT TTTAAATCAC AAATCAAATG TTTTTTGTTT TTTGTTATTA 708AATTGATTTC CTCTCCTTTC GTGTTGACTA CGTAACACAA GCTAACGTGT CAGTATGTCA 768CCGTCTTGTA ACACGTGCTT TTGCACATGC AG A GGA CTT ATG ACG AGT CAA 819Gly Leu Met Thr Ser Gln180ATG TTC ACT ACC GCC AAA GGT TTA GTG ACG AAT CTG ATG TCA CTT GTG867Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val Thr Asn Leu Met Ser Leu Val185 190 195GAG ACT TAT GGT TAC GCT TTG AAC GGT GCT AGA GCT TAT TAT ACT AAC915Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn200 205 210 215AGA AG GTAACTACAA CTCTTTGTCT CTATTTGAGA TTTGTCAATA ACGGAGAAAA970Arg SerTAAAATGTTT ATGAGATTTA TAATGTTTTT ATTGTTACAA G C CAA CCA CCT TTG1024Gln Pro Pro Leu220TTG AGC TCC ATG GTC TAT GAA ATT TAT AAT GTG ACA AAA GAT GAA GAA1072Leu Ser Ser Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu225 230 235CTT GTG AGG AAA GCA ATC CCT CTG CTT CTC AAA GAG TAC GAG TTT TGG1120Leu Val Arg Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp240 245 250AAC TCA G GTTAGTTATT TAGTTAGATA GTTTAGTAAC ACTAGTTTGG TTTAATTCTT 1177Asn Ser255AGATTGAATA TTGTTATGTT TTCTTCTTTG TAG GA AAA CAT AAA GTG GTT ATT 1230Gly Lys His Lys Val Val Ile260CGA GAC GCT AAT GGT TAT GAT CAC GTT TTG AGC CGT TAT TAT GCT ATG1278Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met265 270 275TGG AAC AAG CCA AGG CCT GAA TCC TCT GTT TTC GTATGTTTCT TGTCTATTTA 1331Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val Phe280 285CAAACATGTT TTCTAATTTT ATTGCGAGAA AAAATGTTGA CTCTTTCTCT TCATGTGTTA 1391CCACAG GAT GAA GAA TCT GCT TCA GGG TTC TCG ACT ATG TTA GAG AAA 1439Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys290 295 300CAA CGG TTC CAT CGA GAT ATA GCC ACG GCT GCT GAA TCA GGA TGC GAT1487Gln Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp305 310 315TTC AGC ACG CGA TGG ATG AG GTTCGATTAC TTAACAAACT AATCAAGTGT1537Phe Ser Thr Arg Trp Met Arg320 325AGTTCATGTT ACTACTGTCA CTTATACTTA AATTCTCAAA ATGATAATGC AG G GAT1593AspCCT CCT AAT TTC ACA ACG ATG GCT ACA ACA TCA GTG GTT CCT GTT GAT1641Pro Pro Asn Phe 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2103Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser420 425TATGTATACA CTTTATATGT TGAATTATGT ATTTGAACGT TTAATTTTGC AACATGTAG AT 2164AspGAA AAT CTT GTC AAG AAA GTT GTG ACA GCT CTT AAG AAC TCA GGG CTC 2212Glu Asn Leu Val Lys Lys Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu430 435 440ATT GCT CCC GCT GGA ATC CTA ACT TCT TTG ACA AAC TCA GGA CAA CAA TG2262Ile Ala Pro Ala Gly Ile Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp445 450 455GTAAATGAAG CTTGCGGTTC AAGTTTCATT TGGAATCTTG AAATTTACTT CACTAAGCAT 2322ATTATCTTGA TACATATGTG GTTGCACTGG AACAG G GAT TCT CCG AAT GGA TGG 2376Asp Ser Pro Asn Gly Trp460 465GCA CCG CAA CAA GAG ATG ATC GTC ACA GGG CTC GGA AGA TCG AGT GTA 2424Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser Val470 475 480AAA GAA GCT AAA GAG ATG GCA GAG GAT ATT GCA AGG AGA TGG ATC AAA 2472Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile Lys485 490 495AGC AAC TAT CTT GTC TAC AAG AAA AGT GGG ACT ATA CAT GAG AAG CTC 2520Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys Leu500 505 510AAA GTT ACA GAG CTT GGT GAA TAT GGT GGT GGA GGA GAA TAT ATG CCA 2568Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met Pro515 520 525CAG GTCAACTTTT CTTCTTCAAC TTTCTTTTGA TTTCATGAGT TTTAGGGGTC2621Gln530CAAATAAAAG TTTCTTGTAA TGTTGACTTC ATGTTTCCAA AAAATGCAG ACC GGA 2676Thr GlyTTC GGA TGG TCA AAT GGA GTT ATC TTA GCA TTC TTG GAG GAA TAT GGA 2724Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Gly535 540 545TGG CCC TCT CAT CTT AGC ATT GAA GCC TAGATTTACT AAGTTTATTG2771Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala550 555AAAGTTAAAT AACGGAATTA GACATTTTAT GTTACAAAAA CTTTGGTAGA TTTGATCGTA2831GTGGATTATT TCTTGGGGTT TTCTGTCAGA ACGTTTTAGA GTTACAAATG TTTTATGACC2891AAATATTGTA TATGCAAATA AAGTTAAATA TAATAAGCAT CTAATGGTA2940(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度557個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Leu Asp Ser Asp Thr Asp Thr Asp Ser Gly Pro Val Val Ala Thr1 5 10 15Thr Lys Leu Val Thr Phe Leu Gln Arg Val Gln His Thr Ala Leu Arg20 25 30Ser Tyr Pro Lys Lys Gln Thr Pro Asp Pro Lys Ser Tyr Ile Asp Leu35 40 45Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Ile Glu Ser Ala Phe Asp50 55 60Asp Leu Thr Ser Glu Ser His Asp Gln Pro Val Pro Val Glu Thr Leu65 70 75 80Glu Lys Phe Val Lys Glu Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Glu Asp Leu Leu85 90 95His His Glu Pro Val Asp Phe Val Ser Asp Pro Ser Gly Phe Leu Ser100105 110Asn Val Glu Asn Glu Glu Val Arg Glu Trp Ala Arg Glu Val His Gly115 120 125Leu Trp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Ser Asp Ser Val Arg Glu Ser130 135 140Ala Asp Arg His Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro Val Ile Ile Pro145 150 155 160Gly Ser Arg Phe Arg Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile165 170 175Lys Gly Leu Met Thr Ser Gln Met Phe Thr Thr Ala Lys Gly Leu Val180 185 190Thr Asn Leu Met Ser Leu Val Glu Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asn Gly195 200 205Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu Leu Ser Ser210 215 220Met Val Tyr Glu Ile Tyr Asn Val Thr Lys Asp Glu Glu Leu Val Arg225 230 235 240Lys Ala Ile Pro Leu Leu Leu Lys Glu Tyr Glu Phe Trp Asn Ser Gly245 250 255Lys His Lys Val Val Ile Arg Asp Ala Asn Gly Tyr Asp His Val Leu260 265 270Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Val275 280 285Phe Asp Glu Glu Ser Ala Ser Gly Phe Ser Thr Met Leu Glu Lys Gln290 295 300Arg Phe His Arg Asp Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ser Gly Cys Asp Phe305 310 315 320Ser Thr Arg Trp Met Arg Asp Pro Pro Asn Phe Thr Thr Met Ala Thr325 330 335Thr Ser Val Val Pro Val Asp Leu Asn Val Phe Leu Leu Lys Met Glu340 345 350Leu Asp Ile Ala Phe Met Met Lys Val Ser Gly Asp Gln Asn Gly Ser355 360 365Asp Arg Phe Val Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Lys Ala Phe Gln Thr370 375 380Val Phe Thr Asn Glu Lys Ala Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Ser385 390 395 400Ser Ser Gly Glu Asn Gln Asn Thr Asn Val Phe Ala Ser Asn Phe Ala405 410 415Pro Ile Trp Ile Asn Ser Ile Asn Ser Asp Glu Asn Leu Val Lys Lys420 425 430Val Val Thr Ala Leu Lys Asn Ser Gly Leu Ile Ala Pro Ala Gly Ile435 440 445Leu Thr Ser Leu Thr Asn Ser Gly Gln Gln Trp Asp Ser Pro Asn Gly450 455 460Trp Ala Pro Gln Gln Glu Met Ile Val Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ser465 470 475 480Val Lys Glu Ala Lys Glu Met Ala Glu Asp Ile Ala Arg Arg Trp Ile485 490 495Lys Ser Asn Tyr Leu Val Tyr Lys Lys Ser Gly Thr Ile His Glu Lys500 505 510Leu Lys Val Thr Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Met515 520 525Pro Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Ile Leu Ala Phe Leu530 535 540Glu Glu Tyr Gly Trp Pro Ser His Leu Ser Ile Glu Ala545 550 55權(quán)利要求
1.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來修飾體內(nèi)細(xì)胞、組織或器官的發(fā)育和/組成的方法。
2.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來抑制糖酵解方向中碳流的方法。
3.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平刺激光合作用的方法。
4.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平刺激庫相關(guān)活性的方法。
5.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來抑制細(xì)胞或組織生長的方法。
6.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來防止冷凍甜化的方法。
7.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來抑制收獲后甜菜中轉(zhuǎn)化酶的方法。
8.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平誘導(dǎo)抽苔的方法。
9.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平增加植物產(chǎn)量的方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項所述的方法，其特征在于對內(nèi)源海藻糖酶水平的抑制效應(yīng)由細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸水平的增加引起。
11.通過抑制內(nèi)源海藻糖酶水平來增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸有效來源的方法。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述的方法，其特征在于內(nèi)源海藻糖酶水平的抑制是在海藻糖酶抑制劑存在的情況下培養(yǎng)或生長所述細(xì)胞、組織、器官或植株的結(jié)果。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制劑以適于所述細(xì)胞、組織、器官或植株吸收的形式包含有效霉素A，優(yōu)選地其中水溶液中有效霉素A的濃度為100nM到10mM，更優(yōu)選地0.1到1mM。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制劑以適于所述細(xì)胞、組織、器官或植株吸收的形式包含美洲蟑郎(Periplanetaamericana)86kD蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述的方法，其特征在于所述對細(xì)胞、組織、器官或植株進(jìn)行了遺傳改變從而含有海藻糖酶抑制劑的遺傳信息。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制劑的遺傳信息包括編碼美洲蟑郎(Periplaneta americana)86kD蛋白的基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制劑的遺傳信息包括能表達(dá)與由編碼內(nèi)源海藻糖酶的基因所產(chǎn)生的RNA至少部分互補(bǔ)的RNA的DNA序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于海藻糖酶抑制劑的遺傳信息包括編碼海藻糖酶的DNA序列，該序列與編碼內(nèi)源海藻糖酶的DNA序列一致。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其特征在于編碼內(nèi)源海藻糖酶的DNA序列選自包括編碼SEQ ID NO4蛋白的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO6蛋白的核苷酸序列、編碼SEQ ID NO8蛋白的核苷酸序列和編碼SEQ IDNO10蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列組。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于編碼內(nèi)源海藻糖酶的DNA序列選自包括SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO5中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO7中所示的核苷酸序列和SEQ ID NO9中所示的核苷酸序列的核苷酸序列組。
全文摘要
本發(fā)明在細(xì)胞代謝碳流調(diào)節(jié)領(lǐng)域內(nèi)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)糖類海藻糖－6－磷酸(T－6－P)有效來源的變化會誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞、組織和器官的發(fā)育和/或組成的變化。這些變化可通過抑制內(nèi)源海藻糖酶來誘導(dǎo),該酶能夠?qū)⒑Ｔ逄撬獬蓛蓚€葡萄糖組分。
文檔編號A01H5/00GK1260001SQ98805991
公開日2000年7月12日 申請日期1998年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月2日
發(fā)明者O·J·M·格迪津, J·佩恩, J·C·M·斯米肯斯, M·T·斯米茨 申請人:莫根國際股份有限公司